Abstract
أربعة إلى ستة أسابيع من العمر، استخدمت فئران ويستار الذكور لإنتاج نماذج حيوانية من تليف الكبد. وتتطلب هذه العملية أربعة أسابيع الإدارة من 10 ملغ / كغ dimethylnitrosamine (DMN)، نظرا البريتونى لمدة ثلاثة أيام متتالية في الأسبوع. تم إجراء الحقن داخل الصفاق في غطاء الدخان كما DMN هو hepatoxin المعروفة ومسرطنة. نموذج لديها العديد من المزايا. أولا، حدوث تغيرات في الكبد يمكن دراستها بشكل متتالي أو في مراحل معينة من الاهتمام. ثانيا، يمكن رصد مرحلة مرض الكبد عن طريق قياس الألانين المصل ألانين (ALT) والألانين اسبارتاتي (AST) الانزيمات. ثالثا، من شدة تلف الكبد في مراحل مختلفة ويمكن التأكد من ذلك تضحية من الحيوانات في نقطة زمنية معينة، تليها الفحص النسيجي لأنسجة الكبد شعري الشكل الملون ماسون. بعد أربعة أسابيع من DMN الجرعات، والنتيجة التليف النموذجية هي 5-6 على نطاق وإسحاق. نموذج يمكن أن تتكرر باستمرار، وكانتتستخدم على نطاق واسع لتقييم فعالية الأدوية المضادة للمتليفة المحتملين.
Introduction
DMN هو سامة معينة الكبد قوية. وذكر في التمثيل الغذائي، وتوزيع الأنسجة، والقدرة على تتسبب في إصابة كبد الفئران عن طريق ماجي 1، ووصف آلية تلف خلايا الكبد وموت الخلايا المبرمج من قبل من قبل بريتشارد وبتلر 2. وذكرت إدارة متقطعة من هذا المركب للحث على التليف في الكبد في الكلاب والفئران 3،4.
وقد تم التحقيق في الآليات والتغييرات الشكلية من تليف الكبد على نطاق واسع باستخدام هذا النموذج. في الدراسات المبكرة باستخدام الفئران والعلاج 3 أسابيع مع DMN أنتجت نخر نزفي مركزي وتلتها تليف العقيدات بدون تشحم 5. وقد تبين أنه في تليف في وقت مبكر، وكان الكولاجين شكلت أكثر عبر ربط مع النوع الثالث يكون أكثر بروزا من النوع الأول 6. من القواسم المشتركة مع أسباب أخرى، ارتبطت التغيرات التليف الناتج عن DMN مع زيادة في خلايا كوبفر. الضامة الكبدية الموجودة طن الجيوب. هذه الخلايا تتحول إلى myofibroblasts وتنتج كميات كبيرة من المصفوفة خارج الخلية التي هي المشكلة الأساسية في التليف 7.
من حيث الإشارات الخلوية، ناكامورا وآخرون أظهرت أن TGF-β يلعب دورا حاسما في تطور التليف في الكبد 8. واستخدم الباحثون اتش تعبر عن اقتطاع من النوع الثاني TGF-β مستقبل، لمنع تحديدا TGF-β الإشارات. وتوقف تليف الكبد في هذه الفئران بشكل مذهل خلال فترة العلاج DMN بالمقارنة مع مجموعة السيطرة. وقد أكدت دراسات أخرى أن قمع TGF-β يؤدي إلى التخفيف من الكبد تطوير التليف 9،10. تم استخدام النموذج أيضا في دراسة عالمية التنميط الجيني لتحديد علامات تليف الأخرى والبروتينات التي يمكن أن تستخدم كأهداف المخدرات إلى العلاج المضاد للمتليفة 11.
تستخدم مواد كيميائية أخرى للحث على التليف في الكبد تشمل thioacetamide (التعديل التجاري) و (ج)رابع كلوريد في Arbon (لجنة علم المناخ 4). وقد استخدم التعديل التجاري لأول مرة في الجرذان والفئران في وقت لاحق (12). مزايا هذا النموذج ما يلي: سهولة الإدارة الكيميائية في المياه، واستنساخ نموذج مع تليف صغير العقيدات مميزة والتغيرات البيوكيميائية الشرب. وتشمل العيوب: لفترة طويلة من الزمن من 3 أشهر لتليف الكبد لتطوير وعدم فهم الآلية الجزيئية لتحريض التليف في الكبد. أما بالنسبة للجنة علم المناخ 4، انخفض استخدامه للأسباب التالية: أنها لا تحاكي مرض الكبد البشري، لها تأثير ضار على طبقة الأوزون، ويسبب الألم والضيق للحيوانات، هي سامة جدا للإنسان، ويتطلب احتياطات اضافية في تعاملها مع و التخلص 13،14.
وأفادت التقارير المطولة انسداد القناة الصفراوية (عن طريق التدخل الجراحي) كنموذج تجريبي للتليف الكبد أولا من قبل Kountouras وآخرون. 15. هذا الأسلوب هو غير سام للإنسان والحيوان. However، الوقت اللازم لتليف الكبد لتطوير يختلف. استعراض 30 تقريرا التي كتبها ماركيز وآخرون. 16، وجدت أن الأمر استغرق من سبعة أيام إلى أربعة أسابيع بعد الجراحة لتليف الكبد لتتطور. التغيرات المرضية ووصف تحاكي تلك البشرية التليف الصفراوي المزمن وان النموذج سيكون أكثر ملاءمة للباحثين المهتمين في هذا المجال.
وباختصار، فإن إدارة متقطعة من جرعة ثابتة من DMN في الفئران أكثر من 4 أسابيع تنتج تليف الكبد الذي يحاكي الأمراض التي تصيب البشر. تظهر الفئران أعطيت جرعات التطوير التدريجي للتلف الكبد وتليف متني 4،17. تطور المرض وشدة يمكن رصدها عبر عينات من الدم أو تضحية من الحيوانات في نقاط زمنية محددة، وأثر هو تكرار للغاية (18). وهكذا فقد تم استخدام النموذج على نطاق واسع لدراسة آليات تليف الكبد وتليف الكبد، وكذلك للكشف عن احتمال العوامل المضادة للمتليفة 10،19،20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام كلية العلوم التطبيقية، الدراسي.
1. إعداد DMN
- ماصة 200 ميكرولتر من DMN (1 غرام / مل حل الأسهم) وإضافة 19.8 مل من برنامج تلفزيوني لإعداد 10 ملغ / مل حل DMN للحقن.
ملاحظة: DMN غير مسرطنة. استخدام غطاء الدخان لإعداد DMN وتنفيذ أعمال حقن الحيوان.
2. حقن داخل الصفاق من DMN
- استخدام الفئران ويستار الذكور بمتوسط وزن 150 - 200 جم. تأقلم الفئران ل4-7 أيام قبل بدء التجربة.
- الحفاظ على الفئران في درجة حرارة الغرفة من 22 ± 1 درجة مئوية، مع 12 ساعة ضوء و 12 ساعة دورات المظلمة. تقديم طعام الفئران والمياه libitum الإعلانية.
- قياس مآخذ الغذاء والماء يوميا. قياس وزن الجسم أسبوعيا.
- حساب كمية DMN عن كل فأر على أساس جرعة من 10 ملغ / كغ من وزن الجسم. استخدام حقنة 1 مل مع قياس 25 إبرة رس رسم حجم المحسوبة حل DMN في حقنة.
- كبح جماح الفئران للحقن داخل الصفاق 21.
- مع الفئران ضبط النفس بشكل صحيح، وإدخال الإبرة في الربع السفلي الأيمن من البطن، التراجع على المكبس من حقنة (يجب أن يستنشق شيئا) للتحقق من وضع الصحيح للإبرة داخل الفضاء في البطن وحقن ببطء الحل DMN.
- عندما لم يتلق جرعة من DMN، سحب ببطء الإبرة والتخلص منها في سلة الأدوات الحادة.
- إجراء الحقن داخل الصفاق من DMN لمدة 3 أيام متتالية في الأسبوع لمدة 4 أسابيع. إدارة الحقن في نفس الوقت كل يوم. إعادة حساب الجرعة على أساس وزن الجسم في بداية كل أسبوع من الحقن.
- جمع الدم من الوريد أسبوعيا ذيل لقياس القياسات البيوكيميائية: الألانين ألانين (ALT) والألانين اسبارتاتي (AST) 22.
- ALT المصل قياس وAST باستخدام الطبيب البيطري التجارياختبار الكيمياء محلل.
3. غروس فحص وحصاد الكبد
- الموت ببطء الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال بجرعة 100 ملغم / كغم من وزن الجسم. ضمان الموت عن طريق التحقق من عدم وجود ضربات القلب.
- الاستعداد لتشريح الجثة وتقييم حالة الحيوان كما وصفها باركنسون وآخرون. 23 مكان فئران نافقة على متن تشريح في الاستلقاء على ظهري مع البطن متجهة لأعلى.
- تطهير وترطيب الجلد مع الايثانول 70٪.
- باستخدام مقص، شق الجلد على كامل طول ventrum من فتحة الشرج إلى الذقن، وتعكس الجلد. مع مقص، شق جدار البطن من فتحة الشرج إلى الغضروف الخنجري، لفضح أحشاء البطن.
- دراسة أعضاء البطن في الموقع للتحقق من أي تشوهات. ملاحظة أي تغيرات في اللون والحجم والموقع من الأجهزة ووجود السوائل داخل التجويف البريتوني. فحص اتساق الأجهزة ويلاحظ وجود أي روائح.
- باستخدام مقص وملقط، تشريح مجانا الكبد كاملة من الأربطة والمرفقات.
- تبدأ في النقير حيث تعلق على الحجاب الحاجز، والعمل على إطلاق سراح جميع فصوص الكبد من المرفقات. قطع بعناية جميع الأربطة والأوعية الدموية.
- نقل الكبد على طبق بتري وتزن الكبد.
- باستخدام مشرط، وقطع 2-5 ملم أبواب سميكة من فصوص الكبد. من أجل التناسق، ودائما تأخذ عينات من نفس الفص الكبد. اتخاذ إسفين حوالي 5 ملم قطر في السمك، من الفص الجانبي الأيمن 24 حوالي 1 سم من حافة المكان lobe.Immediately إلى 10٪ مخزنة الفورمالين لتثبيت. ضمان الأنسجة لحجم الفورمالين هي 1:10 أو أكثر.
- الحصاد وتجميد فورا أجزاء (باستخدام النيتروجين السائل) من فصوص الكبد في هذه المرحلة إذا لزم الأمر لدراسات أخرى. أما بالنسبة لل(3.8)، عينة من نفس الفص الكبد من أجل التناسق.
معشوقة = "jove_title"> 4. تجهيز والتضمين وباجتزاء الكبد
- إصلاح عينات الكبد في 10٪ مخزنة الفورمالين مدة لا تقل عن 24 ساعة.
- بعد التثبيت، وتقليم الكبد، ضع في أشرطة وتحميلها في سلة المعالج النسيج الآلي.
- وضع سلة مع الأشرطة في المحطة الأولى التي تحتوي على 10٪ مخزنة الفورمالين. وغرقت تماما ضمان الكاسيت. ويمكن أن تبقى في هذه القاعة لمدة تصل إلى 12 ساعة حتى تبدأ دورة.
- برمجة المعالج الأنسجة لتدوير أشرطة لمدة 1 ساعة لكل منهما، من خلال محطات المتعاقبة التي تحتوي على الحلول التالية: الإيثانول بتركيز 50٪، 70٪، 90٪، 100٪ (2 محطة)، زيلين (2 محطة) والبارافين السائل ( 2 محطة).
- نقل عينات الكبد في حمام الشمع من محطة التضمين. تأكد من أن الجهاز التضمين في وضع التشغيل ساعة واحدة على الأقل في وقت سابق.
- باستخدام ملقط استعد مسبقا (65 درجة مئوية)، وإزالة كل الكاسيت من ثحمام الفأس ومكان على لوحة الحارة (65 درجة مئوية) من آلة التضمين. الاستغناء عن كمية كافية من البارافين السائل في غير القابل للصدأ العفن قاعدة الصلب (قبل تحسنت إلى 65 درجة مئوية) حتى نصف كاملة. نقل جزء من الكبد من الكاسيت في القالب. تأكد يتم وضع العينة مع سطح قطع (لفحصها مجهريا) شقة على الجزء السفلي من القالب.
- ملء القالب تماما مع البرافين السائل، وتركيب كاسيت فارغ على رأس ووضع القالب على C لوحة 4 درجات من آلة التضمين لتبرد لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- تأكد من أن الشمع قد بردت وتصلبت، وإزالة كتلة البارافين من القالب. كتلة يجب أن تخرج بسهولة وليس عصا أو الكراك. إذا حدث هذا، تذوب كتلة وكرر هذه الخطوة. كتلة البارافين يمكن مقطوع بمجرد أن يتصلب. ويمكن تخزين كتل في درجة حرارة الغرفة لسنوات عديدة.
- وضع كتلة البارافين في مشراح والقسم في 10 ميكرون سمك حتى طبقة الشمعتتم إزالة بما فيه الكفاية لأنسجة الكبد جزءا لا يتجزأ من أن تكون مرئية.
- تغيير الإعداد على مشراح لقطع في 5 ميكرون سمك. باستخدام ملقط، والتقاط مقطع قطع جيدا بوضعها على حافة وتعويم بعناية القسم في حمام مائي عند درجة حرارة 40 درجة مئوية.
- وضع بلطف شريحة زجاجية نظيفة تحت قسم العائمة ورفع وضعها على سطح شريحة زجاجية. وضع الشريحة على شريحة دفئا عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
5. ماسون ثلاثي الألوان تلطيخ
- قبل تطبيق البقع، وعلاج الشرائح لإزالة الشمع وترطيب الأنسجة على النحو التالي:
- تزج المقاطع في الزيلين لمدة 5 دقائق. كرر 2X.
- تزج المقاطع في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق. كرر 1X.
- تزج الأقسام لمدة 1 دقيقة في كل من الحلول التالية من الايثانول: 90٪، 80٪ و 70٪.
- شطف الشريحة تحت ماء الصنبور لإزالة أي الإيثانول الموجودة على الشريحة.
- تزج الشرائح في الهيماتوكسيلين الحديد لمدة 10 دقيقة وصمة عار على النواة.
- شطف الشرائح بالماء لإزالة وصمة عار الزائدة من الشرائح.
- تزج الشرائح في Biebrich القرمزي الحمضية بالفوكسين لمدة 2 دقيقة وصمة عار على السيتوبلازم.
- شطف الشرائح مع الماء.
- ضع الشرائح في الفسفوتنغستيك / الفسفومولبديك حمض الحل لمدة 10 دقيقة لتعزيز امتصاص الأنيلين الأزرق. تغيير حمض الحل الفسفوتنغستيك / الفسفومولبديك بعد 2 طلقة من الاستخدام.
- ضع الشرائح في حل أزرق الأنيلين لمدة 10 دقيقة وصمة عار على ألياف الكولاجين.
- شطف وصمة عار الزائدة مع الماء ووضع الشرائح في محلول حمض الخليك 1٪ لمدة 1 دقيقة للسماح للتمايز لتأخذ مكان لتقديم لون الشريحة أكثر حساسية وشفافية.
- شطف الشرائح مع الماء، والشروع في يذوى المقاطع الأنسجة. الخطوات الجفاف هي كما يلي:
- تزج الشرائح على التوالي لمدة 10 ثانية في كل مرة، في بغية دراسته واقراره التاليةntrations من الايثانول: 70٪، 80٪، 95٪ و 100٪.
- تزج الشرائح لمدة 30 ثانية في الإيثانول بنسبة 100٪. كرر 1X.
- شطف الشرائح من خلال 3 محطات الزيلين لمدة 5 دقائق كل لإزالة الإيثانول.
- جبل زلة غطاء زجاجي على عينة مع وسائل الإعلام تركيب (على سبيل المثال، DPX مرس) والسماح ليجف.
ملاحظة: DPX هو الراتنج الاصطناعي الذي يجف بسرعة، ويحافظ على وصمة عار ويحمي قسم الأنسجة.
6. الكيسي يحرز على أقسام شعري الشكل الملون ماسون في الكبد
- لديهم علم الامراض البيطرية تقييم شدة التليف وفقا لتليف يسجل 25. وسيكون من الأمثل إذا يتم التهديف التليف قبل اثنين أو ثلاثة الأطباء بشكل مستقل بطريقة أعمى. في مثل هذا السيناريو، للحصول على النتيجة النهائية بعد مناقشة واستعراض مجموعة لفرز أي خلافات في التهديف.
| أحرز هدفاً | وصف |
| 0 | لا التليف |
| 1 | التوسع ليفية من بعض مناطق المداخل، مع أو بدون حواجز ليفية قصيرة |
| 2 | التوسع ليفية من معظم مناطق المداخل، مع أو بدون حواجز ليفية قصيرة |
| 3 | التوسع ليفية من معظم المناطق البوابة، بوابة عرضية في بوابة (PP) سد |
| 4 | التوسع ليفية من مناطق المداخل مع تميز سد (المدخل إلى البوابة (PP) وكذلك المدخل إلى وسط (PC) |
| 5 | شهد سد (PP و / أو PC) مع العقيدات عرضية (تليف الكبد غير مكتمل) |
| 6 | تليف الكبد، ومحتمل أو واضح |
الجدول 1: الكيسي استخدام نقاط لقراءة أقسام شعري الشكل الملون الكبد وماسون 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMN الفئران المعالجة فقدان الوزن وتصبح أقل قوية مع معطف الشعر تكدرت. هناك خسائر كبيرة في متوسط وزن الجسم من DMN الفئران المعالجة. أولا كشفها بعد 2 أسابيع من العلاج DMN، ويبقى هذا الاختلاف من خلال 3 أسابيع و 4 بعد العلاج DMN (الشكل 1A). كما تتلقى الفئران DMN خلال الأسابيع المتتالية، إلى أضرار في الكبد يسبب لتصبح أصغر. مؤشر الكبد. وهي كانت في المئة من وزن الكبد في وزن الجسم النهائي أقل بكثير عن الفئران DMN المعالجة (الشكل 1B).
الشكل 1: أ) تعامل أوزان الجسم من DMN الفئران. يتم تمثيل البيانات مثل وسائل ± SD (ن = 6-8). * P <0.05 بالمقارنة مع مجموعة المراقبة العادية ب) مؤشر الكبد؛ الوزن في المئة الكبد في وزن الجسم النهائي من DMN معاملة الفئران بعد 4 أسابيع من عطر DMNatment. يتم تمثيل البيانات مثل وسائل ± SD (ن = 6-8). * P <0.05 مقارنة مع مجموعة التحكم العادية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في التضحية، وبعد 4 أسابيع من العلاج DMN، والكبد هو أصغر وأكثر صعوبة (الشكل 2A) مقارنة مع أولئك من الذين تتراوح أعمارهم بين الحيوانات التي يتم المقارنة (الشكل 2B). الفيبرين قد تكون موجودة على سطح الكبد ويتم الالتزام فصوص الكبد المجاورة. حوالي 20٪ من الفئران لها استسقاء.
الشكل 2: أ) الكبد من الفئران بعد 4 أسابيع من العلاج DMN ب) الكبد من الذين تتراوح أعمارهم بين الفئران التي يتم المقارنة. في الفقرة (أ) من الكبد هو منكمشة، حازما وشاحب مع مسحة صفراء بالمقارنة مع الكبدمن سيطرتها يقابل المسنين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
إصابة الكبد تسبب نفاذية زيادة من غشاء الخلية الكبدية. زيادة ALT المصل وAST مؤشرات تلف خلايا الكبد. ALT المصل (الشكل 3A) وAST (الشكل 3B) من مجموعة DMN المعالجة هي أعلى بكثير من السيطرة على المجموعة بعد أسابيع 2 و 4 من حقن DMN. مصل ALT و AST مستويات تزيد عادة بعد كل أسبوع من العلاج DMN.
الشكل (3): أ) الألانين ألانين المصل (ALT) وب) الألانين اسبارتاتي المصل (AST) مستويات DMN الفئران المعالجة في الأسابيع 0، 2 و 4 بعد آخر حقن DMN. البيانات هي represented كوسيلة ± SD (ن = 6-8). * P <0.05 مقارنة مع مجموعة التحكم العادية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفحص النسيجي للكبد من DMN الفئران المعالجة تظهر أن هناك زيادة مطردة وتوسيع الحاجز ليفي، مع فقدان خلايا الكبد، مع مرور الوقت بالمقارنة مع الفئران السيطرة. يستخدم شعري الشكل وصمة عار ماسون عادة لتسليط الضوء على ودائع الكولاجين في أنسجة الكبد: هي ملطخة هذه الأزرق.
الشكل 4: Photomicrographs الأقسام الكبد الملون مع شعري الشكل ماسون: أ) قسم الكبد من الفئران السيطرة العادي؛ ب) قسم الكبد من الفئران بعد تلقي 1 أسبوع من dimethylnitrosaminه (DMN)؛ ج) قسم الكبد من الفئران بعد تلقي 2 أسابيع من DMN. هناك توسع ليفية من معظم المناطق المدخل مع مدخل عرضية في بوابة سد د) قسم الكبد من الفئران بعد تلقي 3 أسابيع من DMN. ملاحظة التوسع ليفية من مناطق المداخل مع البوابة ملحوظة في بوابة وكذلك المدخل إلى سد المركزية. ه) قسم الكبد من الفئران بعد تلقي 4 أسابيع من DMN. هناك تليف الكبد مع تشكيل العقيدات. الكبد السيطرة هو من مجموعة التضحية جنبا إلى جنب مع الفئران بعد 4 أسابيع من الحقن DMN. هناك نمط من الزيادة التدريجية في درجة التليف من 0 في الفقرة (أ)؛ 2 في (ب)؛ 3 في (ج) 4 في (د) 5/6 في (ه). وقد تم نقل كل photomicrographs في التكبير من 40X مع 1 وحدة طول الحجم شريط يعادل 100 ميكرون. يرجى جلعق هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفناها طريقة لجعل نموذج حيواني من تليف الكبد وتقييم شدة تليف الكبد. ومن المهم لتقديم الجرعة الصحيحة من DMN والالتزام بالجدول الزمني للحقن داخل الصفاق الأسبوعية. كما تقدم هذه التجربة، لا بد من الموازنة بين الفئران وإعادة حساب الجرعة في بداية كل أسبوع من الحقن DMN. نضع في اعتبارنا أن DMN غير سامة، وتحتاج إلى التعامل معها في مجلس الوزراء الدخان. ونحن أداء الحقن داخل الصفاق في مجلس الوزراء الدخان أيضا. مع الحاجة إلى تكرار الحقن، وضبط النفس الصحيح وتقنية الحقن مهم لتجنب إدخال الملوثات والأضرار التي لحقت الأعضاء الداخلية. نادرا ما يكون هناك وفيات من الحقن داخل الصفاق.
وينبغي رصد الفئران 2X يوميا طوال الفترة التجريبية. خلال الأسبوع الأخير من حقن DMN، يجب أن الحيوانات لوحظ أكثر في كثير من الأحيان وكثب بحثا عن علامات الاحتضار. هذه هي المناطق المحيطةالتطوير التنظيمي عندما تلف الكبد هو أشد وسيتم inappetent الفئران المصابة، تفقد وزن الجسم والشرط. 25 - 40٪ من الفئران يمكن أن تصبح مريضا بشدة خلال هذه الفترة، ويموت إذا لم يكن هناك تدخل البيطري. ومن ثم مراقبة وثيقة تسمح للباحث لتقييم حالة الحيوان وخطة إنهاء المناسب من التجربة من أجل أن الأجهزة يمكن المقطوع حديثا من الفئران الموت الرحيم بدلا من الضياع للتسوس من الموت غير متوقع.
لقد وجدنا قياس الأسبوعي لمستويات ALT و AST أن تكون مؤشرات مفيدة لتطور تلف الكبد. وقد لاحظنا أيضا أن AST أقل تحديدا من ALT ويعزو هذا لصدوره من كريات الدم الحمراء التالفة والأنسجة العضلية، بالإضافة إلى الكبد.
ضمان كمية كافية من الدم التي يتم جمعها لانتاج الكمية المطلوبة من المصل لتحليلها. نجمعها عادة 200-300 ميكرولتر من الدم في الفئران.
خلال جollection من أنسجة الكبد للفحص النسيجي، ونحن ننصح أن الحصول على عينة من نفس الفص. ويتم ذلك بعد التحقق من أن التغييرات في الكبد موحدة. DMN يسبب تغيرات معممة في الكبد. في المراحل الأولى من الدراسة، ونحن عينات من الفصوص الجانبية وسطي اليسرى وكذلك الحق في الفص وسطي. نحن لم نلاحظ أي اختلافات في التغيرات المجهرية بين هذه الفصوص.
ينبغي أن تكون ثابتة بأجزاء من الكبد في 10٪ مخزنة الفورمالين لا يقل عن 24 ساعة ومعالجتها بعد فترة وجيزة. غمر لفترات طويلة تتجاوز الأسبوع يمكن أن يؤدي إلى الأنسجة تصبح هشة وصعبة للقسم بعد تضمين البارافين. قطع مناسبة 5 ميكرون المقاطع رقيقة يتطلب ممارسة وصبر. المقاطع التي يتم تقييمها لتكون مناسبة مع بالعين المجردة (الخطوة 4.11) يمكن فحص بالمجهر للتأكد من أنها لا تملك القطع الأثرية مثل طيات أو الدموع داخل القسم. هو أفضل أكملت إجراء تلطيخ وفقا رس الفترات الزمنية لغمر الشريحة في كل خطوة من دون فترات الراحة. أثناء عملية التلوين، وضمان أن يتم الاحتفاظ أقسام رطبة في جميع الأوقات، ونقلها من حل تلطيخ واحدة إلى أخرى في أقرب وقت ممكن.
تقييم أقسام شعري الشكل ماسون الملون للحصول على درجة التليف يتطلب مساهمة من علم الامراض البيطرية. هو / هي عضو فريق الحاسم الذي يجب أن تكون جزءا من الدراسة من البداية، كما انه / انها سوف تكون قادرة على تقديم المشورة والمشاركة في جمع الصحيح من الأجهزة في جميع مراحل التجربة. وهكذا فإن المعيار الذهبي الحالي للكشف عن التليف في الكبد التهديف هو تقييم أقسام النسيج الملون بشكل مناسب من قبل الطبيب الشرعي. على الرغم من أنه سيكون من الأمثل الحصول على مدخلات من الطبيب الشرعي أكثر من واحد، وهذا قد لا يكون ممكنا في المنظمات الأصغر حجما. في مثل هذه الحالات، والموضوعية يمكن تحسينها عن طريق استخدام تكنولوجيا التصوير 26. لقد وجدنا أن النتائج من تكنولوجيا التصويرقابلة للمقارنة من إحراز الهدف المرضي (بيانات غير منشورة)، ويوصي بأن يتم استخدامها كوسيلة من وسائل التكميلي للتقييم.
وباختصار، فإن نموذج DMN الناجم عن تليف الكبد ومزايا عديدة أكثر النماذج الحيوانية الأخرى. بل هو نموذج من السهل نسبيا لجعل لأنها لا تتطلب مهارات جراحية. DMN هو بيئة أكثر أمانا وأقل سمية للإنسان والحيوان من لجنة علم المناخ (4) ويستغرق وقتا أقصر للحث على المرض من التعديل التجاري. مقارنة أمراض الكبد التي تنتجها لجنة علم المناخ 4، TAA، والقناة الصفراوية ربط، DMN تنتج تمثيل أقرب من تليف الكبد البشري. لهذه الأسباب، ونحن نتوقع أن يستمر هذا النموذج ليتم استخدامها على نطاق واسع لدراسة آليات تليف الكبد وكذلك للكشف عن العوامل المضادة للمتليفة المحتملين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
References
- Magee, P. N. Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine. Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).
- Pritchard, D. J., Butler, W. H. Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity. J Pathol. 158 (3), 253-260 (1989).
- Madden, J. W., Gertman, P. M., Peacock, E. E. Dimethylnitrosamine-induced hepatic cirrhosis: a new canine model of an ancient human disease. Surgery. 68 (1), 260-267 (1970).
- Jenkins, S. A., Grandison, A., Baxter, J. N., Day, D. W., Taylor, I., Shields, R. A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat. J Hepatol. 1 (5), 489-499 (1985).
- Jézéquel, A. M., Mancini, R., Rinaldesi, M. L., Macarri, G., Venturini, C., Orlandi, F. A morphological study of the early stages of hepatic fibrosis induced by low doses of dimethylnitrosamine in the rat. J Hepatol. 5 (2), 174-181 (1987).
- George, J., Chandrakasan, G. Molecular characteristics of dimethylnitrosamine induced fibrotic liver collagen. Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol. 1292 (2), 215-222 (1996).
- Winwood, P. J., Arthur, M. J. Kupffer cells: their activation and role in animal models of liver injury and human liver disease. Semin Liver Dis. 13 (1), 50-59 (1993).
- Nakamura, T., Sakata, R., Ueno, T., Sata, M., Ueno, H. Inhibition of transforming growth factorβ prevents progression of liver fibrosis and enhances hepatocyte regeneration in dimethylnitrosamine-treated rats. Hepatology. 32 (2), 247-255 (2000).
- Shek, F. W., Benyon, R. C. How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis? Eur J Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 123-126 (2004).
- Wang, J. H., Shin, J. W., Son, J. Y., Cho, J. H., Son, C. G. Antifibrotic effects of CGX, a traditional herbal formula, and its mechanisms in rats. J Ethnopharmacol. 127 (2), 534-542 (2010).
- Su, L. J., Hsu, S. L., Yang, J. S., Tseng, H. H., Huang, S. F., Huang, C. Y. F. Global gene expression profiling of dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis: from pathological and biochemical data to microarray analysis. Gene Expr. 13 (2), 107-132 (2006).
- Müller, A., Machnik, F., Zimmermann, T., Schubert, H. Thioacetamide-induced cirrhosis-like liver lesions in rats usefulness and reliability of this animal model. Exp Pathol. 34 (4), 229-236 (1988).
- Martinez-Hernandez, A. The hepatic extracellular matrix. II. Electron immunohistochemical studies in rats with CCl4-induced cirrhosis. Lab Invest. 53 (2), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3894794 166-186 (1985).
- Pritchard, M. T., Apte, U. Models to Study Liver Regeneration. Liver Regeneration. , 15-40 (2015).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Marques, T. G., Chaib, E., et al. Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection. Acta Cir Bras. 27 (8), 589-594 (2012).
- Wasser, S., Tan, C. E. Experimental models of hepatic fibrosis in the rat. Ann Acad Med Singapore. 28 (1), 109-111 (1999).
- George, J., Chandrakasan, G. Biochemical abnormalities during the progression of hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine. Clin Biochem. 33 (7), 563-570 (2000).
- Shimizu, I., Ma, Y. R., et al. Effects of Sho-saiko-to, a Japanese herbal medicine, on hepatic fibrosis in rats. Hepatology. 29 (1), 149-160 (1999).
- Wang, Y., Gao, J., Zhang, D., Zhang, J., Ma, J., Jiang, H. New insights into the antifibrotic effects of sorafenib on hepatic stellate cells and liver fibrosis. J Hepatol. 53 (1), 132-144 (2010).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat. J Vis Exp. (99), (2015).
- Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Ruehl-Fehlert, C., Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Ishak, K., Baptista, A., et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 22 (6), 696-699 (1995).
- Sant'Anna, L. B., Sant'Anna, N., Parolini, O. Application of computer assisted image analysis for identifying and quantifying liver fibrosis in a experimental model. J Comput Interdiscip Sci. 2 (2), 139-148 (2011).
