Summary
Nous présentons des techniques simples pour isoler géants chromosomes plumeux transcriptionnellement actifs à partir d'ovocytes de grenouilles et de salamandres vivant. Nous décrivons comment observer ces chromosomes "vivant" par contraste de phase ou de contraste d' interférence différentiel, et comment les fixer pour hybridation in situ fluorescente ou immunofluorescence dans.
Abstract
Nous décrivons des méthodes pour étudier les chromosomes géants transcriptionnellement actifs plumeux (LBC) trouvés dans l'ovocyte, ou l'oeuf unlaid, des grenouilles et des salamandres. LBC individuels peuvent être jusqu'à 1 mm de longueur et ils résident dans un noyau gigantesque, se jusqu'à 0,5 mm de diamètre. La grande taille des chromosomes permet des observations sans précédent de gènes actifs par microscopie optique à lumière, mais en même temps, des techniques spéciales sont nécessaires pour isoler le noyau, en enlevant l'enveloppe nucléaire, et la propagation des chromosomes sur une lame de microscope. Le noyau de l'ovocyte, également appelé la vésicule germinale (GV) est isolé dans un milieu qui permet une gélification partielle de l'actine nucléaire et préserve la structure délicate des LBC. Cette étape est réalisée manuellement sous un microscope à dissection à l'aide des pinces de bijoutier. Ensuite, l'enveloppe nucléaire est retirée, à nouveau manuellement à l'aide des pinces de bijoutier. Les matières nucléaires sont rapidement transférés vers un milieu dispeÉSA le gel d'actine et permet aux LBC intactes pour régler sur une lame de microscope. À ce stade, les LBC et autres organites nucléaires peuvent être consultés par contraste de phase ou de contraste d'interférence différentiel microscopie, bien que les détails plus fins sont obscurcis par le mouvement brownien. Pour l'observation de résolution microscopique élevée ou l'analyse moléculaire, l'ensemble de la préparation est centrifugée pour attacher les LBC délicates fermement à la diapositive. Une brève fixation dans paraformaldéhyde est ensuite suivie par immunofluorescence ou par hybridation in situ. LBC sont dans un état transcriptionnellement actif et de leur taille énorme permet une analyse moléculaire au niveau du gène individuel utilisant confocale ou nanoscope.
Introduction
La plupart des vertébrés, à l'exception notable des marsupiaux et des mammifères placentaires, produisent de gros œufs yolky. En dépit de leur taille énorme, parfois, ces œufs sont des cellules uniques qui atteignent leur dimension finale tout en restant dans l'ovaire de la femelle. Oeufs ovariens sont appelés ovocytes et contiennent généralement un seul noyau géant, connu depuis le début du 19 e siècle comme la vésicule germinale ou simplement GV. 1 Ovocytes des grenouilles de laboratoire communes, Xenopus laevis et Xenopus tropicalis, atteignent un diamètre maximal de 1,2 mm et 0,8 mm respectivement (figure 1). GVS de ovocytes matures de ces deux grenouilles sont de 0,3 - 0,4 mm de diamètre (figures 2, 3). Salamandres ont généralement ovocytes et GV encore plus. Ovocytes entièrement matures de l'axolotl mexicain, Ambystoma mexicanum, sont plus de 2 mm de diamètre et la GV est d' environ 0,5 mm. Ainsi, ces noyaux sont facilement visibles à l'oeil nu et peutmanipuler de nombreuses manières qui sont impossibles avec les noyaux de cellules somatiques typiques.
Tout aussi remarquable est la taille gigantesque des chromosomes au sein de la GV, un fait déjà reconnu à la fin du 19 ème siècle. Chromosomes individuels de Ambystoma et d' autres salamandres peuvent être jusqu'à 1 mm de longueur (figures 4, 5). Ceux de Xenopus sont considérables plus petit, mais avec des longueurs allant jusqu'à 100 um ou plus, ils éclipsent les chromosomes somatiques typiques de la plupart des organismes. Une caractéristique importante de chromosomes ovocyte est leur activité transcriptionnelle extraordinaire, ce qui conduit à l' un de leurs plus caractéristiques morphologiques caractéristiques - des centaines de boucles latérales appariées (figure 5). Chaque boucle est constituée d'une ou de quelques unités de transcription qui synthétisent activement l'ARN. Les boucles donnent ovocyte chromosomes une apparence floue, ce qui a conduit au nom "lampbrush" chromosome après leur superficielleressemblance avec les pinceaux utilisés dans les premiers temps de nettoyer les cheminées de lampes au kérosène. 2
L'objectif de cet article est sur l'utilisation de GV isolées pour étudier et LBC organites nucléaires (nucléoles, les organismes de locus histone et mouchetures). Deux techniques assez différentes seront décrites. Dans la première technique, plus commune, GV sont isolés dans une solution saline à l'aide des pinces de bijoutier, brièvement rincé pour éliminer le jaune adhérent, et l'enveloppe nucléaire est retiré, encore une fois avec une pince de bijoutier. Le contenu gélatineux, contenant les LBC et des organites nucléaires, peuvent se déposer sur une lame de microscope en verre ou lamelle. Ces préparations peuvent être examinées directement par contraste de phase ou microscopie DIC. Alternativement, les préparations peuvent être centrifugés pour fixer les LBC et organites à la diapositive ou lamelle. De telles préparations peuvent ensuite être traitées pour une analyse moléculaire détaillée des acides nucléiques et de protéines, principalement par immunofluorescence et fluorescent hybridation in situ (FISH). 3-7
Une seconde technique implique l'isolement du GV dans de l'huile minérale. 8 GV de pétrole isolé restent transcriptionnellement actif pendant de nombreuses heures et sont potentiellement utiles pour les études où l' on veut le contenu nucléaires soient aussi réalistes que possible. 9,10 Parce que l'indice de réfraction de la "sève" nucléaire est proche de celle des LBC et autres organites nucléaires (figure 3), les techniques microscopiques peut être un défi avec GV de pétrole isolé.
Enfin, en raison de leur taille et leur facilité de manipulation, GVS matériau idéal pour des études sur l'enveloppe nucléaire. Le complexe du pore nucléaire a été décrite à partir études au microscope électronique sur des enveloppes GV amphibien 11 et des observations plus récentes SuperResolution ont utilisé le même matériau. 12,13
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Protocol
Informations générales sur les grenouilles et les salamandres, ainsi que des sources d'animaux, peuvent être trouvés sur les sites suivants: Xenbase (http://www.xenbase.org) et Sal-Site (http://www.ambystoma.org). Ce protocole suit les directives de protection des animaux du ministère de l'embryologie de la Carnegie Institution for Science.
1. Solutions
- Faire 10 L "eau de grenouille": Ajouter 10 ml de 1 M CaCl 2 et 10 ml de 1 M NaHCO 3 à 10 L désionisée ou H 2 O déchlorée sous agitation.
- Faire 1 L 20% paraformaldéhyde: Faire 1 L de 4 mM Na 2 CO 3. Dans une hotte chimique ajouter 200 g de paraformaldéhyde en poudre, et on chauffe à environ 80 ° C pour dissoudre. Cool, et le filtre à travers un papier filtre. Attention: paraformaldéhyde est toxique et doit être manipulé avec précaution. Vous pouvez également acheter une solution de paraformaldehyde commercial.
- Faire 1 L solution anesthésique amphibien: Ajouter 1,5 g de 3-aminobenméthanesulfonate benzoate à 1 L d'eau de grenouille. Ranger à température ambiante.
- Faire 1 L milieu de culture ovocyte OR2 14: NaCl 82,5, 2,5 mM de KCl, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, 1 mM Na 2 HPO 4, 5 mM de HEPES (500 mM, pH 8,3). Le pH final sera d'environ pH 7,8. Ajouter 100 mg d'ampicilline et 100 mg de streptomycine pour empêcher la croissance bactérienne.
- Faire 1 litre Solution d'isolement GV: KCl 83 mM , NaCl 17 6,5 mM , Na 2 HPO 4, 3,5 mM de KH 2 PO 4, 1 mM de MgCl2, 1 mM de dithiothréitol (DTT). Ajuster le pH à 7,0.
- Faire 100 ml d'une solution de dispersion GV: 20,7 mM de KCl, 4,3 mM de NaCl, 1,6 mM de Na 2 HPO 4, 0,9 mM de KH 2 PO 4, 1 mM de MgCl2, 1 mM de dithiothréitol (DTT), 0,1% de paraformaldehyde. Ajuster le pH à 7,0. Pour faciliter davantage la dispersion rapide du gel nucléaire, ajouter 10-50 uM de CaCl2.
- Faire une solution sous-jacente de 500 mL. Swell 0,5 g de gélatine commerciale 20 ml de H 2 O pendant 5 - 10 min. Ajouter 500 ml d' ébullition de H 2 O et soigneusement agiter pour dissoudre la gélatine. 50 mg CRK Refroidir et ajouter (SO 4) 2 · 12 H 2 O. Filtre avec aspiration et conserver à 4 o C.
- Faire 10 ml de milieu de montage. Dissoudre 10 mg phénylènediamine dans 5 ml de PBS (135 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 4,3 mM de Na 2 HPO 4, 1,5 mM de KH 2 PO 4, ajusté à pH 9). Ajouter 5 ml de glycérol. Magasin dans 250 aliquotes pi à -80 o C.
2. Matériaux
- Pour les diapositives Subbed, lieu de 3 pouces x 1 pouce microscope en verre glisse dans une solution de détergent commercial et les frotter pour enlever les contaminants. Placez dans un rack de diapositives et bien rincer à l'eau du robinet, puis dans de l'eau déminéralisée. Plonger les lames dans la solution sous - jacente, les égoutter à un angle, et cuire au four pendant une nuit à 60 o C.
- Pour carrés en plastique, couper 25 mm carrés à partir d'une feuille de 1 mm d'épaisseur de poly (méthacrylate de méthyle). Percez untrou 5 mm ronde au centre de chaque carré. Sable les deux faces et les bords de la place ainsi que la circonférence du trou.
NOTE: Comme une alternative à la maison carrés en plastique et les diapositives de puits, comme décrit dans le paragraphe suivant, utiliser l' adhésif commercial PCR in situ et des chambres d'hybridation (25 pi). On pourrait probablement utiliser aussi réutilisables isolateurs en silicone pour la culture cellulaire, bien que cela n'a pas été testé en profondeur encore. - Pour les diapositives ainsi, faire fondre 20 - 30 g de cire de paraffine (56-57 o C) dans un bécher de 50 ml en verre sur une plaque chauffante. Avec une pipette 20 ul, étaler une goutte de 5 pi de paraffine, de chaque côté du centre d'une lame substrate. Appuyez sur un carré de plastique dans la paraffine et placer la lame sur la plaque chaude. La paraffine va fondre et devrait répartir uniformément dans le carré en plastique.
- Retirer la lame de la plaque chaude et le laisser refroidir. Placer un support en dessous de chaque extrémité de la glissière, de sorte que la lame ne touche pas le tablETOP au cours du processus de refroidissement. Si la paraffine refroidit trop rapidement, il peut se détacher du trou central. Préparer 10 ou plusieurs diapositives ainsi: chaque préparation de GV utilise une nouvelle diapositive de puits.
- Pour les transporteurs de diapositives pour la centrifugation, utilisez spécialement construit pour les transporteurs du rotor utilisé. Plusieurs fabricants proposent des centrifugeuses avec des supports pour 96 - et des plaques en plastique. Ces supports peuvent être adaptés assez facilement pour tenir des lames de microscope.
3. Isolement des ovocytes
- Placez une grenouille adulte femelle (Xenopus laevis ou Xenopus tropicalis) ou salamandre (Ambystoma mexicanum) dans suffisamment de solution anesthésique pour couvrir l'animal complètement. Lorsque l'animal cesse le mouvement, placez-le ventre sur un lit de glace ébréchée dans un récipient approprié.
- Avec des ciseaux chirurgicaux font un 2 - incision cm 3 dans le bas ventre latéral de la ligne médiane. Déplacer les organes internes doucement de côté pour trouver l'ovaire, du côté de l'incision (thavant deux ovaires, un de chaque côté de l'abdomen). Découpez une partie de l'ovaire avec suffisamment d'ovocytes pour les expériences prévues. Comme il y a des milliers d'ovocytes dans chaque ovaire, relativement petit morceau de l'ovaire (1 - 3 cm) est habituellement suffisante.
- Placez un ou quelques morceaux de l'ovaire en OR2 saline dans une grande boîte de Pétri (100 mm) à la température ambiante. Les ovocytes peuvent être stockés en bon état pendant plusieurs jours, si les ovocytes endommagés sont éliminés et la solution OR2 est changé tous les jours.
- Suturer l'incision avec de la soie chirurgicale et retourner l'animal à un bol en verre individuel pour la récupération. Ajoutez juste assez "eau de grenouille" pour couvrir l'animal jusqu'à ce qu'il reprenne conscience (environ 15 min). Après que l'animal montre des mouvements volontaires, remplir le bol avec de l'eau. Bien que l'eau fraîche doit être utilisée, la stérilité est pas nécessaire, car les amphibiens presque jamais être infectés après la chirurgie. Si on le désire, la néomycine peut être appliquée sur les points de suture. La blessure guérit habituellement complètement après une few jours et le même animal peuvent être utilisées à nouveau après environ 2 mois.
4. Isolement d'un vésicule germinale (GV de)
- Placer une partie de l'ovaire (10 - 20 grands ovocytes) dans une petite boîte de Pétri (35 x 10 mm) contenant une solution OR2.
- Retirer un ovocyte de l'ovaire en utilisant deux paires de pinces d'# 5 bijoutier de déchirer la mince tige de tissu qui relie l'ovocyte à la paroi de l'ovaire. Placez l'ovocyte dans une autre petite boîte de Pétri contenant du milieu d'isolement GV.
NOTE: L'état de la LBC dépend de la taille (maturité) de l'ovocyte. LBC atteignent une longueur maximale avec des boucles de premier plan dans les ovocytes qui sont un peu moins de la taille normale. Les ovocytes les plus matures contiennent souvent des chromosomes courts avec des boucles contractées. - Effectuez les étapes suivantes sous faible grossissement d'un microscope à dissection (diamètre de champ d'environ 10 - 20 mm).
- Saisir l'ovocyte avec les deux paires de pinces à proximité du pôle animal (hémisphère sombre) et faire une smtoute larme. Regardez dans le jaune extrudé pour le noyau de l'ovocyte transparent, également appelé la vésicule germinale ou GV.
- Sinon, percer un grand trou près du pôle animal avec une paire de pinces et presser doucement le GV avec le jaune (figure 2).
- Roulez doucement le GV loin de la majeure partie du jaune. Habituellement, il y aura une petite quantité de jaune adhérant fermement à la GV.
5. Retrait de l'enveloppe nucléaire
- Pour X. laevis et X. tropicalis, transférer le GV à partir du milieu d'isolement au milieu d' étalement dans les 60 s d'isolement, même s'il y a encore un peu de jaune adhérente.
NOTE: GV de ces deux espèces "durcir" dans environ 60 s si laissé dans le milieu de l'isolement et ne se propage pas dans les étapes suivantes. Par conséquent , la vitesse est de la plus haute importance lors de l' examen contenu Xenopus GV.- Attrapez l'enveloppe nucléaire près de la partie supérieure de la GV avec une pairedes pinces de bijoutier, en prenant soin de ne pas enfoncer. Saisir l'enveloppe avec une deuxième paire de pinces au plus près du premier que possible. Tirer les deux paires de pinces l'une de l'autre et du contenu GV sera "pop" hors connexion de l'enveloppe, qui adhère étroitement à une ou deux pinces.
- Ramassez le contenu GV dans une pipette en verre ou un réglage de 20 ul micropipette. Si vous utilisez une pipette réglable, régler la pipette à 10 pi et couper l'extrémité de la pointe en plastique avec une lame de rasoir. Dessiner dans 5 pi de liquide avant de prendre la GV dans les 5 pi restants.
- Transférer le contenu nucléaires encore gélifiées au centre d'une lame de puits préalablement rempli avec une solution d'étalement. La solution d'étalement doit avoir une surface convexe de telle sorte qu'une bulle ne soit pas coincé lorsque la lamelle est ajouté.
- Ajouter une lamelle (18 mm) et placer la lame dans une chambre humide. Le gel nucléaire va lentement se disperser sur les 10 prochaines - 60 min, de sorte que le chromosomes et des organites nucléaires viennent se placer sur la surface de la lame de verre.
NOTE: GVS des salamandres A. mexicanum et N. viridescens ne "durcissent" pas indûment dans le milieu d'isolement. Par conséquent , on peut procéder plus tranquille avec le retrait de l'enveloppe nucléaire que l' on peut avec Xenopus.
- Retirez l'enveloppe nucléaire d'un GV salamandre comme décrit dans la section 5.1.1, mais le faire dans le milieu d'isolement.
- Ramassez le contenu GV légèrement gélifiés avec une pipette et transférer dans une boîte de Pétri contenant une solution d'étalement.
- Rincer rapidement la pointe de la pipette dans la solution d'étalement, ramasser le gel nucléaire, et le placer dans le centre d'une lame de puits préalablement rempli avec une solution d'étalement. Ajoutez un 18 mm lamelle et placer la lame entière dans une chambre humide. La sève nucléaire va lentement se disperser sur les 10 prochaines - 60 min et les chromosomes et les organites nucléaires viendra se coucher sur la surface du verre. </ Ol>
6. Observation préliminaire de LBC et Organelles
- Voir les LBC et des organites nucléaires par contraste de phase (microscope droit conventionnel) à faible grossissement après la dispersion du contenu nucléaire dans la chambre de propagation. Parce que la chambre est d'environ 1 mm de profondeur et le contenu nucléaires sont au fond, utilisez un objectif à faible grossissement avec une longue distance de travail (5X - 10X).
NOTE: La principale raison de l'examen de la préparation à ce moment est de déterminer si cela vaut la peine de transport à travers les prochaines étapes. Dans une bonne préparation, les chromosomes ne sont pas interrompues et se sont installés au fond de la chambre. Procéder à l'étape de centrifugation à une heure de fabrication de la préparation, ce qui garantira la fixation optimale des boucles lampbrush du chromosome de la diapositive.
7. Centrifugation des matières nucléaires
- Placez un morceau de papier filtre sur la lamelle et appuyezpour éliminer l'excès de liquide de la chambre.
- Mettre environ 1 mm 3 de la gelée de pétrole , de chaque côté de la lamelle. Faire fondre la gelée de pétrole avec une tige métallique chauffée à environ 70 - 80 o C pour sceller la lamelle sur la place du plastique sous - jacente.
- Placer les lames dans les supports coulissants pour centrifugation, en veillant à ce que les transporteurs opposés sont équilibrés. Centrifuger les diapositives à environ 4.800 xg pendant 30 min - 1 h. à 4 o C. Utilisez la fonction de démarrage lent sur la centrifugeuse.
8. Fixation des matières nucléaires
- Pour la plupart des procédures ultérieures, fixer le contenu nucléaire avec paraformaldehyde.
- Mettez une grille coulissante dans un plat de coloration de lame de microscope standard, puis placer les diapositives individuellement dans le rack. Ajouter suffisamment fixateur pour couvrir les lames (2-4% de paraformaldehyde dans OR2 ou PBS).
- Avec une paire de pinces émoussées, pousser la lamelle latéralement, le ramasser et le jeter à la poubelle de verre approprié.Laisser les lames dans le fixateur pendant au moins 15 - 30 min. Pour l' hybridation in situ et la plupart des taches d' anticorps dans des périodes plus longues de fixation (h d) sont autorisées.
- Pour retirer le carré en plastique, placer les lames une à la fois dans la glace OR2 froid ou PBS dans un plat de coloration. Insérez une lame de rasoir au bord de la place du plastique et soulevez lâche.
NOTE: Idéalement, le plastique se détache proprement, laissant toute la cire de paraffine sur la lame. La cire joue un rôle utile: puisqu'elle entoure la petite zone centrale où les contenus nucléaires sont fixés au coulisseau, il agit comme un barrage qui permet de travailler avec de petits volumes (5-10 pi) de réactifs pour la coloration immunologique, etc. Diapositives peut être tenu indéfiniment dans OR2 froid ou PBS.
9. Immunomarquage de LBC et Organelles nucléaires
- Retirer une préparation GV fixe de stockage dans OR2 ou PBS. Essuyez l'excès de liquide et placer sur des supports dans une chambre humide. Une chamb pratiqueer est un plat mm 90 x 15 de Pétri contenant un cercle de 90 mm de papier filtre humide.
NOTE: A ce stade, le contenu nucléaires sont fermement attaché à la lame dans un 5 mm zone circulaire libre de la cire de paraffine. Parce que la cire est hydrofuge, on peut modifier les solutions en ajoutant et en enlevant de petites quantités de liquide sur le bord de la zone centrale avec une pipette 20 ul. La précaution principale est d'éviter de toucher la zone exempte de cire avec la pointe de la pipette. - Effectuer immunocoloration avec de petits volumes (10 - 20 pi) de réactifs. Du fait que les chromosomes et les organites nucléaires sont très petites et en contact direct avec les réactifs ajoutés, des protocoles de coloration peut être courte. fois la coloration des anticorps primaires et secondaires peuvent être aussi courte que 1 h ou moins. Ne pas inclure de détergent dans une étape quelconque, car cela provoque des dommages à la préparation. Si on le souhaite, la préparation tache avec du DAPI (1 pg / ml) pendant 10 - 20 minutes pour accentuer les axes des LBC.
- Montage dans le glycérol ou une monture commercialeing milieu approprié pour immunofluorescence. Pour éviter d'emprisonner une bulle d'air lors de l'étape de montage, procéder comme suit.
- Tirez 15 pi de milieu de montage dans la pointe d'une pipette de 20 pi. Retirez autant de liquide que possible de la zone immédiatement autour de la propagation nucléaire par "effet de mèche" hors tension avec un morceau de papier filtre (coupe dans la forme d'un triangle très mince d'un cercle de 90 mm de # 1 papier filtre).
- Pipeter la plupart du milieu de montage sur la préparation, en faisant attention à ne pas toucher la zone de la propagation nucléaire. Placez les dernières 1 pi ou alors de milieu de montage dans le centre d'un 22 mm lamelle (épaisseur # 1.5). Inversez la lamelle sur la préparation et déposez soigneusement en place.
- Pour les montages temporaires, jusqu'à quelques jours, utiliser 1 mg / mL phénylènediamine dans 50% de glycérol. Pour les montages permanents, en particulier pour les études de SuperResolution, utiliser un milieu à faible fluorescence qui durcit à un indice de réfraction d'environ 1,46.
10. Fluorescent In Situ Hybridation (FISH) de LBC et Organelles nucléaire
- Parce que les protocoles FISH nécessitent généralement une étape à une température élevée, enlever la cire de paraffine de la préparation. racler soigneusement avec une lame de rasoir, bien que la procédure est fastidieuse et peut conduire à une détérioration accidentelle de la préparation. Il est utile de marquer la zone de la préparation sur le dos de la lame avec une pointe de diamant.
- Alternativement, dissoudre la cire de paraffine avec du xylène. Mettre en place une série de jarres de Coplin ou des plats de coloration contenant: 30%, 50%, 70%, 95% et 100% d'éthanol; 3 conteneurs de xylène; 2 autres récipients d'éthanol à 100% et une acétone.
- Placer les lames dans le porte-lame et déshydrater dans la série d'éthanol, ce qui laisse coulisseaux 3 - 5 min à chaque concentration des durées plus courtes (si agitée).
- Dissoudre la cire de paraffine en faisant passer les diapositives à travers les 3 conteneurs de xylène, environ 5 minutes chacun si agité. Retirer lexylène en passant par deux 100% éthanols, et enfin éliminer l'éthanol avec de l'acétone. Prenez les diapositives à partir d'acétone et inclinez-les sécher.
- Réaliser une hybridation in situ en utilisant un protocole standard. 15,16
11. Isolement d'un GV dans l'huile
- Ramassez un ovocyte de la solution OR2 avec une pince de bijoutier, y compris le moins de tissu environnant que possible. Placez l'ovocyte sur un petit morceau de # 1 papier filtre. La solution en excès OR2 sera transférée au papier filtre, en laissant l'ovocyte presque exempt de liquide. Décrochez le ovocyte "sec" et le placer sous la surface de l'huile minérale de poids léger (huile de paraffine) dans une petite boîte de Pétri (35 x 10 mm).
- Avec une aiguille de tungstène amende ou une dent de la pince, percer un petit trou dans l'ovocyte près du pôle animal sombre. Décrochez le ovocyte avec une paire de pinces (en évitant les pointes) et presser doucement. Le GV va extruder le long d'un petit ou lMontant de Arger de jaune sur sa surface (Figure 3).
- Retirez le plus jaune que possible en balayant doucement le GV avec le côté de la pince. Dans la plupart des cas, il sera difficile d'enlever la totalité du jaune d'oeuf. Cependant, pour la plupart des utilisations une petite quantité de jaune d'oeuf constitue pas un problème.
- Pour observer le contenu GV, aplatir le GV dans une mesure plus ou moins grande.
- Retirez le carré en plastique à partir d'une lame de puits et utiliser la cire de paraffine restant comme un récipient peu profond pour l'huile de paraffine. 10 Relever le GV avec l' huile de paraffine dans une pipette de 20 pi et le transfert vers le centre de la zone de paraffine. Ajouter une lamelle et observer le contenu de la GV partiellement aplaties. Cette technique n'endommage pas les LBC.
- Alternativement, aplatir la GV à environ 10 um d'épaisseur pour l'observation des organites nucléaires.
- Coupez les finales 1 mm d'une pointe de pipette en plastique avec une lame de rasoir. Sucer le GV dans laexactement la pointe avec 5 ul d'huile minérale. Extruder la GV et toute l'huile sur le centre d'une lamelle de verre 22 mm.
- Abaisser une diapositive 3 "x 1" de verre standard lentement jusqu'à ce qu'il touche la goutte d'huile. La chute et la lamelle seront levées par capillarité et l'huile se répandra sur les bords de la lamelle. Lorsque la chute est répandue complètement, l'huile sera d'environ 10 um d'épaisseur. Les LBC seront endommagés et grands nucléoles seront compressés légèrement, mais la plupart des organites nucléaires plus petites apparaissent plus ou moins comme ils existent dans le GV intacte (Figure 3).
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Representative Results
Pour examiner les chromosomes en écouvillon géants on commence par isoler les ovocytes d'une grenouille ou la salamandre. La figure 1 montre un groupe d'ovocytes matures dans une solution saline tamponnée après le retrait de l'ovaire , de la grenouille Xenopus. Ces ovocytes restent en bon état pour les jours à la température ambiante. Le noyau (ou vésicule germinale) est ensuite retirée d' un ovocyte avec une pince de bijoutier, soit dans une solution saline (figure 2) ou dans l' huile (figure 3). Le contenu nucléaire d'un noyau d'huile isolées peuvent être examinés par écrasement doucement le noyau et par l'observation en contraste de phase ou à contraste interférentiel différentiel (DIC), la microscopie. Pour examiner le contenu d'un noyau qui a été isolé dans une solution saline, il faut d'abord retirer l'enveloppe nucléaire avec des pinces de bijoutier et permettre au contenu de se déposer sur une lame de microscope. La préparation est ensuite centrifugée pour fixer til chromosomes fermement sur la lame, après quoi les chromosomes peuvent être colorées avec un anticorps (figure 4) ou soumis à une hybridation in situ. Les chromosomes en écouvillon de salamandres sont beaucoup plus grandes que celles des grenouilles (figure 5). Dans les deux cas individuels des unités de transcription (gènes) peuvent être considérés comme des boucles de chromatine faisant saillie latéralement par rapport à l'axe du chromosome.
Figure 1: ovocytes matures du X. tropicalis Frog. L'ovaire d'une grenouille femelle mature contient des milliers d'ovocytes à différents stades de maturation. Les plus petits ont la taille des cellules somatiques et ont déjà atteint prophase de la première division de la méiose. Comme le ovocyte se développe, il accumule progressivement le jaune, qui donne à la cellule un aspect blanc opaque. Le plus grand tapisoocytes ure, montrées ici, acquièrent une casquette sombre due à l'accumulation de pigments de mélanine. Les plus grandes ovocytes de X. tropicalis sont d' environ 0,8 mm de diamètre, ceux de X. laevis environ 1,4 mm, tandis que celles de l'axolotl sont un énorme 2,2 mm. Sauf pour la taille, tous les trois sont semblables en apparence générale. Barre d'échelle = 1 mm.
Figure 2: Retrait de la GV à partir d' un ovocyte de X. tropicalis. À gauche. Un petit trou a été fait avec des pinces de bijoutier dans le pôle animal plus sombre d'un ovocyte et le GV a été doucement extrudé. Dans cet exemple, le GV était presque libre de jaune comme il est sorti de l'ovocyte. jaune adhérente peut être éliminée par aspiration de la GV dans et hors d'une pipette ayant un diamètre légèrement plus grand que le diamètre de la GV lui-même de la pointe. Droite. Three GV de X. tropicalis. Ces GV ont été laissés quelques minutes dans une (solution de GV d'isolement ajusté à pH 5,8) légèrement acide moyenne, ce qui provoque l'enveloppe nucléaire à gonfler l'écart des matières nucléaires gélifiées. GV traités de cette manière ne se propage pas à l'examen cytologique. Toutefois, ces GV sont idéales pour l'analyse moléculaire: l'enveloppe peut être enlevé avec bijoutiers forceps, fournir un échantillon des matières nucléaires complètement exemptes de contamination cytoplasmique. 17,18 Barre d' échelle = 0,5 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: GV de X. tropicalis Isolé dans l' huile. À gauche. Après une petite piqûre a été faite dans l'ovocyte près de l'obscurité po animalle, le GV a commencé à extruder. Dans ce cas, le GV est sorti avec presque pas de jaune adhérente. Milieu. Le GV est maintenant complètement libre à partir du cytoplasme de l'ovocyte. Ces GV continuent de transcrire l'ARN pendant des heures. Droite. Après la GV est légèrement écrasé dans l'huile sous une lamelle, organites nucléaires peuvent être consultés par DIC, comme montré ici, ou en contraste de phase. L'ensemble de GV est beaucoup plus grande que la petite surface représentée ici. HLB = locus corps histone avec trois petites taches sur sa surface. Barre d'échelle = 0,5 mm pour les deux premiers panneaux de 10 um pour le troisième. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: lampbrush Chromosomes (LBC) à partir du Axolotl A. mexicanum. À gauche. Droite. La même préparation vu par illumination darkfield. On peut maintenant voir les nombreux nucléoles amplifiés non colorées. Barre d'échelle = 250 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: A LBC unique du Axolotl A. mexicanum et les tropicalis Frog X., au même grossissement. Ces images illustrent la différence de taille extrême entre LBC d'une salamandre et une grenouille (encadré). La taille différenC'est en corrélation avec la teneur en ADN total des génomes (environ 30 Gbp pour A. mexicanum vs 1,7 Gbp pour X. tropicalis). boucles latérales individuelles (unités de transcription) sont également beaucoup plus longtemps dans la salamandre que dans la grenouille. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les premières observations de LBC "de vie" de GV isolé main de grenouilles et de salamandres ont été faites il y a près de 80 ans par le biologiste américain William Duryee, 19 avant l'introduction de contraste de phase et microscopie DIC, avant immunomarquage fluorescent, et avant FISH. Les avantages de la LBC pour enquêter sur les détails de la structure des chromosomes et la transcription au niveau du gène individuel développement nécessaire des techniques pour fixer les LBC lames de verre, pour les fixer d'une manière réaliste, et d'appliquer des techniques moléculaires sans détruire leur morphologie de base. Presque toutes les techniques pour atteindre ces objectifs exige une certaine adaptation aux espèces visées par l'enquête et un compromis entre la préservation vivante et la caractérisation moléculaire. Par exemple, VG et LBC d'amphibiens à queue sont exceptionnellement facile à travailler en raison de leur taille énorme et la facilité avec laquelle le contenu GV se dispersent dans le milieu approprié. Uusqu'à récemment, cependant, très peu a été connu au sujet de leurs génomique, ce qui rend difficile de corréler la richesse des caractéristiques cytologiques avec des détails moléculaires. A l' inverse, les LBC de Xenopus sont très petites par rapport à celles des amphibiens à queue (figure 5), mais les deux génomes de X. tropicalis et X. laevis ont été séquencés et sont raisonnablement bien annoté.
Pour les premiers utilisant GV amphibiens, le principal défi sera d'isoler le GV et retirer l'enveloppe nucléaire sans endommager les LBC. À ce jour, personne n'a découvert un moyen de retirer l'enveloppe, sauf à la main avec des pinces de bijoutier. Ce serait un progrès technique majeur si un moyen a été trouvé à «dissoudre» ou «digérer» l'enveloppe, mais laisser les chromosomes et d'autres organites nucléaires en bon état. Une telle technique serait tout aussi utile pour les études moléculaires. Dans nos enquêtes sur l'ARN nucléaire et cytoplasmique nous avons trouvé qu'il est essentiel deretirer l'enveloppe nucléaire avant l' analyse de l' ARN nucléaire (Figure 2). 17,18 Si l'enveloppe est pas retiré, la petite quantité d'ARN nucléaire est submergé par l' ARN contaminant cytoplasmique qui adhèrent à l'extérieur de l'enveloppe.
Une autre amélioration importante serait découverte d'un moyen d'attacher LBC plus étroitement sur une lame de microscope. Centrifugation de la préparation est essentielle, mais même centrifugation prolongée (1 h à 4500 xg) ne garantit pas l'attachement. On peut généralement dire quand LBC sont bien attachés en les examinant avec contraste de phase sous un grossissement moyen. Bien-attachés chromosomes montrent aucun mouvement brownien du tout. Si un mouvement brownien des boucles est détectable, les protocoles de immunocoloration ou FISH subséquentes conduisent à des dommages importants ou de perte de matériel.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
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