Introduction
Glykolipider, glykoproteiner, proteoglykaner och glykosaminoglykaner utgör de fyra huvudklasser av komplexa, heterogena kolhydrater kollektivt kallas glykaner. Som överallt förekommande och integrerade delar av plasmamembranet, glykokalyx, och extracellulär matris och vätskor, glykaner delta i så skilda biokemiska processer som endocytos, intracellulär trafficking, cellmotilitet, signaltransduktion, molekylär igenkänning, receptoraktivering, cellvidhäftning, värdpatogen interaktion , intercellulär kommunikation, immunosurveillance och immunsvar initiering. 1 närvarande i nästan alla områden i livet, enzymer som kallas glykosyltransferaser som bygger glykan polymerer agera i tandem med glykosid hydrolaser (även känd som glykosidaser som bryter ner glykaner) att bygga, renovera, och slutligen producerar färdig glykan polymerer 2. Även om varje glykosyltransferas kan verka på olika glykokonjugat, en glykosyltransferasallmänhet förfalskar ett redskap, som och anomer specifika glykosidbindning genom överföring av monosackarid-delen av en speciell aktiverad nukleotid sockerdonator (t.ex. GDP-fukos) till en viss kategori av nukleofila acceptorer (till exempel, en lipid, polypeptid, nukleinsyra, eller odling oligosackarid). Det har uppskattats att mer än 50% av proteiner (speciellt membran och sekretoriska proteiner) är posttranslationellt modifierat genom glykosylering 3 rudimentära kombinatoriska beräkningar ger en uppskattning för den stora variationen, mångsidighet och specificitet tillerkänns glykoproteiner av glykosylering. till exempel om en polypeptid substratet har endast 10 glykosyleringsställen och för varje plats kan bilda en glykosidbindning med en av endast tre olika monosackarid-reducerande ändarna, då, teoretiskt, den slutliga glykoprotein kan anta 3 10 = 59049 distinkta identiteter. I glykoproteiner, glykosidbindningar bildas vanligen med sidokedjan kväve of asparaginrester i sekvensen Asn-X-Ser / Thr (X kan vara vilken aminosyra som helst med undantag för prolin) för att ge N-glykaner 2 och sidokedjan hydroxyler serin- och treoninrester för att ge O-glykaner 4. Sammansättningen av en cells glycome (dvs dess komplement av glykosyleringsprodukter) är unik och begränsad eftersom, med få undantag, glykosyltransferaser uppvisar strikt donator, acceptor, och länk specificitet. 5 Viktigt och rikliga blodplasma glykoproteiner lider avvikande glykosylering som en nedströms följd från onormal glykosyltransferas expression och aktivitet på grund av många patologiska tillstånd, speciellt cancer och inflammatoriska sjukdomar. 6-24
Främst på grund av epigenetiska faktorer är glycome betydligt mer mångsidig, dynamisk och komplex än proteomet och transkriptom. 25,26 medan cirka 1% av däggdjursgenomet kodar bildning, modifiering ochmontering av glykaner, till 27 glykosylering fortskrider i en icke-mallbaserade sätt, en skarp kontrast polypeptid och nukleinsyra biosyntesen syra. Samspelet mellan den relativa mängden och aktiviteten av glykosyleringsenzymer och sådana miljöfaktorer som näringsämnen och föregångare tillgänglighet slutligen bestämmer naturen, hastighet och omfattning av glykosylering. 5,28 embryogenesen (t.ex. bestämning och differentiering), cellulär aktivering, och progression genom cellcykeln påverkar genuttryck (dvs transkription och translation) och ändra identiteten och mängden av tillgängliga glykosyltransferaser, vars verksamhet är direkt uppströms faktorn för cellens glykan profil. Eftersom (en del av) det proliferativa, gummering och invasiva egenskaper hos cancerceller liknar dem för vanliga embryogena celler, specifika förändringar i glycan biosyntetiska vägar (t.ex. ackumulering prekursor, avreglerad expression, aberrant modifiering, strukturell trunkering, eller ny formation) fungerar som universella cancer biomarkörer som indikerar olika stadier av tumörbildning, progression, migration och invasion 29 Även glykosylering är mycket komplex, tydligen bara några förändringar i glykosylering kan aktivera cancer och metastaser. tydligen vissa "avvikande" glykosyleringsprodukter verkligen gynnar cancerceller genom att ge dem möjlighet att undvika immunigenkänning och överleva krav migration i ogästvänliga intravaskulära och metastaserande miljöer. 28,30,31 Inte överraskande, har experiment visat att störa eller förhindra mönster förändras genuttryck och avvikande glykan bildning kan stoppa tumörbildning. 29 Trots de avvikande glykaner upptäckts i en biofluid prov (t.ex. urin, saliv, och blodplasma eller serum) får inte vara direkta indikatorer på cancer (eller annan sjukdom), utan snarare nedströms resultaten av subtil men ändå betydandeförändringar i immunsystemet eller mätbara konsekvenserna av en fördärvlig tillstånd på ett oförutsägbart organ. 32
Även om de ger allmän information om glycome många molekylär interaktion baserade glycomics tekniker (t.ex. lektin / antikropps matriser och metabolisk / kovalent märkning) beror på att upptäcka hela glykanstrukturer och inte ge detaljerad strukturell information om enskilda glykaner. I skarp kontrast, kan masspektrometri (MS) hjälpa till att identifiera och kvantifiera individuella glykanstrukturer och avslöja sådan strukturinformation som bindningsställen till polypeptid kärnor. Avreglerad expression eller aktivitet av endast ett glykosyltransferas kan initiera en kaskad av skadliga molekylära händelser i flera glykosylerings vägar. Eftersom varje glykosyltransferas kan arbeta på mer än ett glykokonjugat substrat och mellan olika växande glykan polymerer, avreglerade biosyntetiska kaskader ger dispropornellt ökade mängder av endast en glykan produkt men flera heterogena klasser av avvikande glykaner i inträ- eller extracellulära vätskor. 33 Sådana unika avvikande glykaner anses ibland opraktiska som biomarkörer för cancer eller andra glykan-affektiva sjukdomar eftersom, jämfört med den stora poolen av välreglerad glykaner dessa avvikande glykaner utgör en mycket liten del som ofta kan förbli odetekterbara även genom sådana känsliga metoder som masspektrometri. Till exempel i intra- och extracellulära kroppsvätskor, kan den breda proteinkoncentration spektrum (som spänner över åtta storleksordningar) förhindra upptäckt av knappa glykoproteiner som är maskerade av rikligare arter. 32 Vidare bestämma glykosyltransferas aktivitet fortfarande en avsevärd praktisk och teoretisk utmaning eftersom många glykosyltransferaser är frånvarande i kliniska Biofluids eller blir inaktiva ex vivo. Trots svårigheten av jämn,tly detektera och kvantifiera ultra små mängder av unika hela glykaner, har utövare av masspektrometri gjort enorma framsteg mot att använda intakta glykaner som kliniska markörer. Vi har nyligen utvecklat ett komplement till den analys av intakta glykaner som sysselsätter GC-MS, underlättar upptäckt av alla ingående gren-punkt och kopplingsspecifika monosackarider ( "glykan noder") som tillsammans ger unika för varje glykan och i många fall direkt tjäna som molekylära surrogat som kvantifierar den relativa aktiviteten för den klandervärt glykosyltransferas (er).
Sedan dess första rapporterade direkt ansökan till glykan analys 1958 har gaskromatografi (GC) visat sig vara en kraftfull teknik för att analysera per-metylerade mono- och disackarider, 34 bestämma deras anomericity och absolut konfiguration, och skilja dem för senare analys masspektrometrisk. 35 mellan 1984 och 2007, Ciucanu och kollegorinfört och förfinat en fast fas glykan permetylering teknik som användes natriumhydroxid och jodmetan, följt av vätska / vätske-extraktion av permetylerad glykaner med vatten och kloroform. 35,36 Mellan 2005 och 2008, Kang och medarbetare integrerat en tidsbesparande spin kolonn tillvägagångssätt i permetylering steg. 37,38 Under 2008 Goetz forskargrupp tagit fram en kvantitativ fast fas permetylering glykan-profilering metod som använder matrisassisterad laserdesorption-jonisering (MALDI) masspektrometri att jämföra och eventuellt skilja invasiva och icke -invasive bröstcancerceller, 39 sedan, år 2009, den Goetz laget kombinerad enzymatisk och släppteknik kemiska att klyva O-glykaner från intakta glykoproteiner i en starkt alkalisk fast fas permetylering schema 40 Även om Goetz förfarande underlättas samtidig permetylering och kemisk release. av O-glykaner, var det endast tillämpas på pre-isolerade glykoproteiner. Vi ändrade denna teknik under 2013 och anpassat det för hela ofraktionerade Biofluids och homogeniserad vävnadsprover genom att införliva trifluorättiksyra (TFA) hydrolys, reduktion och acetylering steg. 33 Dessa ytterligare steg också släppa glykaner från glykolipider och N-kopplade glykaner från glykoproteiner och konvertera dem i delvis metylerade alditol acetater (PMAAs, Figur 1), vars utmärkande metylering-och-acetylering mönster underlättar analys av GC-MS och unikt karaktärisera de ingående glykan noderna i den ursprungliga intakta glykan polymer 41 (Figur 2). 33 Ytterst detta förfarande ger en sammansatt porträtt av alla glykanema i en komplex biofluid baserad på direkt, relativ kvantifiering av unika glykan funktioner som "kärn fukosylering", "sex-sialylering", "skär GlcNAc" och "beta 1-6 förgrening" - varje härledd från en enda GC-MS chromatographic topp. I denna artikel presenteras ytterligare optimering av permetylering, acetylering, isolering och saneringssteg tillsammans med förbättringar i läge av relativ kvantifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Varning: Undvik hudkontakt / öga med någon av de reagenser som används i detta experiment. Vid exponering, spola noggrant det drabbade området med vatten och omedelbart söka läkare.
1. permetylering och glykan Extraktion
- kolonn Framställning
- Få så många mikrospinnkolonn enheter de prover som ska analyseras. Bryt och lossa plastbehållaren rörslock. Placera en mikrofug mini filter i varje förrådsröret. Placera de monterade mikrofugrör spinnkolonner (innehållande mini filter) i ett mikrofugrör rack.
- Erhålla ett lager av natriumhydroxid (NaOH) pärlor (20-40 mesh). Överföra en del NaOH till en liten vägning båt eller om fukt orsakar klumpning, en varm porslinsmortel som arbets lager av NaOH. Undvik att använda klumpar av NaOH eller krossade / pulveriserad NaOH pärlor.
Varning: NaOH är en potent toxin och frätande bas. Spola exponerad hud / ögonen med vatten under 15 minuter. Thoroughly rengöra bänken efter att ha avslutat experimentet. - Med hjälp av en liten skopa eller spatel, överför NaOH pärlor från arbets lager för att fylla mikrofugrör mini filter med NaOH upp till den första yttre avfasning (~ 5 mm under brädden). Tryck på fyllda mikrofugrör filter på bänken topp att packa / kondensera NaOH pärlor.
Obs: Under detta experiment, för att minimera överdriven vatten adsorption av hygroskopiska NaOH pärlor, upprätthålla nivån för eventuellt tillsatta vätskor (t.ex. acetonitril, dimetylsulfoxid, analytlösningen) ovanför ytan av NaOH packning i kolonnen och begränsa direkt kontakt med luft. - Skaffa ett lager av acetonitril (ACN). Överför ~ 350 ul ACN varje NaOH-packade mikro mini filter. Håll NaOH nedsänkt under ACN och ta bort stora luftbubblor genom omrörning med en spets-krusad gel-laddning pipettspetsen.
Varning: Acetonitril är ett brandfarligt irriterande. - kolonn Centrifugering
- Ordna mikrofugrör kolumner symmetriskt inuti en centrifug; använda en vågröret om nödvändigt. Undvik att spilla NaOH granulat inuti centrifugen. Stänger centrifuglocket.
- Centrifugera kolumnerna (innehållande NaOH och ACN) för ~ 15 sek vid 2400 x g.
- Efter avslutad centrifugering, ta bort mikrofugrör kolumner från centrifugen, och kassera ACN i en farlig avfallsbehållare. Hålla NaOH-kolonn packning intakt.
- Lägg ~ 350 l dimetylsulfoxid (DMSO) till varje NaOH-packade mikro mini filter. Håll NaOH nedsänkt under DMSO och avlägsna eventuella stora luftbubblor med en pipettspets. Såsom tidigare beskrivits, centrifug kolumner för ~ 15 sek vid 2400 x g, och kassera DMSO och samtidigt hålla den NaOH packning intakt.
Varning: DMSO är en mutagen och irriterande och absorberas lätt genom huden. - Anslut alla mikrofugrör mini filter med pluggar som ingår i spinnfilterutrustning. Överföra ~ 350 | j, l DMSO till varje NaOH-packade mikrofug mini filter och använda en 200 mikroliter pipettspets för att avlägsna luftbubblor i NaOH packning så att DMSO når alla regioner inom sedan NaOH packning. Undvik att krossa eller alltför skrapa NaOH pärlor; NaOH pulver är icke önskvärt. Avsluta detta steg så snabbt som möjligt.
- Framställning av plasma Kvalitetskontroll (QC) Prov (s)
Obs! För att säkerställa enhetliga resultat i hela experimentella satser, överväga att använda åtminstone en delmängd av ett prov som tagits från en stor, homogen bulk uppsamling av biologiskt material av intresse som skall analyseras i varje sats. Till exempel om att analysera blodplasma, använd alikvot (er) av en bulk samling av blodplasma som QC prov (er) i varje sats. Process QC prover på samma sätt som okända prover.- Centrifugera en lager prov QC plasma under 4 min vid ~ 10.000 x g. Under centrifugeringen, kan en del med hög densitet fällning sedimentera till the botten och en del med låg densitet fällning kan flyta till toppen av plasmat. Undvika såväl vid demontering alikvot (er) av plasma.
- Fortsätt till "1,3) Provberedning" nedan. Gå sedan tillbaka till det här steget efter plasma centrifugeringen är klar.
- Återkalla 9 il centrifug QC plasma och överföra den till en lämpligt märkt 1,5 ml polypropylen provrör utrustat med en snap-shut lock (nedan kallat "1,5-ml plast provrör"). Tillsätt 1 pl av avjoniserat vatten till varje alikvot, om så önskas, använda detta som en bärare för intern standard (s).
- Lägg 270 ul DMSO till denna kontrollplasma. Virveln för att säkerställa fullständig upplösning.
- prov~~POS=TRUNC
- Få så många 1,5-ml plastprovrör som antalet biologiska (analyt) prover.
- Överföring 9 pl av varje biologiskt (analyt) prov till dess motsvarande 1,5 ml plast provrör. Överför 1 | il avjoniserat vatten och 270 | il DMSO till varje provrör.
- Kraftigt blanda (t.ex. virvel och / eller upprepade gånger pipett upp och ner) proven för att säkerställa fullständig upplösning i DMSO.
Varning: Utför följande steg inuti ett dragskåp. Används i de följande stegen, jodmetan (CH 3 I), diklormetan (CH 2 Cl 2, aka metylenklorid), och kloroform (CHCI3, triklormetan), är flyktiga vätskor med förmåga att lösa vissa typer av plast (t.ex. nitril) . Var noga med att använda lösningsmedelsbeständiga handskar. På grund av deras tryck låg viskositet och hög ånga, kan dessa reagens droppa från en pipettspets under överföringen. Minimera reagensförlust och potentiell exponering genom att hålla stamlösningen intill det mottagande fartyget. - Leverera en tillräcklig total volym av jodmetan till en liten, rent rör. Varje analyt prov kommer att kräva 105 pl jodmetan. Transfer ~ 500 l diklormetan i another rent rör. För att förhindra spruta igensättning, skölj sprutan med diklormetan omedelbart efter jodmetan överföring.
Varning: Jodmetan är ljuskänsliga, flyktig, och potent toxin som kan skada det centrala nervsystemet eller orsakar dödsfall vid inandning eller förtäring. Diklormetan är en potentiellt cancerframkallande, reproduktions mutagen, och potent irriterande kan skada flera organ eller orsaka dödsfall. - Använd en analytisk spruta för att lägga till 105 l jodmetan till varje analyt prov. Cap analyt rören omedelbart för att minimera jodmetan avdunstning. Grundligt virvel och, om så är nödvändigt, i korthet centrifug alla prover för att säkerställa att ingen vätska finns kvar i locket. Någon färgförändring (t.ex. till brunt, lila eller gul) signalerar jodmetan nedbrytning, vilket kan äventyra följande permetylering reaktion.
- Skölj den analytiska spruta används för att överföra jodmetan med diklormetan minst 3 gånger. Detta kommer att förhindra det tillbakam igensättning. Avyttra denna sköljning, tillsammans med extra jodmetan och diklormetan i ett organiskt avfall kärl farligt. Placera används provrör i en farlig avfallsbehållare.
- Skaffa en ny uppsättning av två ml Plastbehållare rör. Ta bort snäpplock om så önskas.
- Koppla ur mikrominifilter. Centrifugera unplugged kolumner för 15 sek vid 2400 x g, och sedan kasta reservoarrören tillsammans med DMSO utflödet.
- Åter plugga centrifugespinnkolonner, och placera dem i de nya reservoarrören. Antalet varje spinnkolonn och dess motsvarande förrådsröret med samma prov nummer. Se till att minifilterpluggar är täta; potentiella läckage kan påverka nästa steg. Minimera tiden mellan avlägsna DMSO från spinnkolonner och överföra analytprov på spinnkolonner.
- permetylering
- Överför kvantitativt varje provlösning till dess motsvarande NaOH-pärla fyllda mikro spin column. Använda en 1000-mikroliter pipettspets för detta steg. Efter överföring, crimp ~ 2 mm från slutet av en 200 | j, l spets och lämna den i kolumn innehållet att använda som en omrörare. Upprepa för alla prover.
Obs: Den låga viskositeten för jodmetan kan orsaka provförlust eftersom analytlösningen kan droppa från pipettspetsen under överföringen. Håll provröret och den spinnkolonn intill varandra med en hand, och snabbt överförs provlösningen med den andra handen. - Låt permetylering reaktionen fortsätta i 11 minuter. Rör om varje prov minst 4-5 gånger under denna period. Att underlätta effektiv permetylering, vilket sker vid ytan av NaOH pärlor, använd spets-krusad gel-laddning pipettspetsar som omrörare för att försiktigt blanda kolumn innehåll. Aggressiv blandning kan punktera spinnfilter, pulverisera och avbryta NaOH pärlor (som kan minska effekten av efterföljande vätska / vätske-extraktion), och / eller orsaka provförlust (som sample indränkta NaOH granulat kan svämma över från kolonnen).
- Som förberedelse för den efterföljande vätske / vätske-extraktionssteget, förbereda en tillräcklig mängd av 0,5 M natriumklorid (NaCl) lösning i en 0,2 M natriumfosfatbuffert (pH 7,0), som skall lagras vid rumstemperatur. Varje prov kommer att kräva totalt ~ 12 ml NaCl-lösning för alla tre cykler av vätske / vätske-extraktion.
- Vid slutförandet av 11-min permetylering perioden omedelbart ännu noggrant dra kolumnerna och centrifugera dem i 15 sek vid 2400 x g. Kasta pluggarna.
- Överför kvantitativt varje provlösning till dess motsvarande NaOH-pärla fyllda mikro spin column. Använda en 1000-mikroliter pipettspets för detta steg. Efter överföring, crimp ~ 2 mm från slutet av en 200 | j, l spets och lämna den i kolumn innehållet att använda som en omrörare. Upprepa för alla prover.
- Omedelbart bort spinnkolonner från centrifugen och placera dem i en ny uppsättning av tomma spin reservoar rör, lämnar genomströmnings lösning innehållande nyligen permetylerad glykaner bakom. Kasta inte bort någonting.
- Så snart som möjligt, tillsätt 300 l acetonitril (ACN) till de torra, NaOH fyllda spinnfilter. Centrifugera spinnfilter för 30 sek vid 9600 x g.
- Immediately därefter överföra huvud permetylering lösning (dvs den lösning som inkuberades med NaOH pärlor för 11 minuter sedan spinns genom spinnfilter i ett centrifugrör före tillsats av 300 pl ACN i föregående steg) till silaniserade 13 x 100 mm provrör av glas 42 som innehåller 3,5 ml av 0,2 M natriumfosfatbuffert innehållande 0,5 M NaCl, pH 7,0 och blanda (vortex) omedelbart. Undvik att överföra någon fast vit återstod under detta steg. Gör detta för varje prov innan du fortsätter till nästa steg.
- Utan dröjsmål, överföring (kombinera) ACN spin-igenom i varje förrådsröret till (med) resten av vätskeprovet i sin respektive silaniserad glasrör och blanda (virvel) omedelbart. Återigen, undvika att överföra någon fast vit återstod under detta steg. Cap, skaka och virvelglasröret. Upprepa för varje prov. Kasta NaOH kolumner och Pasteur pipetter i lämpliga avfallsbehållare.
- Vätska / vätska ExtraInsatser och glykan Rening
- Inuti dragskåp, tillsätt 1,2 ml kloroform till varje prov. Omedelbart därefter, mössa de silaniserade glasrör och kraftigt blanda innehållet.
- Värm metallblock till cirka 75 ° C i en avdunstning grenrör. Använd värmeblock med brunnar som kan rymma 13 mm x 100 mm glasrör.
- Erhålla en ny uppsättning av silaniserade Pasteurpipetter, icke-silaniserade Pasteurpipetter och silaniserade glasprovrör med lock.
Varning: kloroform (CHCI3) är irriterande, mutagen och potentiellt cancerframkallande förmåga att tränga igenom vissa typer av handskar. - Kortfattat centrifug (~ 3000 x g) provinnehållande glasrör för att separera de vattenhaltiga och organiska skikt.
- Använda en icke-silaniserad pasteurpipett för att extrahera tillräckligt mycket av det övre vattenhaltiga skiktet så att ~ 3 mm av den vattenhaltiga skiktet förblir ovanför botten organiska skiktet.
- Tillsätt 3,5 ml av 0,5 M NaCl-lösning i en 0,2 M natriumfosfatbuffert (pH 7) till varje glasrör, kraftfullt blanda, och kort centrifug (~ 3000 x g). Liksom i föregående steg (1.4.3), använda en icke-silaniserad pasteurpipett för att extrahera vattenskiktet.
- Upprepa föregående steg (1.4.4), men lämna ~ 1 ml av vattenskiktet.
- Använd en ren silaniserad pasteurpipett att överföra det organiska skiktet till en ren och korrekt märkt silaniserad 13 x 100 mm provrör. Undvika vattenförorening genom extraktion på följande sätt:
- Håll både nuvarande och nya silaniserad provrör intill varandra i ena handen. Med den andra handen trycker pipetten glödlampa att skapa bubblor medan du sätter pipetten ner genom vattenskiktet.
- Väl inne det organiska skiktet, sluta att skapa bubblor, och hålla pipetten glödlampa stadig att låta organiska och vattenskikten för att stabilisera och separera igen. Sedan, långsamt släppa lampan att dra tillbaka så mycket av organic skikt som möjligt utan någon vattenförorening.
- Snabbt höja pipettspetsen genom det vattenhaltiga skiktet, och motstå den naturliga reflex av något frigörglödlampan (vilket resulterar i att dra tillbaka några vattenhaltig förorening) samtidigt höja pipetten ut ur röret.
- Snabbt överföra låg viskositet organiska skiktet till den intilliggande nytt rör. Någon vattenhaltig förorening kommer att vara synliga som små vätskedroppar på toppen av det extraherade organiska skiktet i de nya glasrör. Om vatten / NaCl förorening är synlig, ta bort den med en pipett; centrifugera vid behov att samla vattendropparna i en enda droppe.
- Kasta gamla glasrör, pipetter och vatten och avfallslösningar organiska. Tvätta och återvinna glas rörslock.
- Torka alla prover under en svag och konstant ström av kväve i ett förvärmt avdunstning grenrör vid 75 ° C under ~ 5 minuter inuti ett dragskåp. För att säkerställa evaporativ kylning under hela torr ned steps, en mild och konstant flöde av kväve får störa vätskeytan utan stänk eller stänker vätskan. Ta prover från indunstningen grenröret vid fullständig torkning av det slutliga provet. Vita fläckar på botten av en torkad glasrör indikerar buffert / NaCl förorening.
- Paus proceduren här om det inte finns tillräckligt med tid kvar i dag för att slutföra TFA hydrolyssteget. Tillfälligt (dvs över natten) lagra torra prover vid -20 ° C. Att fortsätta förfarandet efter lagring, ta prover från -20 ° C frys och tillåta dem att värma helt innan avtäckning.
- Medan prover varmt, som en förberedelse för trifluorättiksyra (TFA) hydrolys (nästa steg), ställa värmemanteln så att temperaturen av innehållet flytande provrörs kommer att nå 121 ° C. Förbered TFA-lösning från TFA lager (se steg 2,1 nedan).
2. trifluorättiksyra (TFA) Hydrolys
3. Reduktion 4. Acetylering (utförd i ett dragskåp) 5. gaskromatografi - masspektrometri (GC-MS) 6. Dataanalys
Varning: Natriumborhydrid (NaBH4) är en hygroskopisk, vattenreaktiva toxin och potent irriterande att utsläpp upon kontakt med vatten mycket brandfarliga ångor som orsakar allvarliga brännskador vid kontakt inandning, förtäring eller ögon / hud.
Varning: Ammoniumhydroxid (NH4OH) är en frätande irriterande och toxin som kan orsaka svåra brännskador och irreversibel organskada vid kontakt inandning, förtäring eller ögon / hud. Spola drabbade områden med vatten under 30 minuter, och förhindra att offret från att gnida eller repas de drabbade områdena.
Obs: För att skilja luftbubblor från vätskedroppar, luta provröret. Endast vätskedroppar kommer att flytta efter att luta, men det omvända är inte alltid sant: om en bubbla inte rör sig, kan det fortfarande vara en (mycket liten) vätskedroppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt jonström kromatogram (TIC) visar framgångsrik permetylering, hydrolys, reduktion och acetylering av humana blodplasmaprover i förhållande till de fall där två kritiska permetylering steg avrättades felaktigt visas i figur 3.
Absolut Utbytet av HexNAcs förhållande till hexoser:
N -acetylhexosamine (HexNAc) delvis metylerade alditol acetater (PMAAs) tenderar att ha lägre avkastning än hexoser. 43 För att uppskatta den absoluta avkastningen av HexNAcs relativt hexoser, sex 10-ig prover av N-acetyllaktosamin (en Gal1-4GlcNAc disackarid) i 10 fil vatten analyserades. TIC-toppareor för terminal galaktos (t-Gal) och 4-GlcNAc integrerades. Den procentuella andelen av 4-GlcNAc relativt den totala mängden t-Gal och 4-GlcNAc var 11,3 ± 0,7%(SEM). Även HexNAc avkastningen är reproducerbar (se nedan), det faktum att detta värde är mycket mindre än det teoretiska värdet på 0,5 indikerar att utbytet av HexNAcs är i grunden lägre än hexoser. (The HexNAc teoretiska utbytet är 0,5 eftersom N-acetyllaktosamin är en 1:. 1 hexos-HexNAc disackarid)
Intra- och interseriella:
Intra- och interseriella för alla glykan noder som bidrar minst 1% av den totala hexos eller HexNAc signal ges i tabell 1. Dessa data förvärvades av 3 separata analytiker på 3 olika dagar, med samma lager av EDTA plasma. Autosampler stabilitetsdata enligt denna optimerat protokoll för de 18 mest förekommande glykan noder i human plasma (dvs de med> 1% av den totala hexos eller HexNAc signal) ges i figur 4.
Andra Noter observationer:
Medan optimera permetylering metoden, fann vi att det inte är nödvändigt för att förhindra adsorption av vatten i NaOH pärlor Före första tvätt med acetonitril. Vi fann också att närvaro av en liten mängd vatten under det slutliga acetyleringssteget i kombination med en kort period av upphettning med ättiksyraanhydrid utan TFA hjälper till att underlätta fullständig reaktion. Slutligen är inte nödvändigt för en framgångsrik glykan nodanalys den höga upplösningsförmågan hos time-of-flight (TOF) masspektrometri: De första resultaten baserade på parallell injektion av samma uppsättning av prover på en GC-TOF-MS och en traditionell växellåda kvadrupol -baserade GC-MS som drivs i vald jon övervakning (SIM) läge visar liknande resultat när det gäller den slutliga normaliserade hexos och HexNAc relativa förekomsten.
er.within-page = "1"> 
. Figur 1. Molekylär översikt över den globala glykan förfarande metylering analys En O-kopplad glykan visas; dessa släpps under permetylering processen, som har anpassats från Goetz. 40 Efter permetylering och hydrolys, är monosackarider minskas och begynnande hydroxylgrupper "märkt" genom acetylering. Den unika mönster av metylering och acetylering i de slutliga delvis metylerade alditol acetater (PMAAs) motsvarar den unika "glykan nod" i original intakt polymer och ger den molekylära grunden för separering och kvantifiering av GC-MS. N-kopplade och glykolipid glykaner frigörs som kopplings-märkta monosackarider under syrahydrolys. Anpassad från Borges et al. 33 med tillstånd.> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Begrepps översikt av den analytiska begrepp. En uppregleras glykosyltransferas (t.ex., GnT-V) orsakar en ökning av mängden av ett specifikt, unikt kopplad glykan monosackaridåterstod (en 2,6-länkad Mannos "nod" i detta exempel) -som genom efterföljande åtgärder av andra glykosyltransferaser, kan leda till bildandet av en blandning av heterogena helhet-glykanstrukturer i ett lågt kopietal var-som alla kan vara svårt att upptäcka och kvantifiera i rutinmässigt sätt. Analytiskt samla ihop "glykan noder" bland alla avvikande glykanstrukturer ger en mer direkt surrogat mätning av GnT-V-aktivitet än någon enstaka intakta glykan. Samtidig mätning av N -, O -, och lipid kopplad "Glyc en noder "i hela biospecimens som beskrivs här (och ursprungligen annorstädes 33) representerar ett konceptuellt nya medel för att upptäcka och övervaka glykan-affektiva sjukdomar såsom cancer. Faktiska extraherade jonkromatogram från 10-mikroliter blodplasmaprover visas. Numbers intill monosackaridåterstoder i glykanstrukturer indikerar det läge vid vilket den högre återstoden är kopplat till den nedre återstod. Om inga länk positioner är indikerade i kromatogrammet annotation återstoden är antingen i den terminala positionen eller fria i lösning (t.ex., glukos). Alla rester . utom sialinsyra länk nedåt via sin 1-position; sialinsyra länkar nedåt via sin 2-ställning Split i kromatogrammet indikerar förändring av extraherade jonkromatogram: m / z 117 129 för hexos rester och m / z 116 + 158 för N - acetylhexosamine (HexNAc) rester. Anpassad från Borges et al. 33 med tillstånd.61 / 53961fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa resultat. Total jonström kromatogram (tics) för glykan nod analys av samma humant blodprov EDTA-plasma i vilken A) provet behandlats korrekt, B) den vita återstoden i permetylering lösning som spanns genom NaOH kolonnen bars in den efterföljande blandningen under vätske / vätske-extraktion, och C) den permetylering lösning som spanns genom NaOH-kolonnen sattes till fosfatbufferten men ej blandas noggrant före tillsats av kloroform för vätska / vätska-extraktion. Legend tillhandahålls i figur 2. Klicka here för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Autosampler stabilitet. Autosampler stabilitet över 48 timmar för de 18 mest förekommande glykan noder i human plasma. Vid 22 timmar provet helt torkade och rekonstituerades i 120 pl aceton. Varje kluster av datapunkter representerar fyra på varandra följande injektioner av samma prov. Svarta linjer omfattar ± 15% av den genomsnittliga normaliserade värdet för varje glykan nod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Intra- och interseriella. Värdena representerar% CV av den totala hexos eller total HexNAc-normaliserade enskilda glycan noder. Alla glycan noder som bidrar minst 1% av den totala hexos eller HexNAc signal listas. Data förvärvades av 3 separata analytiker på 3 olika dagar, med samma lager av EDTA plasma. N = 6 prover per parti. Klicka här för att ladda ner tabellen som ett Excel-ark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I allmänhet är framgångsrik produktion av delvis metylerade alditol acetater (PMAAs) från hexoser fylld med färre svårigheter och är mer robust än en framgångsrik produktion av N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Den exakta mekanismen bakom detta fenomen som utspelar sig i varje steg av detta förfarande är okänd, men måste relatera till den unika kemi N-acetyl-gruppen (snarare än hydroxylgrupp) som är unik för HexNAcs relativt hexoser. Mekanismen bakom detta fenomen eftersom det gäller syrahydrolys förklaras på annat håll. 43 Kort sagt, kapaciteten för N metylacetamido att bli positivt laddade under syrahydrolys gör glykosidbindning resistent mot syrahydrolys. Detta förklarar det låga utbytet av HexNAc relativt hexos (11,3% av den totala HexNAc + hexos-signal, snarare än 50% av det totala) såsom beskrivits ovan för analys av N-acetyllaktosamin. Noterbart är detta relativt lorn utbyte av HexNAcs inte gör dem svåra att upptäcka i komplexa Biofluids och vävnader, eller hindra enkel detektion av glykan noder som härrör från stora, komplexa glykaner (t ex 2,4-Man, 2,6-Man, 3,4,6 -man, och 3,4-GlcNAc, figur 2). 33 med tanke på det sätt på vilket XIC toppytorna för glycan noder är normaliserade (steg 6,3), så länge som den relativa utbytet av varje individuell HexNAc förblir konsekvent i förhållande till andra HexNAcs ( vilket den gör, se tabell 1), användbar information om de relativa mängderna av de olika HexNAcs mellan olika prover kan erhållas. Detta gäller för hexoser också. Dessutom har vi tidigare visat att förhållandet mellan hexoser till HexNAcs visar konsekvent kvantitativ beteende samt 33 - ett fenomen som ständigt övervakas via inkorporering av QC prov (er) i varje sats.
Det sätt på vilket permetylering utförs har störst påverkan pådet totala utbytet och reproducerbarhet HexNAc PMAAs. Framför allt bör stor försiktighet vidtas för att helt undvika exponering av permetylerad glykaner att alkalisk vattenförhållanden. Två viktiga steg i detta avseende är en) lämnar alla vit fällning i spin-genom lösningar bakom (steg 1.3.13 och 1.3.14), och 2) omedelbart blanda spin-genom lösningar när de tillsätts till fosfatbuffert ( steg 1.3.13 och 1.3.14). En buffert i stället för enkelt salt lösning ingår i detta skede och för efterföljande vätska / vätska extraktionssteg för att förhindra oavsiktlig alkalisering av den vattenhaltiga lösningen. Vi misstänker att under alkaliska betingelser acetylgruppen av den metylerade och acetylerade 2-aminogruppen i HexNAcs kan genomgå hydrolys, vilket resulterar i en mer polär sekundär amin som minskar den totala extraktionseffektiviteten hos den tillhörande glykan i kloroform.
Den mest lätt att känna igen drag av framgång permetylerad HexNAcs ärintensiteten av 4-bunden GlcNAc (4-GlcNAc) kromatografiska toppen i förhållande till de av 6-Gal, 3,6-Man, och baslinjen intensiteten hos bakgrunden under sista kolumnen bake-out (Figur 3). När den absoluta överflöd av 4-GlcNAc PMAA är låg, dess normaliserade överflöd i förhållande till alla andra HexNAcs tenderar också att vara låg, med en samtidig ökning (mest märkbart) av 3,4-GlcNAc.
Några förändringar som syftar till att optimera totala utbytet och analys robusthet har gjorts sedan vår första publikation som beskriver denna analytiska metod 33 En av dessa förändringar är det sätt på vilket de integrerade extraherade jonkromatogram (XICs) normaliseras. För enkelhetens skull, vi nu dela upp området för varje enskild hexos XIC med summan av alla hexos XIC områden; Likaså är det område av varje enskild HexNAc XIC dividerat med summan av alla HexNAc XIC områden. Som framgår av tabell 1, övergripande interassay / inter-analytiker reproducibilheten för alla glykan noder som bidrar till> 1% av deras respektive hexos eller HexNAc signal genomsnitt 13% CV.
Såvitt vi vet är detta den enda inkarnation av verkligt bottom-up glycomics där glykaner först uppdelade och sedan deras komponenter analyseras för att konstruera en kvantitativ prov omfattande porträtt av glykan komposition. Här, i stället för traditionell enzymatisk frisättning, icke-reduktivt eliminerar permetylering processen (utsläpp) O-kopplade glykaner från sina respektive proteiner, 40, medan N-kopplade glykaner frigörs under syrahydrolys. 33 Som ett komplement till traditionella top-down glycomics , är detta tillvägagångssätt kunna samla unika glykan egenskaper av intresse som "kärn fukosylering", "sex-sialylering", "skär GlcNAc" och "beta 1-6 förgrening" i enstaka analytiska signaler (se, 4,6-GlcNAc , 6-Gal, 3,4,6-Man och 2,6-Man noder i figur 2, respectively). I traditionella top-down metoder, är funktioner som dessa som i slutändan beror på de unika verksamhet en eller två nyckel glykosyltransferaser 33 typiskt fördelade över dussintals intakta glykaner och kan ibland vara svårt eller omöjligt att lösa (t.ex. 3-sialylering vs. 6-sialylering) på grund av degenereringen av vissa intakta glykan massorna. Dessutom har underifrånperspektiv som presenteras här visade initialt löfte i icke-invasivt upptäcka lungcancer. 33 Ytterligare studier pågår för att validera dessa första resultat, liksom ytterligare, ännu opublicerade resultat som hänför sig till upptäckt av andra former av cancer.
Den största begränsningen av den metod som beskrivs här är att det är begränsad i termer av dess detektionsgränser, om det skulle tillämpas på i förväg isolerade glykoproteiner. Baserat på opublicerade analyser av enskilda glykan standarder utan bärarprotein, gränserna för kvantifiering for enskilda glykaner förefaller att ligga i den låga mikrogram intervallet. Dessa är ingalunda låga LOQs i absoluta termer, men detta faktum spelar ingen roll när det gäller den ursprungligen avsedda omfattningen av analysen, som inte var avsedd för och har inget behov av att uppnå låga LOQs (åtminstone för de ändamål som beskrivs här och i vår tidigare publikation 33). I själva verket innehåller human plasma / serum glykoproteiner i 10s mg / ml koncentration intervall vilket innebär att vi för analys av blodplasma / serum injicera ~ 1/100: e av den slutliga provvolym och dela 40 av 41 delar som liten mängd till spillo i GC injektorn porten. Utan denna praxis, kan några av de glycan noderna mätta detektorn. Pikomol mängder glykoproteiner som kan producera tillräckligt intakta glykan signaler genom konventionell top-down MALDI-MS eller LC-MS baserade metoder inte kan upptäckas med detta tillvägagångssätt. Ytterligare förfining av metoden pågår för att råda bot på denna begränsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium hydroxide beads | 367176 | Sigma-Aldrich | 20-40 mesh, reagent grade 97% |
| 0.9 ml Spin column | 69705 | Pierce division of ThermoFisher Scientific | Includes plugs and polyethylene frits |
| GC-MS autosampler vial (silanized)* | C4000-9 | ThermoFisher Scientific | Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, includes Teflon-lined pierceable caps |
| 1.5 ml polypropylene test tubes | 05-402-25 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
| 2 ml polypropylene test tubes | 05-408-138 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D8418 | Sigma-Aldrich | BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0% |
| Iodomethane | I8507 | Sigma-Aldrich | Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99% |
| Acetonitrile | A955-4 | ThermoFisher Scientific | Optima LC/MS |
| Microcentrifuge | 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424 |
| 13 x 100 glass test tube (silanized)* | 53283-800 | VWR | 13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish |
| Caps for glass test tubes | 14-930-15D | ThermoFisher Scientific | Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner. |
| Sodium chloride | S7653 | Sigma-Aldrich | >99.5% pure |
| Chloroform | 4440-08 | Macron Fine Chemicals | |
| Trifluoroacetic acid | 299537 | Sigma-Aldrich | 99% purified by redistillation for protein sequencing |
| Sodium borohydride | 71321 | Fluka Analytical | 99% |
| Ammonium hydroxide solution | 320145 | Sigma-Aldrich | NH3 content: 28.0-30.0% |
| Methanol | AH230-4 | Honeywell Burdick & Jackson | HPLC grade |
| Acetic acid | 320099 | Sigma-Aldrich | 99.70% |
| Plastic vacuum desiccator | Any model of adequate size | FoodSaver | |
| Acetic anhydride | 539996 | Sigma-Aldrich | 99.50% |
| Dichloromethane | D143SK-4 | ThermoFisher Scientific | Stabilized HPLC grade |
| Acetone | 9006-03 | J.T.Baker | Baker Analyzed |
| Heated evaporation manifold (main unit) | pi18823 | ThermoFisher Scientific | Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function |
| Heated evaporation manifold (overhead evaporator) | pi18826 | ThermoFisher Scientific | ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module |
| Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold | pi18816 | ThermoFisher Scientific | Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13 mm dia test tubes, 13 holes (14 mm dia. x 45 mm deep) |
| Gas chromatograph | Model A7890 | Agilent | Equipped with CTC PAL autosampler |
| Mass spectrometer | GCT Premier (Time-of-Flight) | Waters | |
| Split-mode liner (deactivated / silanized) | 5183-4647 | Agilent | Containing a small plug of silanized glass wool |
| DB-5ms GC column | 122-5532 | Agilent | 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness |
| Chlorotrimethylsilane | 95541 | Sigma-Aldrich | |
| Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) | EW-06536-30 | Cole-Parmer | 12" wide; 230 mm plate size |
| *Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator. | |||
References
- Li, M., Song, L., Qin, X. Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines. J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).
- Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans (2009).
- Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
- Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).
- Rini, J., Esko, J., Varki, A. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).
- Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer. Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).
- An, H. J., et al. Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer. J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).
- Kanoh, Y., et al. Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression. Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).
- Kyselova, Z., et al. Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer. J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).
- Okuyama, N., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation. Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).
- Zhao, J., et al. Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera. J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).
- Comunale, M. A., et al. Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma. J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).
- Goldman, R., et al. Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis. Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).
- Aurer, I., et al. Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma. Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).
- Abd Hamid, U. M., et al. A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression. Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).
- Kyselova, Z., et al. Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles. Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).
- Hongsachart, P., et al. Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma. Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).
- Arnold, J. N., et al. Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer. J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).
- Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).
- Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival. Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).
- Chen, G., et al. Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer. J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).
- Takeda, Y., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer. Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).
- Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
- Mehta, A. S., et al. Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis. J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).
- Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation. Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).
- Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. Genomics and epigenomics of the human glycome. Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Tuccillo, F. M., et al. Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43. Biomed Res Int. , (2014).
- Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).
- Brockhausen, I. Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions. EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).
- Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens. Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).
- Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography. J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).
- Ciucanu, I., Caprita, R. Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis. Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).
- Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).
- Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis. Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).
- Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).
- Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells. Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).
- Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity. Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).
- Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).
- Seed, B.
- Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen. Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).
