Summary
Este manuscrito describe cómo la pantalla para termoestabilizante mutaciones, purificar el transportador de serotonina humano, generar anticuerpos de alta afinidad, y cristalizar el complejo transportador de serotonina-anticuerpo unido a la antidepresivo fármaco S citalopram. Este protocolo puede ser adaptado para el estudio de otros transportadores desafiantes de membrana, receptores y canales.
Abstract
El transportador de la serotonina es un transportador de sodio y cloruro de acoplamiento de que "bombea" serotonina extracelular en las células. S citalopram es un fármaco utilizado para tratar la depresión y la ansiedad mediante la unión al transportador de serotonina con alta afinidad, el bloqueo de la recaptación de serotonina. Aquí mostramos un procedimiento eficaz y un conjunto de herramientas para estabilizar, expreso, purificar y cristalizar complejos transportador de serotonina-anticuerpo unidos a S citalopram y otros antidepresivos. Las mutaciones que estabilizan el transportador de serotonina se identificaron utilizando un ensayo de unión citalopram S. Transportador de la serotonina expresada en baculovirus transducidas HEK293s GnTI - células, se reconstituyó en proteoliposomas y se utiliza para generar anticuerpos de alta afinidad. Hemos desarrollado una estrategia para descubrir anticuerpos que son útiles para estudios estructurales. También se ha establecido un enfoque directo para la expresión de fragmentos de anticuerpos en células Sf9.Transporter complejos de anticuerpos purificados mediante este procedimiento se comportan bien y fácilmente cristalizan, la producción de complejos con S citalopram que difractan los rayos X para 3-4 Å de resolución. Las estrategias desarrolladas aquí pueden ser utilizados para determinar la estructura de otras proteínas de membrana desafiantes.
Introduction
El transportador de serotonina (SERT) es una proteína integral de membrana que facilita el transporte de la serotonina a través de membranas celulares 1. SERT pertenece a una familia de neurotransmisor de sodio symporters (ENA), que también incluye la dopamina y la norepinefrina 2 transportadores. SERT es la diana molecular de los fármacos antidepresivos y contra la ansiedad ampliamente prescritos que actúan para inhibir competitivamente transporte de serotonina 3. SERT explota el cotransporte energéticamente favorable de sodio para eliminar el neurotransmisor de la hendidura sináptica. Amplia caracterización del sistema serotoninérgico ha demostrado que los cambios en el metabolismo de la serotonina parecen influir en prácticamente todos los procesos neurológicos, incluyendo el estado de ánimo, el sueño, el dolor, la cognición y la agresión comportamientos 4. Función de SERT puede modificarse mediante el uso de antidepresivos y los inhibidores de la recaptación selectiva de serotonina (ISRS) como citalopram S, así como por psychostimulaNTS y drogas adictivas como la anfetamina y -methylamphetamine 3,4-methylenedioxy- N o "éxtasis" 1,2.
ISRS son tremendamente importante para el tratamiento de los trastornos del estado de ánimo, sin embargo, precisamente la base estructural para su acción no se entiende bien. WT SERT es inestable en micelas de detergente, impidiendo así el progreso hacia una estructura tridimensional (3D) de SERT 5,6. Recientemente, hemos desarrollado variantes de SERT que son robustamente estable en una amplia gama de detergentes y retienen la actividad de unión a 6 SSRI. Estas variantes de SERT termoestables fueron seleccionados utilizando un ensayo de termoestabilidad basado en proximidad de centelleo. Aquí se describe un procedimiento para la generación de anticuerpos de alta afinidad que pueden unirse SERT, y la purificación y cristalización de SERT termoestable, en el complejo con anticuerpo y S citalopram.
Este protocolo supone que el SERT y 8B6 genes han sido exitosoy se clonó en los vectores de BacMam 7 e insecto de expresión, respectivamente. Para generar anticuerpos, ADNc que codifican los residuos 73-616 de WT SERT se clonó en el vector BacMam con una etiqueta C-terminal Strep II (SERT IC). Para la pantalla termoestabilidad, se utilizaron residuos de SERT 73-616 con GFP C-terminal, Strep II, y 10-His (TC SERT). Mutaciones puntuales individuales se generaron en el fondo SERT TC. Para el protocolo de cristalización, la proteína de fusión SERT-GFP se utiliza con Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] y 10 Sus etiquetas, llevando los mutantes termoestables, Y110A, I291A, y T439S y mutaciones de cisteínas superficie C554A, C580A y C622A (CC SERT). Secuencias de escisión de trombina (LVPRGS) también se insertaron en el CC SERT después de Q76 y T618 para permitir la retirada de los extremos N- y C-terminales. El plásmido que codifica el Fab 8B6 fue diseñado para expresar tanto la cadena pesada y ligeracadenas del anticuerpo con secuencias de secreción de gp67 bajo el control de dos promotores de polihedrina separadas. El C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo 8B6 fue etiquetado con un 8-His tag y se insertó un sitio de escisión de trombina entre la cadena pesada y la etiqueta.
Protocol
1. Transfección de adherente HEK293s GnTI - Las células para la pantalla termoestabilidad
- Prepare poli-D-lisina (PDL) presenta el revestimiento placas de 96 pocillos. Realizar todo el trabajo en una campana de flujo laminar estéril.
- Filtrar una solución de 25 mg / ml de (PDL), el peso molecular 70,000-150,000 Da, utilizando un filtro estéril de 0,2 micras. Añadir 50 l de PDL a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de cultivo de tejidos (TC), asegurando la parte inferior se recubre de manera uniforme, y se incuba a TA durante 30 min.
- Aspirar solución PDL y lavar con 200 l de agua estéril.
- Permitir que la placa se seque al aire durante 2 h antes de su almacenamiento a 4 ° C. placas recubiertas de PDL se pueden almacenar a 4 ° C durante varias semanas.
- La tripsinización de células HEK293s adherentes.
- Crecer HEK293s a 80% de confluencia en una placa de 10 cm mantenida a 37 ° C con 8% de CO 2. Un plato individual de 10 cm debe tener aproximadamente 10 millones de células HEK293s. No utilice las células después de 30 pasajes! medios Aspirar y lavar con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 1 ml de solución de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina, 0,02% de EDTA) a las células y se incuba durante 2 min a 37 ° C.
- Añadir 10 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y volver a suspender las células pipeteando repetidamente hacia arriba y abajo con una pipeta serológica.
- Pipeta de 10 l de células y mezclar con 10 l de solución de azul tripán (0,4%). Determinar la densidad de células usando un hemocitómetro y un microscopio de luz. No contar las células que están teñidas de azul, ya que están muertos. Asegúrese de que la viabilidad celular está por encima de 90%.
- A fondo resuspender tripsinizaron HEK293s GnTI - células en DMEM suplementado con 10% FBS a una densidad de 0,5 x 10 6 células / ml en un depósito de pipeta desechable. Se necesitarán aproximadamente 5 millones de células HEK293s para cada plato. Un total de 24 constructos se puede transfectar en cada placa utilizando este protocol.
- Usando una pipeta multicanal, añadir 100 l de células a cada pocillo de una placa de PDL revestido. Resuspender las células en el depósito después del llenado de la pipeta cada placa para asegurar una distribución uniforme de las células. Se incuban las células en una incubadora a 37 ° con 8% de CO 2. Después de 24 h, las células deben alcanzar aproximadamente el 80% de confluencia.
- 1 h antes de la transfección en lugar de los medios de comunicación. Preparar complejos de reactivo de transfección de ADN para la transfección.
- Para cada construcción en el fondo SERT TC de ser controlados, mezclar 450 ng de ADN con 45 l de DMEM libre de suero y mezclar. Añadir 1,6 l de reactivo de transfección a 45 l de DMEM libre de suero y mezclar.
- Inmediatamente añadir solución de reactivo de transfección diluido a la solución de ADN y mezclar. No mezcle soluciones en el orden inverso. Espere de 10 - 15 min y añadir 20 l de transfección mezcla de reactivos / ADN de 4 pozos.
- Una vez que todos los pozos han sido transfectadas, placa de mezclar suavemente meciéndose hacia unand vuelta y volver a la incubadora a 37ºC.
- Después de 16 - 24 h a sustituir los soportes con DMEM que contenía suero y butirato sódico 10 mM.
- Aproximadamente 48 horas después de la transfección eliminar los medios de comunicación y, o bien inmediatamente proceder con termoestabilidad pantalla o congelar las células a -80 ° C para su uso posterior. Las células se pueden almacenar a -80 ° C durante varias semanas.
Screen termoestabilidad basado en proximidad de centelleo 2. con S citalopram
- Se incuban las células con citalopram 200 nM S en 25 l de TBS (Tris-Buffered Saline - Tris 20 mM, pH 8, NaCl 100 mM) durante 5 min a TA.
- Solubilizar las células mediante la adición de 25 l de 8 mM n-dodecil-β-D-maltopiranósido (C12M), 1 mM de colesterilo hemmisuccinate (CHS), cóctel inhibidor de proteasa (2 mM fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF), 0,1 mg / ml de aprotinina, 4 g / ml de pepstatina a, y 4 mg / ml de leupeptina) en TBS, e incubando durante 1 h a TA.
- Añadir 50 l de TBS wiTH 20 nM de [3H] citalopram (81,7 Ci / mmol), 0,1% de albúmina de suero bovino, y 2 mg de ensayo / mL His-tag de afinidad de proximidad de centelleo (SPA) perlas a tres pocillos para cada constructo. Para el último pocillo añadir la misma solución de la lista, pero complementar con sertralina 100 mM para determinar la unión no específica. Asegúrese de que la afinidad de His-tag perlas de SPA se mezclan a fondo cuando se añade a la placa de 96 pocillos.
- Medir [3 H] citalopram unión usando un contador de centelleo de 96 pocillos a temperatura ambiente con un tiempo de recuento de 1 min por pocillo. Continuar placas de conteo hasta que los recuentos totales meseta (aproximadamente después de 36 h).
- placas de calor durante 15 minutos en un bloque de calentamiento con una tapa calentada a 33 ° C. Medir [3 H] citalopram unión de nuevo después del calentamiento como se describe en 2.4.
- Repita el paso 2.4 hasta 2.5 y cambiar la etapa de calentamiento a 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C y 51 ° C. Ajuste temperaturas de calentamiento en función de la temperatura aparente de fusión (Tm)de la proteína diana y la termoestabilidad de la construcción más estable. Continuar calentando las placas hasta que todas las construcciones tienen bajos recuentos específicos.
- Analizar los datos para determinar los valores de Tm.
- Determinar las cuentas totales promedio por minuto (CPM) de cada construcción de pozos que no contienen sertralina promediando los 3 pocillos replicados. Determinar el CPM no específico al promediar las CPM de cada pocillo que contiene sertralina en una sola placa.
- Calcula CPM específica restando la CPM no específico del CPM total.
- Calcular la Tm mediante un ajuste no lineal a una función sigmoidal Boltzmann. Construcciones con bajo CPM específica a la temperatura ambiente (<10% de WT) en general no tienen valores precisos de Tm. Las mutaciones de las construcciones de la mayoría de los termoestables pueden combinarse entre sí y se seleccionan de aditivos aumentos en la termoestabilidad.
3. Expresión del transportador de serotonina humano en HEK293s GnTI 4. Purificación por Afinidad del transportador de serotonina de Inmunización y cristalización 5. La reconstitución del Transportador en liposomas para la inmunización 6. La detección de anticuerpos que reconocen epítopos 3D 7. La expresión de fragmento de anticuerpo en células Sf9 9. Formación de Complejos y Separación Transporter-anticuerpo mediante cromatografía de exclusión molecular 10. La cristalización de complejos anticuerpo-Transporter de gota colgante
NOTA: DNA de Bacmid debe transfectarse en células Sf9 de inmediato para los mejores resultados, pero también puede ser almacenado a -20 ° C durante varias semanas. <li> Retire el medio de las células y añadir 2 ml de medio fresco Sf9. Añadir 5 g de ADN bácmido a 100 l de los medios de comunicación Sf9 (Solución A).
NOTA: No se recomienda el uso de más de 80 ml de virus P2 desde la HEK293s GnTI - células crecerán lentamente y puede llegar a ser inviable debido a un cambio en el pH. Sf9 medios de comunicación es más ácido que los medios de comunicación 293 expresión.
NOTA: El rendimiento total será de 3 -4 mg de SERT CC y 1 mg de SERT IC. Una absorbancia de 2 AU a 280 nm es igual a 1 mg / mL SERT.
NOTA: Use Tris ajustado con NaOH a pH 8,5 como tampón. No utilice Tris base ajustada con HCl. La pantalla puede ser preparado en 2 tubos mL y se utiliza hasta que termine. Tenga cuidado de la pipeta con precisión PEG 400 utilizando una pipeta de desplazamiento positivo, ya que es extremadamente viscosa!
NOTA: La placa fue comprado con sellador ya aplicada al borde de los pozos.
NOTA: Los cristales simples aparecerán dentro de aproximadamente 3 días y hacer crecer a 100-175 micras después de 14 días.
Representative Results
Una biblioteca de mutantes de un solo punto en el fondo SERT TC se ha creado para la detección de mutaciones termoestabilizante. mutantes individuales se generaron utilizando mutagénesis estándar. El protocolo de selección utiliza células HEK293s y una pantalla de termoestabilidad basado en proximidad de centelleo transfectadas transitoriamente para rápidamente identidad mutaciones útiles para la cristalización como se describe en la Figura 1A. Los valores de trazado Tm frente unido [3 H] citalopram a TA revela construcciones con altos niveles de termoestabilidad y de expresión adecuados para la purificación de proteínas (Figura 1B). Tres mutantes (Y110A, I291A, y T439S) se combinaron para generar una construcción muy estable (Figura 1C). Termoestabilidad también se correlaciona con aumento de la estabilidad en los detergentes de cadena corta necesarios para la cristalización del complejo SERT-Fab.
La expresión a gran escala de SERT humano utilizando baculovirus-transduced HEK293s GnTI - células puede tomar menos de 2 semanas y puede producir cantidades de miligramos, como se ilustra en la Figura 2A. Uso de la proteína SERT CC GFP-etiquetado permite SERT para ser convenientemente seguida durante la expresión y la purificación por fluorescencia (Figura 2B). Nuestra estrategia de purificación implicó 1) solubilización de SERT unido a S citalopram de HEK293s GnTI - células en C12M en presencia de CHS como un lípido estabilizador; 2) unión de SERT a una matriz de afinidad Strep; 3) eliminación de las proteínas contaminantes por lavado extenso; y 4) la elución de la SERT funcional con tampón que contenía destiobiotina (Figura 2C). La proteína eluida es en gran parte libre de otras proteínas detectables por tinción con azul de Coomassie y monodisperso como se juzga por FSEC (Figura 2D, E).
Una estrategia similar fue llevado a purificar SERT con una etiqueta Strep II que se utilizó para reconstitution y la inmunización (Figura 3A, B). Incorporación de SERT en proteoliposomas aumenta la vida media en suero y la estabilidad de SERT y mejora la probabilidad de aislamiento de anticuerpos de alta afinidad. Además, la inclusión de lípido A, un componente de la pared celular bacteriana, sirve como un potente adyuvante 9. Los liposomas multilamelares se prepararon mediante la adición de tampón a una mezcla de lípidos secos en tubos de vidrio y se resuspendieron en tampón. La extrusión de los liposomas a través de filtros de tamaño de poro de 200 nm produce suspensiones de liposomas unilamelares monodispersas. Los liposomas se saturan entonces con un detergente, seguido de la adición de SERT purificada en detergente. Finalmente, el detergente se elimina por adición de resina de absorción hidrófobo para el lípido: mezcla de detergente. ligando adicional debe ser añadido a la muestra reconstituida para seleccionar anticuerpos que reconocen la conformación unida antidepresivo. La presencia de SERT en los proteoliposomas debe ser confirmado porsolubilización de una pequeña muestra con el tinte SDS-PAGE de carga o C12M y en ejecución en SDS-PAGE y FSEC (Figura 3C, D).
líneas celulares de hibridoma que expresan anticuerpos de SERT pueden ser examinados para la alta afinidad de unión que reconocen epítopos en 3D. Estas propiedades son cruciales para el éxito final de la cristalización, como el anticuerpo debe permanecer firmemente unido a una zona estructurada para promover el empaquetamiento cristalino de dominios homogéneos, bien ordenadas. En el primer paso, se identifican los anticuerpos que reconocen regiones no estructurados. SERT se desnaturaliza y se transfirió sobre una membrana de nitrocelulosa; anticuerpos que se unen SERT desnaturalizada deberán ser occidental-positivo y es probable que reconocen epítopos lineales. En la figura 4A, se muestra 2 ejemplos de anticuerpos que son positivos occidental y probablemente no es útil para promover crystallogenesis. En la Figura 4B, los restantes anticuerpos western-negativas se incubaron con 100 nM SERT-GFP y se separaron porFSEC. Los anticuerpos que se unen SERT se desplazará el pico GFP-positivas a una posición anterior. Los complejos de SERT-anticuerpo pueden diluirse adicionalmente en detergente para determinar si pueden unirse con afinidad nanomolar seguido de análisis por FSEC. La adición de los resultados de serotonina en los cambios conformacionales en el transportador y por tanto los anticuerpos pueden ser controlados de nuevo para determinar si pueden reconocer específicamente la conformación unida a SSRI. En la Figura 4C, los anticuerpos se muestra de obligar a SERT, en presencia de serotonina, lo que demuestra que el epítopo (s) no cambian de la ISRS al sustrato estado ligado. Finalmente, en la Figura 4D combinaciones de anticuerpos se ensayaron para determinar su capacidad de unirse a distintos epítopos, lo que resulta en un desplazamiento hacia la izquierda más allá. Aquí el 15B8 o 8A11 anticuerpos reconocen un epítopo que es diferente de 8B6.
El anticuerpo 8B6 se eligió para su posterior análisis estructural basado en el cribado preliminar con cristal trea papaínaTed Fab. Los genes de la 8B6 Fab se clonaron en un vector de expresión de células de insecto. Fab puede ser expresado y secretado a partir de células Sf9 que crecen en suspensión. El 8B6 Fab se puede purificar a partir del sobrenadante de células Sf9 por His-tag de afinidad (Figura 5A, B) y cromatografía de intercambio catiónico (Figura 5C, D), resultando en la proteína que aparece libre de contaminantes en geles de SDS-PAGE. En la Figura 5E, el recombinante 8B6 Fab se muestra para unirse SERT y se utiliza en experimentos bioquímicos y biofísicos posteriores.
La afinidad purificado SERT CC es digerido con trombina y EndoH y se mezcla con 8B6 Fab para formar un complejo en presencia de S citalopram. El complejo transportador-anticuerpo se separa entonces por SEC en C8M (Figura 6A) y las fracciones pico contiene tanto SERT y Fab tal como se muestra por SDS-PAGE (Figura 6B). El uso de C8M es crucial para la formación de cristales probablemente porqueel detergente de cadena corta permite un mejor empaquetamiento entre las moléculas en la red cristalina. FSEC se emplea para determinar qué fracciones se reunirán para la cristalización (Figura 6C); fracciones que no son monodispersas y / o que contienen grandes cantidades de SERT libre o Fab no se deben combinar.
Prisma en forma de cristales de SERT-anticuerpo pueden ser cultivadas en presencia de S citalopram usando este protocolo en la horca difusión del vapor de gota (Figura 7A). Los cristales resultantes se difractan los rayos X a una resolución de 3,15 Å 10 (Figura 7B).
Figura 1: centelleo por proximidad basada en la termoestabilidad de ensayo A.. Descripción general de protocolo para la detección de termoestabilidad en la presencia de [3H] citalopram. B. Máximo consolidado [3 (Tm). Las líneas de puntos representan los valores para el transportador de WT. Los 3 mutantes más termoestables están etiquetados. Área gris representa mutantes que tienen menos del 10% de citalopram [3H] en relación con valores de Tm por lo tanto inexactas WT y vinculante debido a una baja relación señal-ruido. C. Curvas de termoestabilidad para WT SERT TC y los 3 primeros mutantes. Las barras de error representan la desviación estándar (DE). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visión general de mamífero heterólogos Expresión de proteínas A.. Resumen esquematizado de la generación de virus BacMam y expresión de SERT en HEK293s GnTI -. Células B. ÉLK293S GnTI - células que expresan el SERT CC (fluorescencia GFP) C.. Perfil de elución de SERT CC en resina de afinidad Strep. Rastro verde representa la concentración de destiobiotina, 0 - 100% (0 - 5 mM) D.. Análisis de afinidad purificado CC SERT en un 4 - gel 15% SDS-PAGE E.. FSEC de afinidad CC SERT purificada detectada por fluorescencia de GFP (excitación: 480 nm; Emisión: 510 nm). El pico que eluyó a 15 ml es SERT (#) y 18 ml de GFP es gratuita (*). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representante de afinidad purificación y reconstitución del SERT IC A.. visión general esquemática de la generación de anticuerpos. <strong> B. Perfil de elución observó a 280 nm de la purificación por afinidad de SERT IC en resina de afinidad Strep. Rastro verde representa la concentración de destiobiotina, 0 - 100%. (0 - 5 mM) C. Análisis de afinidad purificado y reconstituido SERT en un 4 - gel 15% SDS-PAGE D.. FSEC de SERT solubilizado después de la reconstitución. Se utilizó la fluorescencia del triptófano residuos para detectar SERT (Excitación: 280 nm; Emisión: 335 nm). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Análisis de anticuerpos representativos de SERT A. Cribado de anticuerpos a través de Western blot. Aproximadamente 1 g de SERT CC con o sin GFP se aplicó a un 4-15% SDSgel PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La unión se detectó utilizando un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con IR Dye. 2G4 y 10F2 son occidentales positivo. B. La unión de anticuerpos a 100 nm SERT GFP-etiquetado y detección por FSEC detectó utilizando fluorescencia de GFP. C. La unión de los Fab seleccionados a 100 nM SERT GFP-etiquetados en presencia de 1 mM de serotonina. D. La unión de los Fab 8A11 o 15B8 de SERT-8B6 Fab. Picos menores que eluyó a 18 ml GFP son gratis. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Purificación Representante de la 8B6 Fab a partir de células Sf9 A.. Perfil de elución observó a 280 nm de la purificación de la 8B6 Fab por His-tag chromatograp afinidad HY. Rastro verde representa la concentración de imidazol, 0 - 50% (0-250 mM) B.. No reductoras y reductoras en gel SDS-PAGE después de la purificación por afinidad de His-tag. La proteína que se extiende cerca de 50 kDa es Fab no reducido (#) y especies menores a 25 kDa se reduce Fab (*). C. Perfil de elución observó a 280 nm de la purificación de la 8B6 Fab mediante intercambio catiónico presentan un único pico simétrico que eluye bajo un gradiente lineal de cloruro sódico. Rastro verde representa la concentración de NaCl, 0 - 100%. (0 - 500 mM) D. Análisis de la 8B6 Fab en un gel de SDS-PAGE al 12,5% después de la purificación por intercambio catiónico. E. La unión del Fab 8B6 a 10 nM SERT GFP-etiquetados, detectado mediante fluorescencia de GFP. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 6: Representante de filtración en gel La cromatografía del Complejo SERT-8B6 en la Presencia de citalopram S A.. Gel perfil de filtración en la elución del complejo de SERT-8B6 purificado. pico principal que eluyó a 11,5 ml es el complejo SERT-8B6. Pico a 15 - 17 ml contiene GFP y Fab B.. Análisis del complejo SERT-8B6 se purificó en una 4 - gel SDS-PAGE 15%. Las posiciones de SERT y las cadenas pesada y ligera del Fab se muestran por un guión. C. FSEC de las fracciones de tamaño separados. complejos SERT-8B6 se detectaron utilizando fluorescencia de triptófano. Fracción 17 contiene una mayor cantidad de SERT que no lo hizo complejo con Fab. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: La cristalización del complejo SERT-8B6 Bound to S citalopram A.. Microscopía de luz de los cristales de forma de paralelepípedo del complejo SERT-8B6 después de 2 semanas de crecimiento. La barra de escala es igual a 200 micras. B. cristales SERT-8B6 difractan los rayos X a 3,15 Å. anillo azul representa un 3,15 Å. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1:. Una pantalla de cristalización para el Complejo SERT-8B6 Bound to S citalopram Por favor, haga clic aquí para descargar la tabla.
Discussion
Determinación de la estructura de la proteína de membrana mediante técnicas biofísicas sigue siendo una tarea de enormes proporciones para muchos transportadores médicamente significativos, receptores y canales 11. Aquí compartimos conocimientos detallados desarrollado para la determinación de la estructura del transportador de serotonina humana unida a S citalopram. Anticipamos que estos métodos serán útiles para determinar estructuras de SERT en otros estados conformacionales, así como estructuras de otras proteínas de la membrana difíciles. Además, las técnicas bioquímicas descritas aquí también se pueden utilizar para la función de SERT purificada en detergente y un entorno de lípidos casi nativo estudiar.
SERT cristalización con bisagras en el desarrollo de varios instrumentos y técnicas. En primer lugar, la mejora de la termoestabilidad transportador producen variantes de SERT que se comportan bien en varias micelas de detergente después de la extracción del transportador de las membranas 6. En segundo lugar, el usode la alta afinidad de ligando S citalopram a lo largo de la purificación y cristalización mejora adicionalmente la estabilidad y la reducción de la heterogeneidad conformacional. En tercer lugar, el desarrollo del sistema de expresión BacMam 7 permitido para la producción de grandes cantidades de SERT en un corto período de 2 semanas, lo que facilita tanto la inmunización y cristalización. Por último, el desarrollo de estrategias para seleccionar los anticuerpos de alta afinidad que reconocen epítopos 3D permitidos para el descubrimiento del anticuerpo 8B6 que promueve el embalaje bien ordenada de los complejos de SERT-anticuerpo en cristales.
Hay una serie de pasos críticos y los reactivos, así como problemas comunes que a menudo se producen en todo el protocolo. En primer lugar, la generación de alto título de virus SERT P2 puede ser problemático. La adición de bajas concentraciones de virus P1 para generar virus P2 como se describe en este protocolo por lo general mitiga este problema, y en casos en que el título de virus P2 es baja, virus P3 se puede hacer usinG del virus a una MOI de 0,0001. Los virus con un título de menos de 1 x 10 8 partículas de virus / mL no se deben utilizar y casi siempre como resultado rendimientos de proteínas bajas. Para la expresión, HEK293s GnTI - se eligieron las células ya que carecen de N -acetylglucosaminyltransferase I actividad y por lo tanto no pueden sintetizar complejos -glycans N, en lugar produciendo sólo de alta manosa N -glycans. Escinde EndoH N -ligada glicosilación de alta manosa glicanos en dos sitios en bucle extracelular 2 (EL2), dejando un acetilglucosamina N unido a asparagina. La digestión de N -vinculada azúcares reduce la entropía superficie de EL2 que probablemente importante para la cristalización. Para la generación de anticuerpos, el SERT IC se debe utilizar para la inmunización. GFP es altamente inmunogénica 12 y no debe ser utilizado como un marcador de fusión para generar anticuerpos, ya que es difícil eliminar completamente por SEC. también El N- flexible y C-terminal de SERT no eranincluido en el constructo con el fin de evitar los anticuerpos contra estas regiones. Los ratones pueden inmunizarse con 30 g de proteína reconstituida; continuar ratones inmunizantes hasta altas concentraciones en suero de anticuerpos se pueden detectar y producir células de hibridoma como se describe 13. Una construcción termoestabilizada suele ser la mejor opción para la inmunización; si el transportista se comporta bien y retiene la actividad biológica después de la purificación, esto es a menudo suficiente para generar anticuerpos. El anticuerpo 8B6 se planteó en contra WT SERT. Para la cristalización, sólo las fracciones de los picos de SEC que contienen complejo monodisperso como se juzga por FSEC deben ser combinados y se concentraron. cristales SERT-8B6 crecen en un estrecho rango de condiciones y hay una serie de pasos que se deben tomar para solucionar problemas relacionados específicamente con el crecimiento de cristales SERT. Tris base ajustado con HCl no se debe utilizar en la solución de depósito, ya que este tampón no soporta el crecimiento de cristales; por lo que es critical para usar en lugar Tris ajustado con NaOH. cristales de SERT crecen en un estrecho rango de concentraciones de PEG 400, por lo que si los cristales no crecen o si se observan muchos cristales pequeños, se aconseja incluso un pequeño aumento o disminución en la concentración de PEG 400. Además, también se utilizó el ácido aditivo 6-aminohexanoico en la pantalla optimizado para mejorar la nucleación. La relación gota de proteínas: solución bien es también un factor determinante para el crecimiento de los cristales. Caída de proporciones de 1,5 a 2: 1 se recomienda, con relaciones de gota más cerca de 2: 1 típicamente apoyar el crecimiento de cristales de 3 dimensiones más grandes. Finalmente, el uso de perfil bajo placas de 24 pocillos también es crucial para el crecimiento de cristales, presumiblemente debido a la modificación de la velocidad de difusión de vapor.
Un enfoque alternativo para el método de SPA ha sido desarrollado para la detección de mutantes que estabilizan el transportador de serotonina de rata en una conformación de cocaína unida usando un filtro de ensayo 5 de unión. Por el contrario, los BA SPAensayo sed permite etapas de calentamiento secuenciales siguientes mediante la determinación de la fracción de SERT que permanece unida a ligando. Por lo tanto, esto permite la determinación rápida de la temperatura de fusión de un pequeño número de muestras. El método de SPA se basa en la disponibilidad de un ligando de alta afinidad radiomarcado y si no se conocen ligandos que se unen con afinidad submicromolar entonces será necesario un enfoque alternativo. Muchos otros métodos se utilizan comúnmente para medir la estabilidad de proteínas tal como la unión de colorantes fluorescentes y calorimetría 14 pero son de bajo rendimiento y son incapaces de medir directamente la función o requerir grandes cantidades de proteína. Si no se puede utilizar el método de SPA, un enfoque de alto rendimiento alternativa es un ensayo basado en FSEC termoestabilidad 15 (FSEC-TS), donde la muestra se calienta seguido de separación de la fracción de transportador restante. FSEC-TS es un enfoque útil para acceder comportamiento cromatográfico y el estado oligomérico y es apowerful herramienta complementaria que puede ser utilizado junto con el método de SPA.
También se encontró una comparación de diversos sistemas de expresión de proteínas comunes a favorecer el uso de células de mamífero para la expresión SERT 16 y como era de esperar este es probablemente el caso de muchas proteínas de origen mamífero. Los métodos que hemos utilizado para la expresión se han adaptado para SERT pero es probable fácilmente adaptable. Las condiciones que favorecen altos niveles de expresión deben ser cuidadosamente identificados por la variación del tiempo de la expresión, la temperatura, la concentración de virus, y la presencia de inhibidores de la histona desacetilasa tales como butirato de sodio.
Por lo general, a favor de la purificación por afinidad en un detergente de cadena larga suave tal como C12M junto con CHS antes de la reconstitución para retener de unión a ligando de alta afinidad. La reconstitución usando absorción hidrófobo es una técnica suave que hemos encontrado para ser eficaz para varios otros transportadores y receptores. Si estono tiene éxito, la eliminación de los detergentes con altas concentraciones micelares críticas mediante diálisis, dilución, o SEC se puede emplear 17 proporcionan el antígeno es suficientemente estable en tales detergentes. En los casos en que no se detectan anticuerpos adecuados, nos encontramos casi siempre el problema es debido a la pérdida de la función o desnaturalización del antígeno y en tales casos se realizó con éxito nuevas vacunas prestando especial atención a la bioquímica de proteínas. Finalmente, ligandos y anticuerpos que se unen con alta afinidad deben constituir la base para un experimento de cristalización racionalmente planificada y mediante el aprovechamiento de una variante termoestable, se puede seleccionar una gama más amplia de condiciones mediante la variación de las propiedades de diferentes detergentes. Además, la cristalización en una mesofase lipídica 18 o el uso de bicelas 19 siempre deben ser considerados como una alternativa a la cristalización en micelas.
Estos principios y métodos se pueden utilizar con un poco de modificación para muchas otras proteínas transmembrana que son difíciles de expresar y purificar a partir de otros huéspedes de expresión, y que será particularmente útil para la determinación de la estructura de los objetivos de los medicamentos de alta afinidad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DH10Bac | Invitrogen | 10361-012 | |
| Kanamycin | Fisher | BP906-5 | |
| Gentamicin | Fisher | BP918-1 | |
| Tetracycline | Sigma | T-7660 | |
| Bluo-gal | Invitrogen | 15519-028 | 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside |
| Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside | Anatrace | I1003 | IPTG |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Cellfectin II | Invitrogen | 10362-100 | Sf9 transfection reagent |
| Sf9 | ATCC | CRL-1711 | |
| Sf-900 III SFM media | Life Technologies | 12658-027 | |
| HEK-293S GnTI- | ATCC | CRL-3022 | |
| Freestyle 293 media | Life Technologies | 12338-018 | 293 expression media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 0984018DJ | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410 | |
| S-citalopram | Sigma | E4786 | Anagrade |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| Cholesteryl hemmisuccinate | Sigma | C6013 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457P | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757P | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol | Avanti Polar Lipids | 840457P | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Desthiobiotin | Iba Life Sciences | 2-1000-05 | |
| Asolectin | Sigma | 11145 | |
| Cholesterol | Sigma | C-8667 | |
| Lipid A | Sigma | L5399 | |
| Brain polar lipid | Avanti Polar Lipids | 141101C | |
| Biobeads | Biorad | 152-3920 | Hydrophobic absorption resin |
| Goat anti-mouse IRDye 680RD | Odyssey | 926-68070 | Used as secondary antibody for western blotting |
| Lauryl maltose neopentyl glycol | Anatrace | NG310 | Anagrade |
| Serotonin | Sigma | H9523 | |
| pFastBac 8B6 | Available from authors | ||
| pEG Bacmam SERT Strep II | SERTIC, Available from authors | ||
| pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His | SERTTC, Available from authors | ||
| pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His | SERTCC, Available from authors | ||
| Imidazole | Sigma | 56749 | |
| n-Octyl β-D-maltoside | Anatrace | O310 | Anagrade |
| Thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| EndoH | New England Biolabs | P0702 | |
| Trizma-HCl | Sigma | T5941 | Tris is used for preparation of crystallization reservoirs |
| PEG 400 | Sigma | 91893 | |
| 6-aminohexanoic acid | Sigma | 7260 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher | MT25052CV | |
| Isoplate-96 TC | PerkinElmer | 6005070 | |
| PolyJet | SignaGen | SL100688 | Polymer transfection reagent for mamalian cells |
| Copper HIS-Tag YSI SPA Beads | PerkinElmer | RPNQ0096 | His-tag affinity SPA beads |
| Citalopram, [N-Methyl-3H] | PerkinElmer | NET1039250UC | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | heating block for thermostability assay |
| ThermoTop | Eppendorf | 5308000003 | |
| SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates | Eppendorf | 5306000006 | |
| 0.2 µm syringe filter | Olympus Plastics | 25-243 | |
| 1 L filter system | Corning | 430517 | |
| 2 L flat bottom tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000 | |
| 2 L baffled tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000B | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Forma Orbital Shaker | Thermo Scientific | 416 | |
| Strep-Tactin resin | Iba Life Sciences | 2-1208-025 | Strep affinity resin |
| Extruder | Northern Lipids | ||
| Li-Cor imaging system | Odyssey | western blot imaging system | |
| XK16 column | GE Healthcare | 28-9889-37 | column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton |
| 100 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC910096 | |
| 30 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC903024 | |
| Äkta FPLC | GE Healthcare | UPC-900 | |
| HPLC | Shimadzu | 51476 | |
| Superose 6 (10/300) column | GE Healthcare | 17-5172-01 | Used for FSEC |
| Tangential flow apparatus | Pall Filtron | ||
| 0.2 µm filter tangential flow cell | Pall Filtron | PSM20C11 | |
| 30 kDa MWCO tangential flow concentrator | Pall Filtron | OS030T12 | |
| Talon resin | Clonetech | 635504 | His-tag affinity resin used for Fab purification |
| 1 mL HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | Cation exchanger used for Fab purification |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | Used for SEC separation of SERT-8B6 |
| 24-well VDXm plate | Hampton Research | HR3-306 | |
| 18 mm coverslips | Hampton Research | HR3-239 | |
| Virocyt virus counter | Virocyt | 2100 | |
| MicroBeta Trilux | PerkinElmer | 1450 | 96-well scintillation counter |
| HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | |
| Sertraline | Sigma | S6319 |
References
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