Abstract
De diversiteit van kleine niet-coderende RNA's (sRNA) breidt zich snel uit en hun rol in biologische processen, met inbegrip van genregulatie, zijn in opkomst. Meest interessant zijn sRNAs ook gevonden buiten de cellen en zijn stabiel in alle biologische vloeistoffen. Als zodanig extracellulaire sRNAs vertegenwoordigen een nieuwe klasse van ziekten biomerkers en zijn waarschijnlijk betrokken bij cel signalering en intercellulaire communicatie netwerken. Hun potentieel als biomarkers beoordelen, kan sRNAs worden gekwantificeerd in plasma, urine en andere vloeistoffen. Niettemin volledig begrijpen van de invloed van extracellulaire sRNAs endocriene signalen, is het belangrijk om te bepalen welke dragers transporteren en te beschermen in biologische vloeistoffen (bijvoorbeeld plasma), die cellen en weefsels bijdragen aan extracellulaire sRNA zwembaden, en cellen en weefsels in staat van het accepteren en het gebruik van extracellulaire sRNA. Om deze doelen te bereiken, is het essentieel om zeer zuivere populaties van extracellulaire dragers isolerenvoor sRNA profilering en kwantificering. We hebben eerder aangetoond dat lipoproteïnen, in het bijzonder high-density lipoproteïnen (HDL), functionele microRNA's (miRNA) tussen cellen en HDL-miRNAs is significant veranderd bij ziekte vervoeren. Hier hebben we detail een nieuw protocol dat tandem HDL isolatie gebruikt met een dichtheid-gradiënt ultracentrifugatie (DGUC) en fast-eiwit-vloeistofchromatografie (FPLC) tot zeer pure HDL krijgen voor downstream profilering en kwantificering van alle sRNAs, met inbegrip van miRNAs, met behulp van zowel een hoge -throughput sequencing en real-time PCR benaderingen. Dit protocol zal een waardevolle bron voor het onderzoek naar sRNAs op HDL zijn.
Introduction
Extracellulaire niet-coderende kleine RNAs (sRNAs) vertegenwoordigen een nieuwe klasse van ziekten biomerkers en potentiële therapeutische doelwitten en waarschijnlijk cel-cel 1 te vergemakkelijken. De meest bestudeerde soort sRNA zijn microRNAs (miRNA) die ongeveer 22 gen in lengte en van langere voorloper vormen en primaire transcripts 2 worden verwerkt. miRNAs is aangetoond post-transcriptioneel genexpressie door middel van onderdrukking van eiwittranslatie en inductie van mRNA degradatie 2. Toch miRNAs zijn slechts een van de vele soorten sRNAs; zoals sRNAs kan worden afgesplitst van ouder tRNA (-tRNA afgeleid sRNAs, TDR), kleine nucleaire RNA's (sRNA-afgeleide sRNAs, sndRNA), kleine nucleolair RNA's (snoRNA-afgeleide sRNAs, snRNA), ribosomaal RNA (rRNA-afgeleide sRNAs, RDR ), Y RNAs (YDR), en andere diverse RNAs 1. Enkele voorbeelden van deze nieuwe sRNAs gemeld Soortgelijke miRNAs functioneren; De biologische functions van veel van deze sRNAs nog worden bepaald, hoewel rollen in genregulatie waarschijnlijk 3-6. Het meest interessante miRNAs en andere sRNAs zijn stabiel aanwezig in extracellulaire vloeistoffen zoals speeksel, plasma, urine en gal. Extracellulaire sRNAs zijn waarschijnlijk beschermd RNases via hun associatie met extracellulaire blaasjes (EV), lipoproteïnen en / of extracellulaire ribonucleoproteïne complexen.
Eerder hebben we gemeld dat lipoproteïnen, namelijk high-density lipoproteïnen (HDL), transport miRNAs in plasma 7. In deze studie werden HDL geïsoleerd met behulp van een sequentiële werkwijze dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie (DGUC), fast-proteïne vloeistofchromatografie (grootte-uitsluitingschromatografie gelfiltratie FPLC) en affiniteitschromatografie (anti-apolipoproteïne AI (apoA-I) immunoprecipitatie ) 7. Waarbij zowel real-time PCR-gebaseerde lage-dichtheid arrays en individuele miRNA assays werden miRNA niveaus gekwantificeerd HDL geïsoleerd uit heelthy en hypercholesterolemic onderwerpen 7. Met behulp van deze aanpak, waren we in staat om miRNAs profileren en te kwantificeren specifieke miRNAs in zeer zuivere HDL preparaten. Sinds 2011 hebben we vastgesteld dat hoewel affiniteitschromatografie verhoogt HDL zuiverheid antilichaam verzadiging sterk beperkt rendement en kunnen kosten prohibitief zijn. Momenteel, ons protocol beveelt een tweestaps opeenvolgende tandemmethode van DGUC gevolgd door FPLC, die ook produceert HDL monsters van hoge kwaliteit voor downstream RNA isolatie en kwantificering sRNA. Als gevolg van de recente vooruitgang in high-throughput sequencing van sRNAs (sRNAseq), bijvoorbeeld, miRNAs, en het toegenomen bewustzijn van andere niet-miRNA sRNA klassen, sRNAseq is de huidige state-of-the-art in miRNA en sRNA profilering. Als zodanig, ons protocol raadt het kwantificeren van miRNAs en andere sRNAs op HDL monsters met behulp van sRNAseq. Niettemin totaal RNA geïsoleerd uit HDL kan ook worden gebruikt om individuele miRNAs en andere sRNAs kwantificeren of valideren sRNAseq resultaten middels real-time PCR eenpproaches. Hier beschrijven we in detail een protocol voor het verzamelen, zuivering, de kwantificering, data-analyse, en validatie van zeer zuiver HDL-sRNAs.
Het algemene doel van dit artikel is om de haalbaarheid en het proces van sRNA kwantificering demonstreren in zeer zuiver HDL geïsoleerd uit menselijk plasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zuivering HDL (~ 5,5 dagen)
- Density-Gradient Ultracentrifugatie (DGUC, ~ 5 dagen)
- Voeg 90 ul van 100x anti-oxidanten 9 ml plasma geïsoleerd uit vers veneus bloed.
- Pas plasmadichtheid met KBr van 1,006 g / ml tot 1,025 g / ml door toevoeging van 0,251 g KBr aan 9 ml plasma uit stap 1.1.1 (0,0278 g / ml plasma KBr). Schommel de plasma totdat al het zout is opgelost bij kamertemperatuur en overbrengen buizen ultracentrifuge en zorgen alle bellen stijgen naar de top.
- Buig de tip van een 18-G naald tot 90 ° 1 cm van de punt, schuine zijde naar boven. Met behulp van een injectiespuit en de 18-gauge naald, plaats voorzichtig 3 ml overlay oplossing # 1 via plasma (tabel 1).
LET OP: De verbogen naald zorgt ervoor dat alle de VLDL / IDL, LDL en HDL worden verwijderd zonder het te mengen met de overlay. - Verwijder de meerderheid van de bellen bij de bovenkant, waardoor 2-3 mm afstand van meniscus de top van de buis en carefully plaatst de tubes in SW-40Ti emmers.
- Weeg elke emmer (met de doppen) op de balans, en precies in evenwicht te brengen met de andere emmer (bucket + cap): # 1 naar # 4, # 2 tot # 5, en # 3 tot # 6.
LET OP: Deze emmers moeten evenwichtig en afgestemd te allen tijde. - Plaats de rotor in de ultracentrifuge (Lijst van Materials). Centrifugeer bij 274.400 xg gedurende 24 uur bij 4 ° C met een # 4 tussenproduct remmen.
- verwijderen emmers uit rotor en de buizen voorzichtig uit emmers.
- Trek 2 ml van de bovenste laag van de overlay met een injectiespuit en verbogen naald. Dit zal de VLDL / IDL fractie die ten 4 kunnen worden opgeslagen zijn ° C of -80 ° C.
- Na het verwijderen van de VLDL / IDL fractie, het verzamelen van de resterende 7 ml monster (plasma) en plaats deze in een 15 ml conische buis. Breng het volume van het monster tot 9 ml met overlay oplossing # 2 (Tabel 1).
- Pas de steekproef dichtheid van 1,025 g / ml tot 1,080 g / ml met behulp van KBrongeveer 0,746 g KBr in de 9 ml monster of 0,0828 g / mL KBr monster. Schud het monster totdat alle KBr wordt opgelost (ongeveer 20 min) en over te dragen aan de buis ultracentrifuge tegelijkertijd bellen stijgen naar de top.
- Met spuit en naald, zorgvuldig plaatst 3 ml overlay oplossing # 3 over het monster (tabel 1). Laat 2-3 mm afstand van meniscus de top van de buis.
- Verwijder het meeste resterende luchtbellen aan de top van de buis en plaats voorzichtig de gevulde ultracentrifuge buizen SW-40Ti emmers.
- Weeg elke emmer (met de doppen) op de balans, en precies in evenwicht te brengen met de andere emmer + cap, zoals in 1.1.5.
- Plaats de rotor in de ultracentrifuge (zie lijst van materialen). Centrifugeer bij 274.400 xg gedurende 24 uur bij 4 ° C met een # 4 tussenproduct remmen.
- verwijderen emmers uit rotor en de buizen voorzichtig uit emmers.
- Verwijder voorzichtig 2 ml van de bovenste laag van de bekleding met een injectiespuit en zijnnt naald. Dit zal de LDL fractie die ten 4 kunnen worden opgeslagen zijn ° C of -80 ° C.
- Na het verwijderen van de LDL-fractie, het verzamelen van de resterende bij benadering 7 ml monster (plasma) en plaats deze in een nieuwe 15 ml conische buis. Breng het volume van het monster (plasma) tot 9 ml met 1,080 g / mL oplossing # 4 (Tabel 1).
- Pas de steekproef dichtheid van 1,080 g / ml tot 1,30 g / mL met KBr behulp van 3,33 g KBr in de 9 ml monster (plasma) of 0,37 g KBr voor elke mL van het monster. Rock of licht schudden van het monster tot alle KBr (zout) is opgelost en over te dragen aan de buis ultracentrifuge.
- Met spuit en naald, zorgvuldig plaatst 3 ml overlay-oplossing # 5 over het monster (tabel 1).
- Verwijder het meeste resterende luchtbellen aan de top van de buis, waardoor 2- 3 mm afstand van meniscus de top van de buis en plaats voorzichtig de gevulde ultracentrifuge buizen SW-40Ti emmers.
- Weeg elke emmer (met de doppen) op de balans, en precies in evenwicht te brengen met de andere emmer + cap, zoals in 1.1.5.
- Plaats de rotor in de ultracentrifuge (zie lijst van materialen). Centrifugeer bij 274.400 xg gedurende 48 uur bij 4 ° C met een # 4 rem.
- verwijderen emmers uit rotor en de buizen voorzichtig uit emmers.
- Haal ongeveer 2 ml van de bovenste laag van de overlay met een injectiespuit en verbogen naald. Dit is de HDL-fractie, die bij 4 ° C of -80 ° C worden opgeslagen.
LET OP: Na DGUC HDL kan worden gedialyseerd aan de high-zoutoplossingen te verwijderen. - Om te dialyseren, plaatst de verzamelde HDL-fractie in een afgesloten dialyse huls (10.000 MW cut-off) en dialyze overnachting in 1 L 1x PBS. Change dialyse buffer (1x PBS) 3 keer meer dan 24 uur. Gentle verstoring van de PBS met een magnetische roer-bar zal dialyse te verbeteren.
- Bepaal de eiwitconcentratie van de DGUC-HDL met een BCA methode 8.
- Fast-Protein Liquid Chromatography (FPLC) of Size-Exclusion Chromatography (~ 6 uur)
- Filter 1.2 mg DGUC-HDL (totaal eiwit) in 500 ul door middel van een 0,22 pm micro-centrifugaal filter (zie lijst van materialen), onmiddellijk voorafgaand aan de injectie.
Opmerking: Een extra filtering van het DGUC-HDL monster door een 0,45 urn micro-centrifugaal filter vóór de 0,22 urn filter kan nodig zijn voor enkele voorbeelden. - Verzamel de gefilterde DGUC-HDL monster, laadt de FPLC (fill) injectiespuit, en ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de spuit voor het injecteren in de FPLC.
- Stel de FPLC debiet tot 0,3 ml / min met een limiet druk op 2,6 MPa. Equilibreren kolommen met 0,2 kolomvolumes (ongeveer 15 ml) buffer alvorens te worden geïnjecteerd monster. Injecteren van het monster met 3 ml buffer in de FPLC (injectieblok) instrument en start de run. Verzamel fracties van 1,5 ml voor een totaal van 72 fracties.
- Filter 1.2 mg DGUC-HDL (totaal eiwit) in 500 ul door middel van een 0,22 pm micro-centrifugaal filter (zie lijst van materialen), onmiddellijk voorafgaand aan de injectie.
2. High-throughput Small RNASequencing (sRNAseq, ~ 9 dagen)
- RNA isolatie (~ 1 dag)
- Identificeer de FPLC fracties overeenkomend met DGUC-HDL door bepaling van totaal cholesterol met een colorimetrische kit volgens instructies van de fabrikant. Met behulp van deze FPLC set-up, verwachten te vinden 6 - 7 FPLC fracties die DGUC-HDL.
- Verzamel alle (ongeveer 8 -1 0 ml pool van 1,45 ml fractievolumes) vanaf DGUC-HDL FPLC fracties en concentreer gebruik 10 kDa cut-off centrifugale filtereenheden bij 4000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C of tot HDL concentraat ongeveer 100 uL.
- Verzamel de HDL concentraat en kwantificeren HDL totale eiwitconcentratie met behulp van de BCA methode 8.
- Bepaal de hoogste concentratie van HDL totaal eiwit tot 1 mg, die kan worden porties van elk monster in de set. Bijvoorbeeld, RNA te isoleren uit dezelfde hoeveelheid HDL totaal eiwit voor elk monster.
- Voeren RNA isolatie gebruikteen gemodificeerd protocol (zie lijst van materialen).
- Voeg 10x volume fenol lysis reagens (zie lijst van materialen) monster en vortex gedurende 1 minuut.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- chloroform (20% fenol lysis reagens volume gebruikt in stap 2.1.5.1) toe te voegen en schud krachtig gedurende 15 s.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.
- Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C in een gekoelde centrifuge.
- Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe buis, het vermijden van de interfase.
- Voeg 1,5x volume 100% ethanol aan de waterige fase en vortex gedurende 1 minuut.
- Opslag monsters gedurende ten minste 1 uur of overnacht bij -80 ° C.
- Ga door met de RNA-isolatie protocol met behulp van de meegeleverde mini columns.
- Elueer met 30 gl RNase-vrij H2O Eerst voeg 15 ul H2O direct naar frit, centrifugeren op lage snelheid (2000 x g) gedurende 2 min, enVervolgens draait heel snel (max) gedurende 1 min. Herhaal deze stap met een extra 15 ui H2O
- Onmiddellijk naar sRNA bibliotheek generatie of op te slaan bij -80 ° C.
- Bibliotheek Generation (~ 6 h)
- Bereid sRNA cDNA bibliotheken die sRNA de bibliotheek generatie kit protocol, volgens instructies van de fabrikant met een wijziging van de PCR-amplificatie zoals hieronder beschreven.
- Bereid de PCR mastermix op ijs bevattende 0,5 gl DNase / RNase-vrij H2O, 15 pl PCR Mix (PML) en 1 pi RNA PCR Primer (RP1) per monster (voorzien van een extra 10% te pipetteren fout).
- Voeg 16,5 ul van de PCR-mix aan elke (cDNA) monster.
- Wijs een index / barcode nummer aan elk monster voor het multiplexen en voeg 1 pl PCR Primer Index (om het bijbehorende nummer) naar het monster.
- Voer een snelle draai met behulp van de microcentrifuge.
LET OP: Het totale volume moetnu 30 ul per monster. - Voer de cycling condities voor PCR-amplificatie zoals beschreven in de tabellen 2 en 3.
- Bereid sRNA cDNA bibliotheken die sRNA de bibliotheek generatie kit protocol, volgens instructies van de fabrikant met een wijziging van de PCR-amplificatie zoals hieronder beschreven.
- Grootte Selecteer sRNA Library te verwijderen Adapter: Adapters (~ 1,5 uur)
- Voer bibliotheek size-selectie met behulp van automatische DNA grootte selector volgens de instructies van de fabrikant met de volgende afmetingen parameters: Doel: 156 bp, Start: 135 bp, End: 177 bp, Range Vlag: Breed.
- DNA Clean Up (~ 0,5 uur)
- Opruimen op grootte geselecteerde cDNA sRNA volgens de instructies van de fabrikant.
- Elueer schoon en sRNA cDNA geconcentreerd met 2 x 7 ul DNase / RNase-free H 2 O.
- Kwantificeren en beoordelen sRNA cDNA Library opbrengst en kwaliteit (~ 1 uur)
- Assess sRNA cDNA- bibliotheek kwaliteit en grootte met behulp van een uiterst gevoelige DNA-chip op een bioanalyzer (Lijst van Materials) als per Manufactinstructies urer's.
- Kwantificeren sRNA individuele cDNA-bibliotheek door gebruikmaking van een uiterst gevoelige DNA assay (List of Materials), volgens instructies van de fabrikant.
LET OP: Het is aanbevolen om alle monsters met verschillende indices worden uitgevoerd op dezelfde rijstrook van de stroom cel, indien mogelijk hebben. Als er meer dan één rijstrook nodig is, meng case en controlemonsters gepast.
- High-throughput sRNA Sequencing (~ 7 dagen)
- Pool individuele geïndexeerd sRNA bibliotheken op basis van equimolaire concentraties.
- Screen samengevoegd sRNA bibliotheken voor de kwaliteit van het gebruik van hoge gevoeligheid DNA-chip op de bioanalyzer en bepaal bibliotheek DNA-concentratie als in 2.5.1 - 2.5.2.
- Voer kwantitatieve PCR (qPCR) van de adapter content naar de juiste sequencing diepte zorgen voor het gebruik van de sequencing bibliotheek qPCR kwantificering kit volgens de instructies van de fabrikant (Lijst van Materials).
- Voer sequencing met behulp van een enkel read, 50 b25 M leest / monster, volgens de instructies van de producent - p protocol bij een diepte van ongeveer 20 bereikt.
3. Data Analysis (~ 1 dag)
- Gebruik bcl2fastq2, volgens handleiding instructies voor te verwerken rauwe fastq dossiers van gedemultiplexte monsters (Lijst van Materials).
- Gebruik Cutadapt om adapters 9 trimmen en verwijderen leest <16 nucleotiden (NTS) in de lengte, als per handleiding instructies (Lijst van Materials).
- Verwijder verontreinigingen sequenties die aanwezig zijn in de sRNA bibliotheken, waaronder stop oplossing sequentie (STP: CCACGTTCCCGTGG) en adapter carry-over (CTACAGTCCGACGATC) met behulp van removeSequenceInFastq functie in NGSPERL kader, volgens handleiding instructies (Lijst van Materials).
- Voer kwaliteitscontrole metrics door FastQC behulp Center for Quantitative Wetenschappen (CQS) gereedschappen, zoals per handleiding instructies (Lijst van Materials).
- Genereer niet-redundante lijst van "identiek" leest (collapse redundant gelezen) en opnemen kopie-aantallen met behulp van CQSTools, volgens handleiding instructies (Lijst van Materials).
- Align leest het menselijk genoom met behulp van Bowtie1.1.2 waardoor 1 mismatch (opties: -a -m 100 --best --strata -v 1), per handleiding instructies (Lijst van Materials).
- Voer lezen uitlijning, tellen, en het resultaat samenvatten taken met NGSPERL, volgens handleiding instructies.
- Omzetten geëxporteerd telling tafel om een spreadsheet bestand.
- Normaliseren leest van een specifieke categorie (bijv miRNAs) tot het totale aantal leest voor die klasse (bv, het totale aantal miRNAs gelezen) en het verslag signalen Leest Per Toegewezen miRNA (RPMM). (Bv RPMM = (miR-X / Totaal van miRNA gelezen) * 1.000.000).
- Input genormaliseerd telling tafel als generieke enkele kleur technologie in software voor low-level en high-level differentiële analyses per handleiding instructies (Lijst van Materials).
LET OP: Op dit moment zijn er geen goed gekarakteriseerd housekeeping genen / SRNVoor HDL-sRNA. Een piek in gebruik kan worden gemaakt, maar kan problematisch zijn. Normaliseren naar HDL totaal eiwit ingang of het volume wordt geadviseerd. Belangrijker nog, is het raadzaam om sequencing resultaten te valideren door een van de verschillende strategieën om miRNAs en sRNAs met behulp van real-time PCR of kwantitatieve PCR kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol is een reeks gevestigde werkwijzen met elkaar verbonden te houden met de kwantificatie van sRNAs op zeer zuiver HDL door high-throughput sequencing of real-time PCR (figuur 1). Om de haalbaarheid en de impact van dit protocol te demonstreren, werd HDL gezuiverd uit menselijk plasma door de tandem DGUC en FPLC methode. Verzamelde FPLC fracties overeenkomende met HDL (door cholesterolverdeling) werden geconcentreerd en totaal RNA werd geïsoleerd uit 1 mg van HDL (totaal eiwit). sRNA bibliotheken werden gegenereerd met HDL vanuit n = 4 gezonde proefpersonen. Alle menselijk bloed / plasma monsters werden verzameld onder actieve Institutional Review Board protocol (# 070416), en de menselijke proefpersonen werden ingeschreven met informed consent, zoals goedgekeurd door Vanderbilt University School of Medicine. Voorbereid sRNA bibliotheken werden gesequenced aan de Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics (VANTAGE) DNA-sequencing centrum en data analyses werden uitgevoerdgebruik interne pijpleidingen. Visualisaties zijn gemaakt door grafische software.
De kritische noodzaak om een tweede methode (FPLC) voor HDL isolatie uit te voeren na DGUC is te wijten aan mogelijke co-zuivering van EV's. EV's een algemene klasse van membraan afgeleide blaasjes die afkomstig zijn van multivesiculaire lichaampjes (exosomes), plasmamembraan ontluikende (microvesicles), en andere processen, met inbegrip van apoptotische lichamen 10. EV, namelijk exosomes, is gerapporteerd dat ze een vergelijkbare dichtheid zo klein HDL (Figuur 2A) zijn, en dus kan in de HDL-fractie dichtheid zijn (1,063-1,21 g / ml) na DGUC 11,12. Om EV's en andere lipoproteïnen (bijvoorbeeld LDL) te verwijderen uit DGUC-HDL, werd FPLC gebruikt om afzonderlijke HDL uit andere blaasjes en deeltjes per grootte; HDL (7 - 12 nm in diameter) en EV (40-220 nm in diameter) zijn gemakkelijk gefractioneerd door hun verschillen in grootte (figuur 2A, B). HDL-fracties waren direct duidelijk door de verdeling van cholesterol en HDL-DGUC FPLC fracties werden samengevoegd en geconcentreerd onder toepassing van 10 kDa cut-off centrifugatie filters. Geconcentreerde HDL werden verzameld en gebruikt voor stroomafwaartse RNA-analyse (Figuur 2B). Om dit punt te illustreren, werd plasma pre-DGUC gefractioneerd met behulp van FPLC en de verdeling van fosfolipiden (fosfatidylcholine, PC); totale cholesterol (TC), en eiwit niveaus werden gekwantificeerd en uitgezet over fracties. PC, TC en eiwitten niveaus werden gekwantificeerd met behulp van drie colorimetrische kits. Alle drie parameters welbepaalde het HDL-fracties (19-24) en VLDL / LDL fracties (14-18). In FPLC gefractioneerd plasma werden eiwitten en lipiden signalen minimaal gedetecteerd of helemaal niet gedetecteerd in fracties overeenkomend met vesicle die groter zijn dan VLDL (links van oranje box) (Figuur 3A). Om DGUC scheiding van HDL te tonen, werd DGUC-HDL ook gefractioneerd door FPLC en PC, TC en eiwitten niveaus waren quantified (Figuur 3B). Plotten deze waarden illustreert de co-fractionering van een kleine hoeveelheid LDL gebruik DGUC en versterkt de noodzaak de tandem DGUC FPLC-benadering als zeer zuiver HDL isoleren. Hoewel EV voorspeld co-fractionering met HDL tijdens DGUC was er weinig tot geen in de lipiden en eiwitten in fracties overeenkomend met afmetingen groter dan LDL (figuur 3B) vesikel. De EV lipiden en handtekening eiwitten in de voorspelde groottebereik is minimaal detecteerbaar of afwezig DGUC-VLDL en LDL-DGUC wanneer gefractioneerd door FPLC (gegevens niet getoond). Voor RNA-analyse werd totaal RNA geïsoleerd uit 1 mg tandem gezuiverd HDL voor sRNA bibliotheek generatie. In het kort werden adaptors geligeerd aan het 3 'en 5' uiteinden van sRNAs, waaronder miRNAs en TDR's (Figuur 4A). Geligeerde producten werden aan reverse transcriptie (RT) en PCR geamplificeerd onder toepassing van PCR primers specifiek harboring indexen ontwikkeld voor het multiplexen monsters tijdens downstream sequensreacties (Figuur 4A). Elke adapter is 61 NTS lang; Daarom zou een geligeerde miRNA (ongeveer 22 nts lang) een product van 144 nts lengte te produceren. Veel niet-miRNA sRNAs zijn iets langer dan miRNAs (bv, 30-35 gen in lengte). Als zodanig onze beoogde lengte van het product was 156 bp lang. Geamplificeerde producten werden op grootte geselecteerd met behulp van een automatische DNA formaatselectie en alle cDNA producten 135-177 bp lang werden verzameld (Figuur 4A). De kwaliteiten van massageselecteerde bibliotheken werden beoordeeld door zeer gevoelige DNA-chips met de bioanalyzer (Figuur 4B). sRNA cDNA banken van deze grootte leek iets groter vanwege mogelijke "borrelen" effecten tijdens de analyse. Voor gemultiplexte sequencing, werden equimolaire concentraties van cDNA bibliotheken samengevoegd, schoongemaakt, geconcentreerd en opnieuw geanalyseerd met de bioanalyzer (Figuur 4B). De gemultiplexte monster werd vervolgens sequenced met behulp van een enkele lees 50 bp protocol. In-house werden gegevensanalyse pijpleidingen gebruikt om monsters op basis van indexen demultiplex, trim adapters, draaien kwaliteitscontrole metrics, af te stemmen op het menselijk genoom en tel geannoteerde sRNAs. De verdeling van de genormaliseerde leest (Leest Per Million, RPM),> 16 gen in de lengte, illustreren de verrijking van sRNAs 20-22 gen in lengte en 34-35 gen in de lengte op de HDL (Figuur 4C).
Uitlijning en tellen analyse van de vier HDL-sRNA bibliotheken gevonden dat 38% van de leest uitgelijnd tegen geannoteerde gebieden van het menselijke genoom was miRNAs (Figuur 5A). Net zo overvloedig (37%) waren sRNAs-afgeleid van tRNA (TDR's). -sRNAs afgeleid van diverse RNA's (bijvoorbeeld Y RNA's), rRNAs, smRNAs, snoRNAs, en lange niet-coderende RNA's (lincRNAs) waren ook aanwezig op de HDL (figuur 5A). Na normalisatie naar het totale aantal bed voor elke klasse, de top 50 meest voorkomende miRNA (Leest Per Toegewezen miRNA, RPMM, figuur 5B), TDRS (leest Per Toegewezen TDR's, RPMT, figuur 5C), en andere niet-miRNA non-TDR sRNAs (Leest Per Toegewezen sRNA, RPMS, figuur 5D) werden georganiseerd door heatmaps . Deze gegevens illustreren de overeenkomsten (bijvoorbeeld HDL-miRNAs) en verschillen (bijvoorbeeld TDR's) van de meest voorkomende HDL-sRNAs in gezonde personen (Figuur 5B-D). Deze resultaten tonen het vermogen van deze strategie en protocol opmerkelijke inzichten in het vervoer van sRNAs door HDL verschaffen. Toch moet sRNA sequencing niet worden gebruikt voor absolute kwantificatie. sRNAs van belang moeten worden gevalideerd door real-time PCR. Ook kunnen veel onderzoekers alleen het kwantificeren van afzonderlijke miRNAs op HDL vereisen. Zo werd totaal RNA geïsoleerd uit HDL elke persoon voor relatieve kwantificatie van HDL-miRNAs middels real-time PCR. Vijf van de meer overvloedig miRNAs gedetecteerd door HDL sRNAseq werden voor real-time PCR assays om het niveau op elk HDL monster (Figuur 5E) te bepalen. De relatieve kwantitatieve waarden werden berekend met een willekeurige housekeeping Ct van 32 (RQV = 2 - ΔCtArb) en genormaliseerd tot 1000 ug HDL eiwit ingevoerd in de 13 RNA-isolatie. De resultaten van de real-time PCR-studie tonen aan dat dit protocol is ook waardevol bij het opsporen van HDL-miRNAs en kwantificeren van verschillen tussen individuen. Collectief, de gepresenteerde schema's bepalen de kritieke gegevens van de methoden en de resultaten van zowel high-throughput sequencing en real-time PCR benaderingen vertegenwoordigen de deliverables van dit protocol.
Figuur 1. Representatieve Flow-chart van het protocol. Pure HDL is geïsoleerd van dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en snel eiwit vloeibare Chromatog grafie. Total HDL RNA kan vervolgens worden gebruikt voor kleine RNA (sRNA) sequencing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Isolatie van HDL. (A) Grafiek van de dichtheid en de diameter van lipoproteïnen en extracellulaire blaasjes (EV). (B) Schematische voorstelling van sequentiële tandem HDL isolatie, waaronder een plasma scheiding, dichtheid-gradiënt ultracentrifugatie (DGUC), fast-eiwit vloeistofchromatografie (FPLC), filtratie en concentratie. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Pbelasting / 54488 / 54488fig3.jpg "/>
Figuur 3. Fast-proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) Scheiding van lipoproteïnen EV, extracellulaire blaasjes.; VLDL, zeer lage dichtheid lipoproteïnen; LDL, low-density lipoproteïnen; HDL, high-density lipoproteïnen; FP, gratis eiwit; PC, fosfatidylcholine; TC en totale cholesterol. Rode lijn, TC; Blauwe lijn, eiwitten en Zwarte lijn, PC. Scheiding van lipoproteïnen uit (A) menselijk plasma voorafgaand aan de dichtheid-gradiënt ultracentrifugatie (DGUC) en (B) HDL-fractie na DGUC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Generatie van Small RNA Libraries. (A) Schematische voorstelling van kleine RNA (sRNA) bibliotheek construction en grootte-selectie. miRNA, microRNA; TDR, tRNA-afgeleide sRNAs; sRNA, non-miRNA non-TDR sRNAs; RT, reverse transcriptie; bp, basenparen; en cDNA, gekloneerd DNA. (B) Analyse van HDL-sRNA bibliotheken voor en na gebruik multiplexing hoge gevoeligheid DNA chips en bioanalyzer. (C) lengteverdeling van HDL-sRNA leest na sequentiebepaling. RPM, Leest Per Million; M, mannelijke proefpersonen; F, vrouwelijke proefpersonen; en nt, nucleotiden. N = 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. De diversiteit van HDL-sRNAs. (A) Distributie van HDL-sRNAs over sRNA klassen. Fractie van leest afgestemd op geannoteerde sRNAs in het menselijk genoom. (BD) Heatmaps N = 4 HDL-sRNA samples.
| 1. Anti-oxidanten Lipoprotein scheiden | Maak voorraad oplossing bij 100x |
| EDTA | Ethyleendiaminetetraazijnzuur (0,5 M voorraad) |
| AZT | 3-amino-1,2,4-triazool: 42 mg / ml H2O |
| BHT | Butylhydroxytolueen: 25 mg / 100 pl EtOH |
| Trolox | (+) - 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carbonzuur: 41,7 mg / 500 gl EtOH |
| 2. Overlay Solutions | |
| Oplossing # 1 | 1,019 g / ml in H2O |
| Oplossing # 2 | 1,025 g / ml KBr / H2O |
| Oplossing # 3 | 1,063 g / ml KBr / H2O |
| Oplossing # 4 | 1,080 g / ml KBr / H2O |
| Oplossing # 5 | 1,255 g / ml KBr / H2O |
| 3. FPLC Buffer | </ Tr> |
| 1 L Recept | 50 ml 3M NaCl; 20 ml 0,5 tris-HCl, pH 7,6; 2 ml 10% natriumazide; 930 ml H2O |
Tabel 1. Speciaal reagentia.
| Stadium | Temp (° C) | Tijd | Cycles |
| EEN | 98 | 30 s | 1 |
| B | 98 | 10 s | 25 |
| 60 | 30 s | ||
| 72 | 15 s | ||
| C | 72 | 10 minuten | 1 |
Tabel 2.Bibliotheek Generation Amplification Steps.
| grondverf | Volgorde |
| primer 1.1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| primer 2.1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
Tabel 3. PCR Primers.
| Stadium | Temp (° C) | Tijd | Cycles |
| EEN | 95 | 10 minuten | 1 |
| B | 95 | 10 s | 40 |
| 60 |
Tabel 4. Bibliotheek kwantificering Amplification Steps.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is ontworpen om miRNAs en andere sRNAs kwantificeren high-throughput sequencing of real-time PCR op zeer zuiver HDL. Zoals bij elke andere aanpak dient speciale overwegingen worden om elke stap in het proces van het zuiveren HDL en RNA en kwantificeren sRNAs. Dit protocol is bedoeld voor projecten ab ≥ 2 ml plasma. Toch kan een hoge kwaliteit RNA analyses gevolg zijn afgerond met HDL gezuiverd uit slechts 80 ul humaan of muizen plasma middels affiniteitschromatografie; echter, grotere uitgangspunt plasma volumes te produceren betere gegevens met behulp van de hier gepresenteerde methoden. Monster verwerking en extractie methoden kan drastisch veranderen miRNA / sRNA kwaliteit en opbrengst. Het gebruik van antistollingsmiddelen, terwijl het van essentieel belang voor plasma, waarschijnlijk van invloed op stroomafwaarts extractie. Bijvoorbeeld, heparine wordt niet gemakkelijk verwijderd tijdens RNA-extractie 14,15 en kunnen enzymen stroomafwaarts gebruikt in PCR 16-18 remmen. Bovendien, there zijn berichten dat natriumcitraat ook kan interfereren met qPCR metingen waarbij miRNAs uit EDTA monsters worden getoond expressie profiel te hebben verbeterd ten opzichte van natriumcitraat monsters 16,19,20. Deze studies tonen de noodzaak van een zorgvuldige afweging bij het kiezen van een antistollingsmiddel. Bovendien, als gevolg van verhoogde kans op cellysis tijdens coagulatie, serummonsters worden niet aanbevolen als gelyseerde cellulaire miRNAs kan kunstmatig associëren met lipoproteïnen. Evenzo is ideaal plasma onmiddellijk geïsoleerd uit totaal bloed om verontreiniging van andere perifere bloedcellen, waaronder gelyseerd leukocyten voorkomen. Koude temperatuur alom bekend dat bloedplaatjes activering beïnvloeden, worden complete bloedmonsters afstand gesponnen uit erytrocyten, leukocyten en bloedplaatjes bij 3000 xg gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Hemolyse ook onverstandig als gebroken erytrocyten gemeld ook beïnvloeden miRNA uitkomst 21,22 mocht miRNAs die kunnen worden vergoten tijdens hemol bevattention 23,24. Plasma kan vervolgens worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 2 - 4 weken of alternatief plasma kan worden ingevroren bij -80 ° C wanneer miRNA inhoud stabiel en levensvatbaar zowel korte termijn als lange termijn opslag (maximaal 4 jaar) 25. Om onze huidige kennis, het bevriezen plasmamonsters wordt niet voorspeld dat HDL-miRNAs en bevroren plasma monsters zijn geschikt om te analyseren schaden. Lipoproteïnen en andere volbloed componenten kunnen worden beïnvloed door voedselinname, het vasten bloedafname voorkeur.
Zoals hierboven vermeld, kunnen plasma HDL worden geïsoleerd door een aantal standaardmethoden, waaronder DGUC, FPLC en affiniteitschromatografie tegen apoA-I. . Isolatie van plasma lipoproteïnen met behulp DGUC KBr, zoals beschreven door Redgraves et al 26, scheidt VLDL (d = 0,94-1,006 g / ml), LDL (d = 1,006-1,063 g / ml) en HDL (d = 1,063-1,21 g / ml) en is een ideale methode voor grote hoeveelheden plasma (2-60 ml per monster). de beperkinghet gebruik van deze aanpak is dat alleen exosomes en andere miRNA bevattende EV worden gemeld aan een soortgelijke dichtheid HDL en kan aanwezig zijn in DGUC HDL (Figuur 2A) zijn. Andere nadelen zijn mogelijke structurele schade aan eiwitten van een hoge blootstelling aan zout in buffers en sterk ultracentrifugatie krachten evenals differentiële stabiliteiten van HDL subklassen 27,28. Desondanks wordt DGUC algemeen gebruikt als het resulteert in een hoge opbrengst van HDL eiwit produceren dicht bij 1 mg HDL proteïne per 1 ml plasma 29. De FPLC benadering, welke maat exclusie gelfiltratie omvat, vergt minder tijd, afhankelijk van de stroomsnelheid (ongeveer 6 uur) en heeft een grotere precisie scheiden HDL van apoB-bevattende lipoproteïnen (grootte) en de subklassen, waaronder EV die veel groter zijn dan HDL maar vergelijkbare dichtheden. Opgemerkt wordt dat het gebruik van de in dit protocol methoden, plasma vesicles tussen ongeveer 220-75 nm in diameter nietwekken een detecteerbaar lipide of proteïne ondertekening afgescheiden door FPLC. Afhankelijk van de set-up, FPLC vereist relatief kleine input, 0,3-1 mL, wat nuttig is voor knaagdieren plasma en kleine hoeveelheden bevroren. Snel cholesterol colorimetrische assays zijn belangrijk na FPLC de verdeling van HDL of andere lipoproteïnefracties bevestigen. Fractionering verdunt monsters en lipoproteïnen; echter, kan vervolgens worden geconcentreerd monsters met standaard afmetingen centrifugaal-filters (bijvoorbeeld 10 kDa cut-off filter). HDL isolatie van apoA-I IP met behulp van micro-spin kolommen zijn de snelste van de drie benaderingen, maar worden beperkt door de lage input (0,08-1 pi) volume en de lage opbrengst (ongeveer 0,1 mg). Terwijl apoA-I IP omslachtig kan zijn, is deze methode ideaal voor laag volume celcultuur supernatanten. Terwijl elk van deze methoden heeft sterke en zwakke punten, kunnen deze worden verlaagd indien gebruikt in tandem (bijv DGUC gevolgd FPLC). Met behulp van twee benaderingen samen resulteert in zuiverderHDL voor miRNA en sRNA analyse.
Hier hebben we gedetailleerd de wijze om hoogzuivere HDL isoleren stappen met de tandem methode DGUC gevolgd door FPLC en waarin een gebruikelijke stappen te kwantificeren HDL-miRNAs en sRNAs behulp van high-throughput sequencing of real-time PCR. Hoewel dit protocol is ontworpen voor HDL, het heeft een grote toepasbaarheid kwantificeren sRNAs andere lipoproteïnen, zoals VLDL en LDL, op basis van hun dichtheid en grootte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
