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Biochemistry

Thermostabilization, अभिव्यक्ति, शोधन, और मानव सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर के क्रिस्टलीकरण के लिए बाध्य Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/54792
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Vollum Institute, Oregon Health & Science University, 2Graduate Group in Biophysics, University of California, San Francisco, 3Howard Hughes Medical Institute, Oregon Health & Science University

Summary

इस पांडुलिपि का वर्णन करता है, म्यूटेशन thermostabilizing के लिए स्क्रीन कैसे करने के लिए मानव सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर को शुद्ध उच्च संबंध एंटीबॉडी पैदा करते हैं, और सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर एंटीबॉडी जटिल एंटी दवा एस -citalopram के लिए बाध्य मणिभ। इस प्रोटोकॉल अन्य चुनौतीपूर्ण झिल्ली ट्रांसपोर्टरों, रिसेप्टर्स, और चैनल के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर एक सोडियम और क्लोराइड युग्मित ट्रांसपोर्टर है कि "पंप" कोशिकाओं में बाह्य सेरोटोनिन है। एस -citalopram उच्च आत्मीयता के साथ सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर के लिए बाध्य, सेरोटोनिन अवरोध अवरुद्ध करके अवसाद और चिंता के इलाज के लिए इस्तेमाल एक दवा है। यहाँ हम एक कुशल प्रक्रिया और उपकरण, स्थिर करने के लिए एक्सप्रेस, शुद्ध, और सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर-प्रतिरक्षी परिसरों एस -citalopram और अन्य अवसादरोधी दवाओं के लिए बाध्य मणिभ का एक सेट की रिपोर्ट। म्यूटेशन जो सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर को स्थिर एक एस -citalopram बाध्यकारी परख का उपयोग पहचान की गई। सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर में baculovirus-transduced HEK293S GnTI व्यक्त - कोशिकाओं, proteoliposomes में पुनर्गठन और उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हम एंटीबॉडी कि संरचनात्मक अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं खोज करने के लिए एक रणनीति विकसित किया है। Sf9 कोशिकाओं में एंटीबॉडी अंशों की अभिव्यक्ति के लिए एक स्पष्ट दृष्टिकोण भी स्थापित किया गया है।ट्रांसपोर्टर-प्रतिरक्षी परिसरों इस प्रक्रिया का उपयोग कर शुद्ध अच्छी तरह से व्यवहार और आसानी से मणिभ, कि 3-4 एक प्रस्ताव को टुकड़े एक्स रे एस -citalopram साथ परिसरों का निर्माण कर रहे हैं। रणनीतियों यहाँ विकसित अन्य चुनौतीपूर्ण झिल्ली प्रोटीन की संरचना निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर (SERT) एक अभिन्न झिल्ली प्रोटीन है कि सेलुलर झिल्ली 1 भर में सेरोटोनिन के परिवहन की सुविधा है। SERT स्नायुसंचारी सोडियम Symporters (NSSs) जो भी डोपामाइन और norepinephrine ट्रांसपोर्टरों 2 शामिल है के एक परिवार के अंतर्गत आता है। SERT व्यापक रूप से निर्धारित एंटी और विरोधी चिंता दवाओं जो प्रतिस्पर्धात्मक रूप सेरोटोनिन परिवहन 3 को बाधित करने के लिए अधिनियम की आणविक लक्ष्य है। SERT synaptic फांक से न्यूरोट्रांसमीटर दूर करने के लिए सोडियम की उर्जा अनुकूल cotransport कारनामे। Serotonergic प्रणाली के व्यापक लक्षण वर्णन से पता चला है कि सेरोटोनिन चयापचय में परिवर्तन लगभग मूड, नींद, दर्द, अनुभूति सहित सभी मस्तिष्क संबंधी प्रक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए दिखाई देते हैं, और आक्रामकता 4 व्यवहार। SERT समारोह एस -citalopram, जैसे antidepressants और चयनात्मक serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) के उपयोग के माध्यम के रूप में अच्छी तरह से psychostimula द्वारा संशोधित किया जा सकताएनटीएस और एम्फेटामाइन और 3,4-methylenedioxy- एन -methylamphetamine या "परमानंद" 1,2 के रूप में की लत की दवाओं।

SSRIs मूड विकारों के उपचार के लिए काफी महत्वपूर्ण हैं, अभी तक उनकी कार्रवाई के लिए सटीक संरचनात्मक आधार अच्छी तरह से समझ नहीं है। गुम्मट SERT इस प्रकार SERT 5,6 की एक तीन आयामी (3 डी) संरचना की दिशा में प्रगति में बाधा, डिटर्जेंट micelles में अस्थिर है। हाल ही में, हम जो मजबूती के साथ डिटर्जेंट की एक विस्तृत श्रृंखला में स्थिर रहे हैं और बाध्यकारी गतिविधि 6 SSRI बनाए रखने SERT के वेरिएंट विकसित की है। ये थर्मास्टाइबल SERT वेरिएंट एक जगमगाहट निकटता आधारित thermostability परख का उपयोग कर चयन किया गया था। यहाँ हम एंटीबॉडी और एस -citalopram के साथ परिसर में उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी जो SERT बाध्य कर सकते हैं की पीढ़ी के लिए एक प्रक्रिया है, और शुद्धि और थर्मास्टाइबल SERT के क्रिस्टलीकरण का वर्णन है,।

इस प्रोटोकॉल मानता है कि SERT और 8B6 जीन सफल किया गया हैY क्रमश BacMam 7 और कीट अभिव्यक्ति वैक्टर में क्लोन। एंटीबॉडी उत्पन्न करने के लिए, सीडीएनए एन्कोडिंग अवशेषों गुम्मट SERT की 73-616 एक सी टर्मिनल Strep द्वितीय टैग (SERT आईसी) के साथ BacMam वेक्टर में क्लोन किया गया था। Thermostability स्क्रीन के लिए, SERT अवशेषों सी टर्मिनल GFP के साथ 73-616, strep द्वितीय, और 10-उनका टैग (SERT टीसी) का इस्तेमाल किया गया था। व्यक्तिगत बिंदु उत्परिवर्तन SERT टीसी पृष्ठभूमि में उत्पन्न किया गया। क्रिस्टलीकरण प्रोटोकॉल के लिए, SERT-GFP संलयन प्रोटीन के साथ ट्विन-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] और 10-उनका टैग इस्तेमाल किया गया था, थर्मास्टाइबल म्यूटेंट, Y110A, I291A, और T439S और सतह cysteines C554A, C580A के म्यूटेशन को ले जाने और C622A (SERT सीसी)। थ्रोम्बिन दरार दृश्यों (LVPRGS) भी Q76 और T618 के बाद SERT सीसी में डाला गया एन के हटाने और सी-Termini की अनुमति है। प्लाज्मिड 8B6 फैब एन्कोडिंग दोनों भारी और हल्के व्यक्त करने के लिए इंजीनियर थादो अलग-अलग polyhedrin प्रमोटरों के नियंत्रण में GP67 स्राव दृश्यों के साथ एंटीबॉडी की जंजीरों। 8B6 एंटीबॉडी की भारी श्रृंखला के सी टर्मिनस एक 8 उनकी टैग के साथ टैग किया गया था और एक थ्रोम्बिन दरार साइट भारी श्रृंखला और टैग के बीच डाला गया था।

Protocol

1. पक्षपाती HEK293S GnTI के अभिकर्मक - thermostability स्क्रीन के लिए प्रकोष्ठों

  1. तैयार पाली-डी lysine (पीडीएल) 96 अच्छी तरह प्लेटें लिपटे। एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में सभी काम करते हैं।
    1. की एक 25 माइक्रोग्राम / एमएल समाधान (पीडीएल), आणविक वजन 70,000-150,000 दा फिल्टर, एक 0.2 माइक्रोन बाँझ फिल्टर का उपयोग कर। पीडीएल के 50 μL एक 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर (टीसी) थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें, यह सुनिश्चित करने के तल में समान रूप से लेपित है, और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
    2. महाप्राण पीडीएल समाधान और बाँझ पानी के 200 μL से धो लें।
    3. अनुमति दें प्लेट 2 घंटे 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए पहले के लिए शुष्क हवा। पीडीएल लिपटे प्लेटों कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. पक्षपाती HEK293S कोशिकाओं के trypsinization।
    1. 8% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा एक 10 सेमी डिश में 80% confluency को HEK293S आगे बढ़ें। एक एकल 10 सेमी पकवान लगभग 10 लाख HEK293S कोशिकाओं होनी चाहिए। 30 मार्ग के बाद कोशिकाओं का उपयोग न करें! महाप्राण मीडिया और फॉस्फेट बफर खारा के 5 एमएल (पीबीएस) से धो लें। Trypsin-EDTA समाधान (0.25% trypsin, 0.02% EDTA) के 1 एमएल कोशिकाओं को जोड़ने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. बार-बार ऊपर pipetting द्वारा और एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर नीचे Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और resuspend कोशिकाओं के साथ पूरक के 10 एमएल जोड़ें।
    3. पिपेट कोशिकाओं के 10 μL और 10 Trypan की μL ब्लू समाधान (0.4%) के साथ मिश्रण। एक hemocytometer और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग सेल घनत्व का निर्धारण करते हैं। कोशिकाओं है कि नीले रंग के दाग रहे हैं के रूप में वे मर चुके हैं भरोसा नहीं है। सुनिश्चित करें कि सेल व्यवहार्यता 90% से ऊपर है।
  3. अच्छी तरह से trypsinized resuspend HEK293S GnTI - DMEM में कोशिकाओं को एक डिस्पोजेबल पिपेट जलाशय में 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व को 10% FBS के साथ पूरक। लगभग 5 लाख HEK293S कोशिकाओं को एक थाली के लिए आवश्यक हो जाएगा। 24 निर्माणों की कुल इस पीआर का उपयोग कर एक थाली पर ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकताotocol।
  4. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, एक पीडीएल लेपित थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं के 100 μL जोड़ें। एक थाली भरने के बाद पिपेट जलाशय में Resuspend कोशिकाओं कोशिकाओं का एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए। 8% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं लगभग 80% confluency तक पहुंच जाना चाहिए।
  5. 1 घंटे अभिकर्मक के लिए पहले मीडिया की जगह। अभिकर्मक के लिए डीएनए अभिकर्मक अभिकर्मक परिसरों तैयार करें।
    1. प्रत्येक SERT टीसी पृष्ठभूमि में निर्माण के लिए जांच की जा करने के लिए, सीरम मुक्त DMEM के 45 μL के साथ मिश्रण 450 एनजी डीएनए और मिश्रण। अभिकर्मक अभिकर्मक के 1.6 μL सीरम मुक्त DMEM के 45 μL जोड़ें और मिश्रण।
    2. इसके तत्काल बाद डीएनए समाधान के लिए पतला अभिकर्मक अभिकर्मक समाधान जोड़ने और मिश्रण। रिवर्स क्रम में समाधान मिश्रण नहीं है। 15 मिनट और 4 कुओं के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक / डीएनए मिश्रण के 20 μL जोड़ने - 10 रुको।
  6. एक बार सभी कुओं ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है, धीरे वापस एक कमाल द्वारा थाली मिश्रणएन डी आगे और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लौटने।
  7. के बाद 16 - 24 h DMEM युक्त सीरम और 10 मिमी सोडियम butyrate साथ मीडिया की जगह।
  8. लगभग 48 घंटे के बाद अभिकर्मक मीडिया को हटाने और या तो तुरंत बाद में प्रयोग की जाने वाली डिग्री सेल्सियस -80 में thermostability स्क्रीन के साथ आगे बढ़ना या कोशिकाओं फ्रीज। प्रकोष्ठों कई हफ्तों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

एस -citalopram साथ thermostability स्क्रीन 2. जगमगाहट निकटता आधारित

  1. आरटी पर 5 मिनट के लिए - (20 मिमी Tris, पीएच 8, 100 मिमी NaCl Tris-buffered खारा) टीबीएस के 25 μL में 200 एनएम एस -citalopram के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. जोड़कर कोशिकाओं solubilize 8 मिमी एन dodecyl-β-D-maltopyranoside (C12M), 1 मिमी cholesteryl hemmisuccinate (सीएचएस), protease अवरोध कॉकटेल (2 मिमी phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड (PMSF), 0.1 मिलीग्राम / एमएल aprotinin, 4 जी के 25 μL / एमएल pepstatin ए, और 4 माइक्रोग्राम / एमएल leupeptin) टीबीएस में, और आरटी पर 1 घंटे के लिए incubating।
  3. टीबीएस वाई के 50 μL जोड़ेवें 20 एनएम [3 एच] citalopram (81.7 सीआइ / mmol), 0.1% गोजातीय सीरम albumin, और 2 मिलीग्राम / एमएल उनकी टैग समानता जगमगाहट निकटता परख (एसपीए) प्रत्येक निर्माण के लिए तीन कुओं के लिए मोती। पिछले के लिए अच्छी तरह से सूचीबद्ध एक ही समाधान जोड़ सकते हैं लेकिन अविशिष्ट बाध्यकारी निर्धारित करने के लिए 100 माइक्रोन के sertraline के साथ पूरक। सुनिश्चित करें कि उनकी टैग आत्मीयता के स्पा मोती अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं जब 96 अच्छी तरह से थाली को जोड़ने।
  4. उपाय [3 एच] citalopram अच्छी तरह से प्रति एक 1 मिनट गिनती के समय के साथ आरटी पर एक 96 अच्छी तरह जगमगाहट काउंटर का उपयोग बाध्यकारी। गिनती प्लेटों जारी रखें जब तक कुल मायने रखता है (36 घंटे के बाद लगभग) पठार।
  5. 33 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म ढक्कन के साथ एक हीटिंग ब्लॉक में 15 मिनट के लिए गर्मी प्लेटें। उपाय 2.4 में वर्णित के रूप में [3 एच] citalopram हीटिंग के बाद फिर से बाध्यकारी।
  6. दोहराएँ 2.4 कदम - 2.5 और 36 डिग्री सेल्सियस, 39 डिग्री सेल्सियस, 45 डिग्री सेल्सियस, 48 डिग्री सेल्सियस, और 51 डिग्री सेल्सियस के लिए हीटिंग कदम बदल जाते हैं। स्पष्ट पिघलने के तापमान पर निर्भर करता है हीटिंग तापमान समायोजित (टीएम)लक्ष्य प्रोटीन और सबसे स्थिर निर्माण के thermostability की। प्लेटों गर्म करने के लिए जब तक सभी निर्माणों कम विशिष्ट मायने रखता है जारी रखें।
  7. टीएम मूल्यों का निर्धारण करने के लिए डेटा का विश्लेषण।
    1. प्रत्येक की औसत कुल मायने रखता प्रति मिनट (सीपीएम) निर्धारित कुओं कि 3 को दोहराने के कुओं के औसत से sertraline शामिल नहीं है के लिए निर्माण। एक ही थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त sertraline के सीपीएम के औसत से अविशिष्ट सीपीएम निर्धारित करते हैं।
    2. कुल सीपीएम से अविशिष्ट सीपीएम घटाकर द्वारा विशिष्ट सीपीएम की गणना।
    3. एक बोल्ट्जमान sigmoidal समारोह के लिए एक गैर रेखीय फिट द्वारा टीएम की गणना। आरटी पर कम विशिष्ट सीपीएम (<गुम्मट के 10%) के साथ निर्माणों आम तौर पर सही Tm मूल्यों की जरूरत नहीं है। सबसे थर्मास्टाइबल निर्माणों से उत्परिवर्तनों एक साथ संयुक्त और thermostability के लिए एक अतिरिक्त वृद्धि के लिए जांच की जा सकती है।

3. HEK293S GnTI में मानव सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर की अभिव्यक्ति

  1. प्लाज्मिड के 1 एनजी के साथ रासायनिक सक्षम DH10Bac कोशिकाओं को बदलने।
    1. DH10Bac कोशिकाओं के 50 μL के लिए प्लाज्मिड जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    2. 30 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी झटका DH10Bac कोशिकाओं। समाज माध्यम के 200 μL जोड़ें और झटकों के साथ 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. प्लेट एक Luria शोरबा (पौंड) 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन, 7 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन, 10 माइक्रोग्राम / एमएल टेट्रासाइक्लिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल 5 ब्रोमो-3-indolyl β-D-galactopyranoside युक्त थाली पर बैक्टीरिया के सभी, और 40 माइक्रोग्राम / एमएल isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)।
  2. पृथक lacZ - कालोनियों (सफेद कालोनियों) लेग अगर प्लेटों पर 2 डी के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से बढ़ी।
  3. लेग युक्त एंटीबायोटिक दवाओं के 5 एमएल में 37 डिग्री सेल्सियस पर कई कालोनियों हे / एन आगे बढ़ें और bacmid डीएनए अलग।
    1. नीचे 5 मिनट के लिए एक अपकेंद्रित्र में 1,000 XG पर बैक्टीरिया स्पिन। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। miniprep आर के 200 μL के साथ Resuspend बैक्टीरियाesuspension बफर।
    2. miniprep lysis बफर के 200 μL जोड़ने और धीरे ट्यूब inverting 10 बार से Lyse बैक्टीरिया। निराकरण बफर के 200 μL जोड़ें।
    3. एक अपकेंद्रित्र में 10 मिनट के लिए 14,000 XG पर कताई द्वारा अघुलनशील अंश निकालें। isopropanol सतह पर तैरनेवाला और ठंड के 1 एमएल -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के जोड़े डीएनए वेग करने के लिए।
    4. एक अपकेंद्रित्र में 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    5. धो डीएनए 70% EtOH के साथ गोली और 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर फिर से स्पिन। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। सभी EtOH जब तक हवा सूखी डीएनए सुखाया और पानी की 50 μL में resuspend गया है।
      नोट: Bacmid डीएनए तुरंत अच्छे परिणाम के लिए Sf9 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया जाना चाहिए, लेकिन यह भी कई हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  4. Transfect पक्षपाती Sf9 की 1x10 6 कोशिकाओं 6 अच्छी तरह से थाली में 27 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified कक्ष में उगाया में डीएनए bacmid। एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में सभी सेल संस्कृति जोड़तोड़ प्रदर्शन।
      <li> कोशिकाओं से मीडिया निकालें और ताजा Sf9 मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें। bacmid डीएनए के 5 माइक्रोग्राम Sf9 मीडिया के 100 μL (समाधान क) में जोड़े।
    1. एक cationic लिपिड Sf9 अभिकर्मक अभिकर्मक के 8 μL Sf9 मीडिया के 100 μL (समाधान बी) में जोड़े। 5 मिनट के लिए समाधान बी युक्त ट्यूब सेते हैं।
    2. समाधान बी के साथ ट्यूब युक्त समाधान मिश्रण है और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं और Sf9 कोशिकाओं को समाधान के सभी जोड़ सकते हैं।
    3. 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा 96 घंटे, फसल सतह पर तैरनेवाला (P1 वायरस) के बाद। P1 वायरस अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए भंडारित किया और जरूरत के रूप में p2 वायरस बनाने के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  5. Sf9 मीडिया में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर Sf9 कोशिकाओं के 1 एल 100 P1 वायरस की μL जोड़ें। 96 घंटे के लिए कोशिकाओं को संक्रमित, 100 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर 27 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ रहा है।
  6. नीचे 15 मिनट और फिल्टर 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से वायरस कणों से युक्त सतह पर तैरनेवाला के लिए 4000 XG पर एक अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं स्पिन। सेल गोली त्यागें। Determine वायरल घनत्व एक वायरल पट्टिका परख या एक वायरस काउंटर का उपयोग। वायरस घनत्व मिली लीटर प्रति> 1 एक्स 10 8 वायरस कणों होना चाहिए। P2 के वायरस अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और कई महीनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  7. 2 के (MOI) संक्रमण की बहुलता पर 293 अभिव्यक्ति 2% FBS के साथ पूरक मीडिया में 130 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन में बढ़ कोशिकाओं 7 8% सीओ 2 और 85% नमी के साथ - HEK293S GnTI के संक्रमित 10 एल और 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल, आमतौर पर 30 के घनत्व - एक 2 एल में प्रति कोशिकाओं की 800 एमएल p2 के वायरस के 50 एमएल कुप्पी चकित।
    नोट: यह HEK293S GnTI के बाद से p2 के वायरस के 80 से अधिक एमएल का उपयोग करने की सिफारिश नहीं है - पीएच में बदलाव के कारण कोशिकाओं को धीरे-धीरे बढ़ेगा और अलाभकारी बन सकता है। Sf9 मीडिया 293 अभिव्यक्ति मीडिया की तुलना में अधिक अम्लीय है।
  8. 12 - 16 घंटे के बाद संक्रमण, एक 1 एम स्टॉक से 10 मिमी की एकाग्रता के लिए सोडियम butyrate जोड़ें। 48 - 60 ज के बाद संक्रमण, centrifugation द्वारा फसल कोशिकाओं पर15 मिनट के लिए 4000 XG। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  9. टीबीएस की 150 एमएल में Resuspend कोशिकाओं, 2 माइक्रोन एस -citalopram या अन्य SERT अवरोधकों और -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान शुद्धि के लिए तैयार है जब तक।

टीकाकरण और क्रिस्टलीकरण के लिए सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर की 4. आत्मीयता शुद्धि

  1. तेजी से सजातीय जब तक एक 10 एमएल पिपेट माध्यम से गुजर से गर्म पानी (लगभग 30 डिग्री सेल्सियस) और resuspend में संस्कृति की 10 एल से कोशिकाओं पिघलना।
  2. 80 मिमी Tris, पीएच 8, 150 मिमी NaCl 40 मिमी C12M, 5 मिमी सीएचएस, युक्त और protease अवरोध कॉकटेल: solubilization (150 एमएल) के लिए डिटर्जेंट समाधान तैयार है।
  3. हलचल पट्टी के साथ एक बीकर कोशिकाओं के सभी जोड़े और जब तक सरगर्मी कोशिकाओं के लिए डिटर्जेंट समाधान के सभी जोड़ सकते हैं। सरगर्मी के साथ 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर solubilize।
  4. 8000 XG पर lysate स्पिन 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए। स्वच्छ ultracentrifuge ट्यूबों में गोली और छानना सतह पर तैरनेवाला त्यागें। एक ultracent में 1 घंटे के लिए 100,000 XG पर स्पिनrifuge। 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गोली और फिल्टर सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  5. 10 Strep एमएल आत्मीयता के एक स्तंभ के एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप धोने बफर में equilibrated का उपयोग करने में पैक राल के ऊपर से गुजरती lysate: 1 मिमी C12M, 0.2 मिमी सीएचएस, 5% ग्लिसरॉल, 25 माइक्रोन के लिपिड (1-palmitoyl-2-oleoyl- एस.एन. -glycero- 3-phosphocholine, 1-palmitoyl-2-oleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine, और 1-palmitoyl-2-oleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoglycerol 1 के एक दाढ़ अनुपात में: 1: 1), और 1 माइक्रोन के एस -citalopram या टीबीएस में SSRI।
  6. एक तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) प्रणाली के लिए Strep आत्मीयता के स्तंभ कनेक्ट और 2 एमएल / धो बफर के 66 एमएल (6.6 स्तंभ मात्रा) के साथ मिनट में स्तंभ धो लें। एक ही बफर में elute शुद्ध प्रोटीन 0.5 मिलीग्राम / मिनट बफर के 33 एमएल (3.3 स्तंभ मात्रा) का उपयोग करने पर desthiobiotin 5 मिमी के साथ पूरक। 1 एमएल अंशों लीजिए; शिखर अंशों ~ 10 मिलीलीटर हो जाएगा। शुद्ध प्रोटीन के लिए 2 से 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है - 3 डी अगर वांछित।
    नोट: कुल उपज 3 होगा -SERT सीसी का 4 मिलीग्राम और SERT आईसी के 1 मिलीग्राम। 280 एनएम पर 2 ए.यू. की एक absorbance 1 मिलीग्राम / एमएल SERT के बराबर है।

टीकाकरण के लिए liposomes में ट्रांसपोर्टर की 5. पुनर्गठन

  1. कोलेस्ट्रॉल: asolectin युक्त liposomes तैयार लिपिड एक: मस्तिष्क ध्रुवीय लिपिड (दाढ़ अनुपात 60: 17: 3: 20)। क्लोरोफॉर्म के 1 एमएल में लिपिड भंग और संकेत दिया दाढ़ अनुपात में 100 एमएल गिलास दौर नीचे कुप्पी के लिए कुल लिपिड की 40 मिलीग्राम जोड़ें।
    1. दौर नीचे कुप्पी गर्म पानी में घूर्णन, लगभग 30 डिग्री सेल्सियस के साथ वैक्यूम के अंतर्गत कम से कम 1 घंटे के लिए क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जाना।
    2. टीबीएस के 10 एमएल जोड़कर लिपिड rehydrate। 10 मिनट के लिए बफर में सेते हैं।
    3. तरल एन 2 में कुप्पी रखकर लिपिड रुक।
    4. पिघलना। गर्म पानी से भरा एक बीकर में कुप्पी की गोलाकार नीचे विसर्जित कर दिया, लगभग 30 डिग्री सेल्सियस। 5 मिनट के लिए एक स्नान sonicator में sonicate।
    5. भंवर और दोहराने कदम 5.1.3 - 5.1.4 10 बार या लिपिड तकपूरी तरह से नीचे से resuspended और एक बादल निलंबन रूपों है।
    6. पूरे लिपिड मिश्रण 200 एनएम फिल्टर के माध्यम से दो बार बाहर निकालना। लिपिड एक दूधिया निलंबन बाहर निकालना से पहले के रूप में दिखाई देगा; बाद में यह पारदर्शी हो जाएगा। पूरे लिपिड मिश्रण बाहर निकालना के लिए एक बार में नमूने के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप के रूप में यह भरा हो सकता है न जोड़ें।
    7. 40 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में टीबीएस के 1 एमएल - 100,000 20 मिनट और 0.5 में resuspend के लिए XG पर लिपिड स्पिन।
  2. 2 के लिए एक 100 केडीए MWCO सेंट्रीफ्यूज प्रोटीन concentrator का उपयोग 500 μL - - 250 के लिए शुद्ध SERT आईसी ध्यान लगाओ 4 मिलीग्राम / एमएल और 5 मिमी C12M साथ liposomes तर। 1 एमएल अंतिम मात्रा में लिपिड मिश्रण: डिटर्जेंट के लिए शुद्ध SERT जोड़ें।
  3. 80 मिलीग्राम / एमएल हाइड्रोफोबिक अवशोषण राल के 3 लगातार परिवर्धन द्वारा C12M निकालें। पहले 2 परिवर्धन के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए रोटेशन के साथ राल के साथ सेते हैं। कांच ऊन के माध्यम से गुजर द्वारा राल निकालें। राल के साथ अंतिम ऊष्मायन प्रदर्शन करनारात भर।
  4. 20 मिनट के लिए 100,000 XG पर centrifugation द्वारा proteoliposomes ध्यान लगाओ। टीबीएस के 500 μL - 250 में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली त्यागें।
  5. राल के अंतिम हटाने के बाद पुनर्गठित प्रोटीन एस -citalopram के 10 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता जोड़ें।
  6. एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है बफर (62.5 मिमी Tris, पीएच 6.8, 10% ग्लिसरॉल, 2% एसडीएस, 0.01% bromophenol नीले, 100 मिमी डीटीटी) में proteoliposomes की solubilize 2.5 μL और 1 के लिए 200 वी पर एक एसडीएस पृष्ठ जेल पर चलने कि SERT सुनिश्चित करने के लिए ज सफलतापूर्वक पुनर्गठन किया गया है। Proteoliposomes लंबी अवधि के भंडारण के लिए aliquots में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और प्रत्येक टीकाकरण करने से पहले बर्फ पर thawed किया जा सकता है।

6. 3 डी epitopes को स्वीकार एंटीबॉडी के लिए स्क्रीनिंग

  1. पश्चिमी धब्बा करके स्क्रीन हाइब्रिडोमा सेल लाइनों। एंटीबॉडी जो पश्चिमी धब्बा द्वारा SERT को पहचान होने की संभावना रेखीय epitopes बाँध और संभावना संरचनात्मक अध्ययन के लिए उपयोगी नहीं होगा।
    1. मिक्स purifi के 1 माइक्रोग्रामएड SERT आईसी या SERT सीसी और एक 4 पर चलाने - 1 घंटे के लिए 200 वी पर 15% एसडीएस पृष्ठ जेल।
    2. Towbin बफर का उपयोग कर 30 मिनट (25 मिमी Tris, 192 मिमी ग्लाइसिन, 20% (वी / वी) मेथनॉल, 0.1% एसडीएस) के लिए 200 मा पर एक nitrocellulose झिल्ली पर स्थानांतरण। झिल्ली सूखे और कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता है।
    3. 10% मेथनॉल के साथ Rewet झिल्ली, और पीबीएस के साथ धोने (10 मिमी फॉस्फेट, पीएच 7.4, 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl)।
    4. आरटी पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 5% दूध पाउडर के साथ ब्लॉक।
    5. पीबीएस के साथ धोने और 0.1% दूध के साथ पीबीएस में 1 माइक्रोग्राम एंटीबॉडी की / एमएल के साथ सेते हैं।
    6. पीबीएस 0.1% बीच 20 से युक्त के साथ बड़े पैमाने पर धो लें।
    7. 0.1% बीच 20 और 0.1% दूध के साथ पीबीएस में 10,000: बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी एक आईआर डाई संयुग्मित के साथ सेते हैं 1 पतला।
    8. बड़े पैमाने पर धो लें और एक इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर स्कैन।
  2. हाइब्रिडोमा सतह पर तैरनेवाला मिक्स 1 की एक दाढ़ अनुपात का उपयोग कर 100 एनएम SERT सीसी प्रोटीन के साथ पश्चिमी नकारात्मक एंटीबॉडी युक्त 2 (एसईआरटी: एमएबी) 200 μL टीबीएस में 1 मिमी C12M, 0.2 मिमी सीएचएस, और 1 माइक्रोन एस -citalopram के साथ। 100,000 20 मिनट के लिए XG पर अपकेंद्रित्र। SERT-एमएबी परिसरों युक्त सतह पर तैरनेवाला का विश्लेषण करें और प्रतिदीप्ति का पता लगाने के आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (FSEC) 8 से विश्लेषण। गोली त्यागें।
    1. एक चल बफर टीबीएस, 0.4 मिमी युक्त का उपयोग कर (510 एनएम: 480 एनएम, उत्सर्जन उत्तेजना) 0.5 मिलीग्राम / मिनट एक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर से लैस एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) प्रणाली का उपयोग करने पर एक आकार अपवर्जन स्तंभ पर सतह पर तैरनेवाला के 100 μL भागो सल्फेट माल्टोज neopentyl ग्लाइकोल, और 1 माइक्रोन एस -citalopram। एंटीबॉडी जो परिसरों फार्म GFP संलयन प्रोटीन आकार अपवर्जन स्तंभ से मुक्त ट्रांसपोर्टर से पहले elute के लिए प्रेरित करेगा।
    2. 10, 1, 0.1 200 μL टीबीएस में 1 मिमी C12M साथ एनएम, 0.2 मिमी सीएचएस, और 1 माइक्रोन एस -citalopram और फिर से दौड़ना FSEC करने के परिसरों पतला। एंटीबॉडी जो अभी भी कम nanomolar सांद्रता में ट्रांसपोर्टर चोटी बदलाव कर सकते हैंउच्च आत्मीयता बाँधने और संरचनात्मक अध्ययन के लिए अच्छा उम्मीदवार।
  3. 1 मिमी सेरोटोनिन की उपस्थिति में FSEC से बाध्यकारी जांचना। एंटीबॉडी जो विशेष रूप से SSRI बाध्य रचना को पहचान सब्सट्रेट की उपस्थिति में बाध्य नहीं होगा। एंटीबॉडी जो एक 3 डी मिलान जो रचना का एक परिणाम के रूप में कोई बदलाव नहीं होता है पहचान ligand वर्तमान की परवाह किए बिना बाध्य होगा।
  4. एंटीबॉडी के जोड़ो में विभिन्न संयोजनों मिक्स और FSEC से बाध्यकारी परीक्षण। एंटीबॉडी जो अलग epitopes को पहचान SERT पहले जब एक साथ संयुक्त रूप से एक एंटीबॉडी के बंधन की तुलना में elute के लिए प्रेरित करेगा।
  5. प्रारंभिक संरचनात्मक अध्ययन के लिए, सबसे ज्यादा आकर्षण एंटीबॉडी जो 3 डी epitopes को पहचान का चयन करें।

Sf9 कोशिकाओं में एंटीबॉडी टुकड़ा के 7. अभिव्यक्ति

  1. क्लोन चर और निरंतर मानक प्रोटोकॉल का उपयोग Sf9 कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के लिए कीट अभिव्यक्ति प्रणाली में पीसीआर द्वारा फैब के डोमेन।
  2. Transfect 1 एक्स 10 6 Bacmid डीएनए के 5 ग्राम के साथ Sf9 कोशिकाओं को एक GP67 स्राव अनुक्रम के साथ 8 उनकी टैग की 8B6 फैब के प्रकाश और भारी जंजीरों एन्कोडिंग (धारा 3.4 के अनुसार)।
  3. हार्वेस्ट P1 वायरस 96 घंटे posttransfection और एक एल 2 फ्लास्क में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर Sf9 कोशिकाओं के 1 एल पी 1 वायरस के 500 μL जोड़ने के p2 वायरस बनाने के लिए। 27 डिग्री सेल्सियस पर 96 घंटे के लिए कोशिकाओं को संक्रमित।
  4. हार्वेस्ट p2 के वायरस (धारा 3.6 के अनुसार)।
  5. 50 प्रत्येक 2 एल कुप्पी में Sf9 कोशिकाओं के 1 एल के साथ फ्लास्क प्रति मिलीलीटर - p2 के वायरस है, आम तौर पर 40 से 2 के MOI के साथ 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल - 2 के घनत्व पर Sf9 कोशिकाओं के 6 एल संक्रमित।
  6. हार्वेस्ट कोशिकाओं लगभग 96 घंटे postinfection। 20 मिनट के लिए 4000 XG पर कोशिकाओं और स्पिन करने के लिए 50 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में फॉस्फेट बफर, पीएच 8 के 50 एमएल जोड़ें। 0.2 माइक्रोन फिल्टर स्पर्शरेखा प्रवाह सेल के माध्यम से सेल गोली और फिल्टर सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 2 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर तैरनेवाला और दुकान लीजिए - 3 दिन अगर वांछित।

  1. 800 एमएल - लगभग 400 करने के लिए उपयोग कर एक 30 केडीए आण्विक वजन कट ऑफ (MWCO) स्पर्शरेखा प्रवाह सेल Sf9 सतह पर तैरनेवाला ध्यान लगाओ।
  2. 10 मिमी और उनकी टैग समानता राल की 10 मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता में imidazole, 8 पीएच जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक बीकर में हिलाओ।
  3. 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर centrifugation द्वारा उनकी टैग समानता राल ले लीजिए। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  4. एक कॉलम में पैक उनकी टैग आत्मीयता के राल और एक FPLC से कनेक्ट।
  5. 2 एमएल / 50 मिमी फॉस्फेट 8 पीएच, 150 मिमी NaCl, 25 मिमी imidazole के 66 एमएल (6.6 स्तंभ मात्रा) के साथ मिनट पर उनकी टैग समानता राल धो लें।
  6. 50 मिमी फॉस्फेट 8 पीएच, 150 मिमी NaCl, 250 मिमी imidazole के 33 एमएल में elute 8B6 फैब। 1 एमएल अंशों लीजिए।
  7. ठंडा 20 मिमी एसीटेट, पीएच 5 से 10 गुना मात्रा के साथ शुद्ध फैब समानता पतला।
  8. 1 एमएल कटियन विनिमय स्तंभ 1 एमएल / मिनट पर एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग करने के लिए फैब बाँध।
  9. अलग फैब एक 30 मिलीलीटर लिन का उपयोग कर20 मिमी एसीटेट पीएच 5.5 में - (500 मिमी 0) एक FPLC का उपयोग कर NaCl के कान ढाल। फैब ~ 300 मिमी NaCl पर एक शिखर के रूप में elute जाएगा।
  10. एक 12.5% ​​एसडीएस पृष्ठ नमूना 100 मिमी डीटीटी युक्त बफर का उपयोग कर जेल पर विश्लेषण। 8B6 फैब की भारी और हल्के चेन 27 और 25 केडीए में चला जाएगा, क्रमशः, एक कम करने एसडीएस पृष्ठ जेल पर।
  11. 3000 x जी एक झूलते बाल्टी अपकेंद्रित्र में एक 30 केडीए MWCO प्रोटीन concentrator का उपयोग 15 मिलीग्राम / एमएल - पूल फैब युक्त भिन्न है और कम से कम 10 के लिए ध्यान देना।
  12. 50 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता और दुकान 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के लिए फैब शुद्ध करने के लिए 1 एम Tris पीएच 8 जोड़कर 8 पीएच को समायोजित करें। 30 मिलीग्राम - कुल उपज 25 हो जाएगी। 280 एनएम पर 1.4 ए.यू. की एक absorbance 1 मिलीग्राम / 8B6 फैब एमएल के बराबर है।

आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा ट्रांसपोर्टर एंटीबॉडी परिसर और जुदाई के गठन 9.

  1. क्रिस्टलीकरण के लिए, जैसा कि पहले बताया (धारा 4) C12M में Strep आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा SERT सीसी शुद्ध।
  2. एक मात्रा 500 μL से भी कम समय में 1.2: 1 के एक दाढ़ अनुपात में फैब के साथ केंद्रित SERT मिक्स। 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 XG पर अपकेंद्रित्र। SERT-फैब जटिल युक्त सतह पर तैरनेवाला लीजिए। त्यागें गोली।
  3. आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) एक आकार अपवर्जन स्तंभ टीबीएस में equilibrated पर एक FPLC का उपयोग करके अलग-अलग 40 मिमी एन octyl-β-D-maltoside (C8M), 0.5 मिमी सीएचएस, 5% ग्लिसरॉल, 25 माइक्रोन के लिपिड (समान रूप के साथ पूरक 4.5 कदम), और 0.5 मिलीग्राम / मिनट पर 1 माइक्रोन एस -citalopram में।
  4. 0.5 एमएल अंशों लीजिए और 4 पर विश्लेषण - 15% एसडीएस पृष्ठ जैल के रूप में अच्छी तरह से एसईसी द्वारा tryptophan प्रतिदीप्ति द्वारा। GFP टैग की SERT एक एसडीएस पृष्ठ जेल पर लगभग 80 केडीए चलेंगे। Termini के हटाने और एन-लिंक्ड शर्करा के बाद यह एक 45 केडीए प्रोटीन के रूप में चलाया जाएगा।
  5. Determine जो अंशों केवल अंशों जो monodisperse के रूप में tryptophan प्रतिदीप्ति एसईसी द्वारा अंशों के विश्लेषण द्वारा न्याय कर रहे हैं पूलिंग से गठबंधन करने के लिए (उत्तेजना: 280, उत्सर्जन: 335 एनएम)।
  6. स्टोर अप करने के लिए 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध SERT-8B6 जटिल।

10 ड्रॉप फांसी से ट्रांसपोर्टर एंटीबॉडी परिसर के क्रिस्टलीकरण

  1. क्रिस्टलीकरण करने से पहले, 2 मिलीग्राम / एमएल SERT-8B6 परिसर के एसईसी जुदाई से चोटी अंशों एक 100 केडीए MWCO सेंट्रीफ्यूज प्रोटीन concentrator का उपयोग ध्यान केंद्रित। 280 एनएम पर 2 ए.यू. की एक absorbance 1 मिलीग्राम / एमएल के बराबर है।
  2. अतिरिक्त फैब 1 के अनुपात में जोड़ें: 0.05 जटिल: नि: शुल्क फैब। 10 माइक्रोन मुक्त एस -citalopram जोड़ें।
  3. 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 XG पर अपकेंद्रित्र। SERT-फैब जटिल युक्त सतह पर तैरनेवाला लीजिए। त्यागें गोली।
  4. 1 टेबल के अनुसार 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फांसी ड्रॉप 24 अच्छी तरह से स्क्रीन की स्थापना की। जलाशय समाधान पर विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल बढ़ो125 मिमी KCl, 32.5 - - 34% खूंटी 400, और 0.5% 6-aminohexanoic एसिड 100 मिमी Tris-NaOH, पीएच 8.5, 25 से युक्त।
    नोट: उपयोग Tris एक बफर के रूप में पीएच 8.5 NaOH के साथ समायोजित। Tris आधार एचसीएल के साथ समायोजित प्रयोग न करें। स्क्रीन 2 एमएल ट्यूबों में तैयार किया है और जब तक समाप्त किया जा सकता है। सही रूप में एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग कर के रूप में यह बहुत चिपचिपा है खूंटी 400 पिपेट के लिए ध्यान रखना!
    1. सीलेंट के साथ एक कम प्रोफ़ाइल 24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए लागू में प्रत्येक जलाशय समाधान के पिपेट 500 μL। पिपेट 1.5, 1.75, और एक 18 मिमी siliconized गिलास को कवर पर्ची पर SERT-8B6 परिसर के 2 μL। पिपेट 1 प्रोटीन नमूना के शीर्ष पर जलाशय समाधान के μL।
      नोट: प्लेट पहले से ही कुओं के रिम के लिए आवेदन किया सीलेंट के साथ खरीदा गया था।
    2. जलाशय समाधान का सामना करना पड़ बूंदों के साथ 24 अच्छी तरह से करने के लिए कवर स्लाइड लागू करें और सीलेंट पर प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से पूर्व आवेदन किया पर्ची कवर दबाकर तुरंत सील।
    3. जारी रखें जब तक सभी 24 कुओं की स्थापना की गई है। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अच्छी तरह से अछूता कमरे में समाप्त प्लेट छोड़ दें। कम से कम 3 दिनों के लिए प्लेटों को परेशान मत करो
      नोट: एकल क्रिस्टल लगभग 3 दिन के भीतर दिखाई देगा और 14 दिनों के बाद 100-175 माइक्रोन के लिए बढ़ता है।
  5. Cryoloops में हार्वेस्ट क्रिस्टल और सीधे एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह करने से पहले तरल एन 2 में फ्लैश-शांत।
  6. यदि आवश्यक हो, फांसी बूंदों के साथ व्यापक स्क्रीनिंग द्वारा अतिरिक्त क्रिस्टलीकरण की स्थिति पाते हैं। 1.5: 1,: 1, 1: 2 के अनुपात में तेज़: प्रोटीन के साथ तीन बूंदों का प्रयोग करें 1। अगर एक रोबोट उपलब्ध है, तो 100-150 नाथन एक 96 अच्छी तरह से थाली में जलाशय समाधान के 70 से अधिक μL बूंदों की स्थापना की। बड़ा 3 डी क्रिस्टल के 24 कुओं में उगाया जा सकता है।
  7. ड्रॉप की उपस्थिति के आधार पर स्कोर: 0, स्पष्ट; 1, धूल; 2, बारीक वेग; 3, चरण जुदाई; 4, माइक्रोक्रिस्टलाइन; 5, सुई; 6, प्लेटें; 7, 3 डी क्रिस्टल।
  8. के रूप में नव पहचान cond के आसपास ऊपर वर्णित 24 कुओं में गिरावट के तरीकों फांसी से क्रिस्टलीकरण सेट अपitions।

Representative Results

SERT टीसी पृष्ठभूमि में एकल बिंदु म्यूटेंट के एक पुस्तकालय म्यूटेशन thermostabilizing के लिए स्क्रीन करने के लिए बनाया गया था। व्यक्तिगत म्यूटेंट मानक mutagenesis का उपयोग कर उत्पन्न किया गया। स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल क्षणिक तेजी से पहचान क्रिस्टलीकरण के लिए उपयोगी म्यूटेशन को ट्रांसफ़ेक्ट का इस्तेमाल HEK293S कोशिकाओं और एक जगमगाहट निकटता आधारित thermostability स्क्रीन के रूप में चित्रा 1 ए में उल्लिखित। साजिश रचने Tm मूल्यों बनाम बाध्य [3 एच] आरटी पर citalopram उच्च thermostability और अभिव्यक्ति के स्तर उपयुक्त के साथ निर्माणों का पता चलता है प्रोटीन शुद्धि के लिए (चित्रा 1 बी)। तीन म्यूटेंट (Y110A, I291A, और T439S) एक अत्यधिक स्थिर निर्माण (चित्रा 1 सी) उत्पन्न करने के लिए संयुक्त थे। Thermostability भी SERT-फैब परिसर के क्रिस्टलीकरण के लिए आवश्यक कम श्रृंखला डिटर्जेंट में वृद्धि की स्थिरता के साथ जोड़ा जाता है।

मानव SERT के बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति baculovirus-TR का उपयोग करansduced HEK293S GnTI - कोशिकाओं को कम से कम 2 सप्ताह लग सकते हैं और चित्रा 2A में सचित्र, मिलीग्राम मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं। GFP टैग SERT सीसी प्रोटीन के उपयोग SERT आसानी से प्रतिदीप्ति (चित्रा 2 बी) द्वारा अभिव्यक्ति और शुद्धि के दौरान अपनाई जाने वाली अनुमति देता है। ; एक स्थिर लिपिड के रूप में सीएचएस की उपस्थिति में C12M में कोशिकाओं - हमारे शुद्धि रणनीति शामिल 1) SERT के solubilization HEK293S GnTI से एस -citalopram के लिए बाध्य 2) एक Strep समानता मैट्रिक्स के लिए SERT के बंधन; 3) व्यापक धोने से दूषित पदार्थों को प्रोटीन को हटाने; और 4) बफर युक्त desthiobiotin (चित्रा 2 सी) के साथ कार्यात्मक SERT की क्षालन। Eluted प्रोटीन Coomassie नीले रंग धुंधला द्वारा अन्य detectable प्रोटीन की काफी हद तक स्वतंत्र और monodisperse रूप FSEC (चित्रा 2 डी, ई) से माना जाता है।

इसी तरह की रणनीति के लिए एक Strep द्वितीय टैग जो reconstitutio के लिए इस्तेमाल किया गया था के साथ SERT शुद्ध करने के लिए ले जाया गयाn और प्रतिरक्षण (चित्रा 3 ए, बी)। proteoliposomes में SERT का निगमन सीरम आधा जीवन और SERT की स्थिरता को बढ़ा देता है और उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी के अलगाव की संभावना को बढ़ाता है। इसके अलावा, लिपिड एक के शामिल किए जाने, बैक्टीरिया कोशिका दीवार का एक घटक है, एक शक्तिशाली सहायक 9 के रूप में कार्य करता है। Multilamellar liposomes ग्लास ट्यूब में एक सूखे लिपिड मिश्रण करने के लिए बफर के अलावा द्वारा तैयार किया है और बफर में resuspended थे। 200 एनएम ताकना आकार फिल्टर के माध्यम से liposomes की बाहर निकालना monodisperse unilamellar लिपोसोमल निलंबन पैदा करता है। liposomes तो डिटर्जेंट में शुद्ध SERT के अलावा द्वारा पीछा साबुन के साथ संतृप्त कर रहे हैं। डिटर्जेंट मिश्रण: अंत में, डिटर्जेंट लिपिड को हाइड्रोफोबिक अवशोषण राल के अलावा द्वारा हटा दिया जाता है। अतिरिक्त ligand एंटीबॉडी कि एंटी बाध्य रचना को पहचान के लिए चयन करने के पुनर्गठन नमूना करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए। proteoliposomes में SERT की मौजूदगी से पुष्टि की जानी चाहिएएसडीएस पृष्ठ लोडिंग डाई या C12M के साथ एक छोटा सा नमूना solubilizing और एसडीएस पृष्ठ और FSEC (चित्रा -3 सी, डी) पर चल रहा है।

हाइब्रिडोमा सेल लाइनों SERT एंटीबॉडी व्यक्त उच्च आत्मीयता बाँधने जो 3 डी epitopes को पहचान के लिए जांच की जा सकती है। इन गुणों, क्रिस्टलीकरण के अंतिम सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं के रूप में एंटीबॉडी मजबूती से एक संरचित क्षेत्र के लिए बाध्य कर रहना चाहिए सजातीय, सुव्यवस्थित डोमेन की क्रिस्टल पैकिंग बढ़ावा देने के लिए। पहले चरण में, एंटीबॉडी जो असंरचित क्षेत्रों को पहचान पहचान कर रहे हैं। SERT विकृत है और एक nitrocellulose झिल्ली पर मिट; एंटीबॉडी जो विकृत SERT बाँध पश्चिमी सकारात्मक हो जाएगा और संभावना रेखीय epitopes को पहचानते हैं। चित्रा -4 ए में, हम जो पश्चिमी पॉजिटिव है और संभावना है crystallogenesis बढ़ावा देने के लिए उपयोगी नहीं हैं एंटीबॉडी के 2 उदाहरण दिखाते हैं। चित्रा 4 बी में, शेष पश्चिमी नकारात्मक एंटीबॉडी 100 एनएम SERT-GFP के साथ incubated और से अलग हो रहे हैंFSEC। एंटीबॉडी जो बाँध SERT एक पहले की स्थिति के लिए GFP पॉजिटिव चोटी बदलाव होगा। SERT एंटीबॉडी परिसरों डिटर्जेंट में आगे निर्धारित करने के लिए अगर वे nanomolar FSEC द्वारा विश्लेषण के बाद आत्मीयता के साथ बाध्य कर सकते हैं पतला हो सकता है। ट्रांसपोर्टर में गठनात्मक परिवर्तन और इस तरह एंटीबॉडी में सेरोटोनिन परिणाम के अलावा निर्धारित करती है कि वे विशेष रूप से SSRI बाध्य रचना को पहचान सकते हैं rescreened जा सकता है। चित्रा 4C में, एंटीबॉडी सेरोटोनिन की उपस्थिति में SERT बाध्य करने, दिखा रहा है कि मिलान (s) बाध्य राज्य सब्सट्रेट करने के लिए SSRI से बदल नहीं है दिखाए जाते हैं। अंत में, चित्रा 4D में एंटीबॉडी के संयोजन अलग epitopes बाध्य करने के लिए, एक और बाई ओर पाली में जिसके परिणामस्वरूप उनकी क्षमता के लिए परीक्षण कर रहे हैं। यहाँ 15B8 या 8A11 एंटीबॉडी एक मिलान जो 8B6 से अलग है पहचान।

8B6 एंटीबॉडी papain Trea के साथ प्रारंभिक क्रिस्टल स्क्रीनिंग के आधार पर आगे की संरचनात्मक विश्लेषण के लिए चुना गया थाटेड फैब। 8B6 फैब के जीन एक कीट सेल अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन किया गया। फैब व्यक्त की और निलंबन में बढ़ Sf9 कोशिकाओं से स्रावित जा सकता है। 8B6 फैब उनकी टैग आत्मीयता (चित्रा 5 ए, बी) और कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 5C, डी) प्रोटीन जो एसडीएस पृष्ठ जैल पर प्रदूषणों से मुक्त करने के लिए प्रकट होता है, जिसके परिणामस्वरूप द्वारा Sf9 सेल सतह पर तैरनेवाला से शुद्ध किया जा सकता है। चित्रा 5E में, पुनः संयोजक 8B6 फैब SERT बाध्य करने के लिए दिखाया गया है और बाद में जैव रासायनिक और biophysical प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है।

आत्मीयता शुद्ध SERT सीसी थ्रोम्बिन और Endoh के साथ पचा और एस -citalopram की उपस्थिति में एक जटिल प्रपत्र 8B6 फैब के साथ मिलाया जाता है। ट्रांसपोर्टर-एंटीबॉडी जटिल तो C8M (चित्रा 6A) में एसईसी द्वारा अलग किया जाता है और के रूप में एसडीएस पृष्ठ (चित्रा 6B) द्वारा दिखाया चोटी अंशों दोनों SERT और फैब होते हैं। C8M का उपयोग क्रिस्टल के गठन के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि शायदलघु श्रृंखला डिटर्जेंट जाली क्रिस्टल में अणुओं के बीच बेहतर पैकिंग की अनुमति देता है। FSEC निर्धारित करने के लिए जो अंशों क्रिस्टलीकरण के लिए जमा किया जाना चाहिए कार्यरत है (चित्रा 6C); अंशों जो monodisperse नहीं हैं और / या मुफ्त SERT या फैब की बड़ी मात्रा में होते नहीं जोड़ा जाना चाहिए।

चश्मे के आकार का SERT एंटीबॉडी क्रिस्टल ड्रॉप वाष्प प्रसार (चित्रा 7A) फांसी से इस प्रोटोकॉल का उपयोग एस -citalopram की उपस्थिति में उगाया जा सकता है। जिसके परिणामस्वरूप क्रिस्टल 3.15 एक 10 (चित्रा 7 बी) के एक प्रस्ताव को टुकड़े एक्स रे।

आकृति 1
चित्रा 1: जगमगाहट निकटता आधारित thermostability परख एक।। [3 एच] citalopram। बी की उपस्थिति में thermostability स्क्रीनिंग के लिए प्रोटोकॉल का अवलोकन। अधिकतम बाध्य [3 (टीएम) citalopram। बिंदीदार लाइनों गुम्मट ट्रांसपोर्टर के लिए मूल्यों का प्रतिनिधित्व। 3 सबसे थर्मास्टाइबल म्यूटेंट लेबल रहे हैं। ग्रे क्षेत्र में कम संकेत करने वाली शोर। सी के कारण म्यूटेंट है कि [3 एच] citalopram बाध्यकारी गुम्मट और इस तरह गलत Tm मूल्यों के सापेक्ष कम से कम 10% का प्रतिनिधित्व करता है। गुम्मट SERT टीसी और शीर्ष 3 म्यूटेंट के लिए thermostability घटता। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन (एसडी) का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। स्तनधारी heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति एक का अवलोकन। HEK293S GnTI में BacMam वायरस पीढ़ी और SERT की अभिव्यक्ति की Schematized अवलोकन -। कोशिकाओं बी। वहK293S GnTI -। SERT सीसी (GFP प्रतिदीप्ति) सी व्यक्त कोशिकाओं। Strep समानता राल पर SERT सीसी की क्षालन प्रोफ़ाइल। 100% (0 - - 5 मिमी) डी। ग्रीन ट्रेस desthiobiotin की एकाग्रता, 0 प्रतिनिधित्व करता है। 15% एसडीएस पृष्ठ जेल ई -। एक 4 पर आत्मीयता शुद्ध SERT सीसी का विश्लेषण। आत्मीयता शुद्ध SERT सीसी GFP प्रतिदीप्ति द्वारा पता चला की FSEC (उत्तेजना: 480 एनएम, उत्सर्जन: 510 एनएम)। चोटी के 15 एमएल में eluting SERT (#) है और 18 एमएल मुक्त GFP (*) है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: प्रतिनिधि आत्मीयता शुद्धि और SERT आईसी एक का पुनर्गठन।। एंटीबॉडी पीढ़ी के योजनाबद्ध सिंहावलोकन। <strong> बी। Strep समानता राल पर SERT आईसी की आत्मीयता शुद्धि के 280 एनएम पर क्षालन प्रोफ़ाइल मनाया। 100%। (0 - - 5 मिमी) सी ग्रीन ट्रेस desthiobiotin की एकाग्रता, 0 प्रतिनिधित्व करता है। समानता के विश्लेषण से शुद्ध और एक 4 पर SERT पुनर्गठन - 15% एसडीएस पृष्ठ जेल डी।। पुनर्गठन के बाद solubilized SERT की FSEC। Tryptophan अवशेषों की प्रतिदीप्ति SERT (: 280 एनएम, उत्सर्जन: उत्तेजना 335 एनएम) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। SERT प्रतिनिधि एंटीबॉडी के विश्लेषण से एक। पश्चिमी धब्बा द्वारा एंटीबॉडी की स्क्रीनिंग। लगभग 1 ग्राम के साथ या बिना GFP SERT सीसी की एक 4 के लिए लागू किया गया था - 15% SDS-पृष्ठ जेल और एक nitrocellulose झिल्ली पर मिट। बंधन एक बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी आईआर डाई संयुग्मित का उपयोग करते हुए पाया गया। 2G4 और 10F2 पश्चिमी सकारात्मक। बी। FSEC द्वारा 100 एनएम GFP टैग SERT और पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के बंधन GFP प्रतिदीप्ति का उपयोग कर पाया। सी। 1 मिमी सेरोटोनिन। डी की उपस्थिति में 100 एनएम GFP टैग SERT करने के लिए चयनित Fabs का बंधन। 8A11 या 15B8 Fabs के बंधन Sert-8B6 के लिए फैब। माइनर में 18 एमएल में eluting चोटियों मुक्त GFP कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: Sf9 कोशिकाओं से 8B6 फैब के प्रतिनिधि शुद्धि एक।। क्षालन प्रोफ़ाइल उनकी टैग समानता chromatograp द्वारा 8B6 फैब की शुद्धि के 280 एनएम पर मनाया हरियाणा। 50% (0 - - 250 मिमी) बी। ग्रीन ट्रेस imidazole की एकाग्रता, 0 प्रतिनिधित्व करता है। गैर को कम करने और उनके टैग आत्मीयता शुद्धि के बाद एसडीएस पृष्ठ जेल को कम करने। प्रोटीन जो 50 केडीए के पास चलाता गैर कम हो फैब (#) और छोटी प्रजातियों 25 पर केडीए फैब (*)। सी कम है। क्षालन प्रोफ़ाइल एक एकल सममित चोटी जो एक रेखीय सोडियम क्लोराइड ढाल के तहत elutes प्रदर्शित कटियन विनिमय द्वारा 8B6 फैब की शुद्धि के 280 एनएम पर मनाया। 100%। (0 - - 500 मिमी) डी ग्रीन ट्रेस सोडियम क्लोराइड की एकाग्रता, 0 प्रतिनिधित्व करता है। कटियन विनिमय। ई द्वारा शुद्धि के बाद 12.5% एसडीएस पृष्ठ जेल पर 8B6 फैब का विश्लेषण। , 10 एनएम GFP टैग SERT को 8B6 फैब के बंधन GFP प्रतिदीप्ति का उपयोग कर पाया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 6:। एस की उपस्थिति -citalopram ए में SERT-8B6 परिसर के प्रतिनिधि जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी। शुद्ध SERT-8B6 परिसर के जेल निस्पंदन क्षालन प्रोफ़ाइल। मुख्य 11.5 एमएल में eluting चोटी SERT-8B6 जटिल है। 15 पर पीक -। 17 एमएल GFP और फैब बी में शामिल है। 15% एसडीएस पृष्ठ जेल - एक 4 पर शुद्ध SERT-8B6 परिसर का विश्लेषण। SERT और फैब की भारी और हल्के चेन के पदों पर एक पानी का छींटा। सी द्वारा दिखाए जाते हैं। आकार-अलग भागों की FSEC। SERT-8B6 परिसरों tryptophan प्रतिदीप्ति का उपयोग पाया गया। अंश 17 जो फैब के साथ जटिल नहीं किया SERT की एक बड़ी राशि शामिल है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7 चित्रा 7:। SERT-8B6 परिसर एस -citalopram एक करने के लिए बाध्य के क्रिस्टलीकरण। विकास के 2 हफ्तों के बाद SERT-8B6 परिसर के समानांतर खात आकार का क्रिस्टल की लाइट माइक्रोस्कोपी। स्केल बार 200 माइक्रोन। बी के बराबर होती है। SERT-8B6 क्रिस्टल 3.15 करने के लिए एक टुकड़े एक्स रे। नीले रंग की अंगूठी 3.15 Å प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1:। SERT-8B6 परिसर एस -citalopram करने के लिए बाध्य करने के लिए एक crystallization स्क्रीन इस तालिका डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

Biophysical तकनीक द्वारा झिल्ली प्रोटीन संरचना के निर्धारण में कई चिकित्सकीय महत्वपूर्ण ट्रांसपोर्टरों, रिसेप्टर्स, और चैनल 11 के लिए एक चुनौतीपूर्ण उपक्रम बनी हुई है। यहाँ हम मानव सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर एस -citalopram के लिए बाध्य की संरचना निर्धारण के लिए विकसित की विस्तृत विशेषज्ञता का हिस्सा है। हम आशा करते हैं कि इन तरीकों अन्य गठनात्मक राज्यों के साथ ही अन्य मुश्किल झिल्ली प्रोटीन के ढांचे में SERT के ढांचे को निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो जाएगा। इसके अलावा, जैव रासायनिक यहाँ वर्णित तकनीक भी डिटर्जेंट में शुद्ध SERT और एक के पास देशी लिपिड पर्यावरण के समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

SERT क्रिस्टलीकरण कई उपकरणों और तकनीकों के विकास पर hinged। सबसे पहले, ट्रांसपोर्टर thermostability में सुधार SERT वेरिएंट जो झिल्ली 6 से ट्रांसपोर्टर की निकासी के बाद विभिन्न डिटर्जेंट micelles में अच्छी तरह से व्यवहार कर रहे थे उत्पादन किया। दूसरा, उपयोगशुद्धि और क्रिस्टलीकरण भर में उच्च आत्मीयता ligand एस -citalopram आगे स्थिरता में सुधार और कम गठनात्मक विविधता की। तीसरा, BacMam अभिव्यक्ति प्रणाली 7 2 सप्ताह की एक छोटी सी अवधि में SERT की बड़ी मात्रा के उत्पादन के लिए अनुमति दी है, दोनों प्रतिरक्षण और क्रिस्टलीकरण की सुविधा का विकास। अंत में, रणनीतियों के विकास के उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी जो 3 डी epitopes 8B6 एंटीबॉडी की खोज की है जो क्रिस्टल में SERT एंटीबॉडी परिसरों का भी आदेश दिया पैकिंग को बढ़ावा के लिए अनुमति दी है पहचान के लिए चयन करने के लिए।

महत्वपूर्ण कदम और अभिकर्मकों के साथ ही आम समस्या है जो अक्सर प्रोटोकॉल भर में होने का एक नंबर रहे हैं। सबसे पहले, उच्च अनुमापांक SERT p2 के वायरस की पीढ़ी समस्याग्रस्त किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में p2 के वायरस उत्पन्न करने के लिए पी 1 वायरस की कम मात्रा जोड़ने से आम तौर पर इस समस्या mitigates, और मामलों में जहां p2 के वायरस अनुमापांक कम है, पी 3 वायरस usin बनाया जा सकता है0.0001 के MOI में जी वायरस। एक अनुमापांक 1 एक्स 10 8 वायरस कणों से भी कम समय के साथ वायरस / एमएल नहीं किया जाना चाहिए और लगभग हमेशा कम प्रोटीन की पैदावार में परिणाम होगा। अभिव्यक्ति के लिए, HEK293S GnTI - कोशिकाओं के बाद से वे कमी एन मैं गतिविधि -acetylglucosaminyltransferase और इस तरह जटिल एन -glycans synthesize नहीं कर सकते चुने गए हैं, बजाय केवल उच्च mannose एन -glycans का निर्माण किया। Endoh cleaves एन बाह्य पाश 2 (EL2) में दो स्थलों पर उच्च mannose ग्लाइकान की ग्लाइकोसिलेशन से जुड़े, एक एन -acetylglucosamine asparagine से जुड़ी जा रही है। एन के पाचन से जुड़े शर्करा EL2 की सतह एन्ट्रापी जो क्रिस्टलीकरण के लिए संभावना महत्वपूर्ण है कम कर देता है। एंटीबॉडी की पीढ़ी के लिए, SERT आईसी टीकाकरण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। GFP अत्यधिक immunogenic 12 है और जब से यह मुश्किल है पूरी तरह से एसईसी द्वारा दूर करने के लिए एंटीबॉडी उत्पन्न करने के लिए एक संलयन टैग के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। लचीला एन और SERT की सी टर्मिनस भी नहीं थेआदेश में इन क्षेत्रों के खिलाफ एंटीबॉडी से बचने के लिए निर्माण में शामिल थे। चूहे पुनर्गठन प्रोटीन की 30 ग्राम के साथ प्रतिरक्षित किया जा सकता है; immunizing चूहों जारी रखने के लिए जब तक एंटीबॉडी के उच्च सांद्रता सीरम का पता लगाया जा सकता है और वर्णित के रूप में 13 हाइब्रिडोमा कोशिकाओं का उत्पादन। एक thermostabilized का निर्माण आम तौर पर टीकाकरण के लिए सबसे अच्छा विकल्प है; यदि ट्रांसपोर्टर अच्छी तरह से व्यवहार किया है और शुद्धि के बाद जैविक गतिविधि को बरकरार रखे हुए है, यह अक्सर एंटीबॉडी बढ़ाने के लिए पर्याप्त है। 8B6 एंटीबॉडी गुम्मट SERT के खिलाफ उठाया गया था। क्रिस्टलीकरण के लिए, एसईसी से केवल चोटी अंशों monodisperse जटिल युक्त रूप FSEC द्वारा न्याय संयुक्त और ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए। SERT-8B6 क्रिस्टल की स्थिति की एक सीमित दायरे में आगे बढ़ने और कदम है जो विशेष रूप से SERT क्रिस्टल विकास से संबंधित समस्याओं का निवारण करने के लिए लिया जाना चाहिए की एक नंबर रहे हैं। Tris आधार एचसीएल के साथ समायोजित किया जलाशय समाधान में नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि इस बफर क्रिस्टल विकास का समर्थन नहीं करता; यह इस प्रकार है CRIराजनैतिक बजाय Tris का उपयोग करने के NaOH के साथ समायोजित। SERT क्रिस्टल, खूंटी 400 के एक संकीर्ण एकाग्रता रेंज में बढ़ने इसलिए यदि क्रिस्टल हो जाना नहीं है या कई छोटे क्रिस्टल मनाया जाता है, खूंटी 400 एकाग्रता में भी एक छोटा सा वृद्धि या कमी की सलाह दी जाएगी। इसके अलावा, एडिटिव 6-aminohexanoic एसिड भी अनुकूलित स्क्रीन में इस्तेमाल किया गया था न्यूक्लिएशन में सुधार होगा। प्रोटीन की बूंद अनुपात: अच्छी तरह से समाधान भी क्रिस्टल विकास के लिए कारक का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है। ड्रॉप 1.5 का अनुपात - 2: 1 सिफारिश कर रहे हैं, ड्रॉप 2 के करीब अनुपात के साथ: 1 आमतौर पर बड़े 3-आयामी क्रिस्टल के विकास का समर्थन। अंत में, कम प्रोफ़ाइल 24 अच्छी तरह प्लेटें का उपयोग भी शायद वाष्प प्रसार की दर के संशोधन के कारण क्रिस्टल विकास की ओर महत्वपूर्ण है।

स्पा विधि करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण म्यूटेंट जो एक कोकीन बाध्य रचना एक फिल्टर बाध्यकारी परख 5 का प्रयोग करने में चूहे सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर को स्थिर करने के लिए स्क्रीन करने के लिए विकसित किया गया है। इसके विपरीत, स्पा बीएएसईडी परख SERT के अंश जो ligand के लिए बाध्य रहता है के निर्धारण के द्वारा निम्नलिखित अनुक्रमिक हीटिंग चरणों के लिए अनुमति देता है। इस प्रकार, इस नमूने की एक छोटी संख्या से पिघलने के तापमान में तेजी से निर्धारण के लिए अनुमति देता है। स्पा विधि एक radiolabeled उच्च आत्मीयता ligand की उपलब्धता पर निर्भर करता है और कोई ligands के नाम से जाना जाता है, तो जो submicromolar आत्मीयता के साथ बाँध तो एक वैकल्पिक दृष्टिकोण आवश्यक हो जाएगा। कई अन्य तरीकों आमतौर पर इस तरह फ्लोरोसेंट रंगों और उष्मामिति 14 के बंधन के रूप में प्रोटीन स्थिरता को मापने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन कम throughput और या तो सीधे समारोह को मापने या प्रोटीन की बड़ी मात्रा की आवश्यकता करने में असमर्थ हैं। स्पा विधि का इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, एक वैकल्पिक उच्च throughput दृष्टिकोण एक FSEC आधारित thermostability परख 15 (FSEC टीएस), जहां नमूना शेष ट्रांसपोर्टर के अंश की जुदाई के द्वारा पीछा गरम किया जाता है। FSEC टीएस chromatographic व्यवहार और oligomeric राज्य पहुँचने के लिए एक उपयोगी तरीका है और एपी हैowerful पूरक उपकरण स्पा विधि के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।

विभिन्न आम प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों की तुलना से भी SERT अभिव्यक्ति के लिए 16 स्तनधारी कोशिकाओं के उपयोग के पक्ष में पाया गया था और हैरानगी इस संभावना स्तनधारी मूल के कई प्रोटीन के लिए मामला है। तरीकों जो हम अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया है SERT के लिए अनुरूप किया गया है, लेकिन संभावना आसानी से निभा रहे हैं। स्थितियां जो अभिव्यक्ति के उच्च स्तर के पक्ष में सावधानी जैसे सोडियम butyrate के रूप में अभिव्यक्ति, तापमान, वायरस एकाग्रता, और उपस्थिति हिस्टोन deacetylase अवरोधकों के समय अलग से पहचान की जानी चाहिए।

हम आम तौर पर सीएचएस के साथ मिलकर इस तरह के C12M रूप में एक हल्के लंबी श्रृंखला डिटर्जेंट में आत्मीयता शुद्धि के पक्ष से पहले बाध्यकारी उच्च आत्मीयता ligand बनाए रखने के लिए पुनर्गठन करने के लिए। हाइड्रोफोबिक अवशोषण का उपयोग कर पुनर्गठन एक हल्के तकनीक है जो हम कई अन्य ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स के लिए प्रभावी होना पाया गया है। अगर यहसफल नहीं, डायलिसिस, कमजोर पड़ने, या एसईसी द्वारा उच्च महत्वपूर्ण मिसेल सांद्रता के साथ डिटर्जेंट को हटाने के 17 प्रदान की प्रतिजन ऐसे डिटर्जेंट में पर्याप्त रूप से स्थिर है नियोजित किया जा सकता है। मामलों में जहां कोई उपयुक्त एंटीबॉडी पाया जाता है, हम लगभग हमेशा मिल मुद्दा समारोह या प्रतिजन का विकृतीकरण के नुकसान की वजह से है और ऐसे मामलों में हम सफलतापूर्वक प्रोटीन जैव रसायन पर विशेष ध्यान दे नए टीकाकरण प्रदर्शन किया। अंत में, ligands और एंटीबॉडी जो उच्च आत्मीयता के साथ बाँध एक तर्क से योजना बनाई क्रिस्टलीकरण प्रयोग के लिए आधार के रूप में करना चाहिए और एक थर्मास्टाइबल संस्करण का लाभ लेने से, एक अलग डिटर्जेंट के गुणों को अलग से स्थितियों की एक व्यापक रेंज स्क्रीन कर सकते हैं। इसके अलावा, एक lipídic mesophase 18 में क्रिस्टलीकरण या bicelles 19 का उपयोग कर हमेशा micelles में क्रिस्टलीकरण के लिए एक विकल्प के रूप में माना जाना चाहिए।

इन प्रिंसिपलों और तरीकों कुछ modifi साथ प्रयोग किया जा सकता हैकई अन्य transmembrane प्रोटीन है जो एक्सप्रेस और अन्य अभिव्यक्ति मेजबान से शुद्ध, और उच्च आत्मीयता दवाओं के लक्ष्यों की संरचना निर्धारण के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो जाएगा करने के लिए मुश्किल हो जाता है के लिए केशन।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DH10Bac Invitrogen 10361-012
Kanamycin Fisher BP906-5
Gentamicin Fisher BP918-1
Tetracycline Sigma T-7660
Bluo-gal Invitrogen 15519-028 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside
Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside Anatrace I1003 IPTG
Miniprep kit Qiagen 27106
Cellfectin II Invitrogen 10362-100 Sf9 transfection reagent
Sf9 ATCC CRL-1711
Sf-900 III SFM media Life Technologies 12658-027
HEK-293S GnTI- ATCC CRL-3022
Freestyle 293 media Life Technologies 12338-018 293 expression media
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 0984018DJ
Sodium butyrate Sigma 303410
S-citalopram Sigma E4786 Anagrade
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside Anatrace D310
Cholesteryl hemmisuccinate Sigma C6013
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol Avanti Polar Lipids 840457P
Leupeptin Sigma L2884
Pepstatin A Sigma P5318
Aprotinin Sigma A1153
PMSF Sigma P7626
Desthiobiotin Iba Life Sciences 2-1000-05
Asolectin Sigma 11145
Cholesterol Sigma C-8667
Lipid A Sigma L5399
Brain polar lipid Avanti Polar Lipids 141101C
Biobeads Biorad 152-3920 Hydrophobic absorption resin
Goat anti-mouse IRDye 680RD Odyssey 926-68070 Used as secondary antibody for western blotting
Lauryl maltose neopentyl glycol Anatrace NG310 Anagrade
Serotonin Sigma H9523
pFastBac 8B6 Available from authors
pEG Bacmam SERT Strep II SERTIC, Available from authors
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His SERTTC, Available from authors
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His SERTCC, Available from authors
Imidazole Sigma 56749
n-Octyl β-D-maltoside Anatrace O310 Anagrade
Thrombin Haematologic Technologies HCT-0020
EndoH New England Biolabs P0702
Trizma-HCl Sigma T5941 Tris is used for preparation of crystallization reservoirs
PEG 400 Sigma 91893
6-aminohexanoic acid Sigma 7260
Trypsin-EDTA Fisher MT25052CV
Isoplate-96 TC PerkinElmer 6005070
PolyJet SignaGen SL100688 Polymer transfection reagent for mamalian cells
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads PerkinElmer RPNQ0096 His-tag affinity SPA beads
Citalopram, [N-Methyl-3H] PerkinElmer NET1039250UC
ThermoMixer C Eppendorf 5382000023 heating block for thermostability assay
ThermoTop Eppendorf 5308000003
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates Eppendorf 5306000006
0.2 µm syringe filter Olympus Plastics 25-243
1 L filter system Corning 430517
2 L flat bottom tissue culture flask Genemate F-5909-2000
2 L baffled tissue culture flask Genemate F-5909-2000B
CO2 incubator Thermo Scientific 3950
Forma Orbital Shaker Thermo Scientific 416
Strep-Tactin resin Iba Life Sciences 2-1208-025 Strep affinity resin
Extruder Northern Lipids
Li-Cor imaging system Odyssey western blot imaging system
XK16 column GE Healthcare 28-9889-37 column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton
100 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC910096
30 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC903024
Äkta FPLC GE Healthcare UPC-900
HPLC Shimadzu 51476
Superose 6 (10/300) column GE Healthcare 17-5172-01 Used for FSEC
Tangential flow apparatus Pall Filtron
0.2 µm filter tangential flow cell Pall Filtron PSM20C11
30 kDa MWCO tangential flow concentrator Pall Filtron OS030T12
Talon resin Clonetech 635504 His-tag affinity resin used for Fab purification
1 mL HiTrap SP column GE Healthcare 17115101 Cation exchanger used for Fab purification
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17-5175-01 Used for SEC separation of SERT-8B6
24-well VDXm plate Hampton Research HR3-306
18 mm coverslips Hampton Research HR3-239
Virocyt virus counter Virocyt 2100
MicroBeta Trilux PerkinElmer 1450 96-well scintillation counter
HiTrap SP column GE Healthcare 17115101
Sertraline Sigma S6319

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References

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Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J. Vis. Exp. (117), e54792, doi:10.3791/54792 (2016).

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