Summary
Мы представляем простые методы для выделения гигантских транскрипционно активных хромосом lampbrush из живых яйцеклеток лягушек и саламандр. Мы опишем , как соблюдать эти хромосомы "живой" с помощью фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста, и как установить их для флуоресцентной гибридизации на месте или иммунофлуоресцентного окрашивания.
Abstract
Описаны методы изучения гигантских транскрипционно активных хромосомы типа ламповых щёток (LBCS), найденный в ооцит или unlaid яйца, лягушек и саламандр. Индивидуальные LBCS может быть до 1 мм в длину, и они находятся в гигантском ядре, сама до 0,5 мм в диаметре. Большой размер хромосом позволяет беспрецедентные наблюдения активных генов с помощью световой оптической микроскопии, но в то же время специальные методы, необходимые для выделения ядра, удаление ядерной оболочки, и распространяя хромосомами на предметное стекло микроскопа. Ядро ооцита, также называется зародышевым пузырьком (GV), выделяют в среде, которая допускает частичное гелеобразование ядерного актина и сохраняет нежную структуру LBCS. Этот шаг выполняется вручную под микроскопом рассекает с помощью щипцов ювелира. Далее, ядерная оболочка удаляется, опять же вручную с помощью пинцета ювелира. Ядерные содержимое быстро переносили в среду, что dispeRSES гель актина и позволяет неповрежденные LBCS обосноваться на предметное стекло микроскопа. На этом этапе LBCS и другие ядерные органеллы могут быть просмотрены с помощью фазового контраста или дифференциального интерференционного контрастного микроскопа, хотя более тонкие детали затемнены броуновским движением. Для высокого разрешения наблюдения микроскопического или молекулярного анализа, весь препарат центрифугируют, чтобы прикрепить тонкие LBCS плотно к каретке. Краткая фиксация в параформальдегида затем следуют иммунофлуоресцентного окрашивания или гибридизация в. LBCS находятся в транскрипционно активном состоянии, и их огромный размер позволяет молекулярный анализ на индивидуальном уровне генов с помощью конфокальной или супер-разрешением микроскопии.
Introduction
Большинство позвоночных животных, за исключением сумчатых и плацентарных млекопитающих, производят большие yolky яйца. Несмотря на их иногда огромных размеров, эти яйца отдельные клетки, которые достигают их окончательный размер в то же время в яичнике самки. Яичниковые яйца называются ооциты , и каждый , как правило , содержит одно гигантское ядро, известное с начала 19 - го века как зародышевым пузырьком или просто GV. 1 ооцитов обычных лабораторных лягушек, Xenopus Laevis и Xenopus tropicalis, достигают максимального диаметра 1,2 мм и 0,8 мм соответственно (рис 1). В GVs из зрелых ооцитов этих двух лягушки 0,3 - 0,4 мм в диаметре (рисунки 2, 3). Саламандры, как правило, имеют даже более крупные ооциты и GvS. Полностью зрелые ооциты мексиканского аксолотля, Ambystoma mexicanum, более 2 мм в диаметре и GV составляет около 0,5 мм. Таким образом, эти ядра хорошо видны невооруженным глазом и может быть,можно манипулировать разными способами, которые невозможны с ядрами типичных соматических клеток.
Не менее примечательно , так это гигантский размер хромосом внутри Г.В., факт , признанный уже в конце 19 - го века. Отдельные хромосомы Ambystoma и других саламандр может быть до 1 мм в длину (рисунки 4, 5). Те из Xenopus значительны меньше, хотя и с длиной до 100 мкм или более, они затмевают типичные соматические хромосомы большинства организмов. Важной особенностью ооцитов хромосом является их необыкновенный транскрипционной активности, что приводит к одному из своих наиболее характерных морфологических признаков - сотни парных боковых петель (рисунок 5). Каждый цикл состоит из одного или нескольких единиц транскрипции, которые активно синтезируют РНК. Петли дают ооцитов хромосомы нечеткий вид, что привело к названию "lampbrush" хромосомы после того, как их поверхностныеСходство с кистей, используемых в прежние времена для чистки керосиновой лампы дымоходы. 2
В центре внимания данной работы находится на использовании изолированных GvS для изучения LBCS и ядерные органеллы (ядрышек, гистонов локусные тела и крапинки). Два весьма различные методы будут описаны ниже. В первом, более распространенной техникой, GVs изолированы в солевом растворе с помощью щипцов ювелира, кратко промыть, чтобы удалить прилипший желток, а ядерная оболочка удаляется, опять же с пинцетом ювелира. Студенистая содержание, содержащие LBCS и ядерные органеллы, дают отстояться на предметное стекло микроскопа или покровное. Такие препараты могут быть рассмотрены непосредственно фазового контраста или DIC микроскопии. В качестве альтернативы, препараты можно центрифугировать для прикрепления LBCS и органелл к слайду или покровное. Такие препараты могут быть обработаны для детального молекулярного анализа нуклеиновых кислот и белков, в первую очередь с помощью иммунофлуоресценции и fluorescenт гибридизация (FISH) в. 3-7
Второй метод предполагает изоляцию GV в минеральном масле. 8 Масло-изолированные GVs остаются транскрипционно активны в течение многих часов и потенциально полезны для исследований , в которых кто -то хочет ядерное содержимое , чтобы быть максимально реалистичное , насколько это возможно. 9,10 Поскольку показатель преломления ядерной "соке" близка к тому , что из LBCS и других ядерных органелл (рис 3), микроскопические методы могут быть проблемой с изолированным нефтью GvS.
Наконец, из-за их размера и простоты манипуляций, GVs являются идеальным материалом для исследований по ядерной оболочки. Пор комплекс атомной был впервые описан из электронно - микроскопических исследований на амфибий Г.В. конвертах 11 и более поздних наблюдений сверхразрешения использовали один и тот же материал. 12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Общая информация о лягушках и саламандр, а также источники животных, можно найти на следующих сайтах: Xenbase (http://www.xenbase.org) и Sal-сайта (http://www.ambystoma.org). Этот протокол следует рекомендациям по уходу за животными Департамента эмбриологии Института Карнеги по науке.
1. Решения
- Сделать 10 л "лягушки вода": Добавляют 10 мл 1 М CaCl 2 и 10 мл 1 М раствором NaHCO 3 до 10 л деионизованной или дехлорированная H 2 O при перемешивании.
- Сделать 1 л 20% параформальдегида: заварить 1 л 4 мМ Na 2 CO 3. В химической капот добавить 200 г порошкообразного параформальдегида, и нагревают до примерно 80 ° С до растворения. Охлаждают, и фильтруют через фильтровальную бумагу. Внимание: параформальдегид является токсичным и должны быть обработаны с осторожностью. Кроме того, покупка коммерческое решение параформальдегида.
- Сделать 1 л раствора амфибия обезболивающий: Добавить 1,5 г этилового эфира 3-aminobenзойной метансульфонат до 1 л воды лягушки. Хранить при комнатной температуре.
- Сделать 1 л культуральной среды ооцитов OR2 14: 82.5 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 1 мМ Na 2 HPO 4, 5 мМ HEPES (от 500 мМ исходного раствора , рН 8,3). Окончательное значение рН будет приблизительно рН 7,8. Добавьте 100 мг ампициллина и 100 мг стрептомицина для предотвращения роста бактерий.
- Сделать 1 л раствора изоляции GV: 83 мМ KCl, 17 мМ NaCl, 6,5 мМ Na 2 HPO 4, 3,5 мМ KH 2 PO 4, 1 мМ MgCl 2, 1 мМ дитиотреитола (DTT). Отрегулировать до рН 7,0.
- Сделать 100 мл раствора GV: 20,7 разгон мМ KCl, 4,3 мМ NaCl, 1,6 мМ Na 2 HPO 4, 0,9 мМ KH 2 PO 4, 1 мМ MgCl 2, 1 мМ дитиотреитола (DTT), 0,1% параформальдегида. Отрегулировать до рН 7,0. В целях содействия более быстрому рассеиванию ядерного геля, добавляют 10-50 мкМ CaCl 2.
- Сделать 500 мл раствора заменял. Swell 0,5 г коммерческого желатина в 20 мл H 2 O в течение 5 - 10 мин. Добавить 500 мл кипящей H 2 O и осторожно встряхните , чтобы растворить желатин. Охлаждают и добавляют 50 мг Crk (SO 4) 2 · 12 H 2 O. Фильтр с всасыванием и хранить при температуре 4 ° С
- Сделайте 10 мл среды монтажа. Растворите 10 мг фенилендиамина в 5 мл PBS (135 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 4,3 мМ Na 2 HPO 4, 1,5 мМ KH 2 PO 4, доводят до рН 9). Добавьте 5 мл глицерина. Хранить в 250 мкл аликвоты при -80 о С.
2. материалы
- Для подкровать слайдов, место 3 дюйма х 1 дюйм стекла микроскопа в коммерческом растворе моющего средства и потрите их, чтобы удалить любые загрязнения. Поместите в стойку слайдов и хорошо промыть в проточной воде, затем в деионизированной воде. Dip слайды в растворе заменял, слейте под углом, и выпекать в течение ночи при 60 ° С
- Для пластиковых квадратов, вырезать 25 мм квадраты из листа толщиной 1 мм, поли (метилметакрилат). Просверлите5 мм круглое отверстие в центре каждого квадрата. Песок обе поверхности и края квадрата, а также по окружности отверстия.
Примечание: В качестве альтернативы самодельные пластиковые квадраты и хорошо скользит, как описано в следующем абзаце, используют коммерческий клей в месте ПЦР и гибридизации камер (25 мкл). Можно было бы, вероятно, также использовать многоразовые силиконовые изоляторы для культивирования клеток, хотя это не были тщательно протестированы еще. - Для хорошо слайдами, растопить 20 - 30 г парафина (56 - 57 ° С) в стеклянном стакане на 50 мл на горячей плите. С 20 мкл пипеткой, распространить одну каплю 5 мкл парафина на каждой стороне центра подкровать слайда. Нажмите пластмассовый квадрат в парафин и поместите слайд на горячей плите. Парафин расплавится и должна распространяться равномерно под пластиковой площади.
- Удалить слайд из горячей плиты и дайте ему остыть. Поместите опору под конец каждого слайда, так что слайд не контактирует с TABLETOP во время процесса охлаждения. Если парафин остывает слишком быстро, он может оторваться от центрального отверстия. Подготовьте 10 или более хорошо слайдов: каждый препарат GV использует новый слайд хорошо.
- Для слайд-носителей для центрифугирования, использовать специально сконструированные носители для ротора, используемого. Некоторые производители предоставляют центрифуг с носителями для 96 - луночных пластиковых пластин. Эти носители могут быть адаптированы довольно легко провести предметные стекла микроскопа.
3. Выделение ооцитов
- Поместите взрослая самка лягушки (Xenopus Laevis или Xenopus tropicalis) или саламандра (Ambystoma mexicanum) в достаточном количестве раствора анестетика , чтобы полностью покрыть животное. Когда животное перестает движение, поместите его кверху брюхом на ложе из колотого льда в подходящем контейнере.
- С помощью хирургических ножниц сделать 2 - см надрез 3 в нижней части живота сбоку от средней линии. Перемещение внутренние органы аккуратно в сторону, чтобы найти яичник на стороне разреза (йERE два яичники, по одному на каждой стороне живота). Вырежьте часть яичника с достаточным количеством ооцитов для запланированных экспериментов. Так как существуют тысячи ооцитов в каждом яичнике, относительно небольшая часть завязи (1 - 3 см), как правило, достаточно.
- Поместите один или несколько кусочков яичника в OR2 физиологического раствора в большой чашке Петри (100 мм) при комнатной температуре. Ооциты могут быть сохранены в хорошем состоянии в течение нескольких дней, если поврежденные ооциты удаляют и раствор OR 2 изменяется ежедневно.
- Шовный разрез с хирургическим шелком и вернуть животное к индивидуальной стеклянной чаши для восстановления. Добавьте достаточно просто "Лягушка воды", чтобы покрыть животное, пока он не приходит в сознание (около 15 мин). После того, как животное показывает произвольные движения, заполнить чашу с водой. Хотя пресная вода должна использоваться, стерильность не является необходимым, так как амфибии почти никогда не становятся зараженными после операции. При желании, неомицин может быть применен к швами. Рана обычно заживает полностью после феW дней и то же животное может быть использован снова примерно через 2 месяца.
4. Выделение зародышевым пузырьком (GV)
- Поместите часть яичник (10 - 20 крупных ооцитов) в небольшую чашку Петри (35 х 10 мм), содержащую раствор or2.
- Удаление яйцеклетку из яичника с помощью двух пар щипцов # 5 ювелира, чтобы разорвать тонкую стебелек ткани, которая соединяет яйцеклетку к завязи стене. Поместите ооцит в другой небольшой чашке Петри, содержащей GV изоляции среды.
Примечание: Состояние LBCS зависит от размера (погашения) ооцита. LBCS достигают максимальной длины с видными петель в ооцитах, которые немного меньше, чем полный размер. Наиболее зрелые ооциты часто содержат короткие хромосомы с законтрактованных петель. - Выполните следующие действия при низком увеличении рассекает микроскопа (диаметр поля около 10 - 20 мм).
- Возьмитесь яйцеклетку с обоими парами щипцов вблизи полюса животного (темное полушарие) и сделать смвсе слезы. Посмотрите в экструдированной желтка для прозрачного ядра ооцитов, также называемый зародышевый пузырек или GV.
- В качестве альтернативы, совать большое отверстие анимальной с одной парой щипцов и аккуратно выдавить GV вместе с желтком (рисунок 2).
- Аккуратно сверните GV от основной массы желтка. Как правило, там будет небольшое количество желтка плотно прилегает к GV.
5. Удаление ядерной оболочки
- Для X. Laevis и X. tropicalis, передача GV от изоляции среды к среде распространения в пределах 60 с изоляцией, даже если есть еще немного приверженцем желток.
Примечание: GVs из этих двух видов "затвердевать" в течение 60 секунд, если оставить в среде для выделения и не будет распространяться на последующих стадиях. Поэтому скорость имеет первостепенное значение при рассмотрении содержимого Xenopus GV.- Возьмитесь ядерной оболочки вблизи верхней части GV с одной паройщипцов ювелирного, следя за тем, чтобы не придавить. Возьмитесь конверт со второй парой щипцов как можно ближе к первой, как это возможно. Потяните две пары щипцов далеко друг от друга, и содержимое GV "выскочит" из свободной от оболочки, которая плотно прилегает к одному или обоим щипцов.
- Возьмите содержимое GV в стеклянной пипетки или регулируемый 20 мкл микропипетки. При использовании регулируемого пипетку, установите пипеткой 10 мкл и отрезать конец пластмассовым наконечником с лезвием бритвы. Ничья в 5 мкл жидкости перед подбирая GV в оставшихся 5 мкл.
- Перенесите еще желированном ядерное содержимое в центре хорошо горкой предварительно заполнены с распространением раствора. Распространение решение должно иметь выпуклую поверхность, так что пузырь не был зажат, когда добавляется покровное.
- Добавить покровное (18 мм) и поместите слайд во влажной камере. Ядерный гель будет медленно расходиться в течение ближайших 10 - 60 мин, так что хромосомаs и ядерные органеллы приходят лежать на поверхности предметного стекла.
Примечание: GvS из саламандры А. mexicanum и Н. viridescens не "затвердеет" излишне в среде для выделения. Поэтому можно продолжить более неторопливый с удалением ядерной оболочки , чем можно с Xenopus.
- Удалите ядерную оболочку из саламандры GV, как описано в разделе 5.1.1, но делают это в среде для выделения.
- Возьмите немного загущенных содержимое GV с пипеткой и переносят в чашку Петри, содержащую расшир раствор.
- Быстро промыть кончик пипетки в распространении раствора, подобрать ядерный гель, и поместить его в центре хорошо слайде ранее заполненной с распространением раствора. Добавить 18 мм покровное и поместить весь слайд во влажной камере. Ядерный сок будет медленно расходиться в течение ближайших 10 - 60 мин, а хромосомы и ядерные органеллы придут лежать на поверхности стекла. </ Ол>
6. Предварительное наблюдение LBCS и органелл
- Просмотр LBCS и ядерные органеллы от фазового контраста (обычного вертикального микроскопа) при малом увеличении после разгона ядерного содержания в камере расширения. Поскольку камера глубиной около 1 мм, а ядерное содержимое в нижней части, используйте цель поддержания низкого уровня увеличения с большим рабочим расстоянием (5X - 10X).
Примечание: Основная причина для изучения препарата в это время, чтобы определить, стоит ли проведение в течение следующих шагов. В хорошей подготовки хромосомы и непрерывный осели на дно камеры. Перейдите к стадии центрифугирования в течение часа после принятия препарата, так как это обеспечит оптимальное прикрепление хромосомы типа ламповых щёток петель к слайду.
7. Центрифугирование ядерных Содержание
- Поместите кусочек фильтровальной бумаги на покровное и нажмите вниздля удаления избытка жидкости из камеры.
- Помещенный около 1 мм 3 вазелина на каждой стороне покровного стекла. Растопить вазелин с металлическим стержнем нагревают до температуры около 70 - 80 ° С для герметизации покровное на основной пластиковой площади.
- Место слайдов в слайд-носителей для центрифугирования, убедившись, что противоположные носители сбалансированы. Центрифуга слайды при температуре около 4,800 мкг в течение 30 мин - 1 ч. при 4 о С. Используйте медленный старт функции на центрифуге.
8. Крепление ядерных Содержание
- Для большинства последующих процедур, устранить ядерное содержимое с помощью параформальдегида.
- Поместите слайд стойку в стандартную стекло микроскопа для окрашивания блюдо, а затем поместить слайды по отдельности в стойке. Добавьте достаточно, чтобы покрыть закрепителем слайды (2 - 4% параформальдегидом в OR2 или PBS).
- С парой тупыми щипцами, толкать покровное в боковом направлении, поднять его, и выбросить его в соответствующий стеклянный мусор.Оставьте слайды в фиксаторе, по крайней мере, на 15 - 30 мин. Для гибридизация и пятен большинство антител в более длительные периоды фиксации (ч или г) допустимы.
- Чтобы снять пластиковый квадрат, место скользит по одному за раз в ледяную OR2 или PBS в окрашивании блюдо. Вставьте острым лезвием бритвы на краю пластиковой квадрата и приподнять крышку.
Примечание: В идеале пластик оторвется чисто, оставив все парафина на слайде. Воск служит полезной цели: поскольку она окружает малую центральную область , где ядерное содержимое прикреплены к каретке, он действует как плотины , что позволяет работать с малыми объемами (5 - 10 мкл) реагентов для иммунологического окрашивания и др. Слайды могут быть проведены на неопределенное время в холодной OR2 или PBS.
9. Иммуноокрашивание LBCS и ядерных органелл
- Удалить фиксированный препарат GV из хранилища в OR2 или PBS. Вытрите лишнюю жидкость и место на опорах во влажной камере. Удобный chambщик 90 х 15 мм чашку Петри, содержащую 90 мм круг влажной фильтровальной бумагой.
Примечание: На данный момент ядерное содержимое прочно прикреплены к слайду в круговой зоне 5 мм свободного парафина. Так как воск водоотталкивающий, можно изменить решения, добавление и удаление небольших объемов жидкости к краю центральной области с 20 мкл пипеткой. Основная мера предосторожности, чтобы не касаться Беспарафиновая области с наконечником пипетки. - Проводят иммунным с небольшими объемами (10 - 20 мкл) реагентов. Так как на хромосомах и ядерные органеллы очень малы и находятся в непосредственном контакте с добавлением реагентов, протоколы окрашивания могут быть короткими. Первичные и вторичные раз с использованием меченых антител может быть столь же коротким, как 1 час или меньше. Не включать моющие средства на любой стадии, так как это приводит к повреждению препарата. При желании, окрасить препарат с DAPI (1 мкг / мл) в течение 10 - 20 мин, чтобы подчеркнуть осей LBCS.
- Гора в глицерине или коммерческого монтированияИНГ среда, подходящая для иммунофлуоресценции. Для того, чтобы избежать захвата воздушных пузырьков во время стадии монтажа, действуйте следующим образом.
- Извлечь 15 мкл монтажа среду в кончике 20 мкл пипеткой. Удалите так много жидкости, как можно дальше от зоны непосредственно вокруг ядерного распространения путем "затекания" его с куском фильтровальной бумаги (вырезанной в форме очень тонкого треугольника от 90 мм круг # 1 фильтровальной бумаги).
- Пипетировать большая часть монтажной среды на подготовку, соблюдая осторожность, чтобы не прикоснуться к области ядерного распространения. Поместите последний 1 мкл или так гистологическая среда в центре 22 мм покровным (толщина # 1,5). Обратить покровное над подготовкой и аккуратно уронить на место.
- Для временных креплений, до нескольких дней, используйте 1 мг / мл фенилендиамин в 50% глицерина. Для постоянных креплений, особенно для исследований сверхразрешения, использовать низко-флуоресцентную среду, которая затвердевает в показатель преломления около 1,46.
10. Флуоресцентные В гибридизация (FISH) из LBCS и ядерных органелл
- Поскольку протоколы FISH обычно требует стадии при повышенной температуре, удалить парафин из препарата. Осторожно соскоблить с бритвенным лезвием, хотя процедура является утомительным и может привести к случайного повреждения препарата. Полезно отметить область препарата на задней стороне слайда с алмазным.
- В качестве альтернативы, растворить парафин с ксилолом. Настроенный серию Коплин банок или красящих блюд, содержащих: 30%, 50%, 70%, 95% и 100% этанола; 3 контейнера ксилола; более 2 контейнера 100% этанола и одного ацетона.
- Поместите слайды в держателе слайдов и обезвоживает их в серии этанола, в результате чего слайды 3 - 5 мин в каждой концентрации (более короткое время, если перемешивается).
- Растворить парафина путем пропускания слайдов через 3 контейнера ксилола, примерно 5 мин каждый раз, если перемешивается. Удалитьксилола путем пропускания через два 100% этанолов, и, наконец, удалить этанол с ацетоном. Возьмите слайды из ацетона и наклонять их, чтобы высохнуть.
- Проводят гибридизация с использованием любого стандартного протокола. 15,16
11. Выделение GV под Oil
- Возьмите ооцита из раствора OR2 с пинцетом ювелира, в том числе и как мало окружающие ткани, как это возможно. Поместите ооцит на небольшой кусочек # 1 фильтровальной бумаги. Избыток раствора OR 2 будет передавать на фильтровальную бумагу, в результате чего ооцит практически свободна от жидкости. Возьмите "сухой" яйцеклетку и поместить его под поверхностью легкого веса минерального масла (парафинового масла) в небольшую чашку Петри (35 х 10 мм).
- С помощью тонкой иглы вольфрама или одного зубца пинцета, ткните маленькое отверстие в ооцитах вблизи темного полюса животного. Возьмите яйцеклетку с одной парой щипцов (избегающий кончики) и сжать мягко. GV вытеснят наряду с меньшим или лARGER количество желтка на его поверхности (рисунок 3).
- Удалить столько желтка, насколько это возможно, аккуратно подметает GV стороной пинцета. В большинстве случаев это будет трудно удалить все желтка. Тем не менее, в большинстве случаев небольшое количество желтка не является проблемой.
- Для наблюдения содержание GV, придавить GV в большей или меньшей степени.
- Снимите пластиковый квадрат со слайда также и использовать оставшийся парафин в качестве мелкой емкости для парафинового масла. 10 Поднимите GV вместе с парафиновым маслом в 20 мкл пипеткой и передать в центр зоны парафина. Добавить покровное и наблюдать содержимое частично сплющенной GV. Этот метод не повреждает LBCS.
- В качестве альтернативы, придавить GV до приблизительно 10 мкм толщины для наблюдения ядерных органелл.
- Отрезанные финальные 1 мм пластикового наконечника пипетки с острым лезвием бритвы. Сосать GV внаклонить вместе с точно 5 мкл минерального масла. Выдавите GV и всю нефть на центр покровного стекла 22 мм.
- Опустите стандартный 3 "х 1" предметное стекло медленно, пока он не коснется капли масла. Падение и покровное будет поднимать капиллярности и масло будет распространяться на края покровного. Когда падение распространился полностью, нефть будет составлять приблизительно 10 мкм. В LBCS будут повреждены и крупные ядрышки будут слегка сжатое, но большинство из небольших ядерных органелл будут появляться более или менее , как они существуют в неповрежденном GV (рисунок 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того, чтобы исследовать гигантские хромосомы типа ламповых щёток один начинается с выделения ооцитов из лягушки или саламандры. На рисунке 1 показана группа зрелых ооцитов в буферном солевом растворе после удаления из яичника лягушки, Xenopus. Такие ооциты остаются в хорошем состоянии в течение нескольких дней при комнатной температуре. Ядро (или зародышевым пузырьком) затем удаляют из ооцита с пинцетом ювелира, либо в солевом растворе (рис 2) или в масле (рисунок 3). Ядерные содержание изолированного масла ядра можно исследовать, осторожно давя ядро и наблюдение с помощью фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста (DIC) микроскопии. Для того, чтобы исследовать содержимое ядра, который был выделен в солевом растворе, необходимо сначала удалить ядерный конверт с пинцетом ювелира и позволить содержание селиться на предметное стекло микроскопа. Препарат затем центрифугируют для прикрепления тон твердо хромосомах к слайду, после чего хромосомы могут быть окрашивали антителом (рисунок 4) или подвергают гибридизация. В хромосомы типа ламповых щёток саламандр гораздо больше , чем у лягушек (рисунок 5). В обоих случаях отдельные транскрипционные единицы (гены), можно рассматривать как петли хроматина выступающих в боковом направлении от оси хромосомы.
Рисунок 1: Зрелые ооциты из X. tropicalis лягушки. Завязь зрелой женской лягушки содержит тысячи ооцитов на разных стадиях созревания. Наименьший являются размер соматических клеток и уже достигли профазу первого мейотического деления. По мере роста ооцитов, он постепенно накапливает желток, который дает клетке непрозрачный белый внешний вид. Самый большой коврикURE ооциты, показанные здесь, приобретают более темный колпачок из-за накопления пигмента меланина. Крупнейшие ооциты X. tropicalis около 0,8 мм в диаметре, те из X. Laevis около 1,4 мм, в то время как те аксолотля являются огромным 2,2 мм. за исключением размера, все трое похожи по общему виду. Шкала бар = 1 мм.
Рисунок 2: Удаление GV из ооциты X. tropicalis. Оставил. Небольшое отверстие было сделано с пинцетом ювелира в темной анимальной ооцита и GV осторожно выдавливается. В этом примере GV был почти свободен от желтка, как он вышел из ооцита. Адгезивная желток могут быть удалены при всасывании GV и из пипетки с диаметром кончика чуть-чуть больше, чем диаметр самого GV. Правильно. THREE GVs из X. tropicalis. Эти GVs осталось несколько минут в слегка кислой (раствор изоляции GV доводили до рН 5,8) среды, что вызывает ядерная оболочка набухать от гелеобразных ядерного содержимого. GVs, обработанные таким образом, не будет распространяться на цитологическое обследование. Тем не менее, такие GVs идеально подходят для молекулярного анализа: оболочка может быть удалена с ювелирами щипцов, получение пробы ядерного содержимого полностью свободной от цитоплазматической загрязнения. 17,18 Шкала бар = 0,5 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: GV из X. tropicalis , изолированных в масле. Оставил. После небольшой прокол был сделан в ооцитах вблизи темного животного роле, то GV начал выдавливать. В этом случае GV вышел почти без клейкого желтка. Средний. GV теперь полностью свободен от цитоплазме ооцита. Такие GVs продолжают транскрибировать РНК в течение нескольких часов. Правильно. После того, как GV мягко сжато в масле под покровное, ядерные органеллы могут быть просмотрены DIC, как показано здесь, или с помощью фазового контраста. Весь GV намного больше, чем небольшой площади, показанной здесь. HLB = гистона локус тело с тремя крапинками на его поверхности. Шкала бар = 0,5 мм для первых двух панелей, 10 мкм для третьего. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: хромосомы типа ламповых щёток (LBCS) от аксолотля А. mexicanum. Оставил. Правильно. Же препарат рассматривается темнопольным освещения. Теперь можно увидеть многочисленные неокрашенные амплифицированные ядрышки. Шкала бар = 250 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Единый LBC от аксолотля А. mexicanum и tropicalis лягушки X., при том же увеличении. Эти изображения иллюстрируют разницу экстремальный размер между LBCS саламандры и лягушки (врезка). Размер дифферев.п. коррелирует с общим содержанием ДНК геномов (около 30 фунтов стерлингов для А. mexicanum против 1,7 Gbp для X. tropicalis). Отдельные боковые петли (транскрипционные единицы) также намного больше в саламандры, чем у лягушки. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первые наблюдения «живых» LBCS из рук-изолированные GvS лягушек и саламандр были сделаны около 80 лет назад американский биолог Уильям Duryee, 19 до введения фазового контраста и ДИК микроскопии перед флуоресцентным иммунным окрашиванием и перед FISH. Преимущества LBCS для исследования деталей структуры хромосом и транскрипции на уровне отдельных генов, необходимого развития техники для прикрепления LBCS к стеклах, чтобы зафиксировать их в реалистичное образом, и применять молекулярные методы, не разрушая их основной морфологии. Почти каждый метод для достижения этих целей требует некоторой адаптации к видов, находящихся под следствием и некоторого компромисса между реалистичное сохранения и молекулярной характеристики. Например, GVs и LBCS из хвостатых земноводных необыкновенно легко работать из-за их огромных размеров и легкость, с которой содержимое GV диспергировать в подходящей среде. Until в последнее время, однако, очень мало было известно об их геномики, что делает его трудно соотнести богатство цитологических признаков с молекулярными деталями. И наоборот, LBCS из Xenopus весьма малы по сравнению с теми хвостатых амфибий (рисунок 5), но геномы обоих X. tropicalis и X. Laevis были секвенированы и достаточно хорошо примеч.
Для тех, кто в первую очередь с использованием амфибий GvS, основной задачей будет изолировать GV и удалить ядерной оболочки без повреждения LBCS. На сегодняшний день никто не нашел способ, чтобы удалить конверт, за исключением вручную пинцетом ювелира. Это было бы главным технический прогресс, если путь были найдены "растворить" или "переварить" конверт, но оставить хромосомы и другие ядерные органеллы неповрежденными. Такая методика была бы столь же полезно для молекулярных исследований. В наших исследованиях по ядерной и цитоплазматической РНК мы нашли необходимымудалить ядерной оболочки перед анализом ядерной РНК (рис 2). 17,18 Если конверт не удаляется, небольшое количество ядерной РНК перегружены загрязняя цитоплазматической РНК , которая прилипает к внешней стороне конверта.
Еще одним значительным улучшением могло бы стать открытие каким-то образом, чтобы прикрепить LBCS более плотно к стеклу микроскопа. Центрифугирование препарата является критическим, но даже длительное центрифугировани (1 час при 4500 XG) не обеспечивает прикрепление. Можно сказать, когда обычно LBCS хорошо прикреплены, рассматривая их с фазовым контрастом при среднем увеличении. Хорошо прилагается хромосомами не показывают броуновское движение вообще. Если любое броуновское движение петель обнаруживается, последующие иммунным окрашиванием или FISH протоколы приведут к обширному повреждению или потере материала.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. Lampbrush Chromosomes. 36, Springer-Verlag. (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G.
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
