Summary
Vi presenterar enkla tekniker för att isolera jättetranskription aktiva lampbrush kromosomer från levande oocyter av grodor och salamandrar. Vi beskriver hur man följa dessa kromosomer "levande" av faskontrast eller differentiell interferenskontrast, och hur man rättar dem för fluorescent in situ hybridisering eller immunofluorescerande färgning.
Abstract
Vi beskriver metoder för att studera den gigantiska transkription aktiva lampbrush kromosomer (LBC) finns i äggcellen, eller unlaid ägg, grodor och salamandrar. Enskilda LBC kan vara upp till 1 mm i längd och de bor i en gigantisk kärnan själv upp till 0,5 mm i diameter. Den stora storleken på kromosomerna medger motstycke observationer av aktiva gener genom ljus optisk mikroskopi, men på samma gång speciella tekniker erfordras för att isolera kärnan, avlägsna kärnhöljet, och sprida kromosomerna på ett objektglas. Äggcellen nucleus, även kallad den germinala vesikeln (GV), isoleras i ett medium som tillåter partiell gelning av den nukleära aktin och bevarar den ömtåliga strukturen av LBC. Detta steg utförs manuellt under ett dissektionsmikroskop med användning av guldsmeder pincett. Därefter kärnhöljet avlägsnas, återigen manuellt med jeveleraraffärer pincett. De nukleära innehållet snabbt överföras till ett medium som disperses aktin gelen och tillåter de oskadade LBC sedimentera på ett objektglas. Vid denna punkt LBC och andra kärnorgan kan ses av faskontrast eller differentiell interferenskontrast mikroskopi, även om finare detaljer skyms av Brownsk rörelse. För hög upplösning mikroskopisk observation eller molekylär analys är hela beredningen centrifuger att fästa den känsliga LBC fast bilden. En kort fixering i paraformaldehyd följs sedan av immunofluorescerande färgning eller in situ hybridisering. LBC är i ett transkription aktivt tillstånd och deras enorma storlek medger molekylär analys på individ gennivå med hjälp av konfokal eller super-upplösning mikroskopi.
Introduction
De flesta ryggradsdjur, med det anmärkningsvärda undantaget av pungdjur och moderkakan däggdjur, producerar stora yolky ägg. Trots deras ibland enorma storlek, dessa ägg är enstaka celler som når sin slutliga dimension samtidigt i äggstocken av den kvinnliga. Äggstocks ägg kallas ägg och var och en innehåller vanligtvis en enda gigantisk kärna, känd sedan början av 19-talet som germinala vesikeln eller helt enkelt GV. 1 Oocyter av den gemensamma laboratorie grodor, Xenopus laevis och Xenopus tropic, nå en maximal diameter på 1,2 mm och 0,8 mm respektive (Figur 1). De GVS från mogna oocyter från dessa två grodor är 0,3 - 0,4 mm i diameter (fig 2, 3). Salamandrar har typiskt ännu större oocyter och GVS. Fullt mogna ägg i den mexikanska axolotl, Ambystoma mexicanum, är mer än 2 mm i diameter och GV är ca 0,5 mm. Således är dessa kärnor är lätt synliga för blotta ögat och kanmanipuleras på många sätt som är omöjligt med kärnorna hos typiska somatiska celler.
Lika anmärkningsvärt är den gigantiska storlek kromosomerna inom GV, ett faktum redan erkänt i slutet av 19-talet. Individuella kromosomerna hos Ambystoma och andra salamandrar kan vara upp till 1 mm i längd (Figurerna 4, 5). De av Xenopus är betydligt mindre, men med längder upp till 100 pm eller mer, de dvärg typiska somatiska kromosomer de flesta organismer. Ett viktigt inslag i äggcell kromosomer är deras extraordinära transkriptionsaktivitet, vilket leder till en av sina mest karakteristiska morfologiska egenskaper - hundratals parade sido slingor (Figur 5). Varje slinga består av en eller ett fåtal transkriptionsenheter som aktivt syntetiserar RNA. Slingorna ger äggcellen kromosomer en suddig utseende, vilket ledde till namnet "lampbrush" kromosom efter deras ytligalikhet med de borstar som används i äldre tider för att rengöra fotogenlampa skorstenar. 2
Fokus i denna uppsats är om användningen av isolerade GVS att studera LBC och kärnorgan (nukleolerna, histon locus organ och prickar). Två ganska olika tekniker kommer att beskrivas. I den första, mer vanlig teknik, är GVS isoleras i en koksaltlösning med användning av jeveleraraffärer pincett, i korthet sköljdes för att avlägsna vidhäftande äggula, och kärnhöljet avlägsnas, återigen med jeveleraraffärer pincett. De gelatin innehåll, innehåller LBC och kärnorgan, får sedimentera på en glasobjektglas eller täck. Sådana preparat kan undersökas direkt genom faskontrast eller DIC mikroskopi. Alternativt kan beredningar centrifugeras för att fästa LBC och organeller till bilden eller täck. Sådana preparat kan sedan bearbetas för detaljerad molekylär analys av nukleinsyror och proteiner, främst genom immunofluorescens och fluorescent in situ-hybridisering (FISH). 3-7
En andra teknik innefattar isolering av GV i mineralolja. 8 Olje isolerade GVS förblir transkriptionellt aktiv i många timmar och är potentiellt användbara för studier där man vill kärn innehållet att vara så naturtrogen som möjligt. 9,10 Eftersom brytningsindex för den nukleära "sav" är nära den för de-LBC och andra kärnorganeller (Figur 3), kan mikroskopiska tekniker vara en utmaning med olje isolerade GVS.
Slutligen, på grund av sin storlek och enkel hantering, GSV är idealiskt material för studier på kärnhöljet. Den kärnpor komplex beskrevs först från elektronmikroskopstudier på amfibie GV kuvert 11 och nyare Superresolution observationer har använt samma material. 12,13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allmän information om grodor och salamandrar, liksom källor till djur, kan hittas på följande webbplatser: Xenbase (http://www.xenbase.org) och Sal-Site (http://www.ambystoma.org). Detta protokoll följer riktlinjerna för djurskötsel av avdelningen av embryologi av Carnegie Institution for Science.
1. Lösningar
- Göra 10 L "groda vatten": Tillsätt 10 ml 1 M CaCl2 och 10 ml 1 M NaHCOs 3 till 10 L avjoniserat eller avklorerat H2O under omröring.
- Gör en L 20% paraformaldehyd: Gör en liter 4 mM Na 2 CO 3. I en kemisk huv tillsätt 200 g pulverformig paraformaldehyd, och värm till ca 80 ° C för upplösning. Cool, och filter genom filterpapper. Varning: paraformaldehyd är giftig och måste hanteras varsamt. Alternativt köpa kommersiella paraformaldehydlösning.
- Gör en L amfibie bedövningsmedel lösning: Tillsätt 1,5 g etyl-3-aminobenZoate metansulfonat till en L groda vatten. Förvaras vid rumstemperatur.
- Göra en L oocyt odlingsmedium OR2 14: 82,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, 5 mM HEPES (från 500 mM stam, pH 8,3). Det slutliga pH-värdet är omkring pH 7,8. Tillsätt 100 mg ampicillin och 100 mg streptomycin för att förhindra bakterietillväxt.
- Göra en L GV isoleringslösning: 83 mM KCl, 17 mM NaCl, 6,5 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT). Justera till pH 7,0.
- Gör 100 ml GV dispersal lösning: 20,7 mM KCl, 4,3 mM NaCl, 1,6 mM Na 2 HPO 4, 0,9 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT), 0,1% paraformaldehyd. Justera till pH 7,0. För att underlätta en snabbare spridning av kärn gel, tillsätt 10-50 iM CaCl2.
- Gör 500 ml grundöverdragslösningen. Swell 0,5 g kommersiell gelatin i 20 ml H2O under 5 - 10 min. Tillsätt 500 ml kokande H2O och noggrant virvla för att lösa upp gelatinet. Kyl och tillsätt 50 mg CRK (SO 4) 2 · 12 H2O sugfiltrera och förvara vid 4 ° C.
- Göra 10 ml monteringsmedium. Lös upp 10 mg fenylendiamin i 5 ml PBS (135 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 4,3 mM Na 2 HPO 4, 1,5 mM KH 2 PO 4, justerad till pH 9). Tillsätt 5 ml glycerol. Butik i 250 pl alikvoter vid -80 ° C.
2. Material
- För subbed diabilder, plats 3 tum x 1 tum glas objektglas i en kommersiell rengöringslösning och gnugga dem för att avlägsna eventuella föroreningar. Placera i en bild rack och skölj väl i kranvatten, sedan i avjoniserat vatten. Doppa dem i subbing lösning, rinna i en vinkel, och grädda över natten vid 60 ° C
- För plast torg, skär 25 mm rutor från ett ark av 1 mm tjock poly (metylmetakrylat). borra ett5 mm runt hål i mitten av varje kvadrat. Sand båda ytorna och kanterna på den fyrkantiga såväl som omkretsen av hålet.
OBS: Som ett alternativ till hemlagad plast torg och även bilder, som beskrivs i nästa stycke, använder kommersiella lim in situ PCR och hybridiseringstekniker kammare (25 mikroliter). Man kan nog också använda återanvändbara silikon isolatorer för cellodling, även om detta inte har testats grundligt ännu. - För såväl diabilder, smälta 20-30 g paraffinvax (56-57 ° C) i en 50 ml glasbägare på en varm platta. Med en 20 mikroliter pipett, spred en 5 mikroliter droppe paraffin på vardera sidan av centrum av en subbed bild. Tryck på en plast torg i paraffin och placera bilden på värmeplattan. Paraffinet smälter och bör spridas jämnt under plast torget.
- Ta bilden från den varma plattan och låt den svalna. Placera ett stöd under varje ände av bilden, så att bilden inte kommer i kontakt med tablETOP under kylningsprocessen. Om paraffin svalnar för snabbt, kan det dra bort från det centrala hålet. Förbered 10 eller fler och diabilder: varje GV preparat använder en ny brunn bild.
- För glid bärare för centrifugering, använder speciellt konstruerade bärare för rotorn används. Flera tillverkare erbjuder centrifuger med bärare för 96 - och plastplattor. Dessa bärare kan anpassas helt enkelt för att hålla objektglas.
3. Isolering av oocyter
- Placera en vuxen hona groda (Xenopus laevis eller Xenopus tropic) eller salamander (Ambystoma mexicanum) i tillräckligt bedövningsmedel lösning för att täcka djuret helt. När djuret upphör rörelse, placera den magen upp på en bädd av flisas is i en lämplig behållare.
- Med kirurgiska saxar gör en 2-3 cm snitt i nedre delen av buken sidled till mittlinjen. Flytta de inre organen försiktigt åt sidan för att hitta äggstocken på den sida av snittet (there finns två äggstockar, en på vardera sidan av buken). Klipp ut en del av äggstocken med tillräckligt äggceller för de planerade experiment. Eftersom det finns tusentals ägg i varje äggstock, en relativt liten bit av äggstocken - kommer (en 3 cm) vanligen tillräcklig.
- Placera en eller några bitar av äggstockarna i OR2 saltlösning i en stor petriskål (100 mm) vid rumstemperatur. Oocyter kan lagras i gott skick under flera dagar, om skadade ägg avlägsnas och OR2 lösning ändras dagligen.
- Sutur snittet med kirurgiska siden och tillbaka djuret till en enskild glasskål för återvinning. Lägg bara tillräckligt "groda vatten" för att täcka djuret tills det återfår medvetandet (ca 15 min). Efter djuret visar frivilliga rörelser, fyll skålen med vatten. Även bör användas färskvatten, är sterilitet inte nödvändigt, eftersom amfibier nästan aldrig bli infekterade efter operation. Om så önskas kan neomycin appliceras på suturerna. Såret läker vanligtvis helt efter en few dagar och samma djur kan användas igen efter ca 2 månader.
4. Isolering av en Germinal vesikel (GV)
- Placera en portion av ovary (10 - 20 stora oocyter) i en liten petriskål (35 x 10 mm) innehållande OR2-lösning.
- Ta bort en oocyt från äggstocken använder två par # 5 jeveleraraffärer pincett för att riva den tunna stjälk av vävnad som ansluter oocyten till äggstocken väggen. Placera ägget i en annan liten petriskål med GV isoleringsmedium.
OBS: Tillståndet för LBC beror på storleken (löptid) i äggcellen. LBC når maximal längd med framstående öglor i oocyter som är något mindre än full storlek. De mest mogna ägg innehåller ofta korta kromosomer med kontrakterade slingor. - Utför följande steg under låg förstoring av ett dissektionsmikroskop (fält diameter ungefär 10-20 mm).
- Ta tag i äggcellen med båda paren av tång nära djuret pol (mörk halvklotet) och göra en smalla tår. Titta i den extruderade äggula för den transparenta äggcellen kärnan, även kallad germinal vesikel eller GV.
- Alternativt, peta ett stort hål nära djuret polen med en pincett och försiktigt pressa ut GV tillsammans med äggula (Figur 2).
- Rulla försiktigt GV bort från huvuddelen av äggula. Vanligtvis kommer det att finnas en liten mängd äggula tätt vidhäftande till GV.
5. Borttagning av kärnhöljet
- För X. laevis och X. tropicalis, överföra GV från isoleringsmediet till spridningsmediet inom 60 sekunder av isolering, även om det fortfarande finns en liten vidhäftande äggula.
OBS: GVS av dessa två arter "härda" inom cirka 60 s om de lämnas i isoleringsmediet och kommer inte att sprida sig i efterföljande steg. Därför hastigheten är av yttersta vikt när man undersöker Xenopus GV innehåll.- Ta tag i kärnhöljet nära toppen av GV med ett parav juvelerare pincett, noga med att inte trycka ner. Ta tag i kuvertet med ett andra par av pincett så nära den första som möjligt. Dra de två paren av pincett bort från varandra och de GV innehåll kommer "pop" ut fritt från kuvertet, som vidhäftar tätt till den ena eller båda pincett.
- Plocka upp GV innehållet i ett glas pipett eller en justerbar 20 pl mikropipett. Om du använder en justerbar pipett in pipetten till 10 mikroliter och avskurna slutet av plast spets med ett rakblad. Rita i 5 mikroliter av vätska innan plocka upp GV i de återstående 5 pl.
- Överför fortfarande gelade kärn innehåll till centrum av en väl glida tidigare fylld med spridning lösning. Spridningslösningen måste ha en konvex yta så att en bubbla inte kläms när täckglas tillsätts.
- Lägg till en täck (18 mm) och placera bilden i en fuktig kammare. Kärnkrafts gel långsamt sprida över nästa 10-60 minuter, så att kromosomens och kärnorganeller kommit att ligga på ytan av glasskivan.
OBS: GVS av salamandrar A. mexicanum och N. viridescens inte "härda" otillbörligt i isoleringsmediet. Därför kan man fortsätta mer avslappnad med avlägsnande av kärnhöljet än en burk med Xenopus.
- Ta bort kärnhöljet från en salamander GV som beskrivs i avsnitt 5.1.1, men gör det i isoleringsmediet.
- Plocka upp något gelade GV innehåll med en pipett och överföra till en petriskål som innehåller spridnings lösning.
- Snabbt skölja ur pipettspetsen i spridnings lösning, plocka upp kärn gel, och placera den i mitten av en väl glida tidigare fylld med spridning lösning. Lägg till ett 18 mm täckglas och placera hela bilden i en fuktig kammare. Kärnkrafts sav kommer sakta sprida över nästa 10-60 minuter och kromosomer och kärnorgan kommer att ligga på glasytan. </ Ol>
6. Preliminär Observation av LBC och organeller
- Visa LBC och kärnorgan av faskontrast (konventionell upprätt mikroskop) vid låg förstoring efter spridning av kärn innehållet i spridningskammaren. Eftersom kammaren är cirka 1 mm djup och kärn innehållet i botten, använd en låg förstoring mål med en lång arbetsavstånd (5X - 10X).
OBS: Det främsta skälet till att undersöka beredningen vid denna tidpunkt är att avgöra om det är värt att bära genom nästa steg. I en bra förberedelse kromosomerna är obruten och har sjunkit till botten av kammaren. Fortsätt till centrifugeringssteget inom en timme för att göra preparatet, eftersom detta kommer att säkerställa en optimal fastsättning av lampbrush kromosom öglorna på glaset.
7. centrifugering av Nuclear Innehåll
- Placera en bit filterpapper på täck och tryck neratt avlägsna överskottsvätska från kammaren.
- Sätta ca 1 mm 3 vaselin på varje sida av täckglas. Smält vaselin med en metallstång upphettas till cirka 70-80 ° C för att täta täck på den underliggande plast torget.
- Placera objektglasen i glid bärare för centrifugering, och se till att motsatta bärare är balanserade. Centrifugera bilderna på cirka 4800 xg under 30 min - 1 timme. vid 4 ° C. Använd långsam start-funktionen på centrifugen.
8. Fastställande Nuclear Innehåll
- För de flesta efterföljande procedurer, fixa kärn innehåll med paraformaldehyd.
- Sätt en bild rack i en standardobjektglas färgskål och sedan placera bilderna individuellt i racket. Tillsätt tillräckligt fixativ för att täcka bilderna (2-4% paraformaldehyd i OR2 eller PBS).
- Med ett par trubbiga pincett, tryck täck sidled, plocka upp och kasta det i rätt glas papperskorgen.Låt bilderna i fixativ under minst 15-30 minuter. För in situ hybridisering och fläckar mest antikropps längre fixering (h eller d) är tillåtna.
- För att ta bort plast torg, plats glider en åt gången i iskall OR2 eller PBS i en färgskål. Sätt i ett vasst rakblad vid kanten av plast torget och bända loss den.
OBS: Helst plasten kommer att lossna rent, lämnar alla paraffinvax på bilden. Vaxet någon funktion: eftersom det omger den lilla centrala området där kärninnehållet är knutna till bilden, fungerar den som en fördämning som gör att man kan arbeta med små volymer (5-10 mikroliter) av reagens för immunfärgning, osv. Diabilder kan hållas på obestämd tid i kall OR2 eller PBS.
9. Immunfärgning av LBC och Nuclear Organ
- Ta bort en fast GV preparat från lagret i OR2 eller PBS. Torka bort överskottsvätska och placera på stöd i en fuktig kammare. En bekväm ChambER är en 90 x 15 mm petriskål innehållande ett 90 mm cirkel av fuktigt filterpapper.
OBS: Vid denna punkt kärn innehållet stadigt fäst till bilden i en 5 mm cirkulärt område fritt från paraffinvax. Eftersom vaxet är vattenavvisande, kan en ändra lösningar genom att lägga till och ta bort små volymer av vätska till kanten av det centrala området med en 20 mikroliter pipett. Den största försiktighet är att undvika att röra vid vaxfria område med pipettspetsen. - Utföra immunfärgning med små volymer (10 - 20 fil) av reagens. Eftersom kromosomerna och kärnorgan är mycket liten och i omedelbar kontakt med tillsats av reagens, kan färgningsprotokoll vara kort. Primära och sekundära antikroppsfärgningstider kan vara så kort som 1 h eller mindre. Ta inte med tvättmedel i alla steg, eftersom detta skadar beredningen. Om så önskas, färgas beredningen med DAPI (1 | ig / ml) under 10 - 20 min för att accentuera axlarna hos LBC.
- Montera i glycerol eller en kommersiell fästeing medium som är lämpligt för immunofluorescens. För att undvika att fånga en luftbubbla under monteringssteget Gör så här.
- Dra 15 mikroliter av monteringsmedium in i spetsen av en 20 mikroliter pipett. Ta bort så mycket vätska som möjligt från området omedelbart kring den nukleära spridningen av "uppsugning" den med en bit filterpapper (skuren i form av en mycket tunn triangel från en 90 mm cirkel av # 1 filterpapper).
- Pipett större delen av monteringsmedium på preparatet, var noga med att inte röra vid området av kärn spridning. Placera de senaste 1 mikroliter eller så av monteringsmedium i mitten av en 22 mm täck (tjocklek # 1,5). Vänd täck över förberedelserna och släpp försiktigt på plats.
- För tillfälliga fästen, upp till ett par dagar, använda 1 mg / ml fenylendiamin i 50% glycerol. För permanenta fästen, särskilt för Superresolution studier, använda en låg fluorescens medium som härdar till ett brytningsindex på ca 1,46.
10. Fluorescent In Situ Hybridisering (FISH) av LBC och Nuclear Organ
- Eftersom FISH protokoll kräver vanligtvis ett steg vid förhöjd temperatur, ta bort paraffinvax från beredningen. Skrapa med ett rakblad, även om förfarandet är omständligt och kan leda till skador av preparatet. Det är nyttigt att markera det område av preparatet på baksidan av sliden med en diamantspets.
- Alternativt upplösa paraffinvax med xylen. Inrätta en serie Coplin burkar eller färgningsskålar innehållande: 30%, 50%, 70%, 95% och 100% etanol; 3 behållare xylen; 2 fler behållare med 100% etanol och en aceton.
- Placera bilder i bildbäraren och torka dem i etanolserie och lämnar slides 3-5 minuter i varje koncentration (kortare tider om upprörd).
- Lös paraffinvax genom att bilderna genom de 3 behållarna xylen, ca 5 minuter vardera om upprörd. Ta bortxylen genom att passera genom två 100% etanoler, och slutligen avlägsna etanolen med aceton. Ta bilderna från aceton och luta dem torka.
- Utföra in situ-hybridisering med användning av någon standardprotokoll. 15,16
11. Isolering av en GV enligt Oil
- Plocka upp en äggcell från OR2 lösning med juvelerare pincett, inklusive så lite omgivande vävnad som möjligt. Placera oocyten på en liten bit av # 1 filterpapper. Överskott OR2 lösning kommer att övergå till filterpapper, lämnar äggcellen nästan fri från vätska. Plocka upp den "torra" äggcellen och placera den under ytan av låg vikt mineralolja (paraffinolja) i en liten petriskål (35 x 10 mm).
- Med en fin volfram nål eller en pinne av pincett, peta ett litet hål i äggcellen nära den mörka djur pol. Plocka upp äggcellen med en pincett (undvika tips) och pressa försiktigt. GV kommer pressa tillsammans med en mindre eller lArger mängden äggula på dess yta (figur 3).
- Ta bort så mycket äggula som möjligt genom att försiktigt sopa GV med sidan av tången. I de flesta fall kommer det att vara svårt att ta bort all äggula. Men för de flesta ändamål en liten mängd av äggulan är inte ett problem.
- Att observera GV innehåll, platta GV i större eller mindre utsträckning.
- Ta bort plast torget från en brunn bild och använda den återstående paraffinvax som en grund behållare för paraffinolja. 10 Plocka upp GV tillsammans med paraffinolja i en 20 mikroliter pipett och överföra till mitten av paraffinområdet. Lägg en täck och observera innehållet i den delvis tillplattade GV. Denna teknik inte skadar LBC.
- Alternativt platta GV till cirka 10 um tjocklek för observation av kärnorganeller.
- Skära av de sista 1 mm av en plast pipettspets med en vass rakblad. Suga GV itippa tillsammans med exakt 5 mikroliter av mineralolja. Extrudera GV och all olja på mitten av en 22 mm täckglas.
- Sänka en standard 3 "x 1" glasskiva sakta tills det bara rör oljedroppe. Nedgången och täck kommer att lyftas av kapillärkraften och oljan kommer att sprida sig till kanterna på täckglas. När droppen har spridit sig helt, kommer oljan att vara ungefär 10 | j, m tjockt. De LBC skadas och stora nukleolerna kommer att komprimeras något, men de flesta av de mindre kärnorgan visas mer eller mindre som de existerar i den intakta GV (Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att undersöka jätte lampbrush kromosomer man börjar genom att isolera ägg från en groda eller salamander. Figur 1 visar en grupp av mogna oocyter i en buffrad salinlösning efter avlägsnande från äggstocken hos groda, Xenopus. Sådana ägg kvar i gott skick för dagar vid rumstemperatur. Kärnan (eller germinal vesikel) avlägsnas sedan från en oocyt med jeveleraraffärer pincett, antingen i en koksaltlösning (figur 2) eller i olja (figur 3). De nukleära innehållet i en olje isolerad kärna kan undersökas genom att försiktigt kläm kärnan och observera genom faskontrast eller differentiell interferenskontrast (DIC) mikroskopi. Att undersöka innehållet i en kärna som har isolerats i en saltlösning, måste man först ta bort kärnhöljet med jeveleraraffärer pincett och tillåta innehållet att sedimentera på ett objektglas. Preparatet centrifugeras sedan för att fästa than kromosomer fast bilden, varefter kromosomerna kan färgas med en antikropp (Figur 4) eller utsattes för in situ hybridisering. De lampbrush kromosomer salamandrar är mycket större än de av grodor (Figur 5). I båda fallen individuella transkriptionsenheter (gener) kan ses som öglor av kromatin utskjutande i sidled från kromosomen axeln.
Figur 1: Mogna oocyter från groda X. tropicalis. Äggstockarna av en mogen kvinna groda innehåller tusentals ägg i olika stadier av mognad. Den minsta är storleken på somatiska celler och har redan nått profas av den första meiotiska delningen. Som äggcellen växer gradvis ackumuleras det äggula, vilket ger cellen en ogenomskinlig vit utseende. Den största mattanure oocyter, som visas här, förvärva en mörkare cap grund av ansamling av melaninpigment. De största oocyter av X. tropicalis är ca 0,8 mm i diameter, de X. laevis ca 1,4 mm, medan de i Axolotl är en enorm 2,2 mm. Utom för storlek, alla tre är likartade i allmänna utseende. Skalstreck = 1 mm.
Figur 2: Borttagning av GV från en oocyt X. tropicalis. Vänster. Ett litet hål gjordes med jeveleraraffärer pincett i mörkare animaliska polen på en oocyt och GV försiktigt extruderas. I det här exemplet var GV nästan fri från äggula som det kom ut ur äggcellen. Vidhäftande äggula kan avlägsnas genom att suga GV in och ut ur en pipett med en spetsdiameter bara något större än diametern på GV självt. Höger. Three GVS av X. tropicalis. Dessa GVS lämnades några minuter i en något surt medium (GV isoleringslösning justerad till pH 5,8), som orsakar kärnhöljet att svälla bort från de gelade nukleära innehållet. GVS behandlats på detta sätt kommer inte sprids för cytologisk undersökning. Men sådana GSV är idealiska för molekylär analys: kuvertet kan tas bort med juvelerare pincett, vilket ger ett prov av kärn innehåll helt fria från cytoplasma förorening. 17,18 Skala bar = 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: GV X. tropic Isolerade i olja. Vänster. Efter en liten punktering gjordes i äggcellen nära den mörka djur pole, började GV att pressa. I detta fall GV kom ut med nästan ingen vidhäftande äggula. Mitten. GV är nu helt fri från äggcellen cytoplasman. Sådana GVS fortsätta att transkribera RNA i timmar. Höger. Efter GV försiktigt kläm i olja under en täck kan kärnorgan ses av DIC, som visas här, eller genom faskontrast. Hela GV är mycket större än den lilla område som visas här. HLB = histon locus kropp med tre fläckar på sin yta. Skalstreck = 0,5 mm för första två panelerna, 10 | j, m för den tredje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: lampbrush kromosomer (LBC) från Axolotl A. mexicanum. Vänster. Höger. Samma preparat ses av mörkfält belysning. Man kan nu se de många ofärgade förstärkta nukleolerna. Skalstreck = 250 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: A Single LBC från Axolotl A. mexicanum och Frog X. tropicalis, med samma förstoring. Dessa bilder illustrerar den extrema storleksskillnaden mellan LBC av en salamander och en groda (infälld). Storleken difference korrelerar med den totala DNA-innehållet i genomen (ca 30 pund för A. mexicanum vs 1,7 pund för X. tropicalis). Individuella sido slingor (transkriptionsenheter) är också mycket längre i salamandern än i grodan. Skalstreck = 100 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De första observationerna av "levande" LBC från hand isolerade GVS av grodor och salamandrar gjordes nästan 80 år sedan av den amerikanska biologen William Duryee, 19 före införandet av faskontrast och DIC mikroskopi, innan fluorescerande immunfärgning, och innan FISH. Fördelarna med LBC för att undersöka uppgifter om kromosomstrukturen och transkription på individuell gennivå krävs utveckling av tekniker för att fästa LBC till objektglas, för att fixera dem på ett verklighetstroget sätt, och att tillämpa molekylära tekniker utan att förstöra deras grundläggande morfologi. Nästan varje teknik för att uppnå dessa mål krävs en viss anpassning till de arter som omfattas av undersökningen och vissa kompromiss mellan levande bevarande och molekylär karakterisering. Till exempel GVS och LBC av tailed amfibier är ovanligt lätt att arbeta med på grund av sin enorma storlek och den lätthet med vilken de GV innehållet löses upp i ett lämpligt medium. Until nyligen, dock mycket lite känt om deras genomik, vilket gör det svårt att korrelera den rikedom av cytologiska funktioner med molekylära detaljerna. Omvänt, LBC av Xenopus är ganska små jämfört med de tailed amfibier (Figur 5), men genomen hos både X. tropic och X. laevis har sekvenserats och är tämligen väl kommenterad.
För de första som använder amfibie GVS, kommer den stora utmaningen är att isolera GV och ta bort kärnhöljet utan att skada LBC. Hittills har ingen en upptäckt ett sätt att ta bort kuvertet med undantag för hand med jeveleraraffärer pincett. Det skulle vara ett stort tekniskt framsteg om ett sätt befanns "lösa" eller "smälta" kuvertet men lämna kromosomer och andra kärnorgan oskadade. En sådan teknik skulle vara lika användbar för molekylära studier. I våra undersökningar på nukleär och cytoplasmisk RNA fann vi det nödvändigt attavlägsna kärnhöljet före analys av kärn RNA (figur 2). 17,18 Om kuvertet inte avlägsnas, är den lilla mängden nukleärt RNA överväldigade av kontaminerande cytoplasmiskt RNA som fäster på utsidan av kuvertet.
En annan stor förbättring skulle vara upptäckten av något sätt att fästa LBC mer tätt till ett objektglas. Centrifugering av beredningen är kritisk, men även förlängd centrifugering (1 h vid 4500 xg) säkerställer inte fastsättning. Man kan oftast berätta när LBC är väl fäst genom att undersöka dem med faskontrast i medel förstoring. Väl fäst kromosomer visar ingen Brownsk rörelse alls. Om någon Brownsk rörelse av slingorna är detekterbar, kommer efterföljande immunfärgning eller fisk protokoll leda till omfattande skador eller förlust av material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. Lampbrush Chromosomes. 36, Springer-Verlag. (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G.
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
