Summary
We presenteren eenvoudige technieken voor het isoleren van giant transcriptioneel actieve lampbrush chromosomen van levende eicellen van kikkers en salamanders. We beschrijven hoe deze chromosomen "levend" te observeren door fase contrast of differentieel interferentie contrast, en hoe ze op te lossen voor fluorescentie in situ hybridisatie of immunofluorescentiekleuring.
Abstract
We beschrijven methoden voor het bestuderen van de reus transcriptioneel actieve lampbrush chromosomen (LBCs) gevonden in de eicel, of unlaid ei, kikkers en salamanders. Individuele LBCs kan tot 1 mm lang en ze verblijven in een gigantische kern, zich tot 0,5 mm in diameter. De grote omvang van de chromosomen maakt ongeëvenaarde opmerkingen van actieve genen door licht optische microscopie, maar tegelijkertijd speciale technieken vereist voor het isoleren van de kern, het verwijderen van de nucleaire envelop, en gespreid chromosomen op een microscoopglaasje. De eicel kern, ook wel de germinale vesicle (GV) wordt geïsoleerd in een medium dat gedeeltelijke gelering van de nucleaire actine maakt en behoudt de delicate structuur van de LBCs. Deze stap wordt handmatig uitgevoerd onder een dissectie microscoop behulp van een tang juwelier. Vervolgens wordt de kern envelop verwijderd, weer handmatig met een pincet juwelier. De nucleaire inhoud snel overgebracht in een medium dat Vervenrses het actine gel en laat de onbeschadigde LBCs om zich te vestigen op een microscoopglaasje. Op dit punt is de LBCs en andere nucleaire organellen kunnen worden bekeken door fase contrast of differentieel interferentie contrast microscopie, hoewel de fijnere details worden verduisterd door de Brownse beweging. Voor hoge resolutie microscopische observatie of moleculaire analyse, wordt de hele voorbereiding gecentrifugeerd om de delicate LBCs stevig hechten aan de dia. Een korte fixatie in paraformaldehyde wordt gevolgd door immunofluorescentie kleuring of in situ hybridisatie. LBCs zijn in een transcriptioneel actieve toestand en hun enorme omvang toelaat moleculaire analyse op individueel gen-niveau met behulp van confocale of super-resolutie microscopie.
Introduction
De meeste gewervelde dieren, met de opmerkelijke uitzondering van buideldieren en zoogdieren, produceren grote Yolky eieren. Ondanks de soms enorme omvang, deze eieren zijn enkele cellen die hun definitieve dimensie, terwijl nog steeds te bereiken in de eierstok van de vrouw. Ovariële eieren worden eicellen genoemd en elk bevat meestal een enkele gigantische kern, bekend sinds het begin van de 19 e eeuw als de kiemblaasje of gewoon GV. 1 Eicellen conventionele laboratorium kikker, Xenopus laevis en Xenopus tropicalis, bereikt een maximale diameter van 1,2 mm en 0,8 mm respectievelijk (figuur 1). De GVS van rijpe oöcyten van deze twee kikkers 0,3-0,4 mm in diameter (figuren 2, 3). Salamanders hebben meestal nog groter eicellen en GVS. Volledig rijpe eicellen van de Mexicaanse axolotl, Ambystoma mexicanum, zijn meer dan 2 mm in diameter en de GV is ongeveer 0,5 mm. Aldus zijn deze kernen gemakkelijk met het blote oog en kanworden gemanipuleerd vele manieren die onmogelijk zijn bij de kernen van typische somatische cellen.
Even opmerkelijk is de gigantische omvang van de chromosomen binnen de GV, een feit reeds erkend aan het eind van de 19 e eeuw. Individuele chromosomen van Ambystoma en andere salamanders kan tot 1 mm (figuren 4, 5). Die van Xenopus aanzienlijk kleiner, maar met een lengte tot 100 urn of meer, ze dwerg typische somatische chromosomen van de meeste organismen. Een belangrijk kenmerk van eicel chromosomen hun buitengewone transcriptionele activiteit, wat leidt tot een van de meest karakteristieke morfologische kenmerken - honderden gepaarde zijdelingse lussen (Figuur 5). Elke lus bestaat uit één of enkele transcriptie-eenheden die actief RNA synthetiseren. De lussen geven eicel chromosomen een fuzzy verschijning, waardoor de naam "lampbrush" chromosoom na oppervlakkigegelijkenis met de borstels die vroeger kerosine lamp schoorstenen reinigen. 2
De focus van dit artikel is op het gebruik van geïsoleerde GVS tot LBCs en nucleaire organellen (nucleoli, histone locus lichamen, en spikkels) te bestuderen. Nogal verschillende technieken worden beschreven. In de eerste, meer gebruikelijke techniek worden geïsoleerd GVS in een zoutoplossing met behulp van een tang juwelier kort gespoeld om aanhechtende dooier te verwijderen, en de nucleaire envelop is verwijderd, opnieuw met forceps juwelen. Het gelatineuze inhoud met het LBCs en nucleaire organellen, bezinken op een glazen microscoopglaasje of dekglaasje. Dergelijke preparaten kunnen rechtstreeks door fase contrast of DIC microscopie worden onderzocht. Als alternatief kunnen de voorbereidingen worden gecentrifugeerd om de LBCs en organellen hechten aan de dia of dekglaasje. Dergelijke preparaten kunnen dan worden verwerkt voor gedetailleerde moleculaire analyse van nucleïnezuren en eiwitten, voornamelijk door immunofluorescentie en fluorescent in situ hybridisatie (FISH). 3-7
Een tweede techniek betreft het isoleren van het GV in minerale olie. 8-olie geïsoleerd GVS transcriptioneel actief blijven vele uren en mogelijk bruikbaar voor studies wanneer men wil de nucleaire inhoud zo levensecht mogelijk zijn. 9,10 Omdat de brekingsindex van de nucleaire "sap" is dicht bij die van de LBCs en andere nucleaire organellen (figuur 3), kunnen microscopische technieken een uitdaging met olie geïsoleerd GVS zijn.
Tenslotte, vanwege hun grootte en het gemak van manipulatie, GVS ideaal materiaal voor onderzoek naar de nucleaire enveloppe. De porie complex kern werd eerst beschreven door elektronenmicroscopische studies amfibie GV enveloppen 11 en recentere superresolutie waarnemingen hetzelfde materiaal gebruikt. 12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Algemene informatie over kikkers en salamanders, evenals bronnen van dieren, kunt u vinden op de volgende websites: Xenbase (http://www.xenbase.org) en Sal-Site (http://www.ambystoma.org). Dit protocol volgt het dier zorg richtlijnen van de Embryologie van het Carnegie Institution for Science.
1. Oplossingen
- Maak 10 L "kikker water": Voeg 10 ml 1 M CaCl2 en 10 ml 1 M NaHCO 3-10 L gedemineraliseerd of chloorvrij H 2 O onder roeren.
- Maak 1 L 20% paraformaldehyde: maak 1 L van 4 mM Na 2 CO 3. In een chemische kap voeg 200 g poedervormig paraformaldehyde, en verhit tot ongeveer 80 ° C op te lossen. Cool, en filter door het filter papier. Let op: paraformaldehyde is giftig en moet met zorg worden behandeld. Als alternatief, de aankoop van commerciële paraformaldehyde oplossing.
- Maak 1 L amfibie verdoving oplossing: Voeg 1,5 g ethyl-3-aminobenZoate methaansulfonaat tot 1 L kikker water. Bewaren bij kamertemperatuur.
- Voeg 1 L eicel kweekmedium OR2 14: 82,5 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, 5 mM HEPES (500 mM stock, pH 8,3). De eind pH is ongeveer pH 7,8. Voeg 100 mg ampicilline en 100 mg streptomycine om bacteriegroei te voorkomen.
- Maak 1 L GV isolatie oplossing: 83 mM KCl, 17 mM NaCl, 6,5 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mm KH 2 PO 4, 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT). Op pH 7,0.
- Voeg 100 ml GV dispersie-oplossing: 20,7 mM KCI, 4,3 mM NaCl, 1,6 mM Na 2 HPO 4, 0,9 mM KH 2PO 4, 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0,1% paraformaldehyde. Op pH 7,0. Om een snellere verspreiding van de nucleaire gel te vergemakkelijken, voeg 10-50 pM CaCl2.
- Voeg 500 ml subbing oplossing. Swell 0,5 g gelatine in commerciële 20 mL H2O gedurende 5-10 min. Voeg 500 ml kokende H2O en voorzichtig wervelen de gelatine oplossen. Koel af en voeg 50 mg CRK (SO 4) 2 · 12 H 2 O. Filter met afzuiging en bewaar bij 4 ° C.
- Maak 10 ml montage medium. Los 10 mg fenyleendiamine in 5 ml PBS (135 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 4,3 mM Na 2 HPO 4, 1,5 mM KH 2PO 4, pH 9). Voeg 5 ml glycerol. Winkel in 250 ul fracties bij -80 o C.
2. Materialen
- Voor subbed dia's, plaats 3 inch x 1 inch glas microscoopglaasjes in een commercieel reinigingsmiddel en wrijf ze om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Leg ze in een glijbaan rack en goed spoelen in leidingwater en vervolgens in gedemineraliseerd water. Dompel de substraatlaag oplossing, afvoer schuin en bak nacht bij 60 oC
- Voor kunststof vierkantjes gesneden 25 mm vierkantjes van een vel van 1 mm dik poly (methylmethacrylaat). boor een5 mm rond gat in het midden van elk vierkant. Zand beide vlakken en de randen van het vierkant en de omtrek van het gat.
Opmerking: Als alternatief voor zelfgemaakte kunststof vierkanten en goed glijdt, zoals beschreven in de volgende paragraaf, commercieel gebruik lijm in situ PCR en hybridisatie kamers (25 ui). Men kan waarschijnlijk ook herbruikbare siliconen isolatoren voor celkweek, hoewel dit niet grondig getest nog. - Voor goed slides smelt 20 - 30 g paraffinewas (56-57 ° C) in een 50 ml bekerglas op een hete plaat. Met een 20 ul pipet verdeeld een 5 ul druppel paraffine aan weerszijden van het midden van een gesubstreerde dia. Druk op een plastic plein in de paraffine en plaats de schuif op de hete plaat. De paraffine zal smelten en moet gelijkmatig verdeeld onder de plastic plein.
- Verwijder de dia uit de hete plaat en laat het afkoelen. Een steun onder elk uiteinde van de schuif, zodat de slede niet raakt tabletop tijdens het afkoelen. Als de paraffine te snel afkoelt, kan het van het centrale gat te trekken. Bereid 10 of meer goed schuiven: elke GV voorbereiding maakt gebruik van een nieuwe put dia.
- Voor dia dragers voor centrifugeren, gebruik speciaal geconstrueerde dragers voor de rotor gebruikt. Diverse fabrikanten bieden centrifuges met dragers voor 96 - zowel plastic platen. Deze dragers kunnen vrij gemakkelijk worden aangepast om objectglaasjes te houden.
3. Isolatie van Eicellen
- Plaats een volwassen vrouwelijke kikker (Xenopus laevis of Xenopus tropicalis) of salamander (Ambystoma mexicanum) in voldoende verdoving oplossing voor het dier volledig te bedekken. Als het dier beweging ophoudt, plaats het belly-up op een bed van afgebroken ijs in een geschikte houder.
- Met chirurgische schaar maak een 2 - 3 cm incisie in de onderbuik lateraal van de middellijn. Verplaats de inwendige organen voorzichtig opzij om de eierstok aan de zijde van de incisie te vinden (there twee eierstokken, een aan elke zijde van de buik). Snijd een gedeelte van de eierstok voldoende eicellen van de voorgeschreven experimenten. Aangezien er duizenden oöcyten in elke eierstok, een relatief klein stukje eierstok - zal (1 cm 3) gewoonlijk voldoende.
- Plaats een of enkele stukken eierstok OR2 zoutoplossing in een grote petrischaal (100 mm) bij kamertemperatuur. Eicellen kunnen worden opgeslagen in goede staat voor meerdere dagen, als ze beschadigd eicellen worden verwijderd en de OR2 oplossing wordt dagelijks verschoond.
- Hechtdraad de incisie met chirurgische zijde en de terugkeer van de dieren aan een individuele glazen kom voor herstel. Voeg net genoeg "kikker water" om het dier in kwestie tot het bewustzijn (ongeveer 15 min) herwint. Nadat het dier toont willekeurige bewegingen, vul de schaal met water. Hoewel zoet water moet worden gebruikt, steriliteit is niet nodig, aangezien amfibieën bijna nooit besmet na de operatie te worden. Desgewenst kan neomycine worden toegepast op de hechtingen. De wond geneest meestal volledig na een few dagen en hetzelfde dier weer worden gebruikt na ongeveer 2 maanden.
4. Isolatie van een kiemblaasje (GV)
- Plaats een deel van eierstok (10-20 grote eicellen) in een kleine petrischaal (35 x 10 mm) bevattende OR2 oplossing.
- Verwijder een eicel uit de eierstok gebruik van twee paar pincetten # 5 juwelier de dunne stengel van weefsel dat de eicel aansluit op de eierstok muur scheurt. Plaats de eicel in een petrischaaltje met GV isolatiemedium.
OPMERKING: De staat van het LBCs afhankelijk van de grootte (looptijd) van de eicel. LBCs bereiken maximale lengte met prominente lussen in oöcyten die iets minder dan de volledige grootte zijn. De meest volwassen eicellen bevatten vaak korte chromosomen met gecontracteerde loops. - Voer de volgende stappen onder lage vergroting van een dissectie microscoop (veld een diameter van ongeveer 10 - 20 mm).
- Pak de eicel met beide paren tang in de buurt van het dier paal (donker halfrond) en maak een smalle scheuren. Kijk in de geëxtrudeerde dooier voor de transparante eicel kern, ook wel de kiemblaasje of GV.
- Als alternatief poke een groot gat in de buurt van het dier paal met een pincet en knijp de GV samen met dooier (figuur 2).
- Schud de GV van het grootste deel van de dooier. Meestal is er een kleine hoeveelheid dooier sterk gebonden aan de GV zal zijn.
5. Verwijdering van de Nuclear Envelope
- X. laevis en X. tropicalis, breng de GV van het isolatiemedium om verspreiding medium binnen 60 s van isolatie, zelfs als er nog een beetje hechtende dooier.
LET OP: GVS van deze twee soorten "verharden" binnen ongeveer 60 seconden als links in de isolatie medium en zal niet verspreid in de volgende stappen. Dus snelheid is van het allergrootste belang bij het onderzoek van Xenopus GV inhoud.- Pak de kern envelop in de buurt van de top van de GV met een paartang juwelier, zorg niet te worden ingedrukt. Pak de envelop met een tweede tang zo dicht mogelijk bij de eerste mogelijk. Trek de twee paar pincetten afstand van elkaar en de GV inhoud zal "pop" uit vrij van de envelop, die stevig hecht aan één of beide tangen.
- Pak de GV inhoud in een glas pipet of een instelbare 20 pl micropipet. Als via instelbare pipet, zet de pipet 10 pi en afgesneden einde van de plastic tip met een scheermesje. Trekken 5 ul vloeistof voor het oppakken van de GV in de resterende 5 ul.
- Breng de gegeleerde nucleaire inhoud naar het centrum van een goed slede vooraf gevuld met spreidende oplossing. Verspreiding oplossing moet een convex oppervlak, zodat een bel niet vastzit wanneer het dekglaasje wordt toegevoegd.
- Voeg een dekglaasje (18 mm) en plaats de dia in een vochtige kamer. De nucleaire gel langzaam dispergeren over de volgende 10-60 min, waardoor het chromosooms en nucleaire organellen komen op het oppervlak van het glasplaatje te liggen.
LET OP: GVS van de salamanders A. mexicanum en N. viridescens niet "verharden" ten onrechte in de isolatie medium. Daarom kan men overgaan meer ontspannen met het verwijderen van de nucleaire envelop dan één blikje met Xenopus.
- Verwijder de kern envelop uit een salamander GV zoals beschreven in paragraaf 5.1.1, maar doen dat in de isolatie medium.
- Pak de enigszins gegeleerde GV inhoud met een pipet en over te dragen aan een petrischaaltje met het verspreiden oplossing.
- Snel spoel de pipet tip in de verspreiding oplossing, pak de nucleaire gel, en plaats het in het midden van een goed dia vooraf gevuld met het verspreiden oplossing. Voeg een 18 mm dekglaasje en plaats de gehele dia in een vochtige kamer. De nucleaire sap zal langzaam verspreiden in de komende 10-60 min en de chromosomen en nucleaire organellen zal komen op de glasplaat te liggen. </ Ol>
6. Voorlopige Waarneming van LBCs en Celorganellen
- Bekijk de LBCs en nucleaire organellen door fase contrast (conventionele rechtopstaande microscoop) bij een lage vergroting na de verspreiding van de nucleaire inhoud in de verspreiding kamer. Omdat de kamer is ongeveer 1 mm diep en nucleaire inhoud onderaan, gebruik een lage objectiefvergroting met een lange werkafstand (5X - 10X).
OPMERKING: De belangrijkste reden voor het onderzoek van het preparaat op dit moment te bepalen of het de moeite waard het uitvoeren door de volgende stappen. In een goede voorbereiding van de chromosomen zijn ongebroken en hebben zich aan de bodem van de kamer. Ga verder met het centrifugeren stap binnen een uur na het maken van de voorbereiding, omdat dit zal zorgen voor een optimale hechting van de lampbrush chromosoom lussen aan de dia.
7. centrifugeren van de Nuclear Inhoud
- Leg een stuk filter papier op de dekglaasje en drukom overtollige vloeistof te verwijderen uit de kamer.
- Zet ongeveer 1 mm 3 vaseline aan elke kant van het dekglaasje. Smelt de vaseline met een metalen staaf verhit tot ongeveer 70-80 ° C om het dekglaasje af te dichten op de onderliggende kunststof vierkant.
- Plaats dia's in de dia dragers voor centrifugeren, ervoor te zorgen dat tegenover de vervoerders in balans zijn. Centrifugeer de objectglaasjes bij ongeveer 4800 g gedurende 30 minuten - 1 uur. bij 4 ° C. Gebruik de trage start functie op de centrifuge.
8. Bevestiging van de Nuclear Inhoud
- Voor de meeste latere procedures, bevestig de nucleaire inhoud met paraformaldehyde.
- Zet een dia rack in een standaard microscoopglaasje kleuring schotel en plaats dan de dia's afzonderlijk in het rek. Voeg genoeg fixatief op de objectglaasjes dekking (2 - 4% paraformaldehyde in PBS of OR2).
- Met een paar stompe tang, duw de dekglaasje lateraal, pak het op en gooi het in de juiste glas prullenbak.Laat dia in het fixeermiddel gedurende minstens 15-30 minuten. Voor in situ hybridisatie en meest antilichaam vlekken, langere periodes van fixatie (h of d) zijn toegestaan.
- Om de plastic plein te verwijderen, plaats schuift één tegelijk in ijskoud OR2 of PBS in een kleuring schotel. Steek een scherp scheermesje aan de rand van de plastic plein en wrikken het los.
LET OP: In het ideale geval zal het plastic eraf netjes komen, waardoor alle paraffine op de dia. De was wordt een nuttig doel: omdat het omringt het kleine centrale gebied waar de nucleaire inhoud zijn bevestigd aan de dia, het fungeert als een dam die het mogelijk maakt om te werken met kleine volumes (5-10 pi) van reagentia voor immunokleuring, etc. Dia's kunnen voor onbepaalde tijd worden gehouden in koude OR2 of PBS.
9. Immunokleuring van LBCs en Nucleaire Celorganellen
- Verwijder vaste GV voorbereiding van opslag in OR2 of PBS. Veeg overtollige vloeistof en plaats op steunen in een vochtige kamer. Een handige chamber is een 90 x 15 mm petrischaal die een 90 mm cirkel vochtig filterpapier.
LET OP: Op dit punt het nucleaire inhoud stevig aan de dia in een 5 mm cirkelvormig gebied vrij van paraffine. Omdat de was waterafstotend, kan men oplossingen wijzigen door het toevoegen en verwijderen van kleine hoeveelheden vloeistof aan de rand van het centrale gebied met een 20 pi pipet. De belangrijkste voorzorgsmaatregel is om te voorkomen dat het aanraken van de wax-vrij gebied met de pipet tip. - Het uitvoeren van immunokleuring met kleine volumes (10 - 20 pi) van de reagentia. Omdat de chromosomen en nucleaire organellen zijn zeer klein en in direct contact met toegevoegde reagentia kunnen kleuringsprotocollen kort zijn. Primaire en secundaire antilichaam kleuring tijd zo kort als 1 uur bedragen. Neem geen detergent in elke stap, want dit veroorzaakt schade aan de voorbereiding. Desgewenst vlek het preparaat met DAPI (1 ug / ml) gedurende 10 - 20 min aan de assen van de LBCs accentueren.
- Mount in glycerol of een commercieel mounting medium dat geschikt is voor immunofluorescentie. Om te voorkomen dat het vangen van een luchtbel tijdens de montage stap, gaat u als volgt.
- Trek 15 pi van fixeermiddel in de punt van een pipet 20 ul. Verwijder zoveel vloeistof als mogelijk uit de directe omgeving van de nucleaire verspreiding door "wicking" af met een stukje filterpapier (gesneden in de vorm van een zeer dunne driehoek van een 90 mm kring van # 1 filter papier).
- Pipetteer de meeste van de montage medium op de voorbereiding, en let op het gebied van de nucleaire verspreiding niet aan te raken. Plaats de laatste 1 pi of zo van fixeermiddel in het midden van een 22 mm dekglaasje (dikte # 1,5). Keer de dekglaasje over de voorbereiding en drop voorzichtig op zijn plaats.
- Voor tijdelijke mounts, tot enkele dagen, gebruik 1 mg / ml fenyleendiamine in 50% glycerol. Voor permanente mounts, vooral voor superresolutie studies, gebruik een lage fluorescentie-middel dat hardt uit tot een brekingsindex van ongeveer 1,46.
10. Fluorescent in situ hybridisatie (FISH) van LBCs en Nucleaire Celorganellen
- Omdat FISH protocollen meestal een stap bij verhoogde temperatuur nodig, verwijder de paraffine van de voorbereiding. Voorzichtig schrapen met een scheermesje, hoewel de procedure is vervelend en kan leiden tot onbedoelde beschadiging van het preparaat. Het is nuttig om het gebied van het preparaat op de achterkant van de slede met een diamant te markeren.
- Als alternatief, ontbinding van de paraffine met xyleen. Het opzetten van een reeks Coplin potten of vlekken platen met: 30%, 50%, 70%, 95% en 100% ethanol; 3 containers xyleen; 2 meer containers van 100% ethanol en een aceton.
- Plaats dia's in de dia drager en drogen ze in de ethanol-serie, waardoor slides 3-5 min in elke concentratie (kortere tijden indien geagiteerd).
- Los de paraffinewas door het passeren van de schuiven door de houders 3 xyleen, ongeveer 5 minuten elk indien geroerd. Verwijder dexyleen door het passeren door middel van twee 100% ethanolen, en tenslotte wordt de ethanol met aceton. Neem de dia's uit aceton en kantel ze drogen.
- Uit te voeren in situ hybridisatie met behulp van een standaard protocol. 15,16
11. Isolatie van een GV onder Oil
- Pick-up van een eicel uit de OR2 oplossing met een tang juwelier, met inbegrip van zo weinig omringende weefsel mogelijk. Plaats de eicel op een klein stukje van de # 1 filterpapier. Overmaat OR2 oplossing overgaan naar het filterpapier, waarbij de eicel nagenoeg vrij van vloeistof. Pak de "droge" eicel en plaats het onder het oppervlak van lichte minerale olie (paraffineolie) in een kleine petrischaal (35 x 10 mm).
- Met een fijne wolfraam naald of een tand van de tang, porren een klein gaatje in de eicel in de buurt van de donkere dier paal. Pak de eicel met een pincet (het vermijden van de tips) en knijp zachtjes. De GV zal extruderen samen met een kleinere of lArger hoeveelheid dooier op zijn oppervlak (figuur 3).
- Verwijder zoveel mogelijk dooier door voorzichtig vegen de GV met de zijkant van de tang. In de meeste gevallen zal het moeilijk zijn om alle dooier te verwijderen. Voor de meeste doeleinden een kleine hoeveelheid dooier is geen probleem.
- De inhoud GV observeren, plat de GV in meer of mindere mate.
- Verwijder de plastic plein van een goed glijbaan en gebruik maken van de resterende paraffine als een ondiep vergaarbak voor paraffineolie. 10 Pak de GV samen met paraffineolie in een 20 ul pipet overgebracht naar het midden van de paraffine gebied. Voeg een dekglaasje en de inhoud van de gedeeltelijk afgeplatte GV observeren. Deze techniek is niet de LBCs beschadigen.
- Als alternatief, plat de GV tot ongeveer 10 micrometer dik voor observatie van de nucleaire organellen.
- Snijd de laatste 1 mm van een plastic pipet tip met een scherp scheermesje. Zuigen de GV in detip samen met precies 5 pl minerale olie. Extrusie van de GV en de olie op het midden van een 22 mm glazen dekglaasje.
- Verlaag een standaard 3 "x 1" glasplaatje langzaam tot het net raakt de olie te laten vallen. De daling en dekglaasje wordt door capillariteit worden opgeheven en de olie zal uitbreiden naar de randen van het dekglaasje. Wanneer de druppel volledig is verspreid, zal de olie ongeveer 10 urn dik. De LBCs beschadigd en grote nucleoli enigszins worden samengedrukt, maar de meeste kleinere nucleaire organellen min of meer weergegeven zoals die in de intacte GV (figuur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om gigantische lampbrush chromosomen onderzoeken begint men door het isoleren van eicellen van een kikker of salamander. Figuur 1 toont een groep van rijpe oöcyten in een gebufferde zoutoplossing na verwijdering uit de eierstok van de kikker, Xenopus. Dergelijke eicellen blijft in goede conditie voor dagen bij kamertemperatuur. De kern (of kiemblaasje) wordt vervolgens uit een oöcyt met een pincet juwelier verwijderd, hetzij in een zoutoplossing (figuur 2) of in olie (figuur 3). De nucleaire inhoud van een olie geïsoleerd kern kan worden onderzocht door voorzichtig pletten van de kern en het observeren van fase contrast of differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie. Om de inhoud van een kern die is geïsoleerd in een zoutoplossing te onderzoeken, moet men eerst de nucleaire envelop met een tang juwelier en laat de inhoud om zich te vestigen op een microscoopglaasje. Het preparaat wordt vervolgens gecentrifugeerd om t bevestigenHij chromosomen stevig aan de slede, waarna de chromosomen kan worden gekleurd met een antilichaam (figuur 4) of onderworpen aan in situ hybridisatie. Lampbrush de chromosomen van salamanders zijn veel groter dan die van kikkers (figuur 5). In beide gevallen afzonderlijke transcriptie-eenheden (genen) kan worden gezien als lussen van chromatine zijdelings uitsteekt uit het chromosoom as.
Figuur 1: De rijpe eicellen uit de Frog X. tropicalis. De eierstok van een volwassen vrouwelijke kikker bevat duizenden oöcyten in verschillende stadia van rijping. De kleinste zijn de omvang van somatische cellen en al profase van de eerste meiotische deling bereikt. Als de eicel groeit, het geleidelijk accumuleert dooier, waarbij de cel een ondoorzichtige witte uitstraling geeft. De grootste mature eicellen, hier afgebeeld, het verwerven van een donkere muts door de ophoping van melanine pigment. De grootste oöcyten van X. tropicalis ongeveer 0,8 mm in diameter, die van X. laevis ongeveer 1,4 mm, terwijl die van de axolotl is een enorme 2,2 mm. Behalve size, alle drie zijn vergelijkbaar in uiterlijk. Schaal bar = 1 mm.
Figuur 2: Het verwijderen van de GV uit een Eicel van X. tropicalis. Links. Een klein gat werd gemaakt met een tang juwelier in de donkere dier pool van een eicel en de GV werd voorzichtig geëxtrudeerd. In dit voorbeeld was de GV nagenoeg vrij van dooier als het kwam uit de eicel. Hechtende dooier kan worden verwijderd door zuigen de GV in en uit een pipet met een tip diameter net iets groter dan de diameter van de GV zelf. Rechts. TRIE GVS van X. tropicalis. Deze GVS werden enkele minuten over in een licht zuur milieu (GV isolatie op pH 5,8), waardoor de nucleaire enveloppe van het gegeleerde nucleaire inhoud zwellen. GVS op deze manier behandeld worden niet verspreid voor cytologisch onderzoek. Dergelijke GVS zijn ideaal voor moleculaire analyse: de envelop kan worden verwijderd met een tang juweliers, verschaffen van een monster van nucleaire inhoud volledig vrij van cytoplasmatische verontreinigingen. 17,18 Schaal bar = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: GV van X. tropicalis Geïsoleerd in Oil. Links. Na een kleine punctie werd gemaakt in de eicel in de buurt van de donkere dier pole, de GV begon te extruderen. In dit geval kwam de GV uit met bijna geen aanhangend dooier. Midden. De GV is nu volledig vrij van de eicel cytoplasma. Dergelijke GVS blijven RNA transcriberen voor uren. Rechts. Na de GV zachtjes men in olie onder een dekglaasje kan nucleaire organellen worden bekeken door DIC, zoals hier getoond, of door fasecontrast. De gehele GV is veel groter dan de kleine rechthoek zijn. HLB = histon locus lichaam met drie vlekken op het oppervlak. Schaal bar = 0,5 mm voor de eerste twee panelen, 10 urn voor de derde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Lampbrush Chromosomen (LBCs) van de Axolotl A. mexicanum. Links. Rechts. Hetzelfde preparaat bekeken donkerveld belichting. Men kan nu de talrijke ongekleurde versterkt nucleoli. Schaal bar = 250 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: A Single LBC uit de Axolotl A. mexicanum en de Kikker X. tropicalis, bij dezelfde vergroting. Deze beelden illustreren de extreme verschil in grootte tussen LBCs van een salamander en een kikker (inzet). De grootte difference correleert met de totale DNA-gehalte van het genoom (ongeveer 30 GBP voor A. mexicanum vs 1,7 GBP over X. tropicalis). Individuele laterale lussen (transcriptie-eenheden) zijn ook veel langer in de salamander dan in de kikker. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eerste waarnemingen van de "levende" LBCs uit de hand geïsoleerd GVS van kikkers en salamanders werden bijna 80 jaar geleden gemaakt door de Amerikaanse bioloog William Duryee, 19 vóór de invoering van fase contrast en DIC microscopie, voor fluorescerende immunokleuring, en voor FISH. De voordelen van LBCs voor het onderzoeken van de details van chromosoom structuur en transcriptie op individueel gen dat vereist de ontwikkeling van technieken om de LBCs hechten aan glas dia's, om ze op te lossen in een levensechte manier, en moleculaire technieken toe te passen zonder hun fundamentele morfologie te vernietigen. Bijna elke techniek om deze doelen te bereiken vergt enige aanpassing aan de soort in het kader van het onderzoek en een compromis tussen levensechte behoud en moleculaire karakterisering. Bijvoorbeeld, GVS en LBCs van de steel verwijderd van amfibieën zijn buitengewoon makkelijk om mee te werken vanwege hun enorme omvang en het gemak waarmee de GV inhoud te verspreiden in het geschikte medium. Until onlangs echter zeer weinig bekend over hun genomics, waardoor het moeilijk om de rijkdom van cytologische kenmerken correleren met moleculaire details. Omgekeerd LBCs van Xenopus zijn vrij klein vergeleken met die van staart amfibieën (figuur 5), maar de genomen van zowel X. tropicalis en X. laevis werden gesequenced en zijn redelijk goed geannoteerd.
Voor degenen die het eerste gebruik amfibie GVS, zal de grootste uitdaging zijn om de GV isoleren en verwijder de kern envelop zonder beschadiging van de LBCs. Tot op heden heeft niemand een manier om de envelop te verwijderen, behalve met de hand met een tang juwelier ontdekt. Het zou een belangrijke technische vooruitgang zijn als er een manier gevonden om "op te lossen" of "verteren" de enveloppe maar laat de chromosomen en andere nucleaire organellen onbeschadigd. Een dergelijke techniek zou nuttig als moleculaire studies. In ons onderzoek over nucleaire en cytoplasmatische RNA vonden we het van essentieel belang omVerwijder de kern envelop voor de analyse van nucleair RNA (Figuur 2). 17,18 Als de envelop niet wordt verwijderd, de kleine hoeveelheid nucleaire RNA wordt overweldigd door contaminerende cytoplasmatisch RNA dat zich aan de buitenzijde van de omhulling.
Een andere belangrijke verbetering zou ontdekking van een weg te LBCs strakker hechten aan een microscoopglaasje zijn. Centrifugeren van het preparaat is kritisch, maar ook langdurige centrifugatie (1 uur bij 4500 xg) niet dat bijlage. Men kan meestal vertellen wanneer LBCs goed zijn bevestigd door ze te onderzoeken met fasecontrast onder medium vergroting. Goed verbonden chromosomen vertonen geen Brownse beweging helemaal. Als een Brownse beweging van de lussen detecteerbaar is, zal de volgende immunokleuring of FISH protocollen leiden tot grote schade of verlies van materiaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. Lampbrush Chromosomes. 36, Springer-Verlag. (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G.
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
