Abstract
Mangfoldet av små ikke-kodende RNA (Srna) er raskt voksende og deres roller i biologiske prosesser, herunder genregulering, dukker opp. Mest interessant er sRNAs også funnet utenfor cellene og er stabilt til stede i alle biologiske væsker. Som sådan, ekstracellulære sRNAs representerer en ny klasse av sykdoms biomarkører og er sannsynligvis involvert i cellesignalisering og interkommunikasjonsnettverk. For å vurdere deres potensielle biomarkører som kan sRNAs kvantifiseres i plasma, urin og andre fluider. Likevel, for å fullt ut forstå virkningen av ekstracellulære sRNAs som endokrine signaler, er det viktig å finne ut hvilke bærere er transportere og beskytte dem i biologiske væsker (for eksempel plasma) som celler og vev bidra til ekstracellulære Srna bassenger, og celler og vev som er i stand akseptere og utnytte ekstracellulære Srna. For å oppnå disse målene, er det avgjørende å isolere svært rene bestander av ekstracellulære bærerefor Srna profilering og kvantifisering. Vi har tidligere vist at lipoproteiner, spesielt high-density lipoproteiner (HDL), transportere funksjonelle microRNAs (miRNA) mellom celler og HDL-mirnas er betydelig endret i sykdom. Her har vi detalj en ny protokoll som benytter tandem HDL isolasjon med tetthetsultrasentrifugering (DGUC) og fast-protein-væskekromatografi (FPLC) for å oppnå svært ren HDL for nedstrøms profilering og kvantifisering av alle sRNAs, inkludert mirnas, ved hjelp av både høy -throughput sekvensering og real-time PCR tilnærminger. Denne protokollen vil være en verdifull ressurs for etterforskningen av sRNAs på HDL.
Introduction
Ekstracellulære ikke-kodende små RNA (sRNAs) representerer en ny klasse av sykdoms biomarkører og potensielle terapeutiske mål og sannsynligvis legge til rette for celle-til-celle-kommunikasjon 1. Den mest studerte type Srna er microRNAs (miRNA) som er omtrent 22 nts i lengde og er bearbeidet fra lengre forløper-former og primær transkripsjoner 2. mirnas har blitt demonstrert til post-transcriptionally regulere genekspresjon gjennom undertrykkelse av protein oversettelse og induksjon av mRNA degradering to. Likevel mirnas er bare ett av mange typer sRNAs; som sRNAs kan spaltes fra foreldre tRNAs (tRNA-avledet sRNAs, TDR), små kjernefysiske RNA (Srna-avledet sRNAs, sndRNA), små nukleolære RNA (snoRNA-avledet sRNAs, snRNA), ribosomale RNA (rRNA-avledet sRNAs, RDR ), Y RNA (yDR), og andre diverse RNA 1. Noen få eksempler på disse nye sRNAs har blitt rapportert å fungere som ligner på mirnas; imidlertid den biologiske functions av mange av disse sRNAs gjenstår å fastslå, selv om roller i genregulering er sannsynlig 3-6. Mest interessant, mirnas og andre sRNAs er stabilt til stede i ekstracellulære væsker, inkludert spytt, plasma, urin og galle. Ekstracellulære sRNAs sannsynligvis beskyttet mot RNases gjennom sin tilknytning til ekstracellulære vesikler (EV), lipoproteiner, og / eller ekstracellulære ribonucleoprotein komplekser.
Tidligere rapporterte vi at lipoproteiner, nemlig high-density lipoproteiner (HDL), transport mirnas i plasma 7. I denne studien ble HDL isolert ved anvendelse av en sekvensiell fremgangsmåte for densitet-gradient-ultrasentrifugering (DGUC), hurtig protein væskekromatografi (størrelse-eksklusjonskromatografi gelfiltrering, FPLC), og affinitetskromatografi (anti-apolipoprotein AI (apoA-I) immunpresipitasjon ) 7. Bruk begge real-time PCR-baserte low-density arrays og individuelle miRNA analyser, ble miRNA nivåer kvantifisert på HDL isolert fra helbrededin og hyperkolesterolemi fag 7. Ved hjelp av denne tilnærmingen, var vi i stand til å profilere mirnas og kvantifisere spesifikke mirnas i høyrene HDL forberedelser. Siden 2011 har vi fastslått at selv om affinitetskromatografi øker HDL renhet, antistoff metning i stor grad begrenser utbyttet, og kan være kostnads uoverkommelige. For tiden er vår protokoll anbefaler en to-trinns sekvensiell tandem fremgangsmåte for DGUC etterfulgt av FPLC, som også gir høy kvalitet og HDL-prøver for nedstrøms RNA isolering og kvantifisering Srna. På grunn av nylige fremskritt i high-throughput sekvensering av sRNAs (sRNAseq), for eksempel, mirnas, og økt bevissthet om andre ikke-miRNA Srna klasser, er sRNAseq dagens state-of-the-art i miRNA og Srna profilering. Som sådan, anbefaler vår protokoll kvantifisere mirnas og andre sRNAs på HDL prøver ved hjelp sRNAseq. Likevel kan total RNA isolert fra HDL også brukes til å kvantifisere individuelle mirnas og andre sRNAs eller validere sRNAseq resultater ved hjelp av real-time PCR enpproaches. Her beskriver vi i detalj en protokoll for oppsamling, rensing, kvantifisering, dataanalyse, og validering av høyrent HDL-sRNAs.
Det overordnede målet med denne artikkelen er å demonstrere gjennomførbarheten og prosessen med Srna kvantifisering i svært ren HDL isolert fra humant plasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HDL Rensing (~ 5,5 dager)
- Tetthet-ultrasentrifugering (DGUC, ~ 5 dager)
- Legg 90 mL av 100x anti-oksidanter til 9 ml av plasma isolert fra friskt venøst blod.
- Juster plasmatettheten med KBr fra 1,006 g / ml til 1,025 g / ml ved å tilsette 0,251 g KBr i 9 ml plasma fra trinn 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr plasma). Rock plasma inntil alt saltet er oppløst ved romtemperatur og overføre til ultrasentrifuge-rør, og sikre at alle boblene stiger til toppen.
- Bøy spissen av en 18-G kanyle til 90 ° 1 cm fra spissen, skråsiden opp. Ved hjelp av en sprøyte og 18-gauge nål, legg nøye 3 ml overlegg løsning # 1 over plasma (tabell 1).
MERK: bøyd nål sikrer alle VLDL / IDL, LDL, og HDL fjernes uten å blande med overlegg. - Fjern mesteparten av boblene på toppen, slik at 2 - 3 mm klaring fra menisken til toppen av røret, og carefully plassere rørene i SW-40Ti bøtter.
- Vei hver bøtte (med caps) på balansen, og nøyaktig balanse med det motsatte bøtte (bøtte + hette): # 1 til # 4, # 2 til # 5 og # 3 til # 6.
MERK: Disse skuffene må være balansert og matchet til alle tider. - Plasser rotoren i ultrasentrifuge (Liste over materialer). Sentrifuger ved 274 400 xg i 24 timer ved 4 ° C med en # 4 mellomliggende brems.
- Fjern forsiktig skuffer fra rotoren og rørene fra spann.
- Fjern forsiktig 2 ml fra det øverste laget av overlegget ved hjelp av en sprøyte og nål som er bøyd. Dette vil være den VLDL / IDL fraksjon som kan lagres ved 4 ° C eller -80 ° C.
- Etter fjerning av VLDL / IDL brøkdel, samle de resterende 7 mL prøve (plasma) og plassere den i en 15 ml konisk tube. Bringe volumet av prøven opp til 9 ml med overlegg oppløsning # 2 (tabell 1).
- Juster prøven tetthet fra 1,025 g / ml til 1,080 g / ml med KBr ved hjelpomtrent 0,746 g KBr i 9 ml prøve eller 0,0828 g / ml KBr prøve. Rist forsiktig prøven inntil alt KBr er oppløst (ca. 20 min) og overføre til ultrasentrifugerør samtidig som man sikrer bobler stiger til toppen.
- Med sprøyte og nål, legg nøye 3 ml overlegg løsning # 3 over prøven (tabell 1). La 2 - 3 mm klaring fra menisken til toppen av røret.
- Fjern mesteparten av eventuelle gjenværende bobler på toppen av røret og nøye plasser de fylte ultrasentrifuge-rør i SW-40Ti bøtter.
- Vei hver bøtte (med caps) på balansen, og nøyaktig balanse med det motsatte bøtte + cap, som i 1.1.5.
- Plasser rotoren i ultrasentrifuge (se liste over materialer). Sentrifuger ved 274 400 xg i 24 timer ved 4 ° C med en # 4 mellomliggende brems.
- Fjern forsiktig skuffer fra rotoren og rørene fra spann.
- Fjern forsiktig 2 ml fra det øverste laget av overlappingen ved hjelp av en sprøyte og blint nål. Dette vil være den LDL-fraksjonen som kan lagres ved 4 ° C eller -80 ° C.
- Etter fjerning av LDL-fraksjonen, samle de gjenværende omtrentlig 7 ml av prøven (plasma) og plassere den i en ny 15 ml konisk tube. Bringe volumet av prøven (plasma) opp til 9 ml med 1,080 g / ml oppløsning # 4 (tabell 1).
- Juster prøven tetthet fra 1,080 g / ml til 1,30 g / ml med KBr ved å bruke 3,33 g KBr i 9 ml prøve (plasma) eller 0,37 g KBr for hver mL prøve. Stein eller litt agitere prøven inntil alt KBr (salt), oppløses og overføres til ultrasentrifugerør.
- Med sprøyte og nål, legg nøye 3 ml overlegg løsning # 5 over prøven (tabell 1).
- Fjern mesteparten av eventuelle gjenværende bobler på toppen av røret, og man får 2- 3 mm klaring fra menisken til toppen av røret og nøye plasser de fylte ultrasentrifuge-rør i SW-40Ti bøtter.
- Vei hver bøtte (med caps) på balansen, og nøyaktig balanse med det motsatte bøtte + cap, som i 1.1.5.
- Plasser rotoren i ultrasentrifuge (se liste over materialer). Sentrifuger ved 274 400 xg i 48 timer ved 4 ° C med en # 4 brems.
- Fjern forsiktig skuffer fra rotoren og rørene fra spann.
- Fjern forsiktig omtrent 2 ml av det øverste laget av overlappingen ved hjelp av en sprøyte og nål som er bøyd. Dette er HDL-fraksjonen, som kan bli lagret ved 4 ° C eller -80 ° C.
MERK: Etter DGUC HDL kan dialysert for å fjerne høy saltløsninger. - Å dialyser, plasserer samlet HDL-fraksjonen i en forseglet dialysehylse (10 000 mw cut-off) og dialyser over natten i en L 1x PBS. Endre dialysebuffer (1x PBS) 3 ganger i løpet 24 timer. Lett forstyrrelse av PBS med en magnetisk rørestav vil forbedre dialyse.
- Bestem proteinkonsentrasjonen av den DGUC-HDL ved anvendelse av en BCA-metoden 8.
- Fast-Protein Flytende Chrokromatografi (FPLC) eller størrelseseksklusjonskromatografi (~ 6 timer)
- Filter 1,2 mg DGUC-HDL (total protein) i 500 mL gjennom et 0,22 mikrometer mikro sentrifugale filter (se liste over materialer), umiddelbart før injeksjon.
MERK: En ekstra filtrering av DGUC-HDL prøven gjennom et 0,45 mikrometer mikro sentrifugale filter før 0,22 mikrometer filter kan være nødvendig for noen prøver. - Samle det filtrerte DGUC-HDL prøve, laste FPLC (fyll) injeksjonssprøyte, og sikre at det ikke er noen bobler i sprøyten før injeksjon i FPLC.
- Innstill FPLC strømningshastigheten til 0,3 ml / min med en trykkgrense på 2,6 MPa. Stabilisere kolonner med 0,2 kolonnevolumer (ca. 15 ml) av buffer, før prøve injeksjon. Injiser prøven med 3 ml buffer, og i FPLC (injeksjonssløyfe) instrument og starte kjøringen. Samle 1,5 ml fraksjoner for totalt 72 fraksjoner.
- Filter 1,2 mg DGUC-HDL (total protein) i 500 mL gjennom et 0,22 mikrometer mikro sentrifugale filter (se liste over materialer), umiddelbart før injeksjon.
2. Høy throughput små RNASekvensering (sRNAseq, ~ 9 dager)
- RNA Isolation (~ 1 dag)
- Identifiser FPLC fraksjoner som tilsvarer DGUC-HDL ved å bestemme kolesterolnivået ved hjelp av en kolo kit i henhold til produsentens instruksjoner. Ved hjelp av denne FPLC set-up, forventer å finne 6 - 7 FPLC fraksjoner som inneholder DGUC-HDL.
- Samle alle volum (ca. 8 -1 0 ml pool av 1,45 ml fraksjon volumer) fra DGUC-HDL FPLC fraksjoner og konsentrere bruker 10 kDa mw cut-off sentrifugale filter enheter på 4000 xg i 1 time ved 4 ° C eller til HDL konsentrat er ca 100 mL.
- Samle HDL konsentrat og kvantifisere HDL totale proteinkonsentrasjonen ved hjelp av BCA metode 8.
- Bestem den høyeste konsentrasjonen av HDL totalt protein, opp til 1 mg, som kan bli delt i porsjoner fra hver prøve i settet. For eksempel, isolere RNA fra den samme mengde av HDL totalt protein for hver prøve.
- Utfør RNA Isolation hjelpen modifisert protokoll (se liste over materialer).
- Legg 10x volum av fenol lysereagensen (se liste over materialer) prøve og vortex i 1 min.
- Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Legg kloroform (20% av fenol lyse reagensvolum benyttes i trinn 2.1.5.1) og ristes kraftig i 15 sekunder.
- Inkuber ved romtemperatur i 2 - 3 min.
- Sentrifuger i 15 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C i en avkjølt sentrifuge.
- Overfør den øvre vandige fasen til et nytt rør, unngå interfase.
- Legg 1,5 x volum av 100% etanol til den vandige fase og virvle i 1 min.
- Oppbevar prøver i minst en time eller over natten ved -80 ° C.
- Fortsett med RNA isolering protokollen med den medfølgende mini kolonner.
- Elueres med 30 ul RNase-fritt H 2 O. Først tilsettes 15 pl av H2O direkte til fritten, sentrifugering ved lav hastighet (2.000 x g) i 2 min, ogderetter rotere ved høy hastighet (maks) i 1 min. Gjenta dette trinnet med ytterligere 15 mL av H 2 O.
- Umiddelbart videre til Srna bibliotek generasjon eller oppbevar ved -80 ° C.
- Bibliotek Generation (~ 6 timer)
- Forbered Srna cDNA bibliotek ved hjelp av Srna bibliotek generasjon kit-protokollen, som per produsentens instruksjoner med en modifikasjon av PCR forsterkning som beskrevet nedenfor.
- Fremstille PCR Mastermix på is inneholdende 0,5 pl DNase / RNase-fritt H 2 O, 15 ul PCR-Mix (PML) og 1 pl RNA PCR Primer (RP1) per prøve (inkludere en ytterligere 10% for pipettering feil).
- Legge til 16,5 ul av PCR-blanding til hver (cDNA) prøve.
- Tildel et indeks / strekkode nummer til hver prøve for multipleksing og tilsett 1 pl PCR Primer Index (til det tilsvarende tall) til prøven.
- Utfør en rask spinn bruker mikrofuge.
MERK: Totalt volum børnå være 30 mL per prøve. - Utfør sykkelforholdene for PCR forsterkning som beskrevet i tabell 2 og 3.
- Forbered Srna cDNA bibliotek ved hjelp av Srna bibliotek generasjon kit-protokollen, som per produsentens instruksjoner med en modifikasjon av PCR forsterkning som beskrevet nedenfor.
- Størrelse Velg Srna Library fjerner Adapter: Adapter (~ 1,5 t)
- Utfør bibliotek størrelse-utvalget ved hjelp av automatisk DNA formatvelgeren i henhold til produsentens instruksjoner med følgende størrelses parametere: Mål: 156 bp, start: 135 bp, End: 177 bp, Range Flag: Bred.
- DNA Clean Up (~ 0,5 t)
- Rydd opp size-valgt Srna cDNA i henhold til produsentens instruksjoner.
- Elueres ren og konsentrert Srna cDNA med 2 x 7 mL DNase / RNase-free H 2 O.
- Kvantifisere og vurdere Srna cDNA bibliotek avling og kvalitet (~ 1 time)
- Vurdere Srna cDNA bibliotek kvalitet og størrelse ved hjelp av en høy følsomhet DNA chip på en Bioanalyzer (Liste over materialer) som per produrer instruksjoner.
- Kvantifisere de enkelte Srna cDNA bibliotek konsentrasjoner ved hjelp av en høy følsomhet DNA-analysen (Liste over materialer), som per produsentens instruksjoner.
MERK: Det anbefales å ha alle prøver med ulike indekser kjøres på samme kjørefelt av strømningscellen hvis mulig. Hvis mer enn ett kjørefelt er nødvendig, å blande saks og kontrollprøver på riktig måte.
- Høy throughput Srna Sequencing (~ 7 dager)
- Pool enkelte indeksert Srna biblioteker basert på ekvimolare konsentrasjoner.
- Screen samlet Srna biblioteker for kvalitet med høy følsomhet DNA chip på Bioanalyzer og bestemme bibliotek DNA konsentrasjon som i 2.5.1 - 2.5.2.
- Utfør kvantitativ PCR (qPCR) av adapter innhold for å sikre hensiktsmessig sekvense dybde ved hjelp av sekvensering bibliotek qPCR kvantifisering kit som per produsentens instruksjoner (Liste over materialer).
- Utfør sekvensering ved hjelp av en enkelt lese, 50 bp-protokollen for å nå en dybde på ca 20 - 25 M leser / prøve, i henhold til produsentens anvisninger.
3. Data Analysis (~ 1 dag)
- Bruk bcl2fastq2, som per brukerhåndbok instruksjonene, kan du preprocess rå fastq filer av demultiplekset prøver (Liste over materialer).
- Bruk Cutadapt å trimme adaptere 9 og fjerne leser <16 nukleotider (NTS) i lengde, som per bruksanvisning instruksjoner (Liste over materialer).
- Fjern forurensning sekvenser stede i Srna biblioteker, inkludert stopp løsning sekvens (STP: CCACGTTCCCGTGG) og adapter overheng (CTACAGTCCGACGATC) bruker removeSequenceInFastq funksjon i NGSPERL rammeverk, som per bruksanvisning instruksjoner (Liste over materialer).
- Utføre kvalitetskontroll beregninger av FastQC hjelp Senter for Kvantitative Sciences (cqs) verktøy, som per bruksanvisning instruksjoner (Liste over materialer).
- Genererer ikke-redundante liste over "identiske" leser (kollaps redundant leser) og ta opp kopiantall hjelp CQSTools, som per bruksanvisning instruksjoner (Liste over materialer).
- Align leser for menneskelige genom hjelp Bowtie1.1.2 slik at en mismatch (alternativer: -a -m 100 --best --strata v 1), som per bruksanvisning instruksjoner (Liste over materialer).
- Utfør lese justering, telling, og resultere summarization oppgaver ved hjelp NGSPERL, som per bruker veiledningen.
- Konverter eksportert teller tabellen til et regneark.
- Normal lesninger av en bestemt klasse (f.eks mirnas) til totalt antall leser for at klassen (for eksempel leser totalt antall miRNAs) og rapport signaler som Leser Per kartlagt miRNA (RPMM). (F.eks RPMM = (MIR-X / Antall av miRNA leser) * millioner).
- Input normalisert telletabell som generisk ensfarget teknologien i programvare for lavt nivå og høyt nivå differensial analyser som per bruksanvisning instruksjoner (Liste over materialer).
MERK: For tiden er det ingen veldefinerte housekeeping gener / SRNSom for HDL-Srna. En pigg-kontroll kan anvendes, men kan være problematisk. Normalisering HDL totale protein innspill eller volum anbefales. Viktigst er det anbefalt å validere sekvense resultatene etter en av de ulike strategier for å kvantifisere mirnas og sRNAs ved hjelp av real-time PCR eller kvantitativ PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen er en serie av etablerte metoder koblet sammen for å muliggjøre kvantifisering av sRNAs på høyrent HDL ved high-throughput sekvensering eller sanntids-PCR (figur 1). For å demonstrere gjennomførbarheten og virkningen av denne protokollen, ble HDL renset fra humant plasma ved tandem DGUC og FPLC metode. Innsamlede FPLC-fraksjoner svarende til HDL (av kolesterol fordeling) ble konsentrert, og total RNA ble isolert fra 1 mg HDL (totalprotein). Srna bibliotekene ble generert med HDL hentet fra n = 4 friske mennesker. Alle menneskelige blod / plasmaprøver ble innsamlet under aktiv Institutional Review Board protokollen (# 070416), og forsøkspersoner ble registrert med informert samtykke som er godkjent av Vanderbilt University School of Medicine. Preparerte Srna bibliotekene ble sekvensert ved Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics (Vantage) DNA-sekvensering senter og dataanalyser ble utførtved hjelp av in-house rørledninger. Datavisualisering ble opprettet av grafer programvare.
Den kritiske behov for å utføre en annen metode (FPLC) for HDL isolasjon etter DGUC er på grunn av mulig co-rensing av elbiler. Elbiler er en generalisert klasse av membran-avledet vesikler som stammer fra muitivesikulære organer (exosomes), plasmamembran spirende (mikrovesikler), og andre prosesser, herunder apoptotiske legemer 10. EV, nemlig exosomes, har blitt rapportert å ha en tilsvarende tetthet som små HDL (figur 2A), og således kan være tilstede i HDL-fraksjonen densitet (1,063 til 1,21 g / ml) etter DGUC 11,12. For å fjerne elbiler og andre lipoproteiner (f.eks LDL), fra DGUC-HDL ble FPLC brukes til å skille HDL fra andre vesikler og partikler av størrelse; HDL (7-12 nm i diameter) og EV (40-220 nm i diameter) blir lett fraksjoneres på grunn av deres størrelsesforskjeller (figur 2A, B). HDL-fraksjonens var lett synlig på grunn av fordelingen av kolesterol, og DGUC-HDL FPLC-fraksjoner ble slått sammen og konsentrert ved bruk av 10 kDa-cut-off sentrifugeringsfiltre. Konsentrert HDL ble samlet og anvendt for nedstrøms RNA-analyse (figur 2B). For å illustrere dette punkt ble plasma forhånds DGUC fraksjonert ved hjelp av FPLC og fordelingen av fosfolipider (fosfatidylkolin, PC); total kolesterol (TC), og proteinnivåer ble kvantifisert og plottet på tvers fraksjoner. PC, TC, og proteiner nivåene ble kvantifisert ved hjelp av tre kolorimetriske kits. Alle tre parametere klart definert HDL fraksjoner (19 - 24) og VLDL / LDL fraksjoner (14 - 18). I FPLC-fraksjonert plasma, ble protein og lipid signaler minimal registrert eller ikke registrert i det hele tatt i løpet av brøk tilsvarer vesikkel størrelser over VLDL (til venstre for oransje boks) (figur 3A). For å demonstrere DGUC separasjon av HDL, ble DGUC-HDL også fraksjonert ved FPLC og PC, TC, og proteiner nivåene var quantifIED (figur 3B). Plotte disse verdiene illustrerer ko-fraksjonering av en liten mengde av LDL ved hjelp av DGUC og forsterker behovet for å bruke tandem DGUC-FPLC tilnærming for å isolere høyrent HDL. Selv om elbiler er spådd å co-fraksjonere med HDL under DGUC, var det lite til ingen funnet i lipid og protein i fraksjoner som tilsvarer vesikkel størrelser større enn LDL (figur 3B). Den EV lipid og protein signatur i den forutsagte størrelsesområdet er også minimal detekterbar eller fraværende fra DGUC-VLDL og LDL-DGUC når fraksjonert ved FPLC (data ikke vist). For RNA-analyse, ble total RNA isolert fra 1 mg tandem renset HDL for Srna bibliotek generasjon. I korthet adaptere ble ligert til 3 'og deretter 5'-terminale ender av sRNAs, inkludert mirnas og TDR (figur 4A). Ligerte produkter ble reverstranskribert (RT) og PCR amplifisert ved hjelp av PCR-primere som bærer spesifikke indeksene beregnet for multipleksing av prøvene i løpet av downstream sekvenseringsreaksjoner (figur 4A). Hver adapter er 61 nts i lengde; Derfor ville en ligerte miRNA (ca. 22 nts i lengde) fremstille et produkt av 144 nts i lengde. Mange ikke-miRNA sRNAs er litt lengre enn mirnas (f.eks 30 - 35 nts i lengde). Som sådan, det målsatte lengde av produkt var 156 bp i lengde. Amplifiserte produkter var størrelse valgt ved hjelp av en automatisk DNA formatvelgeren og alle cDNA produkter 135 - 177 bps i lengde ble samlet inn (Figur 4A). Kvaliteter av størrelse valgt bibliotekene ble vurdert ved høy følsomhet DNA chips bruker Bioanalyzer (figur 4B). Srna cDNA-bibliotek av denne størrelse først litt større i størrelse på grunn av mulige "boblende" effekter i løpet av analysen. For multiplekset sekvensering, ble ekvimolare konsentrasjoner av cDNA-bibliotek samlet, renset, konsentrert og analyseres på nytt ved hjelp av Bioanalyzer (figur 4B). Den multiplex Prøven ble deretter Sekvenssert ved hjelp av en enkelt lese 50 bp-protokollen. In-house dataanalyse rørledninger ble brukt til å Demultiplekse prøver basert på indekser, trim adaptere, kjøre kvalitetskontroll beregninger, justere til det menneskelige genom og telle kommenterte sRNAs. Fordelingen av normalisert leser (Leser Per Million, RPM),> 16 nts i lengde, illustrerer anrikning av sRNAs 20 - 22 nts i lengde og 34 - 35 nts i lengde på HDL (Figur 4C).
Justering og teller analyse av de fire HDL-Srna biblioteker fant at 38% av leser samkjøre til kommenterte områder av det menneskelige genom var mirnas (figur 5A). Like rikelig (37%) var sRNAs-avledet fra tRNA (TDR). sRNAs-avledet fra diverse RNA (f.eks Y RNA), rRNAs, smRNAs, snoRNAs, og lange ikke-kodende RNA (lincRNAs) var også tilstede på HDL (figur 5A). Etter normalisering til det totale antall leser for hver klasse, de 50 mest tallrike MIRNAs (Leser Per kartlagt miRNA, RPMM, figur 5B), TDR (Leser Per Kartlagt TDR, RPMT, figur 5C), og andre ikke-miRNA non-TDR sRNAs (Leser Per Kartlagt Srna, RPMS, figur 5D) ble organisert av heatmaps . Disse data illustrerer likhetene (f.eks HDL-mirnas) og avvik (f.eks TDR) av de mest tallrike HDL-sRNAs over friske forsøkspersoner (figur 5B-D). Disse resultatene viser kraften i denne strategien, og protokollen for å gi bemerkelsesverdig innsikt i transport av sRNAs av HDL. Likevel bør Srna sekvense ikke være lettelse opp på for absolutt kvantifisering. sRNAs av interesse skal valideres av real-time PCR. Likeledes kan mange forskere bare krever kvantifisering av individuelle mirnas på HDL. Som sådan, ble total HDL RNA isolert fra hvert fag for relativ kvantifisering av HDL-mirnas med real-time PCR. Fem av de mer rikelig mirnas oppdaget på HDL ved sRNAseq ble brukt for real-time PCR-analyser for å fastslå deres nivå på hver HDL prøve (figur 5E). De relative kvantitative verdier ble beregnet ved bruk av en vilkårlig rengjøring av Ct 32 (RQV = 2 - ΔCtArb) og normalisert til 1 000 ug av HDL protein tilførsel til RNA isolering 13. Resultater fra real-time PCR studie viser at denne protokollen er også verdifull i å oppdage HDL-mirnas og kvantifisere forskjeller mellom individer. Kollektivt, de presenterte skjemaer definere de kritiske detaljer om metodene, og resultatene fra både high-throughput sekvensering og real-time PCR tilnærminger representerer leveransen av denne protokollen.
Figur 1. Representant Flow-diagram av protokollen. Pure HDL er isolert fra densitetsgradient-ultrasentrifugering og hurtig protein-væske-kromatografering raphy. Total HDL RNA kan deretter brukes til små RNA (Srna) sekvensering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Isolering av HDL. (A) Chart av tetthet og diameter av lipoproteiner og ekstracellulære vesikler (EV). (B) Skjematisk av sekvensiell tandem HDL isolasjon, inkludert plasma separasjon, tetthetsultrasentrifugering (DGUC), fast-protein væskekromatografi (FPLC), filtrering og konsentrasjon. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
pload / 54488 / 54488fig3.jpg "/>
Figur 3. Fast-protein væskekromatografi (FPLC) Separering av lipoproteiner EV, ekstracellulære vesikler.; VLDL, svært lav tetthet lipoproteiner; LDL, low-density lipoproteiner; HDL, high-density lipoproteiner; FP, gratis protein; PC, phosphatidylcholine; og TC, total kolesterol. Rød linje, TC; Blå linje, protein, og svart linje, PC. Separasjon av lipoproteiner fra (A) humant plasma før tetthetsultrasentrifugering (DGUC) og (B) HDL-fraksjonen etter DGUC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. generasjon av små RNA Libraries. (A) Skjematisk av små RNA (Srna) bibliotek construction og størrelse-utvalget. miRNA, mikroRNA; TDR, tRNA-avledet sRNAs; Srna, ikke-miRNA ikke-TDR sRNAs; RT, revers transkripsjon; bp, basepar; og cDNA, klonet DNA. (B) Analyse av HDL-Srna biblioteker før og etter multipleksing bruker høy følsomhet DNA chips og Bioanalyzer. (C) Lengde fordeling av HDL-Srna leser etter sekvensering. RPM, Leser Per Million; M, mannlige fag; F, kvinnelige individer; og nt, nukleotid. N = 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Mangfold av HDL-sRNAs. (A) Fordeling av HDL-sRNAs over Srna klasser. Fraksjon av leser justert til kommentert sRNAs i det menneskelige genom. (BD) Heatmaps N = 4 HDL-Srna prøver.
| 1. Anti-oksidanter for Lipoprotein separasjon | Gjør stamløsning på 100x |
| EDTA | Etylendiamintetraeddiksyre (0,5 M stam) |
| AZT | 3-amino-1,2,4-triazol: 42 mg / ml H 2 O |
| BHT | Butylhydroksytoluen: 25 mg / 100 ul EtOH |
| Trolox | (+) - 6-hydroksy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-karboksylsyre: 41,7 mg / 500 ul EtOH |
| 2. Overlay Solutions | |
| Løsning # 1 | 1,019 g / ml i H 2 O |
| Løsning # 2 | 1,025 g / ml KBr / H 2 O |
| Løsning # 3 | 1,063 g / ml KBr / H 2 O |
| Løsning # 4 | 1,080 g / ml KBr / H 2 O |
| Løsning # 5 | 1,255 g / ml KBr / H 2 O |
| 3. FPLC Buffer | </ Tr> |
| 1 L Oppskrift | 50 ml 3M NaCl; 20 ml 0,5 Tris-HCl, pH 7,6; 2 ml av 10% natriumazid; 930 ml H 2 O |
Tabell 1. Spesielle reagenser.
| Scene | Temp (° C) | Tid | Cycles |
| EN | 98 | 30 s | 1 |
| B | 98 | 10 s | 25 |
| 60 | 30 s | ||
| 72 | 15 s | ||
| C | 72 | 10 min | 1 |
Tabell 2.Bibliotek Generation Forsterkning trinn.
| primer | Sekvens |
| primer 1.1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| primer 2.1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
Tabell 3. PCR primere.
| Scene | Temp (° C) | Tid | Cycles |
| EN | 95 | 10 min | 1 |
| B | 95 | 10 s | 40 |
| 60 |
Tabell 4. Bibliotek Kvantifisering Amplification Trappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er utviklet for å kvantifisere mirnas og andre sRNAs ved high-throughput sekvensering eller real-time PCR på høyrent HDL. Som med en hvilken som helst måte, må spesielle hensyn tas hensyn til hvert trinn i prosessen med rensing av HDL og RNA og deretter kvantifisere sRNAs. Denne protokollen er utformet for prosjekter som starter med ≥ 2 ml plasma. Likevel kan høykvalitets RNA analyser hell være ferdig med HDL renset fra så lite som 80 mL av human eller mus plasma ved hjelp av affinitetskromatografi; imidlertid større startplasmavolum gi bedre data ved hjelp av metodene som presenteres her. Utvalgets behandling og utvinning metoder kan drastisk forandre miRNA / Srna kvalitet og yield. Bruk av antikoagulantia, mens avgjørende for plasma samling, påvirker trolig nedstrøms utvinning. For eksempel er heparin ikke er lett å fjerne i løpet av RNA-ekstraksjon 14,15, og kan hemme nedstrøms enzymer som anvendes i PCR 16-18. I tillegg there er rapporter som natriumsitrat kan også forstyrre qPCR målinger der mirnas fra EDTA prøvene er vist å ha forbedret uttrykk profil sammenlignet med natriumsitrat prøver 16,19,20. Disse studiene viser behovet for nøye vurdering når du velger en antikoagulerende. Videre, på grunn av økt potensial for cellelyse under koagulering, serumprøver er ikke anbefalt som lysert cellulære mirnas kan kunstig forbinder med lipoproteiner. Likeledes er plasma ideelt isoleres umiddelbart fra fullblod for å unngå forurensning fra andre perifere blodceller, inkludert lyserte leukocytter. Som kald temperatur er allment kjent for å påvirke blodplateaktivering, er helblodprøver spunnet fra erytrocytter, leukocytter og blodplater ved 3000 xg i 15 min ved romtemperatur. Hemolyse er også syk anbefales som ødelagte erytrocytter har blitt rapportert å også påvirke miRNA utfallet 21,22, som de inneholder mirnas som kan felle under hemolysis 23,24. Plasma kan deretter lagres ved 4 ° C i 2 - 4 uker eller alternativt plasma kan fryses ved -80 ° C hvor miRNA innhold er stabil og levedyktig både på kort sikt og lang sikt lagring (max 4 år) 25. Til vår nåværende kunnskap, frysing plasmaprøver er ikke spådd å skade HDL-mirnas og frosne plasmaprøver er egnet til å analysere. Som lipoproteiner og andre hele blodkomponenter kan påvirkes av matinntak, er fastende blodsamling foretrukket.
Som nevnt ovenfor, kan plasma HDL isoleres ved en rekke standardmetoder, herunder DGUC, FPLC, og affinitetskromatografi mot ApoA-I. . Isolering av plasma lipoproteiner ved hjelp av DGUC KBr, som beskrevet av Redgraves et al 26, som skiller VLDL (d = 0,94 til 1,006 g / ml), LDL (d = 1,006 til 1,063 g / ml) og HDL (d = 1,063 til 1,21 g / ml) og er en ideell metode for store volumer av plasma (2 - 60 ml pr prøve). begrensningenå bruke denne tilnærmingen alene er at exosomes og andre miRNA som inneholder el-biler er rapportert å ha en tilsvarende tetthet til HDL og kan være til stede i DGUC HDL (figur 2A). Andre ulemper er mulig strukturell skade på proteiner fra høye salt eksponering i buffere og sterke ultra-sentrifugeringskrefter samt differensielle stabiliteten for HDL-sub-klasser 27,28. Til tross for dette blir DGUC vanligvis brukes som det resulterer i et høyt utbytte av HDL-protein, som produserer nær til 1 mg av HDL-protein per 1 ml plasma-29. FPLC metode, som innebærer størrelsesutelukkelses gelfiltrering, krever mindre tid, avhengig av strømningsmengden (ca. 6 timer), og har større presisjon å separere HDL fra apoB-holdige lipoproteiner (av størrelse) og deres underklasser, inkludert elbil som er mye større enn HDL, men har lignende tettheter. Det skal bemerkes at ved hjelp av de metoder som er beskrevet i denne protokollen, plasma vesikler mellom omtrent 220 til 75 nm i diameter ikke gjørlokke fram en påvisbar lipid eller protein signatur når atskilt med FPLC. Avhengig av set-up, krever FPLC forholdsvis liten inndata, 0,3 til 1 ml, noe som er nyttig for gnager plasma og små frosne alikvoter. Hurtig kolorimetriske assays kolesterol er også viktig følgende FPLC for å bekrefte fordelingen av HDL eller annet lipoproteinfraksjoner. Fraksjone utvanner prøver og lipoproteiner; imidlertid kan prøvene så konsentreres ved bruk av standard størrelse sentrifugal-filtre (som 10 kDa MW cut-off-filter). HDL isolering ved ApoA-IP ved hjelp av mikro-spinnkolonner er den raskeste av de tre fremgangsmåter, men er begrenset av lav inngang (0,08 til 1 pl) volum og lavt utbytte (ca. 0,1 mg). Mens ApoA-IP kan være arbeidskrevende, er denne metoden ideell for lavvolum cellekultursupernatanter. Selv om hver av disse metodene har styrker og svakheter, kan disse bli redusert dersom det brukes i tandem (f.eks fulgt DGUC FPLC). Ved hjelp av to tilnærminger i tandem, resulterer i større renhetHDL for miRNA og Srna analyse.
Her detaljert vi trinnene som kreves for å isolere svært ren HDL ved hjelp av tandem metoden for DGUC fulgt av FPLC og skissert de trinnene som brukes for å kvantifisere HDL-mirnas og sRNAs ved hjelp av enten high-throughput sekvensering eller real-time PCR. Selv om denne protokollen er designet for HDL, det har stor anvendelse i kvantifisere sRNAs på andre lipoproteiner, inkludert LDL og VLDL, basert på deres tettheter og størrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
