Abstract
تنوع الرنا غير الترميز صغيرة (الحمض الريبي النووي الذواب) توسعا سريعا ودورهم في العمليات البيولوجية، بما في ذلك تنظيم الجينات، آخذة في الظهور. الأمر المثير للاهتمام، وجدت sRNAs أيضا خارج الخلايا وتكون موجودة في جميع السوائل البيولوجية ثابت. على هذا النحو، تمثل sRNAs خارج الخلية فئة جديدة من المؤشرات الحيوية المرض ويشارك على الأرجح في الخلايا مما يشير الى وشبكات الاتصالات بين الخلايا. لتقييم قدراتهم والمؤشرات الحيوية، sRNAs يمكن قياسها كميا في البلازما والبول، وغيرها من السوائل. مع ذلك، إلى فهم كامل للتأثير sRNAs خارج الخلية كإشارات الغدد الصماء، فمن المهم تحديد ناقلات التي تنقل وتحميهم في السوائل البيولوجية (على سبيل المثال، البلازما)، والتي تساهم الخلايا والأنسجة لحمامات الحمض الريبي النووي الذواب خارج الخلية، والخلايا والأنسجة قادرة قبول واستخدام خارج الخلية الحمض الريبي النووي الذواب. ولتحقيق هذه الأهداف، فمن الأهمية بمكان لعزل السكان نقية للغاية من الناقلات خارج الخليةلالتنميط الحمض الريبي النووي الذواب وتقدير. لقد أثبتنا سابقا أن البروتينات الدهنية، وخاصة البروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL)، والنقل الرنا الميكروية وظيفية (ميرنا) بين الخلايا وHDL-miRNAs تتغير بشكل ملحوظ في المرض. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول جديد أن تستخدم جنبا إلى جنب HDL العزلة مع تنبيذ فائق الكثافة التدرج (DGUC) وسريع البروتين السائل اللوني (FPLC) للحصول على HDL نقية للغاية لتحديد ملامح المصب وتقدير من جميع sRNAs، بما في ذلك miRNAs، وذلك باستخدام كلا عالية التسلسل -throughput والنهج PCR في الوقت الحقيقي. وهذا البروتوكول أن يكون مصدرا قيما للتحقيق في sRNAs على HDL.
Introduction
الترميز غير الرنا خارج الخلية الصغيرة (sRNAs) تمثل فئة جديدة من المؤشرات الحيوية المرض والأهداف العلاجية المحتملة، ومن المرجح تسهل خلية الى خلية الاتصال 1. النوع الأكثر درس على نطاق واسع من الحمض الريبي النووي الذواب والرنا الميكروية (ميرنا) التي ما يقرب من 22 اليلة في الطول، ويتم معالجتها من أشكال السلائف أطول والنصوص الأولية 2. أثبتت miRNAs للنشر ما بعد transcriptionally تنظيم التعبير الجيني من خلال قمع ترجمة البروتين وتحريض تدهور مرنا 2. ومع ذلك، miRNAs هي مجرد واحدة من العديد من أنواع sRNAs. كما sRNAs يمكن المشقوق من tRNAs الأم (sRNAs المشتقة من الحمض الريبي النووي النقال، تقرير التجارة والتنمية)، الرنا صغيرة النووية (sRNAs المستمدة الحمض الريبي النووي الذواب، sndRNA)، الرنا صغيرة نويي (sRNAs المستمدة snoRNA، snRNA)، الرنا الريباسي (sRNAs، RDR الريباسي المشتقة )، Y الرنا (yDR)، وغيرها من الرنا المتنوعة 1. وقد أبلغ عن أمثلة قليلة من هذه sRNAs الرواية إلى وظيفة مماثلة لmiRNAs. ومع ذلك، فإن فو البيولوجيnctions العديد من هذه sRNAs ويبقى أن تحدد، على الرغم من الأدوار في تنظيم الجينات من المرجح 3-6. الأمر المثير للاهتمام، miRNAs وsRNAs أخرى موجودة مستقر في السوائل خارج الخلية، بما في ذلك اللعاب، والبلازما والبول، والصفراء. ومن المرجح حماية sRNAs خارج الخلية من RNases من خلال ارتباطهم مع حويصلات خارج الخلية (EV)، البروتينات الدهنية، و / أو المجمعات بروتين نووي ريبوزي خارج الخلية.
سابقا، وذكرت أن البروتينات الدهنية، وهي البروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL)، miRNAs النقل في البلازما 7. في هذه الدراسة، تم عزل HDL باستخدام طريقة متتابعة من تنبيذ فائق الكثافة التدرج (DGUC)، البروتين بسرعة اللوني السائل (حجم الاستبعاد هلام اللوني الترشيح، FPLC)، وتقارب اللوني (مكافحة ئي منظمة العفو الدولية (برنامج عمل ألماتي-I) مناعي ) 7. باستخدام كل الوقت الحقيقي PCR القائم صفائف منخفض الكثافة والمقايسات ميرنا الفردية، وتم قياس كمية مستويات ميرنا على HDL معزولة عن شفاءخاصتك والمواضيع hypercholesterolemic 7. باستخدام هذا النهج، كنا قادرين على البيانات الشخصية miRNAs وتحديد miRNAs محددة في الاستعدادات HDL نقية للغاية. منذ عام 2011، فقد قررنا أنه على الرغم اللوني تقارب يعزز HDL النقاء، الأجسام المضادة التشبع يحد بدرجة كبيرة الغلة، ويمكن أن تكون باهظة التكلفة. حاليا، يوصي بروتوكول لدينا على بعد خطوتين طريقة جنبا إلى جنب متسلسل من DGUC تليها FPLC، التي تنتج أيضا عينات HDL عالية الجودة لأسفل مجرى عزل الحمض النووي الريبي والحمض الريبي النووي الذواب الكمي. بسبب التطورات الحديثة في التسلسل الإنتاجية العالية من sRNAs (sRNAseq)، على سبيل المثال، miRNAs، وزيادة الوعي من الطبقات غير ميرنا الحمض الريبي النووي الذواب أخرى، sRNAseq هو تيار دولة من بين الفن في ميرنا والحمض الريبي النووي الذواب التنميط. على هذا النحو، يوصي بروتوكول لدينا قياس miRNAs وsRNAs الآخرين على عينات HDL باستخدام sRNAseq. ومع ذلك، الحمض النووي الريبي مجموع معزولة عن HDL يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد miRNAs الفردية وsRNAs الآخرين أو التحقق من صحة النتائج sRNAseq في الوقت الحقيقي باستخدام PCR لpproaches. نحن هنا تصف بالتفصيل بروتوكول لجمع وتنقية والتقدير الكمي، وتحليل البيانات، والتحقق من صحة نقية للغاية HDL-sRNAs.
ويتمثل الهدف العام من هذه الورقة هو لإثبات جدوى وعملية من الحمض الريبي النووي الذواب الكمي في HDL نقية للغاية معزولة من البلازما البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HDL تنقية (~ 5.5 أيام)
- الكثافة التدرج تنبيذ فائق (DGUC، ~ 5 أيام)
- إضافة 90 ميكرولتر من 100X المضادة للتأكسد إلى 9 مل من البلازما معزولة من الدم الوريدي جديدة.
- ضبط كثافة البلازما مع شركة KBR من 1.006 غرام / مليلتر إلى 1.025 غرام / مليلتر بإضافة 0.251 ز KBR إلى 9 مل من البلازما من الخطوة 1.1.1 (0.0278 جم / مل KBR البلازما). صخرة البلازما حتى يذوب كل الملح في درجة حرارة الغرفة، ونقل إلى نابذة الأنابيب وضمان جميع فقاعات ترتفع إلى الأعلى.
- ثني غيض من إبرة 18 G 90 ° 1 سم من الحافة، والجانب شطبة مواجهة. باستخدام حقنة وإبرة قياس 18، وضع بعناية 3 مل من تراكب حل # 1 على البلازما (الجدول 1).
ملاحظة: إبرة عازمة يضمن كل VLDL / المختبر الدولي للألماس، LDL، وتتم إزالة HDL دون خلط مع تراكب. - إزالة معظم الفقاعات في الجزء العلوي، وترك 2-3 الفضاء ملم من الغضروف المفصلي إلى أعلى الأنبوب ويتنبهوضع LLY الأنابيب في الدلاء SW-40Ti.
- تزن كل دلو (مع قبعات) على التوازن، والتوازن تماما مع دلو المعاكس (دلو + الحد الأقصى): رقم 1 إلى رقم 4، رقم 2 إلى رقم 5، ورقم 3 إلى رقم 6.
ملاحظة: يجب أن تكون هذه الدلاء متوازن ومطابقة في جميع الأوقات. - وضع الدوار في نابذة (قائمة المواد). أجهزة الطرد المركزي في 274400 x ج لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية مع الفرامل وسيط رقم 4.
- إزالة بعناية دلاء من الدوار وأنابيب من الدلاء.
- إزالة بعناية 2 مل من الطبقة العليا من تراكب باستخدام المحاقن والإبر عازمة. وستكون هذه هي جزء VLDL / المختبر الدولي للألماس والتي يمكن تخزينها في 4 ° C أو -80 ° C.
- بعد إزالة جزء VLDL / المختبر الدولي للألماس، وجمع 7 مل المتبقية من العينة (البلازما) ووضعه في أنبوب مخروطي 15 مل. تبرزي حجم العينة ما يصل إلى 9 مل مع تراكب حل # 2 (الجدول 1).
- ضبط كثافة عينة من 1.025 غرام / مليلتر إلى 1.080 غرام / مليلتر مع KBR باستخدامما يقرب من 0.746 ز كي بي آر في العينة 9 مل أو 0.0828 جم / مل KBR من العينة. صخرة بلطف العينة حتى يتم حل KBR كل (حوالي 20 دقيقة)، ونقل إلى نابذة أنبوب بينما ترتفع ضمان فقاعات إلى الأعلى.
- مع المحاقن والإبر، ضع بعناية 3 مل من تراكب حل # 3 على عينة (الجدول 1). ترك 2-3 الفضاء ملم من الغضروف المفصلي إلى أعلى الأنبوب.
- إزالة معظم أي فقاعات المتبقية في الجزء العلوي من الأنبوب ووضع بعناية أنابيب نابذة شغل في الدلاء SW-40Ti.
- تزن كل دلو (مع قبعات) على التوازن، والتوازن تماما مع دلو المعاكس + كأب، وكما هو الحال في 1.1.5.
- وضع الدوار في نابذة (انظر قائمة من المواد). أجهزة الطرد المركزي في 274400 x ج لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية مع الفرامل وسيط رقم 4.
- إزالة بعناية دلاء من الدوار وأنابيب من الدلاء.
- إزالة بعناية 2 مل من الطبقة العليا من تراكب باستخدام حقنة ويكونالإقليم الشمالي إبرة. وستكون هذه هي جزء LDL التي يمكن تخزينها في 4 ° C أو -80 ° C.
- بعد إزالة جزء LDL، وجمع ما تبقى تقريبية 7 مل من عينة (البلازما) ووضعه في أنبوب جديد 15 مل المخروطية. تبرزي حجم العينة (البلازما) ما يصل إلى 9 مل مع 1.080 غ / مل من محلول رقم 4 (الجدول 1).
- ضبط كثافة عينة من 1.080 غرام / مليلتر إلى 1.30 جم / مل مع KBR باستخدام 3.33 ز كي بي آر في 9 مل العينة (البلازما) أو 0.37 ز KBR لكل مل من العينة. صخرة أو تستنهض الهمم قليلا العينة حتى يتم حل KBR (الملح) كل ونقل إلى نابذة أنبوب.
- مع المحاقن والإبر، ضع بعناية 3 مل من تراكب حل # 5 على عينة (الجدول 1).
- إزالة معظم أي فقاعات المتبقية في الجزء العلوي من الأنبوب، وترك 2- مساحة 3 ملم من الغضروف المفصلي إلى أعلى الأنبوب ووضع بعناية أنابيب نابذة شغل في الدلاء SW-40Ti.
- تزن كل دلو (مع القبعات) على التوازن، والتوازن بالضبط مع دلو المعاكس + كأب، وكما هو الحال في 1.1.5.
- وضع الدوار في نابذة (انظر قائمة من المواد). أجهزة الطرد المركزي في 274400 x ج لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية مع الفرامل رقم 4.
- إزالة بعناية دلاء من الدوار وأنابيب من الدلاء.
- إزالة بعناية ما يقرب من 2 مل من الطبقة العليا من تراكب باستخدام المحاقن والإبر عازمة. هذا هو جزء HDL، والتي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية أو -80 درجة مئوية.
ملاحظة: بعد HDL DGUC يمكن مدال لإزالة الحلول عالية من الملح. - لdialyze، ضع جزء HDL التي تم جمعها في كم غسيل الكلى مختوم (10000 ميغاواط قطع) وdialyze بين عشية وضحاها في 1 لتر برنامج تلفزيوني 1X. عازلة تغيير غسيل الكلى (برنامج تلفزيوني 1X) 3 مرات خلال 24 ساعة. سوف اضطراب طيف من برنامج تلفزيوني مع المغناطيسي ضجة بار تحسين غسيل الكلى.
- تحديد تركيز البروتين من DGUC-HDL باستخدام أسلوب BCA 8.
- سريع البروتين السائل CHROالفصل الكروماتوغرافي (FPLC) أو الحجم، الاستبعاد اللوني (~ 6 ساعات)
- تصفية 1.2 ملغ من DGUC-HDL (البروتين الكلي) في 500 ميليلتر من خلال 0.22 ميكرون فلتر الصغيرة الطرد المركزي (انظر قائمة من المواد)، مباشرة قبل الحقن.
ملاحظة: لتصفية إضافية من العينة DGUC-HDL من خلال 0.45 ميكرون فلتر الصغيرة الطرد المركزي قبل مرشح 0.22 ميكرون قد تكون هناك حاجة لبعض العينات. - جمع تصفيتها عينة DGUC-HDL، تحميل حقن حقنة FPLC (ملء)، والتأكد من عدم وجود فقاعات في حقنة قبل الحقن في FPLC.
- ضبط معدل تدفق FPLC إلى 0.3 مل / دقيقة مع حد الضغط على 2.6 ميجا باسكال. تتوازن الأعمدة مع 0.2 أحجام العمود (حوالي 15 مل) من العازلة، قبل أن يجرب الحقن. حقن عينة مع 3 مل من العازلة في (حقن حلقة) أداة FPLC وبدء التشغيل. جمع 1.5 كسور مل لما مجموعه 72 الكسور.
- تصفية 1.2 ملغ من DGUC-HDL (البروتين الكلي) في 500 ميليلتر من خلال 0.22 ميكرون فلتر الصغيرة الطرد المركزي (انظر قائمة من المواد)، مباشرة قبل الحقن.
2. عالية الإنتاجية RNA الصغيرةالتسلسل (sRNAseq، ~ 9 أيام)
- عزل الحمض النووي الريبي (~ 1 يوم)
- تحديد الكسور FPLC الموافق DGUC-HDL من خلال تحديد مستويات الكولسترول الكلي باستخدام مجموعة اللونية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام هذا FPLC مجموعة المتابعة، ونتوقع أن تجد 6-7 كسور FPLC تحتوي على DGUC-HDL.
- جمع كل حجم (حوالي 8 -1 0 مل بركة من 1.45 مل جزء مجلدات) من كسور DGUC-HDL FPLC والتركيز باستخدام 10 كيلو دالتون ميجاوات وحدات تصفية الطرد المركزي قطع في 4000 x ج لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية أو حتى التركيز HDL ما يقرب من 100 ميكرولتر.
- جمع تركيز HDL وقياس تركيز البروتين الكلي الحميد باستخدام طريقة BCA 8.
- تحديد أعلى تركيز HDL البروتين الكلي، تصل إلى 1 ملغ، والتي يمكن aliquoted من كل عينة في المجموعة. على سبيل المثال، عزل الحمض النووي الريبي من نفس الكمية من HDL البروتين الكلي لكل عينة.
- أداء عزل الحمض النووي الريبي باستخدامبروتوكول تعديل (انظر قائمة من المواد).
- إضافة 10X حجم كاشف الفينول تحلل (انظر قائمة من المواد) عينة ودوامة لمدة 1 دقيقة.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة الكلوروفورم (20٪ من حجم كاشف الفينول تحلل المستخدمة في الخطوة 2.1.5.1) ويهز بقوة لمدة 15 ثانية.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة ل2-3 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المبردة.
- نقل المرحلة المائية العليا لأنبوب جديد، وتجنب البيني.
- إضافة إلى حجم 1.5X من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى المرحلة المائية ودوامة لمدة 1 دقيقة.
- تخزين العينات لمدة 1 ساعة على الأقل أو طوال الليل في -80 درجة مئوية.
- تواصل مع بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي باستخدام أعمدة صغيرة المقدمة.
- أزل مع 30 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية H 2 O. أولا إضافة 15 ميكرولتر من H 2 O مباشرة إلى فريت، وتدور بسرعة منخفضة (2000 x ج) لمدة 2 دقيقة، وثم تدور بسرعة عالية (كحد أقصى) لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة مع 15 ميكرولتر إضافية من H 2 O.
- الشروع فورا في الحمض الريبي النووي الذواب جيل مكتبة أو متجر في -80 درجة مئوية.
- الجيل مكتبة (~ 6 ساعات)
- إعداد مكتبات الحمض الريبي النووي الذواب كدنا] باستخدام الحمض الريبي النووي الذواب جيل مكتبة بروتوكول عدة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع تعديل واحد لتضخيم PCR كما هو موضح أدناه.
- إعداد mastermix PCR على الجليد التي تحتوي على 0.5 ميكرولتر الدناز / ريبونوكلياز خالية H 2 O، 15 ميكرولتر PCR مزيج (الرابطة الاسلامية الباكستانية) و 1 ميكرولتر RNA PCR التمهيدي (RP1) لكل عينة (بما في ذلك مبلغ إضافي 10٪ للpipetting لخطأ).
- إضافة 16.5 ميكرولتر من PCR مزيج من كل (كدنا]) عينة.
- تعيين الرقم القياسي / الباركود على كل عينة لمضاعفة وإضافة 1 ميكرولتر مؤشر التمهيدي PCR (إلى الرقم المناظر) للعينة.
- إجراء دوران سريع باستخدام microfuge.
ملاحظة: الحجم الكلي ينبغييكون الآن 30 ميكرولتر لكل عينة. - أداء الظروف ركوب الدراجات لPCR التضخيم كما هو موضح في الجدولين 2 و 3.
- إعداد مكتبات الحمض الريبي النووي الذواب كدنا] باستخدام الحمض الريبي النووي الذواب جيل مكتبة بروتوكول عدة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع تعديل واحد لتضخيم PCR كما هو موضح أدناه.
- حجم اختر مكتبة الحمض الريبي النووي الذواب لإزالة محول: محولات (~ 1.5 ساعة)
- أداء المكتبة الحجم التحديد باستخدام التلقائي حجم الحمض النووي محدد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع المعلمات حجم التالية: الهدف: 156 نقطة أساس، البدء: 135 سنة مضت، نهاية: 177 سنة مضت، المدى العلم: واسعة.
- الحمض النووي تنظيف (~ 0.5 ساعة)
- تنظيف حجم مختارة الحمض الريبي النووي الذواب كدنا] وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- أزل نظيفة وتتركز الحمض الريبي النووي الذواب كدنا] مع H 2 × 7 ميكرولتر الدناز / ريبونوكلياز خالية من 2 O.
- قياس وتقييم الحمض الريبي النووي الذواب كدنا] مكتبة المحصول والجودة (~ 1 ساعة)
- تقييم الحمض الريبي النووي الذواب كدنا] جودة المكتبات وحجم باستخدام رقاقة الحمض النووي ذات حساسية عالية على bioanalyzer (قائمة المواد) حسب التصنتعليمات urer ل.
- قياس تركيزات مكتبة الحمض الريبي النووي الذواب [كدنا الفردية باستخدام فحص الحمض النووي ذات حساسية عالية (قائمة المواد)، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: من المستحسن أن يكون جميع العينات مع مؤشرات مختلفة يتم تشغيلها على نفس الممر من الخلية التدفق إن أمكن. إذا كنت بحاجة حارة أكثر من واحد، مزيج حالة ومراقبة العينات بشكل مناسب.
- الإنتاجية العالية الحمض الريبي النووي الذواب التسلسل (~ 7 أيام)
- تجمع الفرد فهرسة المكتبات الحمض الريبي النووي الذواب بناء على تركيزات متساوي المولية.
- مجمعة شاشة مكتبات الحمض الريبي النووي الذواب عن الجودة باستخدام ذات حساسية عالية رقاقة الحمض النووي على bioanalyzer وتحديد تركيز الحمض النووي المكتبة كما هو الحال في 2.5.1 - 2.5.2.
- أداء الكمي PCR (QPCR) من المحتويات محول لضمان عمق التسلسل المناسب باستخدام مكتبة التسلسل عدة QPCR الكمي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (قائمة المواد).
- أداء التسلسل باستخدام قراءة واحدة، 50 ببروتوكول ص لتصل إلى عمق حوالي 20 - 25 M يقرأ / عينة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
3. تحليل البيانات (~ 1 يوم)
- استخدام bcl2fastq2، وفقا لتعليمات دليل المستخدم، لملفات fastq الخام المعالجة المسبقة لعينات demultiplexed (قائمة المواد).
- استخدام Cutadapt لخفض محولات 9 و إزالة يقرأ <16 النيوكليوتيدات (اليلة) في الطول، وفقا لتعليمات دليل المستخدم (قائمة المواد).
- إزالة تسلسل التلوث الموجودة في مكتبات الحمض الريبي النووي الذواب، بما في ذلك تسلسل وقف الحل (STP: CCACGTTCCCGTGG) ومحول ترحيل (CTACAGTCCGACGATC) باستخدام وظيفة removeSequenceInFastq في إطار NGSPERL، وفقا لتعليمات دليل المستخدم (قائمة المواد).
- أداء مقاييس مراقبة الجودة من قبل FastQC مركز العلوم الكمي (CQS) أدوات تستخدم، وفقا لتعليمات دليل المستخدم (قائمة المواد).
- توليد قائمة غير زائدة من "متطابقة" يقرأ (انهيار redundaيقرأ الإقليم الشمالي) وأرقام النسخة الأصلية باستخدام CQSTools، وفقا لتعليمات دليل المستخدم (قائمة المواد).
- محاذاة يقرأ على الجينوم البشري باستخدام Bowtie1.1.2 السماح 1 عدم تطابق (خيارات: -A -m 100 --best --strata -v 1)، وفقا لتعليمات دليل المستخدم (قائمة المواد).
- أداء قراءة المحاذاة، العد، ويؤدي المهام التلخيص باستخدام NGSPERL، وفقا لتعليمات دليل المستخدم.
- تحويل جدول العد تصديرها إلى ملف البيانات.
- تطبيع يقرأ من فئة معينة (على سبيل المثال، miRNAs) لعدد من يقرأ لتلك الفئة (على سبيل المثال، عدد من miRNAs يقرأ) وإشارات التقرير بأنه يقرأ لكل المعينة ميرنا (RPMM). (على سبيل المثال، RPMM = (مير-X / إجمالي # ميرنا يقرأ) * 1000000).
- مدخلات تطبيع جدول العد إلى تقنية عامة لون واحد في البرنامج لمستوى منخفض والتفضيلية رفيع المستوى يحلل وفقا لتعليمات دليل المستخدم (قائمة المواد).
ملاحظة: في الوقت الراهن، هناك جينات التدبير المنزلي لا تميز جيدا / صرنأما بالنسبة HDL-الحمض الريبي النووي الذواب. ويمكن استخدام ضبط ارتفاع في، ولكن يمكن أن يكون مشكلة. تطبيع إلى HDL مجموع المدخلات البروتين أو حجم ينصح. الأهم من ذلك، فمن المستحسن للتحقق من صحة النتائج التسلسل من قبل واحدة من استراتيجيات مختلفة لتحديد miRNAs وsRNAs في الوقت الحقيقي باستخدام PCR أو PCR الكمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول هو عبارة عن سلسلة من أساليب إنشاء ترتبط معا للسماح لتقدير حجم sRNAs على HDL نقية للغاية من الإنتاجية العالية التسلسل أو في الوقت الحقيقي PCR (الشكل 1). لإثبات جدوى وتأثير هذا البروتوكول، وتنقيته HDL من البلازما البشرية على الركيزتين DGUC وFPLC الأسلوب. وتركزت كسور FPLC جمعها الموافق HDL (الكوليسترول عن طريق التوزيع) وتم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من 1 ملغ من الكوليسترول الجيد (البروتين الكلي). تم إنشاؤها مكتبات الحمض الريبي النووي الذواب مع HDL التي تم جمعها من ن = 4 موضوعات البشرية السليمة. وقد تم جمع جميع عينات الدم / بلازما الإنسان في ظل نشطا بروتوكول جنة المراجعة المؤسساتية (# 070416)، والتحق بالكائن البشري للموافقة المسبقة عن النحو الذي أقرته جامعة فاندربيلت في كلية الطب. والتسلسل مكتبات الحمض الريبي النووي الذواب أعدت في فاندربيلت تكنولوجيات الجينوم المتقدم (VANTAGE) أجريت مركز تسلسل الحمض النووي وبيانات التحليلاتاستخدام خطوط الأنابيب في المنزل. تم إنشاء تصورات البيانات عن طريق الرسوم البيانية البرمجيات.
ومن المقرر أن المشتركة المحتملة لتنقية المركبات الكهربائية الحاجة الماسة إلى إجراء الطريقة الثانية (FPLC) لعزل HDL بعد DGUC. السيارات الكهربائية هي فئة معممة من الحويصلات المشتقة من غشاء التي تنشأ من الهيئات عديد الحويصلات (exosomes)، غشاء البلازما مهدها (microvesicles)، وغيرها من العمليات، بما في ذلك الهيئات أفكارك 10. تم الإبلاغ عن المركبات الكهربائية، وهي exosomes أن يكون لها كثافة مماثلة لHDL صغير (الشكل 2A)، وبالتالي، يمكن أن تكون موجودة في جزء الكثافة HDL (1،063-1،21 ز / مل) بعد DGUC 11،12. لإزالة المركبات الكهربائية والبروتينات الدهنية الأخرى (على سبيل المثال، LDL)، من DGUC-HDL، وكان يستخدم FPLC إلى HDL منفصل من الحويصلات والجزيئات الأخرى من حيث الحجم. ومجزأة - (220 نانومتر في القطر 40) بسهولة بسبب الخلافات حجمها (الشكل 2A B،) - HDL (7 12 نانومتر في القطر) والمركبات الكهربائية. جزء الحميدكانت الصورة جلية واضحة بسبب توزيع الكوليسترول في الدم، وكان يتم تجميع الكسور DGUC-HDL FPLC وتتركز باستخدام 10 كيلو دالتون قطع مرشحات الطرد المركزي. تم جمع المركزة HDL وتستخدم لتحليل الحمض النووي الريبي المصب (الشكل 2B). لتوضيح هذه النقطة، ومجزأة البلازما قبل DGUC باستخدام FPLC وتوزيع الدهون الفوسفاتية (فسفاتيديل، PC). وتم قياس كمية الكولسترول الكلي (TC)، ومستويات البروتين وتآمر عبر الكسور. وتم قياس كمية الكمبيوتر، والتعاون التقني، والبروتينات مستويات باستخدام ثلاث مجموعات اللونية. تعريف جميع المعلمات الثلاث بوضوح الكسور HDL (19 - 24)، وكسور VLDL / LDL (14-18). في البلازما مجزأة FPLC، تم الكشف عن البروتين والدهون إشارات الحد الأدنى أو لم يتم الكشف على الإطلاق في كسور الموافق حويصلة أحجام أكبر من VLDL (يسار مربع برتقالي) (الشكل 3A). لإثبات الفصل DGUC من HDL، ومجزأة DGUC-HDL أيضا FPLC والكمبيوتر، والتعاون التقني، وكانت مستويات البروتينات quantifالعبوات الناسفة (الشكل 3B). بالتآمر هذه القيم يوضح شارك في تجزئة كمية صغيرة من LDL باستخدام DGUC ويعزز الحاجة إلى استخدام جنبا إلى جنب نهج DGUC-FPLC لعزل HDL نقية للغاية. وعلى الرغم من توقع المركبات الكهربائية للمشاركة في يجزئ مع HDL خلال DGUC، كان هناك القليل لا شيء وجدت في الدهون والبروتين في كسور الموافق حويصلة أحجام أكبر من LDL (الشكل 3B). الدهون EV والتوقيع البروتين في نطاق حجم تنبأ هو أيضا اكتشاف الحد الأدنى أو غائبا عن DGUC-VLDL وDGUC-LDL عندما مجزأة من قبل FPLC (لا تظهر البيانات). لتحليل الحمض النووي الريبي، تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من 1 ملغ من جنبا إلى جنب HDL تنقيته لالحمض الريبي النووي الذواب جيل مكتبة. باختصار، كانت ligated محولات ل3 'ثم 5' نهايات الطرفية من sRNAs، بما في ذلك miRNAs وtDRs الشكل (4A). منتجات Ligated تم نسخه العكس (RT) وPCR تضخيمها باستخدام بادئات PCR إيواء مؤشرات محددة تهدف لعينات مضاعفة خلال داوردود الفعل التسلسل nstream الشكل (4A). لكل محول 61 اليلة في الطول. وبالتالي، فإن ميرنا ligated (ما يقرب من 22 اليلة في الطول) إنتاج منتج من 144 اليلة في الطول. العديد من غير ميرنا sRNAs تكون أطول قليلا من miRNAs (على سبيل المثال، 30 - 35 اليلة في الطول). على هذا النحو، كان لدينا طول المستهدفة من الناتج 156 نقطة أساس في الطول. وكانت المنتجات تضخيمها باستخدام محدد حجم الحمض النووي التلقائي وجميع المنتجات [كدنا 135 الحجم المحدد - تم جمع 177 نقطة أساس في طول الشكل (4A). تم تقييم الصفات من مكتبات مختارة حجم بواسطة رقائق الحمض النووي ذات حساسية عالية باستخدام bioanalyzer (الشكل 4B). ظهرت مكتبات الحمض الريبي النووي الذواب كدنا] من هذا الحجم أكبر قليلا في الحجم بسبب ممكن "السطح" الآثار أثناء التحليل. لتسلسل المضاعفة، وكان يتم تجميع تركيزات متساوي المولية للمكتبات كدنا]، وتنظيفها، تتركز، وأعادوا تحليل باستخدام bioanalyzer (الشكل 4B). العينة المضاعفة ثم sequenدائرة الهندسة المدنية باستخدام واحد يقرأ 50 بروتوكول مضت. تم استخدام أنابيب تحليل البيانات في منزل لdemultiplex عينات المبنية على المؤشرات، وتقليم محولات، تشغيل المقاييس ومراقبة الجودة، محاذاة للجينوم البشري والاعتماد sRNAs المشروح. توزيع تطبيع يقرأ (يقرأ لكل مليون، دورة في الدقيقة)،> 16 اليلة في الطول، وتوضيح إثراء sRNAs 20-22 اليلة في طول و34-35 اليلة في الطول على HDL (الشكل 4C).
وجدت المحاذاة والعد تحليل المكتبات أربع سنوات HDL سرنا أن 38٪ من يقرأ محاذاة إلى المناطق المشروح من الجينوم البشري كانت miRNAs (الشكل 5A). وفيرة على قدم المساواة (37٪) من sRNAs المستمدة من tRNAs (tDRs). كانت sRNAs المستمدة من الرنا متنوعة (على سبيل المثال، Y الرنا)، rRNAs، smRNAs، snoRNAs، والرنا طويلة غير الترميز (lincRNAs) أيضا موجودة على HDL (الشكل 5A). بعد تطبيع لعدد من يقرأ عن كل فئة، وأعلى 50 الأكثر وفرة ميرالناس (قراءات لكل رسم خرائطها ميرنا، RPMM، الشكل 5B)، tDRs (قراءات لكل المعينة tDRs، RPMT، الشكل 5C)، وغيرهم من غير ميرنا غير تقرير التجارة والتنمية-sRNAs (يقرأ لكل المعينة سرنا دورة بالدقيقة، الشكل 5D) نظمتها المخططات الحرارية . وتوضح هذه البيانات أوجه التشابه (على سبيل المثال، HDL-miRNAs) والتناقضات (على سبيل المثال، tDRs) من الأكثر وفرة HDL-sRNAs عبر الأصحاء (الشكل 5B-D). هذه النتائج تثبت قوة هذه الاستراتيجية وبروتوكول لتقديم رؤى رائعة في نقل sRNAs بواسطة HDL. ومع ذلك، لا ينبغي الاعتماد الحمض الريبي النووي الذواب التسلسل لمدة الكميات المطلقة. يجب التحقق من صحة sRNAs من الاهتمام من قبل في الوقت الحقيقي PCR. وبالمثل، قد العديد من المحققين لا تتطلب سوى القياس الكمي لmiRNAs الفردية على HDL. على هذا النحو، تم عزل مجموع HDL الحمض النووي الريبي من كل موضوع لتقدير النسبي للHDL-miRNAs في الوقت الحقيقي باستخدام PCR. استخدمت خمسة من miRNAs أكثر وفرة الكشف على HDL بواسطة sRNAseq لشركات الالمقايسات PCR ل الوقت لتحديد مستوياتها على كل عينة HDL (الشكل 5E). تم حساب القيم الكمية النسبية باستخدام التدبير المنزلي التعسفية ط م 32 (RQV = 2 - ΔCtArb) وتطبيع 1000 ميكروغرام من HDL إدخال البروتين إلى الحمض النووي الريبي العزلة (13). النتائج من دراسة PCR في الوقت الحقيقي تثبت أن هذا البروتوكول هو أيضا قيمة في كشف HDL-miRNAs وقياس الفروق بين الأفراد. إجمالا، الخطط المقدمة تحدد تفاصيل الحرجة من الطرق، والنتائج على حد سواء التسلسل الإنتاجية العالية في الوقت الحقيقي والنهج PCR تمثل مخرجات هذا البروتوكول.
الشكل 1. الممثل تدفق الرسم البياني للبروتوكول. يتم عزل HDL النقي من تنبيذ فائق التدرج الكثافة والبروتين سريع chromatog السائل raphy. إجمالي HDL RNA ومن ثم يمكن استخدامها لRNA الصغيرة (الحمض الريبي النووي الذواب) التسلسل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. عزل HDL. (A) رسم بياني لكثافة وقطر من البروتينات الدهنية والحويصلات خارج الخلية (EV). (ب) رسم تخطيطي للمتسلسلة العزلة جنبا إلى جنب HDL، بما في ذلك فصل البلازما، والكثافة التدرج تنبيذ فائق (DGUC)، بسرعة البروتين اللوني السائل (FPLC)، والترشيح، وتركيز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
pload / 54488 / 54488fig3.jpg "/>
الرقم 3. سريع البروتين اللوني السائل (FPLC) فصل البروتينات الدهنية EV، الحويصلات خارج الخلية؛ VLDL، جدا البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة. LDL، البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة. HDL، البروتينات الدهنية عالية الكثافة. FP، البروتين الحرة؛ PC، فسفاتيديل. وTC، الكوليسترول الكلي. خط أحمر، والتعاون التقني. الخط الأزرق، والبروتين، وخط أسود، وأجهزة الكمبيوتر. فصل البروتينات الدهنية من (A) البلازما البشرية قبل تنبيذ فائق الكثافة التدرج (DGUC) و (ب) HDL الكسر بعد DGUC. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الجيل من الحمض النووي الريبي المكتبات الصغيرة. (A) تخطيطي من الحمض النووي الريبي الصغيرة (الحمض الريبي النووي الذواب) مكتبة جonstruction وحجم التحديد. ميرنا، الرنا الميكروي. تقرير التجارة والتنمية، sRNAs الحمض الريبي النووي النقال المشتقة. سرنا غير ميرنا غير تقرير التجارة والتنمية-sRNAs. RT، عكس النسخ؛ بي بي، زوج قاعدة. وكدنا]، والحمض النووي المستنسخة. (ب) تحليل المكتبات HDL-الحمض الريبي النووي الذواب قبل وبعد مضاعفة باستخدام ذات حساسية عالية رقائق الحمض النووي وbioanalyzer. (C) توزيع طول HDL-الحمض الريبي النووي الذواب يقرأ بعد التسلسل. دورة في الدقيقة، يقرأ لكل مليون. M، والموضوعات الذكور. F، والموضوعات الإناث. والإقليم الشمالي، النوكليوتيدات. N = 4. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تنوع HDL-sRNAs. (A) توزيع HDL-sRNAs جميع فئات الحمض الريبي النووي الذواب. يقرأ محاذاة جزء من لsRNAs المشروح في الجينوم البشري. (BD) المخططات الحرارية N = 4 عينات HDL-الحمض الريبي النووي الذواب.
| 1. المضادة للتأكسد لفصل البروتين الدهني | جعل حل الأسهم في 100X |
| EDTA | ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (0.5 M الأسهم) |
| AZT | 3-أمينو-1،2،4-التريازول: 42 ملغ / مل H 2 O |
| BHT | الأنيسول Hydroxytoluene: 25 ملغ / 100 ميكرولتر ETOH |
| TROLOX | (+) - 6-هيدروكسي-2،5،7،8-tetramethylchromane-2-متيل حمض: 41.7 ملغ / 500 ميكرولتر ETOH |
| 2. حلول تراكب | |
| حل # 1 | 1.019 غرام / مليلتر في H 2 O |
| حل # 2 | 1.025 غرام / مليلتر كي بي آر / H 2 O |
| حل # 3 | 1.063 غرام / مليلتر كي بي آر / H 2 O |
| حل # 4 | 1.080 غرام / مليلتر كي بي آر / H 2 O |
| حل # 5 | 1.255 غرام / مليلتر كي بي آر / H 2 O |
| 3. FPLC العازلة | </ tr> |
| 1 لتر وصفة | 50 مل 3M كلوريد الصوديوم. 20 مل 0.5 تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.6. 2 مل من 10٪ أزيد الصوديوم. 930 مل H 2 O |
الجدول 1. الكواشف الخاصة.
| المسرح | درجة الحرارة (° C) | مرة | دورات |
| ا | 98 | 30 ثانية | 1 |
| ب | 98 | 10 ثانية | 25 |
| 60 | 30 ثانية | ||
| 72 | 15 ثانية | ||
| C | 72 | 10 دقائق | 1 |
الجدول 2.مكتبة الجيل خطوات التضخيم.
| كتاب تمهيدي | تسلسل |
| التمهيدي 1.1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| التمهيدي 2.1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
الجدول 3. PCR الاشعال.
| المسرح | درجة الحرارة (° C) | مرة | دورات |
| ا | 95 | 10 دقائق | 1 |
| ب | 95 | 10 ثانية | 40 |
| 60 |
الجدول 4. مكتبة الكمي التضخيم خطوات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد miRNAs وsRNAs الآخرين من خلال الإنتاجية العالية التسلسل أو في الوقت الحقيقي PCR على HDL نقية للغاية. كما هو الحال مع أي نهج، ينبغي إيلاء اعتبار خاص لكل خطوة في عملية HDL تنقية وRNA ومن ثم قياس sRNAs. تم تصميم هذا البروتوكول لمشاريع بدءا ≥ 2 مل من البلازما. ومع ذلك، يمكن أن تكتمل بنجاح تحليلات الحمض النووي الريبي جودة عالية مع HDL تنقيته من اقل من 80 ميكرولتر من البلازما البشرية أو الماوس باستخدام تقارب اللوني. ومع ذلك، وأكبر كميات انطلاق البلازما تنتج بيانات أفضل باستخدام الأساليب المقدمة هنا. يمكن أن طرق المعالجة واستخراج عينة يغير بشكل جذري ميرنا / الحمض الريبي النووي الذواب الجودة والإنتاجية. استخدام مضادات التخثر، وإن كان ضروريا لجمع البلازما، من المرجح أن يؤثر استخراج المصب. على سبيل المثال، لا يتم إزالة الهيبارين بسهولة أثناء استخراج الحمض النووي الريبي 14،15، ويمكن أن تمنع الانزيمات المصب المستخدمة في PCR 16-18. وبالإضافة إلى ذلك، اليحرث تقارير تفيد بأن سيترات الصوديوم قد تتداخل أيضا مع قياسات QPCR حيث يتم عرض miRNAs من عينات EDTA قد تحسنت الشخصي التعبير مقارنة عينات سيترات الصوديوم 16،19،20. وتوضح هذه الدراسات الحاجة إلى دراسة متأنية عند اختيار مضادة للتخثر. وعلاوة على ذلك، نظرا لزيادة احتمال تحلل الخلية خلال تجلط الدم، لا ينصح عينات المصل كما miRNAs الخلوية هي lysed قد ربط مصطنع مع البروتينات الدهنية. وبالمثل، يتم عزل البلازما في موقع متميز من الدم الكامل لتجنب التلوث من خلايا الدم الطرفية الأخرى، بما في ذلك الكريات البيض هي lysed. وكما هو معروف على نطاق واسع درجة الحرارة الباردة تؤثر على تنشيط الصفائح الدموية، ونسج عينات دم كاملة بعيدا عن كريات الدم الحمراء، كريات الدم البيضاء والصفائح الدموية في 3000 x ج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كما نصح انحلال الدم سوء كما تم الإبلاغ عن كريات الدم الحمراء تمزق في التأثير أيضا ميرنا نتيجة 21،22، لأنها تحتوي على miRNAs التي يمكن تسليط خلال hemolيسيس 23،24. البلازما يمكن تخزينها بعد ذلك في 4 درجة مئوية لمدة 2-4 أسابيع أو بدلا من البلازما يمكن تجميد في -80 درجة مئوية حيث المحتوى ميرنا غير مستقرة وقابلة للحياة في كل من المدى القصير والتخزين على المدى الطويل (بحد أقصى 4 سنوات) 25. لمعرفتنا الحالية، وتجميد عينات البلازما لا يتوقع أن تضر HDL-miRNAs وعينات البلازما المجمدة هي مناسبة لتحليل. كما البروتينات الدهنية وغيرها من مكونات الدم الكامل يمكن أن تتأثر تناول الطعام، ويفضل الصيام جمع الدم.
وكما ذكر أعلاه، HDL البلازما يمكن أن تكون معزولة من خلال عدد من الأساليب القياسية، بما في ذلك DGUC، FPLC، واللوني تقارب ضد برنامج عمل ألماتي-I. . عزل البروتينات الدهنية البلازما DGUC باستخدام KBR، كما وصفها Redgraves وآخرون 26، يفصل VLDL (د = 0،94-1،006 ز / مل)، LDL (د = 1،006-1،063 غ / مل) وHDL (د = 1،063-1،21 ز / مل) وهو الأسلوب الأمثل لكميات كبيرة من البلازما (2-60 مل لكل عينة). الحدلاستخدام هذا النهج وحده هو الذي يتم الإبلاغ exosomes وميرنا الأخرى التي تحتوي على المركبات الكهربائية لديها كثافة مماثلة لHDL وقد تكون موجودة في DGUC HDL (الشكل 2A). وتشمل العيوب الأخرى أضرار هيكلية الممكن البروتينات من التعرض الملح العالية في مخازن وقوات تنبيذ فائق قوية وكذلك بثبات التفاضلية من HDL دون الطبقات 27،28. على الرغم من هذا، ويستخدم عادة DGUC كما أنه يؤدي إلى ارتفاع العائد من البروتين HDL، وتنتج ما يقرب من 1 ملغ من البروتين HDL لكل 1 مل من البلازما 29. النهج FPLC، الذي ينطوي على الحجم استبعاد جل والترشيح، ويتطلب وقتا أقل، وهذا يتوقف على معدل التدفق (حوالي 6 ساعات)، ولديه قدر أكبر من الدقة التي تفصل HDL من apoB التي تحتوي على البروتينات الدهنية (حسب الحجم) والطبقات الفرعية، بما في ذلك المركبات الكهربائية التي هي أكبر بكثير من HDL ولكن لديها كثافة مماثلة. وتجدر الإشارة إلى أن استخدام الطرق المفصلة في هذا البروتوكول، والحويصلات البلازما بين ما يقرب من 220 حتي 75 نانومتر في قطر لاانتزاع اكتشاف الدهون أو البروتين توقيع عندما مفصولة FPLC. تبعا لانشاء، FPLC يتطلب إدخال صغير نسبيا، 0،3-1 مل، وهو مفيد للالبلازما القوارض وقسامات المجمدة صغيرة. سريعة فحوصات الكولسترول اللونية مهمة أيضا التالية FPLC لتأكيد توزيع HDL أو غيرها من مكونات البروتين الدهني. تجزئة يخفف العينات والبروتينات الدهنية. ومع ذلك، والعينات ويمكن بعد ذلك أن تتركز باستخدام معيار الطرد المركزي حجم المرشحات (على سبيل المثال، 10 كيلو دالتون ميغاواط قطع فلتر). العزلة هدل بواسطة برنامج عمل ألماتي-I IP باستخدام الأعمدة تدور الصغيرة هي أسرع من الطرق الثلاث، لكنها محدودة من المدخلات المنخفضة (،08-1 ميكرولتر) حجم وانخفاض الغلة (حوالي 0.1 ملغ). في حين أن برنامج عمل ألماتي-I IP تكون شاقة، وهذه الطريقة مثالية لانخفاض حجم supernatants ثقافة الخلية. في حين أن كل من هذه الأساليب لديها القوة والضعف، وهذه يمكن أن تخفض إذا استخدمت جنبا إلى جنب (على سبيل المثال، تليها DGUC FPLC). باستخدام نهجين جنبا إلى جنب، في نتائج اكبر نقاءHDL لميرنا والحمض الريبي النووي الذواب التحليل.
هنا، ونحن بالتفصيل الخطوات المطلوبة لعزل HDL نقية للغاية باستخدام طريقة جنبا إلى جنب من DGUC تليها FPLC وحددت الخطوات المتبعة لتحديد HDL-miRNAs وsRNAs باستخدام التسلسل الإنتاجية العالية أو في الوقت الحقيقي PCR. على الرغم من أن هذا البروتوكول تم تصميمه من أجل HDL، فقد تطبيق كبير في قياس sRNAs على البروتينات الدهنية الأخرى، بما في ذلك LDL وVLDL، على أساس الكثافة وأحجامها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
