Abstract
La diversité des petits ARN non codants (ARNs) est en pleine expansion et leur rôle dans les processus biologiques, y compris la régulation des gènes, sont en train d'émerger. Le plus intéressant, ARNs sont également trouvés à l'extérieur des cellules et sont présents de manière stable dans tous les fluides biologiques. En tant que tel, ARNs extracellulaires représentent une nouvelle classe de biomarqueurs de la maladie et sont probablement impliqués dans la signalisation cellulaire et les réseaux de communication intercellulaire. Pour évaluer leur potentiel en tant que biomarqueurs, ARNs peuvent être quantifiés dans le plasma, l'urine et d'autres fluides. Néanmoins, pour comprendre pleinement l'impact des ARNs extracellulaires comme des signaux endocriniens, il est important de déterminer quels transporteurs transportent et de les protéger dans les fluides biologiques (par exemple, plasma), dont les cellules et les tissus contribuent à des pools de ARNs extracellulaires, et les cellules et les tissus capables d'accepter et d'utiliser extracellulaire ARNs. Pour atteindre ces objectifs, il est essentiel d'isoler des populations très pures des transporteurs extracellulairesARNs pour le profilage et la quantification. Nous avons déjà démontré que les lipoprotéines, en particulier les lipoprotéines de haute densité (HDL), le transport de microARN (miARN fonctionnels) entre les cellules et HDL-miARN sont significativement altérées dans la maladie. Ici, nous détaillons un nouveau protocole qui utilise tandem isolement HDL avec gradient de densité ultracentrifugation (DGUC) et rapide aux protéines chromatographie liquide (FPLC) pour obtenir HDL très pur pour le profilage aval et la quantification de tous les ARNs, y compris miARN, utilisant à la fois haute Le séquençage -throughput et des approches de PCR en temps réel. Ce protocole sera une ressource précieuse pour l'étude des ARNs sur HDL.
Introduction
Extracellulaires non codantes petits ARN (ARNs) représentent une nouvelle classe de biomarqueurs de la maladie et des cibles thérapeutiques potentielles et susceptibles de faciliter la cellule à cellule communication 1. Le type le plus largement étudié des ARNs sont microARN (miARN) qui sont environ 22 nts de longueur et sont traités de plus longues formes précurseurs et transcrits primaires 2. miARN a été démontré que la post-transcriptionnel réguler l' expression génique par la suppression de la conversion des protéines et de l' induction de la dégradation de l' ARNm 2. Néanmoins, les miARN sont juste un des nombreux types de ARNs; comme ARNs peuvent être clivés de ARNt mères (des ARNs ARNt dérivés, TDR), petits ARN nucléaires (ARNs ARNs dérivés, sndRNA), petits ARN nucléolaires (des ARNs snoRNA dérivés, snARN), ARNs ribosomiques (ARNs, rdr ARNr dérivé ), Y (ARN ydr) et d' autres divers ARNs 1. Quelques exemples de ces nouveaux ARNs ont été rapportés à fonction similaire à celle miARN; cependant, le fu biologiquenctions de beaucoup de ces ARNs reste à déterminer, bien que les rôles dans la régulation des gènes sont susceptibles 3-6. Le plus intéressant, et d'autres miARN ARNs sont présents de manière stable dans les fluides extra-cellulaires, y compris la salive, le plasma, l'urine et la bile. ARNs extracellulaires sont probablement protégés de RNases par leur association avec des vésicules extracellulaires (EV), les lipoprotéines, et / ou complexes de ribonucléoprotéines extracellulaires.
Auparavant, nous avons signalé que les lipoprotéines, à savoir les lipoprotéines de haute densité (HDL), miARN de transport dans le plasma 7. Dans cette étude, les HDL ont été isolés à l'aide d'un procédé séquentiel d'une ultracentrifugation en gradient de densité (DGUC), la chromatographie liquide rapide de protéines (par exclusion de taille sur gel de chromatographie de filtration, FPLC) et la Chromatographie d'affinité (AI anti- apolipoprotéine (apoA-I) immunoprécipitation ) 7. En utilisant les deux en temps réel basés sur la PCR des réseaux à faible densité et des essais de miARN individuels, les niveaux de miARN ont été quantifiés sur HDL isolés de guérirton et les sujets hypercholestérolémiques 7. En utilisant cette approche, nous avons pu le profil de miARN et quantifier miARN spécifiques dans des préparations de HDL très pures. Depuis 2011, nous avons déterminé que, bien que la chromatographie d'affinité améliore la pureté de HDL, la saturation des anticorps limite fortement le rendement, et peut être un coût prohibitif. Actuellement, notre protocole recommande une méthode tandem séquentielle en deux étapes de DGUC suivie par FPLC, qui produit également des échantillons de HDL de haute qualité pour l'isolement en aval de l'ARN et ARNs quantification. En raison des récents progrès dans le séquençage à haut débit de ARNs (sRNAseq), par exemple, miARN et la prise de conscience accrue des autres classes non-miARN ARNs, sRNAseq est l'état actuel de la technique dans miRNA et ARNs profilage. En tant que tel, notre protocole recommande miARN quantifier et d'autres ARNs sur des échantillons HDL utilisant sRNAseq. Néanmoins, l'ARN total isolé de HDL peut également être utilisé pour quantifier les miARN individuels et d'autres ARNs ou de valider les résultats de sRNAseq en utilisant PCR en temps réel unepproches. Ici, nous décrivons en détail un protocole pour la collecte, la purification, la quantification, l'analyse des données, et la validation de haute pureté HDL-ARNs.
L'objectif global de cet article est de démontrer la faisabilité et le processus de ARNs quantification dans HDL très pur isolé du plasma humain.
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Protocol
1. La purification HDL (~ 5,5 jours)
- Densité-Gradient ultracentrifugation (DGUC, ~ 5 jours)
- Ajouter 90 ul de 100x anti-oxydants à 9 ml de plasma isolé à partir de sang veineux frais.
- Ajuster la densité du plasma avec KBr de 1,006 g / mL à 1,025 g / mL en ajoutant 0,251 g KBr à 9 ml de plasma de l'étape 1.1.1 (0,0278 g / KBr ml de plasma). Rock the plasma jusqu'à ce que tout le sel est dissous à la température ambiante et transfert à ultracentrifugation tubes et faire en sorte que toutes les bulles remontent à la surface.
- Pliez la pointe d'une aiguille de 18 G à 90 ° 1 cm de la pointe, côté conique vers le haut. En utilisant une seringue et l'aiguille de calibre 18, placer soigneusement 3 ml de solution de superposition n ° 1 sur le plasma (tableau 1).
REMARQUE: L'aiguille pliée assure tous les VLDL / IDL, LDL et HDL sont éliminés sans mélange avec la superposition. - Retirer la majorité des bulles dans la partie supérieure, en laissant 2 - 3 mm, l'espace à partir du ménisque à l'extrémité supérieure du tube et savouplacer lly les tubes dans des seaux SW-40Ti.
- Peser chaque godet (avec les bouchons) sur la balance, et d'équilibrer exactement avec le seau opposé (seau + cap): # 1 à # 4, # 2 à # 5 et # 3 à # 6.
NOTE: Ces seaux doivent être équilibrés et adapté à tout moment. - Placez rotor dans ultracentrifugation (Liste des Matériaux). Centrifugeuse à 274.400 xg pendant 24 h à 4 ° C avec un frein intermédiaire n ° 4.
- Retirez soigneusement les seaux de rotor et les tubes des seaux.
- Retirez délicatement 2 mL de la couche supérieure du revêtement à l'aide d'une seringue et une aiguille recourbée. Ce sera la fraction VLDL / IDL qui peut être stocké à 4 -80 ° C ou ° C.
- Après avoir enlevé la fraction VLDL / IDL, recueillir les 7 ml restants de l'échantillon (plasma) et le placer dans un tube de 15 ml conique. Amener le volume de l'échantillon jusqu'à 9 ml avec une solution de revêtement # 2 (Tableau 1).
- Réglez la densité de l'échantillon de 1,025 g / mL à 1,080 g / mL avec KBr en utilisantenviron 0,746 g KBr dans l'échantillon 9 ml ou 0,0828 g / KBr mL d'échantillon. Secouez doucement l'échantillon jusqu'à ce que tout le KBr est dissous (environ 20 min) et transfert à l'ultracentrifugation tube tout en assurant des bulles remontent à la surface.
- Avec une seringue et une aiguille, placer soigneusement 3 ml de solution de recouvrement n ° 3 sur l'échantillon (tableau 1). Laissez 2 - 3 mm d'espace de ménisque à la partie supérieure du tube.
- Retirez la majorité des bulles restantes dans la partie supérieure du tube et placer soigneusement les tubes d'ultracentrifugation remplis dans des seaux SW-40Ti.
- Peser chaque godet (avec les bouchons) sur la balance, et d'équilibrer exactement avec le seau face + bouchon, comme dans 1.1.5.
- Placez rotor dans ultracentrifugation (voir la liste des matériaux). Centrifugeuse à 274.400 xg pendant 24 h à 4 ° C avec un frein intermédiaire n ° 4.
- Retirez soigneusement les seaux de rotor et les tubes des seaux.
- Retirez délicatement 2 mL de la couche supérieure du revêtement à l'aide d'une seringue et d'êtreaiguille nt. Ce sera la fraction LDL qui peut être stocké à 4 -80 ° C ou ° C.
- Après avoir retiré la fraction LDL, recueillir les approximatives restantes 7 ml d'échantillon (plasma) et le placer dans un nouveau tube de 15 ml conique. Amener le volume de l'échantillon (plasma) jusqu'à 9 mL avec 1,080 g / ml de la solution n ° 4 (Tableau 1).
- Réglez la densité de l'échantillon de 1.080 g / mL à 1,30 g / mL avec KBr en utilisant 3,33 g KBr dans le 9 ml d'échantillon (plasma) ou 0,37 g KBr pour chaque ml d'échantillon. Roche ou légèrement agiter l'échantillon jusqu'à ce que tous les KBr (sel) est dissous et transfert à l'ultracentrifugation tube.
- Avec une seringue et une aiguille, placer soigneusement 3 ml de solution de recouvrement n ° 5 sur l'échantillon (tableau 1).
- Retirez la majorité des bulles restantes dans la partie supérieure du tube, en laissant 2 à 3 mm d'espace de ménisque au sommet du tube et placer soigneusement les tubes d'ultracentrifugation remplis dans des seaux SW-40Ti.
- Peser chaque godet (avec les bouchons) sur la balance, et exactement l'équilibre avec le seau face + bouchon, comme dans 1.1.5.
- Placez rotor dans ultracentrifugation (voir la liste des matériaux). Centrifuger à 274 400 xg pendant 48 h à 4 ° C avec un frein # 4.
- Retirez soigneusement les seaux de rotor et les tubes des seaux.
- Retirez délicatement environ 2 mL de la couche supérieure du revêtement à l'aide d'une seringue et une aiguille recourbée. Ceci est la fraction de HDL, qui peut être stocké à 4 ° C ou -80 ° C.
NOTE: Après HDL DGUC peut être dialysée pour éliminer les solutions riches en sel. - Pour dialyser, placer la fraction HDL recueillie dans un manchon de dialyse étanche (10.000 mw cut-off) et dialyser la nuit dans 1 L 1x PBS. tampon Changement de dialyse (1x PBS) 3 fois plus de 24 h. perturbation douce du PBS avec une barre d'agitation magnétique permettra d'améliorer la dialyse.
- Déterminer la concentration en protéines de la DGUC HDL en utilisant une méthode BCA 8.
- Fast Protein Liquid Chrochromatogra- (FPLC) ou Taille-chromatographie d'exclusion (~ 6 h)
- Filtre 1,2 mg de DGUC-HDL (protéine totale) dans 500 pi à travers un filtre um micro-centrifuge 0,22 (voir la liste des matériaux), immédiatement avant l'injection.
NOTE: Un filtrage supplémentaire de l'échantillon DGUC-HDL à travers un filtre um micro-centrifuge avant le filtre de 0,22 um 0,45 peut être nécessaire pour certains échantillons. - Recueillir l'échantillon DGUC-HDL filtré, charger le FPLC (remplissage) seringue d'injection, et assurer qu'il n'y a pas de bulles dans la seringue avant injection dans la FPLC.
- Réglez le débit FPLC à 0,3 mL / min avec une limite de pression à 2,6 MPa. Equilibrer colonnes avec 0,2 volumes de colonne (environ 15 ml) de tampon, avant l'injection de l'échantillon. Injecter l'échantillon avec 3 ml de tampon dans la FPLC (boucle d'injection) instrument et commencer la course. Recueillir 1,5 ml fractions pour un total de 72 fractions.
- Filtre 1,2 mg de DGUC-HDL (protéine totale) dans 500 pi à travers un filtre um micro-centrifuge 0,22 (voir la liste des matériaux), immédiatement avant l'injection.
2. Haut-débit Petit ARNSéquençage (sRNAseq, ~ 9 jours)
- Isolement de l' ARN (~ 1 jour)
- Identifier les fractions FPLC correspondant à DGUC-HDL en déterminant les niveaux de cholestérol total en utilisant un kit colorimétrique selon les instructions du fabricant. L'utilisation de ce FPLC set-up, attendre à trouver 6 - 7 fractions FPLC contenant DGUC-HDL.
- Recueillir tout le volume (environ 8 -1 0 ml piscine de 1,45 fraction mL volumes) à partir de fractions DGUC-HDL FPLC et de se concentrer à l'aide de 10 kDa mw unités de filtre centrifuge de coupure à 4000 g pendant 1 h à 4 ° C ou jusqu'à ce que HDL concentré est d'environ 100 pi.
- Recueillir le concentré de cholestérol HDL et de quantifier la concentration totale en protéines HDL en utilisant la méthode BCA 8.
- Déterminer la plus forte concentration de HDL protéine totale, jusqu'à 1 mg, qui peut être aliquote de chaque échantillon dans l'ensemble. Par exemple, isoler l'ARN à partir de la même quantité de protéines totales HDL pour chaque échantillon.
- Effectuer Isolement de l'ARN en utilisantun protocole modifié (voir la liste des matériaux).
- Ajouter 10x volume de réactif phénol de lyse (voir la liste des matériaux) échantillon et vortex pendant 1 min.
- Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter le chloroforme (20% du volume de réactif phénol de lyse utilisé dans l'étape 2.1.5.1) et agiter vigoureusement pendant 15 s.
- Incuber à température ambiante pendant 2 - 3 min.
- Centrifuger pendant 15 min à 12 000 xg à 4 ° C dans une centrifugeuse réfrigérée.
- Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube, évitant l'interphase.
- Ajouter le volume 1,5x de 100% d'éthanol à la phase aqueuse et vortexer pendant 1 min.
- Conserver les échantillons pendant au moins 1 h ou toute la nuit à -80 ° C.
- Poursuivre le protocole d'isolement d'ARN en utilisant des mini-colonnes fournies.
- Eluer avec 30 H pl de RNase 2 O. Tout d' abord , ajouter 15 pi de H 2 O directement à la fritte, rotation à faible vitesse (2000 xg) pendant 2 min, etpuis tourner à grande vitesse (max) pendant 1 min. Répétez cette étape avec un 15 pi supplémentaires de H 2 O.
- procéder immédiatement à la génération ou un magasin bibliothèque ARNs à -80 ° C.
- Generation Library (~ 6 h)
- Préparer des banques d'ADNc ARNs en utilisant le protocole du kit de génération de bibliothèque ARNs, conformément aux instructions du fabricant avec une modification de l'amplification par PCR comme indiqué ci-dessous.
- Préparer la mastermix PCR sur la glace contenant 0,5 pi de DNase / RNase H 2 O, 15 Mix PCR uL (PML) et Primer (de RP1) par échantillon (y compris 10% supplémentaires pour le pipetage erreur) 1 ul ARN PCR.
- Ajouter 16,5 ul de la PCR se mélangent à chaque (ADNc) échantillon.
- Attribuez un numéro d'index / code à barres pour chaque échantillon pour le multiplexage et ajouter 1 pl PCR Primer Index (au nombre correspondant) à l'échantillon.
- Effectuer une rotation rapide à l'aide de la microcentrifugeuse.
NOTE: Le volume total devraitmaintenant 30 pi par échantillon. - Effectuez les conditions de cycle pour l' amplification par PCR comme indiqué dans les tableaux 2 et 3.
- Préparer des banques d'ADNc ARNs en utilisant le protocole du kit de génération de bibliothèque ARNs, conformément aux instructions du fabricant avec une modification de l'amplification par PCR comme indiqué ci-dessous.
- Taille Sélectionnez ARNs Library pour supprimer Adapter: adaptateurs (~ 1,5 h)
- Effectuer bibliothèque taille-sélection en utilisant le sélecteur automatique de la taille de l'ADN selon les instructions du fabricant avec les paramètres de taille suivantes: Cible: 156 pb, Début: 135 pb, End: 177 pb, Drapeau Range: Broad.
- DNA Clean Up (~ 0,5 h)
- Nettoyer la taille sélectionnée ARNs ADNc selon les instructions du fabricant.
- Eluer propre et concentrée ARNs ADNc avec 2 x 7 pi DNase / RNase H 2 O.
- Quantifier et évaluer les ARNs bibliothèque d' ADNc rendement et la qualité (~ 1 h)
- Évaluer la qualité bibliothèque ARNs ADNc et la taille en utilisant une puce à ADN à haute sensibilité sur une Bioanalyseur (Liste des Matériaux) selon manufactles instructions rier.
- Quantifier les concentrations de bibliothèque ARNs d'ADNc individuels en utilisant un test d'ADN à haute sensibilité (Liste des matériaux), selon les instructions du fabricant.
NOTE: Il est recommandé d'avoir tous les échantillons avec différents indices être exécutés sur la même voie de la cellule d'écoulement si possible. Si plus d'une voie est nécessaire, mélanger les échantillons de cas et de contrôle de manière appropriée.
- Haut-débit ARNs Sequencing (~ 7 jours)
- Piscine individuelle indexée bibliothèques ARNs en fonction des concentrations équimolaires.
- Écran mis en commun des bibliothèques ARNs pour la qualité en utilisant la puce à ADN à haute sensibilité sur le Bioanalyseur et déterminer la concentration en ADN de la banque comme dans 2.5.1 - 2.5.2.
- Effectuer la PCR quantitative (qPCR) du contenu de l'adaptateur pour assurer la profondeur de séquençage approprié à l'aide de la bibliothèque de séquençage kit qPCR de quantification selon les instructions du fabricant (Liste des Matériaux).
- Effectuer le séquençage en utilisant une seule lecture, 50 bprotocole de p pour atteindre une profondeur d'environ 20 à 25 M lit / échantillon, selon les instructions du fabricant.
3. Analyse des données (~ 1 jour)
- Utilisez bcl2fastq2, selon les instructions de guidage de l'utilisateur, aux fichiers fastq premières prétraiter des échantillons démultiplexés (Liste des Matériaux).
- Utilisez Cutadapt pour couper les adaptateurs 9 et enlever lit <16 nucléotides (nt) de longueur, selon les instructions utilisateur de guidage (Liste des Matériaux).
- Retirer les séquences de contamination présents dans les bibliothèques ARNs, y compris la séquence de solution d'arrêt (STP: CCACGTTCCCGTGG) et adaptateur report (CTACAGTCCGACGATC) en utilisant la fonction removeSequenceInFastq dans le cadre NGSPERL, selon les instructions utilisateur de guidage (Liste des Matériaux).
- Effectuer des mesures de contrôle de la qualité par FastQC l'aide du Centre pour les sciences quantitatives (CQS) outils, selon les instructions utilisateur de guidage (Liste des Matériaux).
- Générer liste non redondante de «identique» lit (effondrement redundant lit) et le nombre de copies d'enregistrement en utilisant CQSTools, selon les instructions utilisateur de guidage (Liste des Matériaux).
- Alignez lit à génome humain en utilisant Bowtie1.1.2 permettant 1 mismatch (options: -a -m 100 --best --strata -v 1), selon les instructions utilisateur de guidage (Liste des Matériaux).
- Effectuer lire l'alignement, le comptage, et entraîner des tâches de récapitulation en utilisant NGSPERL, selon les instructions de guidage de l'utilisateur.
- Convertir table de comptage exporté vers un fichier tableur.
- Normaliser lit d'une classe spécifique (par exemple, miARN) au nombre total de lectures pour cette classe (par exemple, le nombre total de miARN lectures) et des signaux de rapport en tant Reads miRNA Per mappé (de RPMM). (Par exemple, RPMM = (miR-X / Nombre total de miRNA lectures) * 1000000).
- Entrée normalisée table de comptage que la technologie de couleur unique générique dans le logiciel pour le niveau bas et différencié de haut niveau des analyses selon les instructions utilisateur de guidage (Liste des Matériaux).
NOTE: Actuellement, il y a des gènes de ménage pas bien caractérisées / SRNEn ce qui concerne le HDL-ARNs. Un contrôle de pic-in peut être utilisé, mais peut être problématique. Normaliser HDL entrée de la protéine ou le volume total est conseillé. Plus important encore, il est recommandé de valider les résultats de séquençage par l'une des différentes stratégies pour quantifier miARN et ARNs en utilisant PCR en temps réel ou PCR quantitative.
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Representative Results
Ce protocole est une série de méthodes établies reliées entre elles pour permettre la quantification des HDL sur les ARNs de haute pureté par séquençage à haut débit ou PCR en temps réel (figure 1). Pour démontrer la faisabilité et l'impact de ce protocole, HDL a été purifié à partir de plasma humain par le tandem DGUC et FPLC méthode. Les fractions recueillies FPLC correspondant aux HDL (par la distribution du cholestérol) ont été concentrées et l'ARN total a été isolé à partir de 1 mg de cholestérol HDL (protéine totale). bibliothèques ARNs ont été générées avec HDL recueillies à partir de n = 4 sujets humains sains. Tous les échantillons de sang / plasma humains ont été recueillies dans le cadre protocole actif Institutional Review Board (# 070416), et des sujets humains ont été inscrits avec le consentement éclairé approuvé par l'École de médecine de l'Université Vanderbilt. bibliothèques ARNs préparés ont été séquencés à Vanderbilt Technologies pour Advanced Genomics (VANTAGE) analyses du centre de séquençage de l'ADN et de données ont été réaliséesen utilisant des conduites dans la maison. visualisations de données ont été créées en traçant le logiciel.
Le besoin crucial d'effectuer une deuxième méthode (FPLC) pour l'isolement de HDL après DGUC est due à une éventuelle co-purification de véhicules électriques. Les véhicules électriques sont une classe généralisée de vésicules membranaires dérivés qui proviennent de corps multivésiculaires (exosomes), membrane plasmique en herbe (microvésicules), et d' autres processus, y compris les corps apoptotiques 10. Des véhicules électriques, à savoir les exosomes ont été rapportés pour avoir une densité aussi faible HDL similaire (figure 2A) et, par conséquent, peuvent être présents dans la fraction de HDL densité (1,063 à 1,21 g / mL) après DGUC 11,12. Pour retirer les véhicules électriques et d' autres lipoprotéines (par exemple, LDL), de DGUC-HDL, FPLC a été utilisé pour HDL séparé des autres vésicules et des particules par taille; HDL (7 - 12 nm de diamètre) et les véhicules électriques (40-220 nm de diamètre) sont facilement fractionnés en raison de leurs différences de taille (Figure 2A B,). fraction HDLs étaient évidents en raison de la répartition du cholestérol, et les fractions DGUC-HDL FPLC ont été regroupées et concentrées en utilisant 10 kDa filtres de centrifugation de coupure. Concentré de HDL ont été recueillies et utilisées pour l' analyse de l' ARN en aval (figure 2B). Pour illustrer ce point, le plasma pré-DGUC a été fractionné en utilisant FPLC et la distribution des phospholipides (phosphatidylcholine, PC); cholestérol total (CT), et de protéines niveaux ont été quantifiés et tracés à travers les fractions. PC, TC et protéines niveaux ont été quantifiés en utilisant trois kits colorimétriques. Tous les trois paramètres clairement définis les fractions de HDL (19 - 24) et les fractions VLDL / LDL (14 - 18). Dans le plasma fractionné par FPLC, les signaux de protéines et de lipides ont été très peu ou détection n'a pas détecté du tout dans les fractions correspondant à des vésicules de tailles supérieures à VLDL ( à gauche de la boîte orange) (figure 3A). Pour mettre en évidence la séparation DGUC de HDL-cholestérol HDL DGUC a également été fractionné par FPLC et PC, TC et les niveaux de protéines ont été QUANTIFied (figure 3B). Traçage ces valeurs illustre la co-fractionnement d'une petite quantité de LDL en utilisant DGUC et renforce la nécessité d'utiliser le tandem d'approche DGUC-FPLC pour isoler HDL très pur. Bien que les véhicules électriques sont prévus pour coopérer avec HDL au cours de fractionner DGUC, il y avait peu à aucun trouvé dans le lipide et de protéines dans les fractions correspondant aux vésicules tailles supérieures à LDL (figure 3B). Le lipide EV et la signature des protéines dans la gamme de taille prédite est également détectable minimale ou absente du DGUC-VLDL et LDL lorsque DGUC fractionnés par FPLC (données non présentées). Pour l'analyse de l'ARN, l'ARN total a été isolé à partir de 1 mg de cholestérol HDL purifiée en tandem pour la génération de la bibliothèque ARNs. En bref, les adaptateurs ont été ligaturées à l'extrémité 3 'et 5' extrémités terminales des ARNs, y compris miARN et TDR (figure 4A). les produits ligaturés ont été transcription inverse (RT) et amplifiés par PCR en utilisant des amorces de PCR portant des indices spécifiques conçus pour des échantillons de multiplexage pendant dowLes réactions de séquençage nStream (figure 4A). Chaque adaptateur est de 61 nts de longueur; par conséquent, un miARN ligaturé (environ 22 Les nts de longueur) produirait un produit de 144 nts de longueur. Beaucoup de non-miARN ARNs sont légèrement plus longues que miARN (par exemple, 30 - 35 nts de longueur). En tant que tel, notre longueur ciblée du produit était de 156 points de base de longueur. Les produits d' amplification sont de taille sélectionnées à l' aide d' un sélecteur de format automatique d'ADN et tous les produits d'ADNc de 135 - 177 pb de longueur ont été collectées (figure 4A). Les qualités des bibliothèques de taille sélectionnées ont été évaluées par les puces à ADN à haute sensibilité en utilisant le bioanalyseur (figure 4B). bibliothèques ARNs ADNc de cette taille sont apparus légèrement plus grand en taille en raison de possibles "bouillonnant" effets lors de l'analyse. Pour le séquençage multiplexé, les concentrations équimolaires des banques d'ADNc ont été rassemblées, nettoyées, concentrées et réanalysés en utilisant le bioanalyseur (figure 4B). L'échantillon a ensuite été multiplexé Sequenced en utilisant un seul protocole lu 50 pb. In-house pipelines d'analyse des données ont été utilisées pour démultiplexer échantillons basés sur les indices, trim adaptateurs, exécuter des mesures de contrôle de la qualité, alignement sur le génome humain et comptent ARNs annotés. La répartition des lectures normalisées (Reads Per Million, RPM),> 16 nts en longueur, illustrent l'enrichissement des ARNs 20 - 22 nts de longueur et 34 - 35 nts de longueur sur HDL (figure 4C).
L' alignement et le comptage analyse des quatre bibliothèques de HDL-ARNs ont constaté que 38% des lectures alignant les régions annotées du génome humain étaient miARN (figure 5A). Tout aussi abondante (37%) étaient ARNs-dérivés de ARNt (TDR). ARNs-dérivés des ARNs divers (par exemple, Y ARNs), ARNr, smRNAs, snoRNAs, et de longs ARN non codant (lincRNAs) étaient également présents sur le HDL (figure 5A). Après normalisation au nombre total de lectures pour chaque classe, le top 50 le plus abondant miRNAs (lectures par mappés miRNA, RPMM, figure 5B), TDR (Reads Per mappé SRDT, RPMT, figure 5C), et d' autres non-miARN non-TdR ARNs (Lit Per mappé ARNs, RPMS, figure 5D) ont été organisées par heatmaps . Ces données illustrent les similitudes (par exemple, le HDL-miARN) et des anomalies (par exemple, TDR) de HDL-ARNs les plus abondants à travers des sujets sains (figure 5B-D). Ces résultats démontrent la puissance de cette stratégie et protocole pour fournir des aperçus remarquables dans le transport des ARNs par HDL. Néanmoins, le séquençage ARNs ne doit pas être invoqué pour la quantification absolue. ARNs d'intérêt doivent être validés par PCR en temps réel. De même, de nombreux chercheurs ne peuvent exiger que la quantification des miARN individuels sur HDL. En tant que tel, le total des HDL ARN a été isolé à partir de chaque sujet pour la quantification relative des taux de HDL-miARN en utilisant PCR en temps réel. Cinq des miARN plus abondantes détectées sur HDL par sRNAseq ont été utilisées pour reatests PCR en temps l pour déterminer leurs niveaux sur chaque échantillon de HDL (Figure 5E). Les valeurs quantitatives relatives ont été calculées en utilisant un ménage arbitraire Ct de 32 (RQV = 2 - ΔCtArb) et normalisée à 1000 pg de HDL entrée de protéine dans l'isolement de l' ARN 13. Les résultats de l'étude de PCR en temps réel montrent que ce protocole est également utile dans la détection de HDL-miARN et de quantifier les différences entre les individus. Collectivement, les schémas présentés définissent les détails critiques des méthodes, et les résultats des approches PCR à la fois le séquençage à haut débit et en temps réel représentent les livrables de ce protocole.
Figure 1. Représentant organigramme du Protocole. HDL pur est isolé à partir d'un gradient de densité ultracentrifugation et rapide des protéines Chromatog liquide phie. HDL total ARN peut ensuite être utilisé pour les petits ARN (ARNs) séquençage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Isolement des HDL. (A) Graphique de la densité et le diamètre des lipoprotéines et des vésicules extracellulaires (EV). (B) Schéma de séquentielle isolement tandem HDL, y compris la séparation de plasma, gradient de densité ultracentrifugation (DGUC), fast-protéine chromatographie en phase liquide (FPLC), la filtration et la concentration. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Rapide-protéine chromatographie liquide (FPLC) Séparation des lipoprotéines EV, des vésicules extracellulaires. VLDL, lipoprotéines de très faible densité; LDL, lipoprotéines de basse densité; HDL, lipoprotéines de haute densité; FP, protéine libre; PC, phosphatidylcholine; et TC, le cholestérol total. La ligne rouge, TC; Ligne bleue, la protéine, et la ligne noire, PC. Séparation des lipoprotéines de (A) du plasma humain avant ultracentrifugation à gradient de densité (DGUC) et (B) fraction HDL après DGUC. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Génération des petits ARN bibliothèques. (A) Schéma de petits ARN (ARNs) bibliothèque construction et la taille-sélection. miRNA, microARN; TDR, ARNs ARNt dérivé; ARNs, non-miARN non-TdR ARNs; RT, la transcription inverse; pb, paire base; et l' ADNc, l' ADN clone. (B) Analyse des bibliothèques HDL-ARNs avant et après le multiplexage en utilisant haute sensibilité des puces à ADN et Bioanalyseur. (C) la distribution de longueur de HDL-ARNs lit après séquençage. RPM, Lit par million; M, sujets de sexe masculin; F, sujets féminins; et nt, nucleotides. N = 4. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Diversité des HDL-ARNs. (A) Distribution de HDL-ARNs dans les classes ARNs. Fraction de lectures aligné sur ARNs annotées dans le génome humain. (BD) Heatmaps N = 4 échantillons HDL-ARNs.
| 1. Anti-oxydants pour Lipoprotein séparation | Faites solution stock à 100x |
| EDTA | l'acide éthylènediaminetétraacétique (0,5 M stock) |
| AZT | 3-amino-1,2,4-triazole: 42 mg / ml de H 2 O |
| BHT | Butylhydroxytoluène: 25 mg / 100 ul EtOH |
| TROLOX | (+) - 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique: 41,7 mg / 500 ul de EtOH |
| 2. Overlay Solutions | |
| Solution # 1 | 1,019 g / ml dans H 2 O |
| Solution # 2 | 1,025 g / ml de KBr / H 2 O |
| Solution N ° 3 | 1,063 g / ml de KBr / H 2 O |
| Solution n ° 4 | 1,080 g / ml de KBr / H 2 O |
| Solution # 5 | 1,255 g / ml de KBr / H 2 O |
| 3. FPLC Buffer | </ Tr> |
| 1 L Recette | 50 ml de NaCl 3M; 20 0,5 ml de Tris-HCl, pH 7,6; 2 mL de 10% d'azoture de sodium; 930 ml H 2 O |
Tableau 1. Réactifs spéciaux.
| Étape | Temp (° C) | Temps | Cycles |
| UNE | 98 | 30 s | 1 |
| B | 98 | 10 s | 25 |
| 60 | 30 s | ||
| 72 | 15 s | ||
| C | 72 | 10 minutes | 1 |
Tableau 2.Bibliothèque Génération étapes Amplification.
| Apprêt | Séquence |
| Primer 1.1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| Primer 2.1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
Tableau 3. Amorces de PCR.
| Étape | Temp (° C) | Temps | Cycles |
| UNE | 95 | 10 minutes | 1 |
| B | 95 | 10 s | 40 |
| 60 |
Tableau 4. Bibliothèque Quantification Amplification étapes.
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Discussion
Ce protocole est conçu pour quantifier miARN et d'autres ARNs par séquençage à haut débit ou PCR en temps réel sur le HDL très pur. Comme pour toute approche, des considérations particulières devraient être données à chaque étape du processus de purification de HDL et de l'ARN, puis quantifier ARNs. Ce protocole est conçu pour des projets commençant par ≥ 2 mL de plasma. Néanmoins, des analyses d'ARN de haute qualité peuvent être complétés avec succès HDL purifié à partir d'aussi peu que 80 pi de plasma humain ou de souris en utilisant la chromatographie d'affinité; Cependant, de plus grands volumes de départ plasmatiques produisent de meilleures données en utilisant les méthodes présentées ici. les méthodes de traitement et d'extraction des échantillons peuvent modifier radicalement miRNA / ARNs qualité et le rendement. L'utilisation d'anticoagulants, si elle est indispensable pour la collecte de plasma, affecte probablement l'extraction en aval. Par exemple, l' héparine n'a pas été facilement éliminé lors de l' extraction de l' ARN 14,15 et peut inhiber les enzymes utilisées dans la PCR en aval 16-18. En outre, eoici rapports que le citrate de sodium peut également interférer avec les mesures qPCR où miARN à partir d' échantillons EDTA sont montrés avoir amélioré le profil d'expression par rapport à des échantillons de citrate de sodium 16,19,20. Ces études démontrent la nécessité d'un examen attentif lors du choix d'un anticoagulant. En outre, en raison de l'augmentation potentielle de la lyse cellulaire pendant la coagulation, des échantillons de sérum ne sont pas recommandés comme miARN cellulaires lysées peut associer artificiellement avec des lipoprotéines. De même, le plasma est parfaitement isolé du sang total immédiatement pour éviter la contamination par d'autres cellules du sang périphérique, y compris les leucocytes lysées. Lorsque la température froide est largement connu pour affecter l'activation des plaquettes, des échantillons de sang total sont filées loin érythrocytes, leucocytes et des plaquettes à 3000 xg pendant 15 min à température ambiante. Hémolyse est également mal avisé que les érythrocytes rompus ont été signalés à influencer aussi miRNA résultat 21,22, car ils contiennent des miARN qui peut être versé au cours hemolyse 23,24. Le plasma peut ensuite être conservé à 4 ° C pendant 2 - 4 semaines ou encore le plasma peut être congelé à -80 ° C , où le contenu miARN est stable et viable à la fois à court terme et stockage à long terme (max 4 ans) 25. À notre connaissance actuelle, la congélation des échantillons de plasma n'a pas prédit de nuire HDL-miARN et des échantillons de plasma congelés conviennent à analyser. Lipoprotéines et d'autres composants de sang entier peut être affectée par l'ingestion de nourriture, le jeûne de collecte de sang est préférée.
Comme mentionné plus haut, le HDL plasmatique peut être isolé par un certain nombre de procédés standard, y compris DGUC, la FPLC et la Chromatographie par affinité contre ApoA-I. . Isolement des lipoprotéines plasmatiques en utilisant DGUC KBr, comme décrit par Redgraves et al 26, sépare les VLDL (d = 0,94 à 1,006 g / ml), de LDL (d = 1,006 à 1,063 g / ml) et de HDL (d = 1,063 à 1,21 g / ml) et est une méthode idéale pour de grands volumes de plasma (2 - 60 ml par échantillon). la limitationà l' utilisation de cette approche est que seule exosomes et d' autres miARN contenant les véhicules électriques sont signalés à avoir une densité similaire à HDL et peuvent être présents dans DGUC HDL (figure 2A). D' autres inconvénients sont possibles dommages structurels aux protéines d' une exposition élevée de sel dans les tampons et les forces de ultracentrifugation fortes ainsi que des stabilités différentielles de HDL sous-classes 27,28. Malgré cela, DGUC est couramment utilisé car il conduit à un rendement élevé de protéines HDL, produisant près de 1 mg de protéine HDL par 1 ml de plasma 29. L'approche FPLC, qui implique la filtration sur gel taille d'exclusion, nécessite moins de temps, en fonction du débit (environ 6 h), et a une plus grande précision de séparation HDL de apoB lipoprotéines contenant (par la taille) et leurs sous-classes, y compris les véhicules électriques qui sont beaucoup plus grandes que HDL, mais ont des densités similaires. Il convient de noter que l'utilisation des méthodes décrites dans ce protocole, des vésicules de plasma entre environ 220-75 nm de diamètre ne le font pasobtenir un lipide ou une protéine détectable lorsque la signature séparée par FPLC. En fonction de la mise en place, FPLC nécessite relativement petite entrée, de 0,3 à 1 ml, ce qui est utile pour le plasma des rongeurs et de petits aliquotes congelées. Rapides tests de cholestérol colorimétriques sont également importants suivants FPLC pour confirmer la distribution de HDL ou d'autres fractions de lipoprotéines. Fractionnement dilue les échantillons et les lipoprotéines; Cependant, les échantillons peuvent ensuite être concentrés en utilisant la taille-filtres centrifuges standards (par exemple, 10 kDa mw coupure du filtre). isolement HDL par apoA-I IP en utilisant des colonnes de micro-spin sont le plus rapide des trois approches, mais sont limités par une faible entrée (0,08 à 1 pi) volume et un faible rendement (environ 0,1 mg). Alors que apoA-IP peut être laborieux, cette méthode est idéale pour les faibles volumes de surnageants de culture cellulaire. Bien que chacune de ces méthodes a ses forces et faiblesses, celles - ci peuvent être réduites si elle est utilisée en tandem (par exemple, DGUC suivi FPLC). En utilisant deux approches en tandem, les résultats dans une plus grande pureté deHDL pour miRNA et ARNs analyse.
Ici, nous avons détaillé les étapes nécessaires pour isoler HDL très pur en utilisant la méthode en tandem de DGUC suivie par FPLC et décrit les étapes utilisées pour quantifier HDL-miARN et ARNs en utilisant soit le séquençage à haut débit ou PCR en temps réel. Bien que ce protocole a été conçu pour HDL, il a une grande applicabilité dans la quantification ARNs sur d'autres lipoprotéines, y compris les LDL et VLDL, en fonction de leurs densités et de tailles.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
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