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Biochemistry

热稳定，表达，纯化，和人类血清素转运蛋白结晶绑定到 Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/54792
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Vollum Institute, Oregon Health & Science University, 2Graduate Group in Biophysics, University of California, San Francisco, 3Howard Hughes Medical Institute, Oregon Health & Science University

Summary

这份手稿介绍如何筛选thermostabilizing突变，净化人的羟色胺转运，产生高亲和力的抗体，并结晶势必抗抑郁药物小号 -citalopram羟色胺转运-抗体复合物。该协议可以适于其他具有挑战性的膜转运，受体和通道的研究。

Abstract

羟色胺转运是钠和氯偶联转运的“泵”外血清素进入细胞：S -citalopram是用于通过结合具有高亲和力的羟色胺转运，阻断血清素再摄取来治疗抑郁症和焦虑症的药物。在这里，我们报告一个有效的程序和一套工具，以稳定，快速，纯化和结晶势必给S -citalopram和其他抗抑郁药羟色胺转运-抗体复合物。其中稳定羟色胺转运突变使用S -citalopram结合分析鉴定。在杆状病毒转导HEK293S GnTI表示羟色胺转运-细胞，被改组为脂酶和用于提高高亲和力的抗体。我们已经制定了一项战略，以发现对于结构研究的抗体。抗体片段在昆虫细胞中表达的直接方法也已确立。使用这种方法纯化运输车-抗体复合物的乖巧和容易结晶，产生带有S -citalopram的衍射X射线，以3-4的分辨率配合。这里开发的策略可以被用来确定其他具有挑战性的膜蛋白的结构。

Introduction

血清素转运蛋白（SERT）是有助于羟色胺的穿过细胞膜1传送一个完整的膜蛋白。 SERT属于家庭神经递质钠Symporters（NSSS），其中还包括多巴胺和去甲肾上腺素转运2。 SERT是广泛的处方抗抑郁和抗焦虑药，其作用是竞争性抑制血清素转运3的分子靶点。 SERT利用钠的积极有利的协同转运从突触间隙去除神经递质。血清素系统的广泛的表征已经表明，血清素代谢的变化看起来几乎影响所有神经过程，包括情绪，睡眠，疼痛，认知和攻击行为4。 SERT功能可以通过使用，比如s -citalopram，抗抑郁药和选择性血清素再摄取抑制剂（SSRIs），以及由psychostimula修改NTS和吸毒成瘾的药物，如安非他明和3,4-亚甲ñ-methylamphetamine或“摇头丸”1,2。

SSRIs的是心境障碍的治疗极为重要的，但对于其作用的确切结构基础还不是很清楚。 WT SERT是在去污剂胶束不稳定，因此妨碍朝SERT 5,6的三维（3D）结构的进展。最近，我们开发这是鲁棒稳定在广泛的洗涤剂和保留SSRI结合活性6 SERT的变体。这些热稳定的SERT变体使用基于邻近闪烁热稳定性测定法中选择。在这里，我们描述了可结合SERT高亲和力抗体的产生的方法，以及热稳定SERT的纯化和结晶，在用抗体和S -citalopram复杂。

这个协议假定SERT和8B6基因已经全成ý分别克隆入BacMam 7和昆虫表达载体。为了产生抗体，编码cDNA残WT SERT的73-616克隆到用C-末端链球菌II标签（SERT IC）的BacMam载体。对于热稳定性屏幕，使用SERT残基73-616具有C末端的GFP，链球菌II和10-His的标签（SERT TC）。在SERT TC背景生成个别的点突变。对于结晶协议中，SERT-GFP融合蛋白与双链球菌[TrpSerHisProGlnPheGluLys（GlyGlyGlySer）2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys]和10他的标签中使用，携带耐高温突变体，Y110A，I291A和T439S和表面半胱氨酸C554A，C580A突变和C622A（SERT CC）。凝血酶裂解序列（LVPRGS）也插入在Q76和T618后SERT CC以允许除去的N-和C-末端。编码8B6的Fab的质粒被工程化以表达两个重链和轻与两个单独的多角体蛋白启动子的控制下，GP67的分泌序列的抗体链。所述8B6抗体的重链的C-末端被标记使用8 His标签和被插入重链和标签之间的凝血酶切割位点。

Protocol

1.粘附HEK293S GnTI转染-细胞对热稳定性屏幕

  1. 制备聚-D-赖氨酸（PDL）包被的96孔板中。在无菌层流罩完成所有的工作。
    1. 过滤的25微克/毫升溶液（PDL），分子量70,000-150,000道尔顿，用0.2μm无菌过滤器。加的PDL 50微升到96孔的组织培养（TC）的板的各孔，以确保底部被均匀地涂覆，并在室温孵育30分钟。
    2. 抽吸PDL溶液和洗涤用的无菌水200微升。
    3. 允许板空气干燥，在4℃下储存前2小时。 PDL涂层板可以储存在4℃几周。
  2. 贴壁细胞HEK293S胰酶消化的。
    1. 生长HEK293S至80％汇合在保持在37℃，8％CO 2的10cm的培养皿中。一个10 cm培养皿应该有大约1000万HEK293S细胞。不要使用细胞后30代！ 抽吸介质和洗涤用5ml磷酸盐缓冲盐水的（PBS）中。添加1毫升的胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25％胰蛋白酶，0.02％EDTA）至细胞中并在37℃孵育2分钟。
    2. 通过反复上下吹吸使用血清吸管添加10毫升Dulbecco氏补充有10％胎牛血清（FBS）和悬浮细胞改良的Eagle培养基（DMEM）的。
    3. 吸管细胞10μL的并用10台盼μL的蓝溶液（0.4％）混合。确定使用血细胞计数器，用光学显微镜的细胞密度。不要算作他们都死了被染成蓝色的细胞。确保细胞存活率是90％以上。
  3. 彻底悬浮胰蛋白酶HEK293S GnTI -细胞在DMEM中一个一次性吸贮补充有10％FBS的至0.5×10 6个细胞/ mL的密度。将需要对每个板约500万HEK293S细胞。共有24个结构可以在每盘用这个PR转染otocol。
  4. 细胞用多道移液器，添加100微升到PDL涂覆板的各孔中。悬浮细胞中的吸移管贮存填充每个板后，以确保均匀的细胞分布。孵育细胞在37℃培养箱用8％ 的 CO 2。 24小时后，细胞应达到约80％汇合。
  5. 转染前1小时更换介质。准备DNA转染试剂复合转染。
    1. 对于每一个在SERT TC背景构造进行筛选，混合450 ng的DNA与无血清DMEM的45μL混匀。添加转染试剂的1.6微升无血清DMEM中45微升并混合。
    2. 立即加入稀转染试剂溶液与DNA溶液并混合。不以相反的顺序混合解决方案。等待10 - 15分钟，并添加转染试剂/ DNA混合物的20μL到4个孔。
  6. 一旦所有井已转染，轻摇回混合板次提出并返回到37℃培养箱。
  7. 经过16 - 24小时更换介质含DMEM血清和10毫米丁酸钠。
  8. 大约48小时后取出转染介质，要么立即在-80与热稳定性屏幕进行或冻结的细胞℃，供以后使用。细胞可以保存在-80℃下几个星期。

基于邻近-2闪烁热稳定性屏幕带有S -citalopram

  1. 孵育200nM的S IN的TBS 25微升-citalopram细胞（Tris-缓冲盐水-的20mM Tris，pH值8，100毫摩尔NaCl），在室温下5分钟。
  2. 通过加入溶解细胞8mM的正十二烷基β-D-麦芽糖苷（C12M），1mM的胆固醇hemmisuccinate（CHS），蛋白酶抑制剂混合物（2mM的苯甲磺酰氟（PMSF），0.1毫克/毫升抑肽酶，将4克25微升/毫升胃蛋白酶抑制素A和4微克/毫升亮肽素）中的TBS，并且温育在室温下1小时。
  3. 加入TBS无线的50微升次为20nM 的[3 H]西酞普兰（81.7居里/毫摩尔），0.1％牛血清白蛋白，和2毫克/毫升His标签亲和闪烁迫近测定法（SPA）小珠至三个孔中的每个构建体。对于最后一个孔加列举的相同的解决方案，但与100μM舍曲林补充，以确定非特异性结合。确保His-标签亲和SPA珠充分混合加入到96孔板时。
  4. 测量[3 H]西酞普兰使用在RT 96孔闪烁计数器以每孔1分钟计数时间绑定。继续计数板，直到总计数（后约36小时）高原。
  5. 热板在33℃的加热块15分钟以加热盖。测量[3 H]西酞普兰如2.4所描述的加热后，再次结合。
  6. 重复步骤2.4 - 2.5，改变加热步骤到36℃，39℃，45℃，48℃，51℃。调整取决于表观熔融温度的加热温度（Tm）的的目标蛋白和最稳定的构建体的热稳定性。继续加热板，直到所有的结构具有低的具体数量。
  7. 分析数据，以确定的Tm值。
    1. 确定每个的平均总计数每分钟（CPM）构造为不通过平均3个重复孔包含舍曲林井。通过在一个单一的板平均每孔含有舍曲林的CPM测定非特异性的CPM。
    2. 通过从总的CPM中减去非特异性的CPM计算特定CPM。
    3. 由非线性拟合波尔兹曼曲函数计算Tm值 。与在RT低特异性的CPM（<WT的10％），构建体通常不具有精确的Tm值。从最耐热构建突变可以一起进行组合，并筛选在热稳定性添加剂的增加。

3. HEK293S GnTI人力羟色胺转运的表达

  1. 变换为1纳克质粒的化学感受细胞DH10Bac感受态。
    1. 添加质粒DH10Bac感受态细胞的50微升，并在冰上孵育30分钟。
    2. 热休克DH10Bac感受态细胞在42℃下30秒。加入200微升SOC培养基中，并在37℃孵育4小时振荡。
    3. 板所有的细菌在含有50微克/毫升卡那霉素，7微克/毫升庆大霉素，10微克/毫升四环素，100微克/毫升5-溴-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷的Luria肉汤（LB）板上，并40微克/毫升异丙β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）。
  2. 隔离的lacZ -在37℃生长在LB琼脂平板2天的菌落（白色菌落）。
  3. 在5毫升含抗生素的LB增长数个殖民地O / N在37℃和隔离杆粒DNA。
    1. 降速菌在1000 xg离心的离心机5分钟。弃上清。重悬细菌用小量的r 200微升esuspension缓冲区。
    2. 裂解细菌通过添加微量制备的裂解缓冲液的200微升，轻轻颠倒试管10次。添加中和缓冲的200微升。
    3. 通过以14,000 xg离心纺丝在离心机中10分钟除去不溶级分。添加1毫升异丙醇上清液和冷却在-20℃下20分钟以沉淀DNA。
    4. 旋转在14000 XG 15分钟，在离心机弃上清。
    5. 洗涤DNA沉淀用70％乙醇，以14000 xg离心再次旋转15分钟。弃上清。空气干燥DNA，直到所有的乙醇蒸发，并在水50微升悬浮。
      注：杆粒DNA的应转染到Sf9细胞立即以取得最佳效果，但也可以存储在-20℃下为几个星期。
  4. 转染杆状病毒质粒DNA导入在6孔培养皿中的潮湿室中在27℃生长贴壁的Sf9的1×10 6个细胞。在无菌层流罩执行所有的细胞培养操作。
      <li>从细胞中移除媒体和补充新鲜的Sf9媒体2毫升。添加杆粒DNA的5微克至100μL的Sf9媒体（溶液A）。
    1. 添加8微升阳离子脂质的Sf9转染试剂的100微升的Sf9介质（溶液B）。孵育含有B液5分钟管。
    2. 含混合溶液管带溶液B，并在室温孵育30分钟，并添加所有的解决Sf9细胞中。
    3. 后96小时，收获上清液（P1病毒）通过穿过一个0.2微米的过滤器。在P1的病毒可以在4℃保存数月在黑暗中并再利用，使P2病毒需要。
  5. 添加100 P1病毒μL到1升Sf9细胞中的在Sf9媒体1×10 6个细胞/ mL的密度。感染细胞96小时，以100rpm的摇床上在27℃下生长。
  6. 降速细胞在离心机以4,000×g离心15分钟并通过0.2微米的过滤器含有病毒颗粒过滤上清液。弃细胞沉淀。 determ的INE病毒密度使用病毒斑块检测或病毒计数器。病毒密度应为每毫升> 1×10 8病毒颗粒。 P2病毒可以被存储在4℃下在黑暗中，并用于数月。
  7. 在补充有2％FBS的293表达介质以130rpm的摇床上以8％的CO 2和85％湿度中悬浮生长的细胞7在37℃下在感染复数为2（MOI） -感染10升HEK293S GnTI的和/毫升，一般为30 3×10 6个细胞的密度-在一个2升每800毫升的细胞的P2病毒的50毫升带挡板烧瓶中。
    注意：不建议使用超过80毫升P2病毒以来，HEK293S GnTI -细胞将缓慢增长，并可能成为不可行由于pH值的变化。 SF9媒体比293表达媒体的酸性。
  8. 12 - 16小时后感染，从1M的库存添加丁酸钠至10mM的浓度。 48 - 60小时后感染，收获细胞，离心4000×g离心15分钟。去除上清。
  9. 悬浮细胞在150ml的TBS，含有2μM 小号 -citalopram或其他SERT抑制剂和在-80℃存储直到准备用于纯化。

4.羟色胺转运的亲和纯化的免疫和结晶

  1. 通过用10毫升吸管迅速传递至均匀解冻从温水中（大约30℃），重悬10升培养的细胞。
  2. 制备用于增溶（150毫升）中的洗涤剂溶液：80毫摩尔Tris，pH值8，150 mM氯化钠含40毫C12M，5mM的CHS，和蛋白酶抑制剂混合物。
  3. 所有的细胞添加到烧杯中有搅拌棒和所有的洗涤剂溶液加入到细胞中，同时搅拌。溶解在4℃下在搅拌下1小时。
  4. 在8000 xg离心旋转裂解液在4℃下15分钟。弃去沉淀，倒出上清液到干净的超速离心管。自旋为100,000 XG 1小时在ultracentrifuge。通过0.2微米的过滤器丢弃沉淀和过滤上清液。
  5. 通过裂解物在填充到用洗涤缓冲液平衡的蠕动泵塔10链球菌毫升亲和树脂：1mM的C12M，0.2mM的CHS，5％甘油，25μM的脂质（1-棕榈酰-2-油酰- SN -glycero- -3-磷酸胆碱，1-棕榈酰-2-油酰- SN -glycero -3-磷酸，1-棕榈酰-2-油酰- SN -glycero -3-磷酸甘油以1:1的摩尔比：1：1），和1个μM 小号 -citalopram或SSRI在TBS。
  6. 链球菌亲和柱连接到快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统，并在用洗涤缓冲液的66毫升（6.6倍柱体积）2毫升/分钟洗涤柱。在相同的缓冲液洗脱纯化的蛋白补充有5mM的脱硫生物素在用缓冲液33毫升（3.3倍柱体积）0.5毫升/分钟。收集1毫升分数;峰馏分将〜10毫升。如果需要的话3天 - 纯化的蛋白质可被储存在4℃，2。
    注：总收益率将在3 -4毫克SERT 的CC和1mg SERT IC组成。在280nm 2 AU的吸光率等于1mg / mL的SERT。

5.重建转运入脂质体免疫为

  1. 准备包含asolectin脂质体：胆固醇：类脂A：大脑极性脂质（摩尔比60：17：3：20）。溶解在1毫升氯仿中的脂类和40mg总脂质的在指定的摩尔比添加到100mL玻璃圆底烧瓶中。
    1. 蒸发氯仿在真空下至少1小时的圆底烧瓶在温水中旋转时，大约30℃。
    2. 通过加入10毫升的TBS再水化脂质。孵育缓冲液10分钟。
    3. 通过将烧瓶置于液态氮冻结的脂质。
    4. 解冻。浸入装满温水的烧杯烧瓶的球形底部，约30℃。声处理的浴中超声发生器5分钟。
    5. 涡并重复步骤5.1.3 - 5.1.4 10次，或直至脂质被完全从底部悬浮并形成混浊的悬浮液。
    6. 通过200nm的过滤器挤出两次整个脂质混合物。脂质将显示为在挤出之前乳状悬浮液;随后它将被半透明的。别整个脂质混合物添加到挤出机一次，因为它可以被堵塞，导致样品损失。
    7. 以100,000×g离心0.5 20分钟，并重新悬浮自旋脂质 - 1毫升的TBS以40毫克/毫升的浓度。
  2. 浓缩纯化的SERT 集成电路 250 - 500μL使用100kDa的MWCO离心蛋白浓缩至2 - 4毫克/毫升和饱和用5mM C12M脂质体。纯化的SERT添加到洗涤剂：类脂混合物在1mL最终体积。
  3. 由80毫克/毫升疏水性吸附树脂连续3次补充删除C12M。进行第2加法，孵育用树脂与旋转为在4℃下2小时。通过穿过玻璃棉除去树脂。执行与树脂的最终培养过夜。
  4. 浓缩离心脂蛋白100,000 XG 20分钟。在弃上清250和重悬沉淀 - TBS的500微升。
  5. 10μM的小号 -citalopram的终浓度添加到重组蛋白之后的最终去除的树脂。
  6. 溶解2.5微升在SDS-PAGE上样缓冲液（62.5毫摩尔Tris，pH值6.8，10％甘油，2％SDS，0.01％溴酚蓝，100mM的DTT）的蛋白脂质体中，并在200伏1上的SDS-PAGE凝胶上运行小时以确保SERT已成功重构。脂蛋白体可存放在等分试样的长期贮藏-80℃和之前每次免疫冰上解冻。

6.筛选抗体认识到3D表位

  1. 屏幕杂交瘤细胞株由免疫印迹。它承认SERT由免疫印迹抗体可能结合线性表位，将可能不会对结构研究。
    1. 混合1微克洁净工作台的编SERT 集成电路或SERT CC和在4运行在- 200伏1小时15％SDS-PAGE凝胶。
    2. 转移到硝酸纤维素膜上以200mA使用Towbin缓冲液（（V / V）甲醇的25mM的Tris，192毫甘氨酸，20％，0.1％SDS）中30分钟。该膜可被干燥并在室温下无限期储存。
    3. 再湿膜用10％甲醇，并用PBS洗（10mM磷酸盐，pH为7.4，137 mM氯化钠，2.7毫摩尔KCl）中。
    4. 用5％奶粉的PBS中在RT下30分钟阻塞。
    5. 用PBS洗涤并用在PBS中1微克/毫升抗体用0.1％乳孵育。
    6. 用PBS含有0.1％Tween-20的广泛洗涤。
    7. 在PBS 10,000 0.1％吐温20和0.1％牛奶：用缀合的IR染料的山羊抗小鼠抗体孵育稀释1。
    8. 广泛冲洗和扫描使用成像系统。
  2. 混合杂交瘤上清液含有西负抗体用100nM SERT CC蛋白使用的摩尔比为1：2（SERT：单抗）在200微升TBS 1毫米C12M，0.2毫米CHS和1μM 小号 -citalopram。离心以100,000×g离心20分钟。分析含SERT-单抗络合物上清液并通过荧光检测用大小排阻色谱（FSEC）8分析。弃沉淀。
    1. 使用含有TBS，0.4毫的运行缓冲液（510毫微米：480纳米，发射激励）上用装有荧光检测器的高效液相色谱（HPLC）系统0.5毫升/分钟的尺寸排阻柱运行100μL的上清月桂麦芽糖新戊二醇，和1μM的小号 -citalopram。形成复合物的抗体将导致GFP融合蛋白洗脱比从大小排阻柱的自由转运早。
    2. 稀释物至10，1，为0.1nM在200微升TBS用1mM C12M，0.2mM的CHS，和1μM的小号 -citalopram并重新运行FSEC。抗体可仍处于较低纳摩尔浓度的转运高峰后移是高亲和力的粘合剂和良好的候选人结构研究。
  3. 在1毫米羟色胺的存在复试约束力的FSEC。特异性识别所述SSRI结合构象的抗体不会在底物的存在结合。无论本配体，其识别一个三维表位不为构象的结果而改变的抗体将结合。
  4. 混合抗体的成对的不同的组合和由FSEC测试结合。能识别不同的表位的抗体将导致相比于单个抗体结合组合在一起SERT的较早洗脱。
  5. 对于初始结构研究中，选择识别3D表位的最高亲和力的抗体。

7.在昆虫细胞中的表达抗体片段

  1. 晶圆厂的克隆变量，恒定区通过PCR将在使用标准协议昆虫细胞表达昆虫表达系统。
  2. 转染1×10 6 Sf9细胞用5微克杆粒DNA与一个GP67分泌序列编码8-His标记的8B6的Fab的轻链和重链（按照第3.4节）。
  3. 收获P1病毒96小时转染后，在1×10 6个细胞/ mL的密度在一个2升烧瓶中添加P1病毒的500μL到1升Sf9细胞，以使P 2病毒。感染细胞在27℃96小时。
  4. 嘉实P2病毒（按3.6节）。
  5. 3×10 6个细胞/毫升的2 P2病毒，典型地40的MOI - -每瓶50毫升用1L Sf9细胞在每2升烧瓶中的2的密度感染6升Sf9细胞的。
  6. 收获细胞大约96小时感染后。以50mM的对细胞和自旋的终浓度加入50毫升磷酸盐缓冲液，pH 8中的4000 xg离心20分钟。丢弃通过0.2微米的过滤器的切向流细胞的细胞沉淀并过滤上清液。如果所需的3-天 - 在4℃下进行2收集上清液并储存。

  1. 集中使用30kDa的分子量截止（MWCO）的切向流细胞的Sf9上清液至大约400 - 800毫升。
  2. 以10mM和10mL His-标签亲和树脂的终浓度添加咪唑，pH为8。搅拌烧杯中，在4℃下1小时。
  3. 在2000×g离心5分钟，收集通过离心His标签亲和树脂。弃上清。
  4. 包His-标签亲和树脂成一列，并连接到FPLC。
  5. 在含有50mM磷酸盐pH为8，150 mM氯化钠，25 mM咪唑的66毫升（6.6倍柱体积）2毫升/分钟洗涤His标签亲和树脂。
  6. 洗脱8B6的Fab 33毫升50 mM磷酸盐pH值为8，150毫米氯化钠，250毫米咪唑。收集1毫升分数。
  7. 稀释纯化的Fab的亲和力与冰冷的20mM乙酸盐，pH为5 10倍体积。
  8. 结合的Fab，使用蠕动泵以1mL /分钟的1毫升阳离子交换柱。
  9. 独立使用的Fab 30毫升林使用FPLC在20mM醋酸盐pH 5.5的 - （500毫0）的NaCl耳梯度。晶圆厂将洗脱截至〜300mM NaCl的一个单峰。
  10. 关于使用含100mM DTT的样本缓冲液中的12.5％SDS-PAGE凝胶分析。的8B6的Fab的重链和轻链将在27和25 kDa的分别运行，在还原SDS-PAGE凝胶。
  11. 含有的Fab池级分，浓缩至至少10 - 15毫克/毫升使用吊桶式离心机30 kDa的MWCO蛋白浓缩以3,000×g的。
  12. 通过加入1M的Tris pH值8至在4℃纯化的Fab长期的50mM的终浓度，并存储调整至pH 8。总收益将是25 - 30毫克。在280nm处1.4 AU的吸光率等于1毫克/ 8B6的Fab中的溶液。

9.形成运输车 - 抗体复合物和分离通过尺寸排阻色谱

  1. 对于结晶，提纯由链球菌亲和层析SERT CC在C12M如前所述（第4节）。
  2. 在一个体积小于500微升1.2：混合用的Fab浓缩SERT以1:1的摩尔比。离心机在4℃下100000×g离心20分钟。收集含SERT-Fab复合上清。丢弃沉淀。
  3. 通过在TBS平衡尺寸排阻柱使用FPLC大小排阻色谱（SEC）分离补充有40mM的正辛基β-D-麦芽糖苷（C8M），0.5毫CHS，5％甘油，25μM的脂质（同在步骤4.5）中，在0.5毫升/分钟1μM的小号 -citalopram。
  4. 收集0.5毫升的级分，并在4个分析 - 15％SDS-PAGE凝胶，以及由通过SEC色氨酸荧光。 GFP标记SERT将在SDS-PAGE凝胶上运行在约80kDa。除去末端的和N-连接的糖后它将作为一个45 kDa蛋白运行。
  5. DETErmine其馏份汇集仅作为判断馏分分析色氨酸荧光SEC这是单分散的分数结合起来（励磁：280，发射：335纳米）。
  6. 商店纯化的SERT-8B6复合体在4℃下长达1周。

10.悬滴运输车 - 抗体复合物的结晶

  1. 结晶前，集中使用100kDa的MWCO离心蛋白浓缩从SERT-8B6复合物的SEC分离为2毫克/毫升的峰值馏分。在280nm 2 AU的吸光率等于1毫克/毫升。
  2. 添加其他晶圆厂在比例为1：0.05复杂：无晶圆厂。加入10μM免费S -citalopram。
  3. 离心机在4℃下100000×g离心20分钟。收集含SERT-Fab复合上清。丢弃沉淀。
  4. 根据表1在4℃设立了悬滴24井屏幕。过水库的解决方案拓展衍射晶体质量含有100mM的Tris-氢氧化钠，pH为8.5，25 - 125毫米氯化钾，32.5 - 34％的PEG 400，和0.5％6-氨基己酸。
    注意：使用的Tris用NaOH调节至pH 8.5作为缓冲。不要使用Tris碱用HCl调整。屏幕可能会在2毫升试管中制备和使用直到完成。注意要使用正位移移液管，因为它是非常粘稠准确量取PEG 400！
    1. 吸移管500微升在施加到各孔用密封剂低轮廓24孔板每个储存溶液。吸取1.5，1.75，和SERT-8B6复杂到18毫米硅化玻璃盖玻片2μL。吸管1微升的蛋白质样品的顶部贮存溶液。
      注：将板与已施加到孔的边缘密封胶购买。
    2. 适用盖滑动到24孔朝向贮存溶液的液滴和通过按盖玻片上密封剂预先涂到每个孔立即密封。
    3. 直到所有24井已成立。 离开成品板中，在4℃的良好的绝缘室。请勿打扰板的至少3天
      注：单晶将会出现在大约3天，后14天增长到100-175微米。
  5. 在cryoloops收获晶体和之前的X射线衍射数据收集直接闪凉爽液体N 2。
  6. 如果有必要，找到悬滴通过广泛筛选附加结晶条件。使用三滴与蛋白质：2沉淀比率：1，1.5：1，1：1。如果机器人可用，则建立100-150 NL滴70微升的储库溶液在96孔板中。大型3D晶体可以在24井生长。
  7. 根据液滴的外观评分：0，清晰; 1，灰尘; 2，颗粒状沉淀物; 3，相分离; 4，微晶; 5，针; 6，板材; 7，三维晶体。
  8. 通过悬挂在24口井drop方法周围新发现的COND上述设置结晶itions。

Representative Results

在SERT TC背景的单点突变体库的建立是为了屏幕thermostabilizing突变。使用标准的诱变产生的变异个体。筛选协议利用瞬时转HEK293S细胞和基于接近闪烁热稳定性屏幕迅速身份进行结晶有用的突变如在图1A中所述。绘制的Tm值与结合的[3 H]西酞普兰在RT揭示具有适当高的热稳定性和表达水平构建蛋白质纯化（ 图1B）。三突变体（Y110A，I291A和T439S）合并以产生高度稳定的构建体（ 图1C）。热稳定性也与在必要的SERT-Fab复合的结晶化短链洗涤剂稳定性增加相关。

利用杆状病毒-TR人类SERT的大规模表达ansduced HEK293S GnTI -细胞可以少于2周，并且能够产生毫克量，如在图2A中示出。的GFP标记SERT CC蛋白的使用允许SERT通过荧光（ 图2B）的表达和纯化过程中方便地遵循。我们的纯化策略涉及1）SERT的增溶从HEK293S GnTI结合至S -citalopram -细胞C12M在CHS的存在作为稳定脂质; 2）SERT到链球菌亲和基质结合; 3）去除充分洗涤污染的蛋白质;和4）用含有缓冲液脱硫生物素（ 图2C）的官能SERT的溶出。洗脱的蛋白是基本上免费通过考马斯蓝染色等可检测的蛋白质和单分散由FSEC（ 图2D，E），来判断。

类似的策略被送往净化SERT与用于reconstitutio链球菌II标签n和免疫（ 图3A，B）。 SERT掺入脂酶提高SERT的血清半衰期和稳定性，并改善高亲和力抗体的隔离的可能性。此外，包含脂质A的，细菌的细胞壁的组分，用作有效的佐剂9。多层脂质体通过加入缓冲到玻璃试管中干燥的脂质混合物的制备和再悬浮于缓冲液中。通过200纳米孔径的过滤器脂质体的挤压产生单分散的单层脂质体悬浮液。脂质体，然后用洗涤剂随后在洗涤剂中加入纯化的SERT的饱和。洗涤剂混合物：最后，洗涤剂通过加入疏水性吸附树脂到脂质的除去。附加配位体应添加到重构的样本选择为识别的抗抑郁剂结合的构象的抗体。 SERT在脂蛋白存在应予以确认增溶用SDS-PAGE加样染料或C12M少量样品和在SDS-PAGE和FSEC（ 图3C，D）的运行。

表达SERT抗体的杂交瘤细胞系可筛选能识别三维表位的高亲和力结合物。这些性能对结晶的最终成功是至关重要的，因为抗体必须保持牢固地结合到结构化区域，以促进均匀，良好有序的域的晶体堆积。在第一步骤中，其识别非结构化区的抗体进行识别。 SERT变性并印迹到硝酸纤维素膜;它结合变性SERT抗体将成为西部阳性，有可能识别线性表位。在图4A中，我们显示抗体2其例子是西方阳性且可能不会有用，以促进crystallogenesis。在图4B中，剩余的西部阴性抗体孵育用100nM SERT-GFP和分隔FSEC。其结合SERT将GFP阳性峰转移至先前位置的抗体。的SERT - 抗体复合物可以在洗涤剂进一步稀释以确定它们是否可以与纳摩尔亲和力接着分析由FSEC结合。在转运的构象变化，从而抗体的血清素的结果的加法可以再次筛选以确定它们是否能特异性识别SSRI结合构象。在图4C中 ，抗体显示结合SERT在血清素的存在，显示出表位不脱离SSRI改变到衬底束缚态。最后，在图4D的抗体的组合被用于其结合不同的表位，从而产生一个进一步左移的能力。这里15B8或8A11抗体识别的表位是从8B6不同。

所述8B6抗体是基于用木瓜蛋白酶TREA初步结晶筛选选择用于进一步的结构分析特德晶圆厂。的8B6的Fab的基因被克隆到昆虫细胞表达载体。晶圆厂能够表达和从Sf9细胞悬浮生长分泌。的8B6的Fab可以从的Sf9细胞上清液通过His标签的亲和力（ 图5A，B）和得到的在其中出现自由在SDS-PAGE凝胶上的污染物的蛋白质的阳离子交换色谱法（ 图5C，D）的纯化。在图5E中，重组8B6的Fab被示出为结合SERT，并在随后的生化和生物物理实验时使用。

亲和纯化的SERT CC被消化凝血酶和EndoH的并与8B6的Fab混合以形成S中-citalopram的存在的复合物。转运-抗体复合物，然后通过SEC在C8M（ 图6A）分离，并且将峰值馏分同时包含SERT和Fab所示通过SDS-PAGE（ 图6B）。 C8M的使用结晶形成可能是因为关键短链洗涤剂允许在晶格分子之间更好的包装。 FSEC被用来确定哪个级分应该合并用于结晶（ 图6C）;馏分哪些不是单分散和/或含有大量游离SERT或Fab的不应该结合。

棱柱形SERT抗体晶体可以S中-citalopram的存在下，通过悬滴蒸气扩散（ 图7A）使用该协议来生长。所生成的晶体衍射X射线，以3.15 10（ 图7B）的分辨率。

图1
图1：闪烁亲近基于热稳定性测定 采用 。协议用于在[3 H]西酞普兰。B存在下筛选热稳定性概述。最大约束[3 （Tm）。虚线表示的WT转运值。 3最耐热的突变体标记。灰色区域表示具有的[3 H]西酞普兰结合相对于WT和因而不准确的Tm值低于10％的突变体由于低信号对噪声。℃。对WT SERT TC和前3个突变体的热稳定性曲线。误差线表示标准偏差（SD）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2：哺乳动物异源蛋白表达的概述 。在HEK293S GnTI BacMam病毒的产生和SERT的表达图式概述-小区B。他K293S GnTI -表达SERT CC（绿色荧光）C细胞。上链球菌亲和树脂的SERT CC的洗脱图。绿色迹线表示脱硫生物素的浓度，0 - 100％（0 - 5毫米）D。分析4亲和纯化的SERT 的CC - 15％SDS-PAGE凝胶即 。通过GFP荧光检测亲和纯化SERT CC的FSEC（激发：480纳米;发射：510纳米）。高峰在15毫升洗脱是SERT（＃）和18毫升是免费的GFP（*）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3：在SERT IC A 的代表亲和纯化和重组 。抗体产生的示意图。 <强>乙。洗脱曲线在SERT 的IC上链球菌亲和树脂的亲和纯化的280nm处观察到。绿色迹线表示脱硫生物素的浓度，0 - 100％。（0 - 5毫米）℃。纯化，并在4重构SERT亲和力的分析- 15％SDS-PAGE凝胶ð。以下重建溶解SERT的FSEC。用色氨酸残基的荧光检测SERT（激发：280纳米;发射：335纳米）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4：代表SERT抗体的分析 的 。 Western blot检测抗体的筛选。约1微克有或没有GFP SERT 的CC被加到4 - 15％SDS-PAGE凝胶并印迹到硝酸纤维素膜上。结合使用缀合到IR染料山羊抗小鼠抗体检测。 2G4和10F2是西方积极的; B。抗体由FSEC 100纳米GFP标记SERT和检测的结合使用GFP荧光检测温度 。选定的Fab结合于100nM的GFP标记的SERT在1mM的血清素。D的存在。 8A11或15B8 Fab的结合SERT-8B6晶圆厂。小峰在18毫升洗脱是免费的GFP。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5：从昆虫细胞的8B6的Fab代表 一个 净化。洗脱分布在8B6的Fab的纯化的280纳米His标签的亲和力chromatograp观察 HY。绿色迹线表示的咪唑的浓度，0 - 50％（0 - 250毫摩尔） 乙 。非还原和His标签亲和纯化后还原SDS-PAGE凝胶。它运行邻近50 kDa蛋白是非还原的Fab（＃），并在25 kDa的被减小的Fab（*）。C小调物种。洗脱曲线在8B6的Fab的纯化的280纳米通过显示该线性氯化钠梯度下洗脱的单个对称峰阳离子交换观察。绿色迹线表示NaCl浓度，0 - 100％。（0 - 500毫）D。以下通过阳离子交换的E纯化在12.5％SDS-PAGE凝胶的8B6的Fab的分析。在8B6的Fab结合纳米10 GFP标记的SERT，利用GFP的荧光检测。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：S中的存在的-citalopram A 中的SERT-8B6复杂的代表凝胶过滤层析 。纯化SERT-8B6复杂的凝胶过滤洗脱图。主峰为11.5毫升洗脱是SERT-8B6复杂。峰15 - 17毫升含有绿色荧光蛋白和Fab 湾 。分析在4纯化的SERT-8B6络合物 - 15％SDS-PAGE凝胶。 SERT和Fab重链和轻链的位置由一个破折号，C中所示。尺寸分离级分的FSEC。利用色氨酸荧光检测SERT-8B6复合物。部分17包含没有用复杂的Fab SERT的用量较大。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7 图7：在SERT-8B6复杂绑定至S -citalopram A 的结晶 。 2周增长后的SERT-8B6复杂的平行六面体状晶体的光镜。比例尺等于200微米; B。 SERT-8B6晶体衍射X射线到3.15埃。蓝环代表3.15埃。 请点击此处查看该图的放大版本。

表 1：结晶屏幕为SERT-8B6复杂绑定至 S -citalopram 请点击这里下载此表。

Discussion

由生物物理技术膜蛋白结构的测定仍然是许多医学显著转运，受体和通道11是一项艰巨的任务。我们在下面分享了约束向S -citalopram人血清素转运蛋白的结构测定制定了详细的专业知识。我们预计，这些方法将是决定在其他构象状态以及其他困难的膜蛋白的结构SERT的结构非常有用。此外，这里所描述的生物化学技术也可以用来研究在洗涤剂纯化SERT和近天然脂质环境的功能。

SERT结晶铰接后的多种工具和技术的发展。首先，在转运热稳定性的改善产生SERT变体是乖巧的继起膜6转运提取各种洗涤剂胶束。二，使用在整个纯化和结晶的高亲和力配体小号 -citalopram进一步改善的稳定性和降低的构象的异质性。第三，允许生产的2周短时间内大量SERT的BacMam表达系统7，促进两个免疫和结晶的发展。最后，发展战略，以选择识别允许的8B6抗体的发现促进SERT抗体复合物秩序井然包装成晶体的3D表位的高亲和力的抗体。

有许多的这往往在整个协议发生的关键步骤和试剂，以及常见的问题。第一，高滴度SERT P2病毒的产生可能是有问题。加入低浓度的P 1病毒的如在本协议中所述生成的P2病毒通常减轻此问题，并在那里在P2病毒滴度是低的情况下，P3病毒可制成全光照G病毒在0.0001的MOI。用滴度小于1×10 8个病毒颗粒的病毒/ mL的不应使用，并且几乎总是导致低蛋白产量。对于表达，HEK293S GnTI -细胞被选择，因为它们缺乏Ñ-acetylglucosaminyltransferase我活性，因此不能合成复合N- -glycans，代替只生产高甘露糖Ñ-glycans。 EndoH的裂解ñ -连接高甘露聚糖的糖基化在胞外环2（EL2）两个网站，留下附着于天冬酰胺的N -acetylglucosamine。 氮消化-连接的糖减少EL2的表面熵这对结晶有可能很重要。对于抗体的产生，所述SERT 集成电路应用于免疫。 GFP是高度免疫原性的12和不应该被用作融合标记来产生抗体，因为它是难以完全通过SEC除去。 SERT的柔性N-和C-末端也没有包含在构建体中，以避免对这些区的抗体。小鼠可以重新构成蛋白质的30微克进行免疫;继续免疫小鼠直到抗体的高血清浓度可以被检测和产生杂交瘤细胞如所述13。一个thermostabilized结构通常是用于免疫接种的最佳选择;如果转运性能良好，并且保留在纯化生物活性，这往往是足以提高抗体。该8B6抗体产生抗WT SERT。结晶，从SEC含有单分散复杂的由FSEC作为判断只有峰值部分应该合并，浓缩。 SERT-8B6晶体生长在一个窄的范围内的条件，并有许多的应采取解决具体涉及SERT晶体生长问题的步骤。 Tris碱用HCl调节不应在贮存溶液中使用，因为这种缓冲器不支持晶体生长;因此它是CRI蒂卡尔改用的Tris用NaOH调节。 SERT晶体生长在聚乙二醇400的窄的浓度范围内，因此，如果晶体不生长或如果观察到许多小晶体，即使在PEG 400浓度的小的增加或减少会被告知。此外，该添加剂6-氨基己酸也被在优化屏幕用于改善成核。的蛋白质的降低率：井溶液也是一个关键的决定因素为晶体生长。降的1.5比 - 2：1，建议，与降比率更接近2:1通常支持较大的三维晶体的生长。最后，使用低轮廓24孔板的也是朝向晶体增长的关键，这大概是由于蒸汽扩散的速率的修饰。

该SPA方法的另一种方法已经发展到屏幕的量稳定的大鼠血清素转运中使用的过滤器结合试验5可卡因结合构象突变。与此相反，对SPA巴SED法允许通过测定SERT的这仍结合配体部分的顺序如下加热步骤。从而，这允许从一个小数目的样本的快速测定熔融温度。 SPA的方法依赖于放射性标记的高亲和性配体的可用性，如果没有配位体是已知的具有亚微摩尔的亲和力结合然后一种替代方法将是必要的。许多其它方法通常用于测量蛋白质稳定性的诸如荧光染料和量热14的结合，但是低通量，均无法直接测量功能或需要大量的蛋白质。如果不能使用了SPA方法，一个可替换的高通量的方法是一种基于FSEC-热稳定性试验15（FSEC-TS），其中样品被加热之后剩余转运的级分的分离。 FSEC-TS是访问色谱行为和低聚状态的有用的方法，是APowerful互补工具，它可以沿着SPA的方法中。

各种常用的蛋白质表达系统的比较也被发现有利于对SERT表达16使用哺乳动物细胞和勿庸置疑，这是有可能为哺乳动物来源的许多蛋白质的情况。我们已经用于表达的方法已被定制为SERT但有可能易于适应。这有利于高水平的表达条件应通过改变表达，温度，病毒浓度和存在的组蛋白脱乙酰酶抑制剂的时候，如丁酸钠仔细鉴别。

我们一般倾向于在温和的长链洗涤剂亲和纯化如C12M连同CHS以复溶之前保留高亲和力配体结合。使用疏水性的吸收重建是一种温和的技术，该技术我们已经发现是有效的几个其他转运和受体。如果这不成功，透析，稀释，或者SEC除去具有高临界胶束浓度洗涤剂可使用17提供的抗原是在这类洗涤剂充分稳定。在没有合适的抗体被发现的情况下，我们几乎总能找到问题是由于功能或抗原变性损失在这种情况下，我们成功地执行新的免疫接种要特别注意蛋白质生物化学。最后，这与高亲和力结合的配体和抗体应当形成用于合理规划结晶实验的基础，并通过采取热变体的优点，人们可以通过改变不同洗涤剂的属性屏幕的条件范围更广。此外，在脂质中间相18结晶或使用bicelles 19应该总是被视为在微胶粒的替代结晶。

这些原理和方法可与一些modifi使用阳离子为许多其他跨膜蛋白这是难以表达，并从其他表达宿主纯化和将成为的高亲和性的药物靶的结构测定是特别有用的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DH10Bac Invitrogen 10361-012
Kanamycin Fisher BP906-5
Gentamicin Fisher BP918-1
Tetracycline Sigma T-7660
Bluo-gal Invitrogen 15519-028 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside
Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside Anatrace I1003 IPTG
Miniprep kit Qiagen 27106
Cellfectin II Invitrogen 10362-100 Sf9 transfection reagent
Sf9 ATCC CRL-1711
Sf-900 III SFM media Life Technologies 12658-027
HEK-293S GnTI- ATCC CRL-3022
Freestyle 293 media Life Technologies 12338-018 293 expression media
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 0984018DJ
Sodium butyrate Sigma 303410
S-citalopram Sigma E4786 Anagrade
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside Anatrace D310
Cholesteryl hemmisuccinate Sigma C6013
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol Avanti Polar Lipids 840457P
Leupeptin Sigma L2884
Pepstatin A Sigma P5318
Aprotinin Sigma A1153
PMSF Sigma P7626
Desthiobiotin Iba Life Sciences 2-1000-05
Asolectin Sigma 11145
Cholesterol Sigma C-8667
Lipid A Sigma L5399
Brain polar lipid Avanti Polar Lipids 141101C
Biobeads Biorad 152-3920 Hydrophobic absorption resin
Goat anti-mouse IRDye 680RD Odyssey 926-68070 Used as secondary antibody for western blotting
Lauryl maltose neopentyl glycol Anatrace NG310 Anagrade
Serotonin Sigma H9523
pFastBac 8B6 Available from authors
pEG Bacmam SERT Strep II SERTIC, Available from authors
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His SERTTC, Available from authors
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His SERTCC, Available from authors
Imidazole Sigma 56749
n-Octyl β-D-maltoside Anatrace O310 Anagrade
Thrombin Haematologic Technologies HCT-0020
EndoH New England Biolabs P0702
Trizma-HCl Sigma T5941 Tris is used for preparation of crystallization reservoirs
PEG 400 Sigma 91893
6-aminohexanoic acid Sigma 7260
Trypsin-EDTA Fisher MT25052CV
Isoplate-96 TC PerkinElmer 6005070
PolyJet SignaGen SL100688 Polymer transfection reagent for mamalian cells
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads PerkinElmer RPNQ0096 His-tag affinity SPA beads
Citalopram, [N-Methyl-3H] PerkinElmer NET1039250UC
ThermoMixer C Eppendorf 5382000023 heating block for thermostability assay
ThermoTop Eppendorf 5308000003
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates Eppendorf 5306000006
0.2 µm syringe filter Olympus Plastics 25-243
1 L filter system Corning 430517
2 L flat bottom tissue culture flask Genemate F-5909-2000
2 L baffled tissue culture flask Genemate F-5909-2000B
CO2 incubator Thermo Scientific 3950
Forma Orbital Shaker Thermo Scientific 416
Strep-Tactin resin Iba Life Sciences 2-1208-025 Strep affinity resin
Extruder Northern Lipids
Li-Cor imaging system Odyssey western blot imaging system
XK16 column GE Healthcare 28-9889-37 column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton
100 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC910096
30 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC903024
Äkta FPLC GE Healthcare UPC-900
HPLC Shimadzu 51476
Superose 6 (10/300) column GE Healthcare 17-5172-01 Used for FSEC
Tangential flow apparatus Pall Filtron
0.2 µm filter tangential flow cell Pall Filtron PSM20C11
30 kDa MWCO tangential flow concentrator Pall Filtron OS030T12
Talon resin Clonetech 635504 His-tag affinity resin used for Fab purification
1 mL HiTrap SP column GE Healthcare 17115101 Cation exchanger used for Fab purification
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17-5175-01 Used for SEC separation of SERT-8B6
24-well VDXm plate Hampton Research HR3-306
18 mm coverslips Hampton Research HR3-239
Virocyt virus counter Virocyt 2100
MicroBeta Trilux PerkinElmer 1450 96-well scintillation counter
HiTrap SP column GE Healthcare 17115101
Sertraline Sigma S6319

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References

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Tags

生物化学，117期，结构生物学，结晶，膜蛋白，抗体，免疫，重建，羟色胺转运，神经递质，抗抑郁药，选择性血清素再摄取抑制剂，热稳定性
热稳定，表达，纯化，和人类血清素转运蛋白结晶绑定到<em&gt;取值</em&gt; -citalopram
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Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J. Vis. Exp. (117), e54792, doi:10.3791/54792 (2016).

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