Abstract
Разнообразие малых некодирующих РНК (рРНК) быстро расширяется и их роли в биологических процессах, в том числе регуляции генов, появляются. Самое интересное, что sRNAs также находятся вне клеток и стабильно присутствуют во всех биологических жидкостях. Таким образом, внеклеточные sRNAs представляют собой новый класс биомаркеров заболеваний, и они, вероятно, участвуют в клеточной сигнализации и межклеточных сетей связи. Для того, чтобы оценить их потенциал в качестве биомаркеров, sRNAs может быть определена количественно в плазме крови, мочи и других жидкостей. Тем не менее, чтобы полностью понять влияние внеклеточных sRNAs как эндокринные сигналов, важно , чтобы определить , какие носители транспортировки и защиты их в биологических жидкостях (например, в плазме), что клетки и ткани , способствуют внеклеточные пулы Срна, и клетки и ткани , способные принятия и использования внеклеточный Срна. Для достижения этих целей, важно, чтобы изолировать высокочистых популяции внеклеточного носителейдля профилирования Срна и количественной оценки. Ранее мы показали, что липопротеиды, в частности, липопротеины высокой плотности (HDL), транспорт (функциональные микроРНК микроРНК) между клетками и ЛВП-микроРНК существенно изменяются при болезни. Здесь мы подробно новый протокол, который использует тандемный HDL изоляции с градиенте плотности ультрацентрифугирования (DGUC) и быстрого белка-жидкостной хроматографии (FPLC) для получения высокочистого HDL для нисходящего профилирования и количественной оценки всех sRNAs, в том числе микроРНК, используя как высокий -throughput секвенирования и ПЦР в реальном времени подходы. Этот протокол будет ценным ресурсом для исследования sRNAs на HDL.
Introduction
Внеклеточного-некодирующие малые РНК (sRNAs) представляют собой новый класс биомаркеров заболеваний и потенциальных терапевтических мишеней и , вероятно , облегчит клетки к клетке связи 1. Наиболее широко изученным типом рРНК являются микроРНК (миРНК) , которые приблизительно 22 NTS в длину и обрабатываются из более длинных форм - предшественников и первичных транскриптов 2. микроРНК были продемонстрированы посттранскрипционно регулируют экспрессию генов путем подавления белка трансляции и индукции деградацию мРНК 2. Тем не менее, микроРНК являются лишь одним из многих типов sRNAs; в качестве sRNAs могут быть расщеплены от родительских тРНК (тРНК производные sRNAs, TDR), малые ядерные РНК (рРНК-производных sRNAs, sndRNA), небольшие ядрышковых РНК (snoRNA-производных sRNAs, мяРНК), рибосомных РНК (рРНК происхождения sRNAs РДР ), Y РНК (yDR) и различных других РНК 1. Несколько примеров таких новых sRNAs Сообщалось, что функцию, аналогичную функции микроРНК; Однако биологические фуnctions многих из этих sRNAs еще предстоит определить, хотя роли в регуляции генов, вероятно , 3-6. Самое интересное, что микроРНК и другие sRNAs стабильно присутствуют в внеклеточной жидкости, в том числе слюны, плазмы, мочи и желчи. Внеклеточные sRNAs, вероятно, защищены от РНКазы через их ассоциации с внеклеточным везикул (EV), липопротеинов и / или внеклеточных рибонуклеопротеидных комплексов.
Ранее мы сообщали , что липопротеины, а именно липопротеины высокой плотности (ЛПВП), транспорт микроРНК в плазме 7. В этом исследовании, ЛВП были выделены с использованием последовательного метода градиента плотности ультрацентрифугирования (DGUC), быстро-жидкостной хроматографии протеинов (гель-хроматография на силикагеле, фильтрование, FPLC) и аффинной хроматографии (анти-аполипопротеина (апо-I) иммунопреципитация ) 7. Используя оба в режиме реального времени массивов на основе ПЦР с низкой плотностью и индивидуальных анализов микроРНК, уровни микроРНК были определены количественно на HDL изолированы от заживаюттвой и гиперхолестеринемией предметы 7. Используя этот подход, мы смогли в профиль микроРНК и количественно определенные микроРНК в высокочистых HDL препаратов. Начиная с 2011 года, мы определили, что, хотя аффинная хроматография повышает чистоту HDL, насыщенность антител значительно ограничивает выход, и может быть экономически запретительными. В настоящее время наш протокол рекомендует двухэтапный метод последовательного тандема DGUC с последующим FPLC, который также производит высококачественные образцы HDL для вниз потока выделения РНК и Срна количественной оценки. В связи с последними достижениями в области высокой пропускной последовательности sRNAs (sRNAseq), например, микроРНК, а также повышение уровня информированности других классов , не микроРНК Срна, sRNAseq текущее состояние-оф-искусства в микроРНК и Срна профилирования. Таким образом, наш протокол рекомендует количественное микроРНК и другие sRNAs на образцах HDL с использованием sRNAseq. Тем не менее, общая РНК, выделенной из HDL также могут быть использованы для определения индивидуальных микроРНК и других sRNAs или проверки достоверности результатов sRNAseq с помощью ПЦР в реальном времени Approaches. Здесь мы опишем подробно протокол для сбора, очистки, количественной оценки, анализа данных и проверки высокочистого HDL-sRNAs.
Основная цель данной работы заключается в демонстрации осуществимости и процесс Срна количественной оценки с высокой степенью чистоты HDL, выделенной из плазмы крови человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Очистка HDL (~ 5,5 дней)
- Градиента плотности Ультрацентрифугирование (DGUC, ~ 5 дней)
- Добавьте 90 мкл 100x антиокислителей к 9 мл плазмы, выделенных из свежей венозной крови.
- Отрегулируйте плотность плазмы с КВг от 1,006 г / мл до 1,025 г / мл путем добавления 0,251 г KBr до 9 мл плазмы со стадии (1.1.1 0,0278 г / мл плазмы KBr). Rock плазму, пока вся соль не растворяется при комнатной температуре и передать Ультрацентрифуга трубы и гарантировать, что все пузырьки поднимаются к вершине.
- Согните кончик 18-G иглы до 90 ° 1 см от кончика, скос стороной вверх. С помощью шприца и 18 иглы калибра, осторожно поместите 3 мл наложения раствора N 1 по плазме (таблица 1).
Примечание: Изогнутая игла обеспечивает все VLDL / IDL, LDL и HDL удаляются без смешивания с наложением. - Удалить большинство пузырьков в верхней части, оставляя 2 - 3 мм пространство от мениска до верхней части трубки и сторожныLLY поместить пробирки в SW-40Ti ведра.
- Взвесить каждый ведро (с крышками) на баланс, а именно баланс с обратным ковшом (ведро + крышки): # 1 # 4, # 2 до # 5 и # 3 # 6.
Примечание: Эти ведра должны быть сбалансированы и согласованы во все времена. - Поместите ротор в ультрацентрифуге (Перечень материалов). Центрифуга на 274,400 мкг в течение 24 ч при 4 ° С с # 4 промежуточного тормоза.
- Осторожно удалите ведра из ротора и трубки из ведра.
- Тщательно удалите 2 мл из верхнего слоя наложения с помощью шприца и изогнутую иглу. Это будет доля VLDL / IDL, который можно хранить при температуре 4 ° С или -80 ° С.
- После удаления фракции ЛПОНП / IDL, собирают оставшиеся 7 мл образца (плазмы) и поместить его в 15 мл коническую трубку. Доведите объем образца до 9 мл с наложенной раствора N 2 (таблица 1).
- Отрегулируйте плотность образца от 1,025 г / мл до 1,080 г / мл с использованием KBrприблизительно 0,746 г KBr в образце 9 мл или 0.0828 г / мл KBr образца. Осторожно покачайте образец, пока весь KBr не растворится (примерно 20 мин) и передать Ультрацентрифуга трубку обеспечивая при этом пузырьки поднимаются к вершине.
- С помощью шприца и иглы, осторожно поместить 3 мл наложения раствора N 3 по образцу (таблица 1). Оставьте 2 - 3 мм Зазор от мениска до верхней части трубы.
- Смещать большинство оставшихся пузырьков в верхней части трубы и осторожно поместить заполненные ультрацентрифуге трубки в SW-40Ti ведра.
- Взвесить каждый ведро (с крышками) на баланс, а именно баланс с обратным ковшом + крышкой, как и в 1.1.5.
- Поместите ротор в ультрацентрифуге (см список материалов). Центрифуга на 274,400 мкг в течение 24 ч при 4 ° С с # 4 промежуточного тормоза.
- Осторожно удалите ведра из ротора и трубки из ведра.
- Тщательно удалите 2 мл из верхнего слоя наложения с помощью шприца и бытьнт игла. Это будет ЛНП фракцию, которую можно хранить при температуре 4 ° С или -80 ° С.
- После удаления фракции LDL, собирают оставшиеся приблизительные 7 мл образца (плазмы) и поместите его в новый 15 мл коническую трубку. Доведите объем образца (плазмы) до 9 мл с 1,080 г / мл раствора N 4 (таблица 1).
- Отрегулируйте плотность образца от 1,080 г / мл до 1,30 г / мл с KBr с использованием 3,33 г KBr в 9 мл образца (плазмы) или 0,37 г KBr для каждого мл образца. Рок или слегка перемешивать образец, пока весь KBr (соль) не растворяется и передать Ультрацентрифуга трубку.
- С помощью шприца и иглы, осторожно поместить 3 мл наложения раствора N 5 по образцу (таблица 1).
- Смещать большинство оставшихся пузырьков в верхней части трубы, в результате чего 2- 3 мм Зазор от мениска до верхней части трубки и осторожно поместить заполненные ультрацентрифуге трубки в SW-40Ti ведра.
- Взвешивать каждое ведро (с колпачками), находящихся на балансе, а именно баланс с противоположным ковшом + крышкой, как и в 1.1.5.
- Поместите ротор в ультрацентрифуге (см список материалов). Центрифуга на 274,400 мкг в течение 48 ч при 4 ° С с # 4 тормозом.
- Осторожно удалите ведра из ротора и трубки из ведра.
- Осторожно удалите приблизительно 2 мл из верхнего слоя наложения с помощью шприца и изогнутую иглу. Это ЛВП фракция, которая может храниться при температуре 4 ° С или -80 ° С.
Примечание: После DGUC HDL может быть диализовали для удаления высокой солевых растворов. - Диализировать, поместите собранную HDL фракцию в запечатанном диализной рукава (10000 Мвт светотеневой) и диализ в течение ночи в 1 л 1x PBS. Изменение диализного буфера (1x PBS) 3 раза в течение 24 часов. Нежная возмущение PBS с магнитной мешалкой-бар улучшит диализ.
- Определить концентрацию белка в DGUC-HDL , используя метод BCA 8.
- Фаст-протеин Жидкий CHROmatography (FPLC) или вытеснительной хроматографии (~ 6 ч)
- Фильтр 1,2 мг DGUC-HDL (всего белка) в 500 мкл через мкм микро-центробежный фильтр 0,22 (см Перечень материалов), непосредственно перед инъекцией.
Примечание: дополнительная фильтрация образца DGUC-ЛПВП через мкм микро-центробежный фильтр 0,45 перед фильтром 0,22 мкм может потребоваться для некоторых образцов. - Соберите отфильтрованный образец DGUC-HDL, загрузите FPLC (наполнитель) шприцем, и гарантировать, что нет никаких пузырей в шприц перед инъекцией в FPLC.
- Установить расход FPLC до 0,3 мл / мин с пределом давления при 2,6 МПа. Равновесие столбцы с 0,2 объемами колонки (приблизительно 15 мл) буфера до начала пробы инъекции. Вводят образца с 3 мл буфера в (впрыск топлива) инструмента FPLC и начать бег. Сбор 1,5 мл фракции в общей сложности 72 фракций.
- Фильтр 1,2 мг DGUC-HDL (всего белка) в 500 мкл через мкм микро-центробежный фильтр 0,22 (см Перечень материалов), непосредственно перед инъекцией.
2. Высокая пропускная способность малых РНКСеквенирование (sRNAseq, ~ 9 дней)
- Выделение РНК (~ 1 день)
- Определение FPLC фракции, соответствующие DGUC-HDL путем определения общего уровня холестерина с помощью колориметрического набора в соответствии с инструкциями изготовителя. С помощью этого FPLC установка, ожидать, чтобы найти 6 - 7 FPLC фракции, содержащие DGUC-HDL.
- Собрать весь объем (примерно 8 -1 0 мл пула 1,45 мл фракции томов) из DGUC-HDL FPLC фракции и концентрата с использованием 10 кДа Мвт отрезные центробежные блоки фильтров при 4000 мкг в течение 1 ч при 4 ° С или до HDL концентрата составляет примерно 100 мкл.
- Собирают HDL концентрата и количественно HDL концентрацией белка с использованием метода BCA 8.
- Определить самую высокую концентрацию ЛПВП общего белка до 1 мг, которые могут быть аликвоты от каждой пробы в наборе. Например, выделения РНК из того же количества HDL общего белка для каждого образца.
- Выполните Выделение РНК с использованиеммодифицированный протокол (см перечень материалов).
- Добавить 10x объем фенола лизирующего реагента (см перечень материалов) образца и вихря в течение 1 мин.
- Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавить хлороформ (20% объема фенольного реагента для лизиса, используемого на стадии 2.1.5.1) и энергично встряхивают в течение 15 с.
- Выдержите при комнатной температуре в течение 2 - 3 мин.
- Центрифуга в течение 15 мин при 12000 х г при 4 ° С в охлаждаемой центрифуге.
- Перенести верхнюю водную фазу в новую пробирку, избегая интерфазе.
- Добавить объем 1.5x 100% этанола к водной фазе и вихря в течение 1 мин.
- хранить образцы в течение по крайней мере 1 ч или в течение ночи при -80 ° С.
- Продолжить с протоколом выделения РНК, используя предоставленный мини-колонки.
- Элюировать 30 мкл РНКазы H 2 O. Сначала добавьте 15 мкл H 2 O непосредственно к фритты, спина при низкой скорости (2000 XG) в течение 2 мин, изатем вращаться на высокой скорости (макс) в течение 1 мин. Повторите этот шаг с дополнительными 15 мкл H 2 O.
- Сразу приступить к Срна библиотеки поколения или хранить при температуре -80 ° C.
- Библиотека поколения (~ 6 ч)
- Подготовить библиотеки рРНК кДНК с использованием протокола набора рРНК библиотеки поколения, в соответствии с инструкциями изготовителя с одной модификацией для ПЦР-амплификации, как описано ниже.
- Подготовьте Mastermix ПЦР на льду , содержащем 0,5 мкл ДНКазы / РНКазы H 2 O, 15 мкл ПЦР Mix (PML) и 1 мкл РНК - праймера ПЦР (RP1) на образец ( в том числе дополнительные 10% для пипетирования ошибка).
- Добавить 16,5 мкл ПЦР смесь к каждому (кДНК) образца.
- Назначают номер индекса / штрих-кодов для каждого образца для мультиплексирования и добавляют 1 мкл ПЦР-праймер Index (к соответствующему номеру) к образцу.
- Произвести быстрое вращение с помощью микроцентрифуге.
Примечание: Общий объем долженТеперь будет 30 мкл каждой пробы. - Выполните Циклическую для ПЦР - амплификации , как указано в таблицах 2 и 3.
- Подготовить библиотеки рРНК кДНК с использованием протокола набора рРНК библиотеки поколения, в соответствии с инструкциями изготовителя с одной модификацией для ПЦР-амплификации, как описано ниже.
- Размер Выберите рРНК Библиотека удалить адаптер: Адаптеры (~ 1,5 ч)
- Выполните размер библиотеки отбор с использованием автоматического выбора размера ДНК в соответствии с инструкциями изготовителя со следующими параметрами размера: Target: 156 пар оснований, Start: 135 пар оснований, Конец: 177 пар оснований, диапазон Флаг: Широкий.
- ДНК Clean Up (~ 0,5 ч)
- Очистка размер выбранных рРНК кДНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Элюции чистый и концентрировали Срна кДНК с 2 х 7 мкл ДНКазы / РНКазы H 2 O.
- Количественная и оценки рРНК кДНК - библиотеки Урожай и качество (~ 1 час)
- Оценка рРНК библиотеки кДНК качество и размер с помощью ДНК-чипа высокой чувствительности на Bioanalyzer (Перечень материалов) в соответствии с изготовлинструкции urer в.
- Количественно индивидуальные концентрации библиотеки рРНК кДНК с использованием анализа ДНК высокой чувствительности (список материалов), в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: Рекомендуется, чтобы все образцы с различными индексами будут работать на той же полосе проточной ячейки, если это возможно. Если требуется более одной полосы движения, смешать тематические и контрольные образцы соответствующим образом.
- Высокая пропускная способность рРНК Секвенирование (~ 7 дней)
- Бассейн индивидуальный индексируется библиотеки Срна на основе эквимолярных концентрациях.
- Экран объединяют библиотеки Срна качества с использованием высокой чувствительности ДНК-чипа на Bioanalyzer и определяют концентрацию библиотеки ДНК, как и в 2.5.1 - 2.5.2.
- Выполните количественный ПЦР (КПЦР) содержания адаптера для обеспечения надлежащей глубины секвенирования с использованием библиотеки секвенирования набора КПЦР квантификации в соответствии с инструкциями изготовителя (перечень материалов).
- Выполнение последовательности с использованием одного чтения, 50 бр протокол достичь глубины примерно 20 - 25 м / считывает образец, в соответствии с инструкциями изготовителя.
3. Анализ данных (~ 1 день)
- Используйте bcl2fastq2, в соответствии с инструкциями руководство пользователя, к предварительной обработки сырого fastq файлов демультиплексированных образцов (список материалов).
- Используйте Cutadapt подрезать адаптеры 9 и удалить читает <16 нуклеотидов (NTS) в длину, как в руководство пользователя инструкции (список материалов).
- Удалить последовательности загрязнения, присутствующие в библиотеках Срна, включая последовательность стоп-раствора (STP: CCACGTTCCCGTGG) и адаптера переноситься на следующий период (CTACAGTCCGACGATC), используя функцию removeSequenceInFastq в рамках NGSPERL, согласно инструкции руководство пользователя (список материалов).
- Выполнение показателей контроля качества путем FastQC с помощью Центра количественных наук (CQS) инструменты, в соответствии с инструкциями руководство пользователя (список материалов).
- Создавать нерезервированный список "идентичный" читает (коллапс redundaнт читает) и номера записи копии с использованием CQSTools, согласно инструкции руководство пользователя (список материалов).
- Align читает генома человека с использованием Bowtie1.1.2 позволяя 1 рассогласования (опции: -a -m 100 --best --strata -v 1), согласно инструкции руководство пользователя (список материалов).
- Выполните выравнивание чтения, счета, и результат задачи реферирования с использованием NGSPERL, в соответствии с инструкциями руководства пользователя.
- Преобразование экспортированной счета таблицу в файл электронной таблицы.
- Нормализация читает определенного класса (например, микроРНК) , к общему числу операций чтения для данного класса (например, общее количество микроРНК читает) и сигналы отчета , как Per Считывает Mapped микроРНК (RPMM). (Например, RPMM = (MIR-X / Общее кол микроРНК читает) * 1000000).
- Входной нормализованы граф таблицы в качестве общей единой технологии цвета в программное обеспечение для низкого уровня и дифференциала высокого уровня анализа в соответствии с инструкциями руководство пользователя (список материалов).
Примечание: В настоящее время не существует четко охарактеризованные генов домашнего хозяйства / СРНЧто касается HDL-рРНК. Шип-в управления может быть использован, но может быть проблематичным. Нормализация на ЛВП общий вход белка или объем рекомендуется. Самое главное, что рекомендуется для проверки результатов секвенирования одним из различных стратегий для количественного определения микроРНК и sRNAs с помощью ПЦР в реальном времени или количественный ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол представляет собой ряд установленных методов , связанных между собой , чтобы позволить квантификации sRNAs на высокочистого HDL по высокой пропускной способностью для секвенирования или ПЦР в реальном времени (рисунок 1). Для демонстрации возможности и влияние этого протокола, HDL был очищен из плазмы крови человека с помощью тандема DGUC и FPLC метода. Собирают фракции, соответствующие FPLC HDL (путем распределения холестерина) концентрировались и тотальную РНК выделяли из 1 мг HDL (общий белок). библиотеки Срна были получены с HDL, собранной из п = 4 здоровых людей. Все человеческие образцы крови / плазмы были собраны в рамках активного протокола Правления Обзор Институциональный (# 070416), и человеку были зачислены с информированного согласия, утвержденный Вандербильта школы медицины университета. Подготовленные библиотеки Срна секвенировали в Vanderbilt Technologies для Advanced Genomics (VANTAGE) Секвенирование ДНК-центр и данные исследования были выполненыза счет собственных трубопроводов. визуализации данных были созданы графическое программное обеспечение.
Острая необходимость выполнения второй метод (FPLC) для выделения HDL после DGUC из-за возможного сотрудничества очистки электромобили. Электромобили представляют собой обобщенный класс мембранных везикул , полученных , которые происходят из мультивезикулярные тел (экзосомы), плазменная мембрана многообещающий (микровезикулы), а также другие процессы, в том числе апоптозных тел 10. Электромобили, а именно экзосомы, как сообщается, имеют аналогичную плотность, малый HDL (фиг.2А), и , таким образом, может присутствовать во фракции плотности ЛПВП (1,063 - 1,21 г / мл) после DGUC 11,12. Чтобы удалить ЭВС и другие липопротеины (например, ЛПНП), из DGUC-HDL, FPLC был использован для разделения HDL от других пузырьков и частиц по размерам; ЛПВП (7 - 12 нм в диаметре) и электромобили (40 - 220 нм в диаметре) легко фракционировать из - за их различия в размерах (рис 2А, В). HDL фракцияs были очевидны в связи с распределением холестерина, и DGUC-ЛПВП FPLC фракции объединяли и концентрировали с использованием 10 кДа отрезные центрифугирование фильтров. Концентрированный ЛПВП собирали и использовали для анализа вниз по течению РНК (Фигура 2В). Чтобы проиллюстрировать это, плазма предварительно DGUC фракционировали с использованием FPLC и распределение фосфолипидов (фосфатидилхолин, ПК); общего холестерина (ТС), и белковые уровни были определены количественно и наносили на график по всей фракции. Уровни PC, TC, и белки были количественно определены с помощью трех колориметрических комплектов. Все три параметра четко определены HDL фракции (19 - 24) и ЛОНП / LDL фракции (14 - 18). В FPLC-фракционированный плазмы, белков и липидов сигналы были обнаружены минимально или не обнаружен вообще в долях , соответствующих везикулы размером более ЛОНП (слева от оранжевой коробки) (рис 3 , а ). Чтобы продемонстрировать DGUC разделение HDL, HDL-DGUC также фракционировали FPLC и PC, TC, и уровни белков quantifIED (фигура 3В). Plotting эти значения иллюстрирует совместное фракционирование небольшого количества ЛНП с использованием DGUC и усиливает необходимость использовать тандем DGUC-FPLC подход изолировать высокочистого HDL. Хотя электромобили, по прогнозам, совместно фракционирования с HDL во время DGUC, было мало , чтобы никто не нашел в липидов и белков в долях , соответствующих везикулы размером более LDL (рис 3B). Е.В. липидов и белков подписи в прогнозируемом диапазоне размеров также минимально детектировании или отсутствует DGUC-ЛПОНП и DGUC-ЛПНП при фракционировании с помощью FPLC (данные не показаны). Для анализа РНК общую РНК выделяли из 1 мг очищенного тандемной HDL для Srna библиотеки поколения. Вкратце, адаптеры лигируют к 3 ' , а затем 5' терминальные концы sRNAs, в том числе микроРНК и TDRS (фиг.4А). Лигированные продукты обратной транскрипции (RT) и ПЦР-амплификации с использованием ПЦР-праймеров, несущие специфические показатели, предназначенные для образцов мультиплексирование во время Дауnstream реакции секвенирования (рис. 4А) Каждый адаптер 61 NTS в длину; следовательно, сшита микроРНК (приблизительно 22 NTS в длину) будет производить продукт 144 нТ в длину. Многие не являющиеся микроРНК sRNAs немного длиннее , чем микроРНК (например, 30 - 35 NTS в длину). Таким образом, наша целевой длина продукта составляет 156 бит в длину. Усиленные продукты были выбраны по размеру с использованием автоматического выбора размера ДНК и все продукты кДНК 135 - были собраны 177 бит в длину (рис 4а). Качества размера выбранных библиотек были оценены с помощью ДНК - чипов с высокой чувствительностью с использованием Bioanalyzer (рис 4б). рРНК библиотеки кДНК такого размера оказались несколько больше в размерах из-за возможного "пузырится" эффекты в процессе анализа. Для получения мультиплексного секвенирования эквимолярные концентрации библиотек кДНК, собирают, очищают, концентрируют и повторно анализировали с использованием Bioanalyzer (фиг.4В). Мультиплексированный Затем образец sequenКНИ с помощью одного протокола чтения 50 пар оснований. В доме были использованы для анализа данных трубопроводов для демультиплексирования образцов на основе индексов, дифферента адаптеры, работающие метрики контроля качества, выравнивания генома человека и считать аннотированные sRNAs. Распределение нормализуется читает (читает на миллион, RPM),> 16 нТ в длину, иллюстрируют обогащение sRNAs 20 - 22 NTS в длину и 34 - 35 NTS в длину на HDL (рис 4в).
Выравнивание и подсчета анализ четырех HDL-рРНК библиотек обнаружили , что 38% чтений совместив с аннотациями областей человеческого генома микроРНК (рис 5А). Не менее обильные (37%) были sRNAs, полученных из тРНК (TDR). sRNAs , полученных из разных РНК (например, Y РНК), рРНК, smRNAs, snoRNAs, и длинных некодирующих РНК (lincRNAs) также присутствовали на HDL (рис 5А). После нормализации к общему количеству просмотров для каждого класса, топ 50 наиболее обильные MIRNAs (читает Per Подключенные микроРНК, RPMM, рисунок 5б), TDRS (Считывает Per Подключенные TDRS, RPMT, 5С), и другие не микроРНК , не ДТР за sRNAs (Читает Per Подключенные Срна, RPMS, рисунок 5D) были организованы тепловые карты , Эти данные иллюстрируют сходства (например, HDL-микроРНК) и расхождения (например, TDRS) из наиболее распространенных HDL-sRNAs через здоровых субъектов (Рисунок 5B-D). Эти результаты демонстрируют мощь этой стратегии и протокола, чтобы обеспечить замечательные способность проникновения в суть перевозки sRNAs ЛВП. Тем не менее, рРНК последовательности не следует полагаться на абсолютную количественному. sRNAs интереса должно быть подтверждено ПЦР в реальном времени. Кроме того, многие исследователи могут требовать только количественную оценку отдельных микроРНК на HDL. Таким образом, общая РНК ЛВП выделяли из каждого предмета для относительного количественного HDL-микроРНК с использованием ПЦР в реальном времени. Пять из наиболее распространенных микроРНК, обнаруженных на HDL по sRNAseq были использованы для REAл-время ПЦР - анализ , чтобы определить их уровни каждого HDL образца (рис 5E). Относительные количественные значения были рассчитаны с использованием произвольного домашнего хозяйства Ct 32 (RQV = 2 - ΔCtArb) и нормализуется до 1000 мкг белка HDL ввода в изоляции РНК 13. Результаты исследования ПЦР в режиме реального времени показывают, что этот протокол является также ценным в выявлении HDL-микроРНК и количественной оценки различия между частными лицами. В совокупности представленные схемы определяют критические детали методов, а результаты как с высокой пропускной способностью для секвенирования и в режиме реального времени подходы ПЦР представляют собой конечные продукты данного протокола.
Рисунок 1. Типичные Блок-схема протокола. Чистый HDL изолирован от градиента плотности ультрацентрифугирования и быстрой белковой жидкости Chromatog фия. Total HDL РНК можно затем использовать для малых РНК (рРНК) последовательности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Выделение HDL. (А) График плотности и диаметра липопротеины и внеклеточных везикул (EV). (Б) Схематическое изображение последовательного выделения тандем HDL, в том числе разделение плазмы, в градиенте плотности ультрацентрифугирования (DGUC), быстро белка жидкостной хроматографии (FPLC), фильтрации и концентрации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
pload / 54488 / 54488fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Фаст-белок жидкостной хроматографии (FPLC) Разделение липопротеинов Е.В., внеклеточного везикул. ЛПОНП, липопротеины очень низкой плотности; LDL, низкой плотности липопротеидов; HDL, высокой плотности липопротеидов; FP, свободный белок; PC, фосфатидилхолин; и ТС, общий холестерин. Красная линия, ТЦ; Синяя линия, белок, и Черная линия, PC. Разделение липопротеинов из (А) человеческой плазмы до градиента плотности ультрацентрифугирования (DGUC) и (В) HDL фракции после DGUC. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Генерация малых РНК библиотек. (А) Схематическое малых РНК (рРНК) библиотеки Construction и размер отбор. микроРНК, микроРНК; ТБИ, тРНК, полученных sRNAs; рРНК, не микроРНК, не ДТР за sRNAs; RT, обратной транскрипции; п.н., пара оснований; и кДНК, клонированной ДНК. (B) Анализ библиотек HDL-Срна до и после того, как мультиплексирование с использованием высокочувствительных ДНК - чипов и Bioanalyzer. (C) распределение Длина HDL-рРНК читает после секвенирования. RPM, читает на миллион; М, мужского пола; F, женские предметы; и нт, нуклеотид. N = 4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Разнообразие HDL-sRNAs. (A) Распределение HDL-sRNAs по классам Срна. Доля чтений выровнен по аннотированных sRNAs в геноме человека. (BD) N = Схемы Зоны активности 4 образца HDL-Срна.
| 1. Антиоксиданты для разделения липопротеинов | Сделать маточного раствора в 100х |
| ЭДТА | Этилендиаминтетрауксусной кислоты (0,5 М маточного) |
| AZT | 3-амино-1,2,4-триазола: 42 мг / мл Н 2 О |
| ВНТ | Бутилгидрокситолуол: 25 мг / 100 мкл этанола |
| Trolox | (+) - 6-гидрокси-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-карбоновой кислоты: 41,7 мг / 500 мкл этанола |
| 2. Решения Overlay | |
| Решение # 1 | 1,019 г / мл в H 2 O |
| Решение # 2 | 1,025 г / мл KBr / H 2 O |
| Решение # 3 | 1,063 г / мл KBr / H 2 O |
| Решение # 4 | 1,080 г / мл KBr / H 2 O |
| Решение # 5 | 1,255 г / мл KBr / H 2 O |
| 3. FPLC буфера | </ TR> |
| 1 л Рецепт | 50 мл 3М NaCl; 20 мл 0,5 Трис-HCl, рН 7,6; 2 мл 10% азида натрия; 930 мл H 2 O |
Таблица 1. Специальные реагенты.
| стадия | Температура (° С) | Время | циклы |
| 98 | 30 лет | 1 | |
| В | 98 | 10 лет | 25 |
| 60 | 30 лет | ||
| 72 | 15 лет | ||
| С | 72 | 10 минут | 1 |
Таблица 2.Библиотека Поколение Amplification шаги.
| грунтовка | Последовательность |
| Праймер 1.1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| Праймер 2.1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
Таблица 3. ПЦР - праймеры.
| стадия | Температура (° С) | Время | циклы |
| 95 | 10 минут | 1 | |
| В | 95 | 10 лет | 40 |
| 60 |
Таблица 4. Библиотека Количественная Amplification шаги.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол предназначен для количественного определения микроРНК и других sRNAs высокой пропускной последовательности или ПЦР в реальном времени на высокочистого HDL. Как и при любом подходе, особые соображения следует уделять каждому шагу в процессе очистки HDL и РНК, а затем количественной оценки sRNAs. Этот протокол предназначен для проектов, начиная с ≥ 2 мл плазмы. Тем не менее, анализ РНК высокого качества может быть успешно завершена с HDL очищенной от всего лишь 80 мкл человека или мыши плазмы с помощью аффинной хроматографии; Однако большие объемы исходной плазмы производят более точные данные, используя методы, представленные здесь. Примеры методов обработки и добычи может радикально изменить качество микроРНК / Срна и выход. Использование антикоагулянтов, в то время как необходимо для сбора плазмы, вероятно, влияет на добычу вниз по течению. Например, гепарин не легко удаляется во время экстракции РНК 14,15, и может ингибировать ферменты , вниз по течению , используемые в ПЦР , 16-18. Кроме того, гоERE сообщения , что цитрат натрия может также столкнуться с измерениями КПЦР , где микроРНК из образцов ЭДТА показаны, улучшились профиль экспрессии по сравнению с образцами цитрат натрия 16,19,20. Эти исследования свидетельствуют о необходимости тщательного рассмотрения при выборе антикоагулянта. Кроме того, в связи с увеличением потенциала для лизиса клеток в процессе коагуляции, образцы сыворотки не рекомендуется использовать в качестве лизированных клеточных микроРНК может искусственно ассоциируют с липопротеинами. Подобным же образом, плазма идеально изолированы сразу из цельной крови, чтобы избежать загрязнения от других клеток периферической крови, в том числе лизированных лейкоцитах. Поскольку температура холодной широко известно, влияет на активацию тромбоцитов, образцов крови центрифугируют от эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов при 3000 х г в течение 15 мин при комнатной температуре. Гемолиз также рекомендуется больным , как разорванные Эритроциты, как сообщалось, также влияют на микроРНК результат 21,22, так как они содержат микроРНК , которые могут быть пролита во время hemolлиз 23,24. Плазма можно хранить при температуре 4 ° С в течение 2 - 4 недель или , альтернативно , плазма может быть заморожена при температуре -80 ° С , где содержание микроРНК является стабильной и жизнеспособной как в краткосрочной , так и длительного хранения ( не более 4 -х лет) 25. Для наших текущих знаний, замораживания образцов плазмы не предсказывается вредить HDL-микроРНК и замороженные образцы плазмы пригодны для анализа. Как липопротеидов и другие целые компоненты крови могут влиять потребление пищи, является предпочтительным для сбора крови натощак.
Как уже упоминалось выше, ЛВП в плазме, могут быть выделены с помощью ряда стандартных методов, в том числе DGUC, FPLC и аффинной хроматографии с АроА-I. . Выделение липопротеинов плазмы путем DGUC использованием KBr, как описано Redgraves др 26, отделяет ЛОНП (d = 0,94 - 1,006 г / мл), ЛНП (d = 1,006 - 1,063 г / мл) и ЛВП (d = 1.063-1.21 г / мл), и является идеальным методом для больших объемов плазмы (2 - 60 мл на образец). ограничениек использованию в одиночку такого подхода заключается в том , что экзосомы и другие микроРНК , содержащие EVs , как сообщается, имеют аналогичную плотность в HDL и может присутствовать в DGUC HDL (Рисунок 2A). Другие недостатки включают возможные структурные повреждения белков с высоким воздействием солей в буферах и сильных ультрацентрифугирования сил, а также дифференциальные ЛВП стабильностью подклассов 27,28. Несмотря на это, DGUC обычно используется как это приводит к высокому выходу белка HDL, производя близко к 1 мг белка ЛВП на 1 мл плазмы 29. Подход FPLC, который включает в себя фильтрацию эксклюзионной гель, требует меньше времени, в зависимости от скорости потока (примерно 6 ч), и имеет большую точность, отделяющую HDL от апоВ-содержащих липопротеидов (по размеру) и их подклассы, включая электромобили что намного больше, чем HDL, но имеют сходные плотности. Следует отметить, что с помощью методов, описанных в этом протоколе, плазменные везикул между приблизительно 220 - 75 нм в диаметре, как правило, невызывают выявляемой липидов или белка подпись, когда разделены FPLC. В зависимости от набора параметров FPLC требует относительно небольшой вход, 0,3 - 1 мл, который полезен для грызуна плазмы и небольших замороженных аликвот. Быстрые колориметрические анализы холестерина также важны следующие FPLC, чтобы подтвердить распределение HDL или других фракций липопротеинов. Фракционирование разбавляет образцы и липопротеины; Тем не менее, образцы затем можно концентрировать с помощью стандартных центробежных размер-фильтры (например, 10 кДа Mw отсечка фильтр). HDL изоляции от апоА-I IP с помощью микро-спиновые столбцы являются самым быстрым из трех подходов, но ограничены низким входом (0,08 - 1 мкл) объема и низким выходом (приблизительно 0,1 мг). В то время как апо-I IP может быть трудоемким, этот метод идеально подходит для небольших объемов супернатантов клеточных культур. Хотя каждый из этих методов имеет свои сильные и слабые стороны, они могут быть уменьшены , если они используются в тандеме (например, DGUC с последующим FPLC). Используя два подхода в тандеме, приводит к большей чистотеHDL для микроРНК и Срна анализа.
Здесь мы подробно шаги, необходимые для выделения высокочистого HDL с использованием метода тандема DGUC с последующей FPLC и наметили шаги, используемые для количественного определения HDL-микроРНК и sRNAs с использованием либо высокой пропускной последовательности или ПЦР в реальном времени. Хотя этот протокол был разработан для HDL, она имеет большое применение при количественной оценке sRNAs на другие липопротеины, включая ЛПНП и ЛПОНП, в зависимости от их плотности и размеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
