Summary
Ce manuscrit décrit comment dépister les thermostabilizing mutations, purifier le transporteur de la sérotonine humaine, générer des anticorps de haute affinité, et cristalliser le complexe transporteur-anticorps sérotonine lié à l'antidépresseur drogue S -citalopram. Ce protocole peut être adapté à l'étude d'autres transporteurs membranaires complexes, des récepteurs et des canaux.
Abstract
Le transporteur de la sérotonine est un transporteur de sodium et de chlorure couplés que "pompes" sérotonine extracellulaire dans les cellules. S -citalopram est un médicament utilisé pour traiter la dépression et l' anxiété en se liant au transporteur de la sérotonine à haute affinité, bloquant la recapture de la sérotonine. Nous rapportons ici une procédure efficace et un ensemble d'outils pour stabiliser, express, purifier et cristalliser les complexes de transporteur-anticorps liés à la sérotonine S -citalopram et d' autres antidépresseurs. Les mutations qui stabilisent le transporteur de la sérotonine ont été identifiés à l' aide d' un essai de liaison S -citalopram. Serotonin transporteur exprimé en baculovirus transduites HEK293S GnTI - cellules, a été reconstitué en protéoliposomes et utilisé pour produire des anticorps de haute affinité. Nous avons développé une stratégie pour découvrir des anticorps qui sont utiles pour les études structurelles. Une approche simple pour l'expression de fragments d'anticorps dans des cellules Sf9 a également été établi.Complexes Transporter-anticorps purifiés à l' aide de cette procédure sont bien comportés et facilement cristallisent, produisant des complexes avec S -citalopram qui diffractent les rayons X à 3-4 Å de résolution. Les stratégies développées ici peuvent être utilisées pour déterminer la structure des autres protéines membranaires difficiles.
Introduction
Le transporteur de la serotonine (SERT) est une protéine membranaire intégrale qui facilite le transport de la sérotonine à travers les membranes cellulaires 1. SERT appartient à une famille de neurotransmetteur Sodium symporteurs (SSN) , qui comprend également la dopamine et la noradrénaline transporteurs 2. SERT est la cible moléculaire des antidépresseurs et anti-anxiété médicaments largement prescrits qui agissent pour inhiber de manière compétitive le transport de la sérotonine 3. SERT exploite le cotransport énergétiquement favorable de sodium pour éliminer neurotransmetteur de la fente synaptique. Une caractérisation exhaustive du système sérotoninergique a montré que les changements dans le métabolisme de la sérotonine semblent influencer pratiquement tous les processus neurologiques y compris l' humeur, le sommeil, la douleur, la cognition et l' agression comportements 4. Fonction SERT peut être modifiée par l'utilisation d'antidépresseurs et sélective recaptage de la sérotonine (ISRS) tels que S -citalopram, ainsi que par psychostimulants et les médicaments de dépendance tels que l' amphétamine et de 3,4-méthylènedioxy N -methylamphetamine ou "ecstasy" 1,2.
ISRS sont extrêmement importantes pour le traitement des troubles de l'humeur, mais la base structurelle précise pour leur action est pas bien comprise. WT SERT est instable dans des micelles de détergent, entravant ainsi les progrès vers un (3D) structure tridimensionnelle de 5,6 SERT. Récemment, nous avons développé des variantes de SERT qui sont solidement stable dans une large gamme de détergents et conservent l' activité 6 liaison ISRS. Ces variants ont été sélectionnés SERT thermostables utilisant un essai de stabilité thermique à base de proximité à scintillation. Nous décrivons ici un procédé pour la production d'anticorps à haute affinité qui peuvent se lier SERT et la purification et la cristallisation du SERT thermostable, dans un complexe avec l' anticorps et S -citalopram.
Ce protocole suppose que le SERT et 8B6 gènes ont été successfully cloné dans les vecteurs BacMam 7 et expression d' insecte, respectivement. Pour générer des anticorps, ADNc codant pour les résidus 73-616 du WT SERT a été cloné dans le vecteur BacMam avec un Strep II tag C-terminal (SERT IC). Pour l'écran de thermostabilité, les résidus de 73-616 avec SERT C-terminal GFP, Strep II, et 10-His (SERT TC) a été utilisé. Mutations ponctuelles individuelles ont été générés en arrière - plan TC SERT. Pour le protocole de cristallisation, la protéine de fusion SERT-GFP a été utilisé avec deux lits Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] et 10-His, portant les mutants thermostables, Y110A, I291A, et T439S et les mutations des cysteines de surface C554A, C580A et C622A (SERT CC). Des séquences de clivage par la thrombine (LVPRGS) ont également été insérés dans le CC SERT après Q76 et T618 pour permettre le retrait de l'extrémité N- et C-terminales. Le plasmide codant pour le 8B6 Fab a été conçu pour exprimer à la fois la lourde et légèrechaînes de l'anticorps avec gp67 sécrétion des séquences sous le contrôle de deux promoteurs de polyhédrine séparés. L'extrémité C-terminale de la chaîne lourde de l'anticorps 8B6 a été marqué avec un-His 8 tag et un site de clivage de thrombine a été inséré entre la chaîne lourde et la balise.
Protocol
1. Transfection de Adhérent HEK293S GnTI - Cellules pour écran Thermostabilité
- Préparer la poly-D-lysine (PDL) doté d'un revêtement de plaques à 96 puits. Effectuer tous les travaux dans une hotte à flux laminaire stérile.
- Filtrer une solution à 25 pg / ml de page (PDL), le poids moléculaire 70,000-150,000 Da, en utilisant un filtre stérile de 0,2 pm. Ajouter 50 ul de PDL à chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 96 puits (TC), assurant ainsi le fond est uniformément revêtue et incuber à température ambiante pendant 30 min.
- solution Aspirer PDL et laver avec 200 pi d'eau stérile.
- Laisser la plaque sécher à l'air pendant 2 h avant le stockage à 4 ° C. des plaques revêtues PDL peuvent être stockés à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
- Trypsinisation des cellules adhérentes HEK293S.
- Cultiver HEK293S à 80% de confluence dans une boîte de 10 cm maintenue à 37 ° C avec 8% de CO 2. Une seule boîte de 10 cm devrait avoir environ 10 millions de cellules HEK293S. Ne pas utiliser des cellules après 30 passages! Aspirer le milieu et on lave avec 5 ml de tampon phosphate salin (PBS). Ajouter 1 ml de solution de trypsine-EDTA (0,25% de trypsine, 0,02% d'EDTA) aux cellules et on incube pendant 2 min à 37 ° C.
- Ajouter 10 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et de remettre les cellules par pipetage de haut en bas plusieurs fois à l'aide d'une pipette sérologique.
- Pipette 10 pi de cellules et mélanger avec 10 pi de solution de bleu trypan (0,4%). Déterminer la densité des cellules en utilisant un hémocytomètre et un microscope optique. Ne pas compter les cellules qui sont colorées bleu comme ils sont morts. Faire en sorte que la viabilité des cellules est supérieure à 90%.
- Remettre en suspension à fond trypsinisées HEK293S GnTI - les cellules dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS à une densité de 0,5 x 10 6 cellules / mL dans un réservoir de pipette jetable. Environ 5 millions de cellules HEK293S seront nécessaires pour chaque plaque. Un total de 24 constructions peuvent être transfectées sur chaque plaque à l'aide de cette protocole.
- À l'aide d'une pipette multicanaux, ajouter 100 pi de cellules à chaque puits d'une plaque revêtue PDL. Resuspendre les cellules dans le réservoir après le remplissage de la pipette chaque plaque pour assurer une distribution uniforme des cellules. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° avec 8% de CO 2. Après 24 h, les cellules devraient atteindre environ 80% de confluence.
- 1 h avant la transfection remplacer les médias. Préparer des complexes ADN-réactif de transfection pour la transfection.
- Pour chaque construction en arrière - plan SERT TC à cribler, mélanger 450 ng d' ADN avec 45 pi de DMEM sans sérum et mélanger. Ajouter 1,6 ul du réactif de transfection à 45 pi de DMEM sans sérum et mélanger.
- Immédiatement ajouter la solution diluée de réactif de transfection à la solution d'ADN et mélanger. Ne pas mélanger les solutions dans l'ordre inverse. Attendez de 10 - 15 min et ajouter 20 pi de mélange réactif / transfection d'ADN à 4 puits.
- Une fois que tous les puits ont été transfectées, mélanger la plaque en basculant doucement unnd avant et revenir à la 37 ° C incubateur.
- Après 16 - 24 h remplacent les médias avec DMEM contenant du sérum et de butyrate de sodium à 10 mM.
- Environ 48 h après la transfection supprimer les médias et soit procéder immédiatement à thermostabilité écran ou congeler les cellules à -80 ° C pour être utilisé plus tard. Les cellules peuvent être stockées à -80 ° C pendant plusieurs semaines.
Écran Thermostabilité basé à proximité 2. Scintillation avec S -citalopram
- Incuber les cellules avec le -citalopram de 200 nM dans 25 pi de TBS (Tris Buffered Saline - Tris 20 mM, pH 8, NaCl 100 mM) pendant 5 min à température ambiante.
- Solubiliser les cellules en ajoutant 25 pi d'mM n-dodécyl-β-D-maltopyranoside 8 (C12M), 1 mM de cholestéryle hemmisuccinate (SCH), cocktail inhibiteur de protease (fluorure de phénylméthanesulfonyle 2 mM (PMSF), 0,1 mg / ml d'aprotinine, 4 g / ml de pepstatine A, et 4 ug / ml de leupeptine) dans du TBS, et incubation pendant 1 h à température ambiante.
- Ajouter 50 pi de TBS wie 20 nM [3 H] citalopram (81,7 Ci / mmol), 0,1% de sérum albumine bovine, et 2 mg / mL His-tag affinité scintillation de proximité (SPA) perles à trois puits pour chaque construction. Pour le dernier puits ajouter la même liste, mais solution compléter avec 100 uM sertraline pour déterminer la liaison non spécifique. Veiller à ce que les perles His-tag affinité SPA sont bien mélangés lors de l'ajout à la plaque de 96 puits.
- Mesurer la liaison [3 H] citalopram en utilisant un 96 puits compteur à scintillation à température ambiante avec un temps de comptage 1 min par puits. Continuer plaques de comptage jusqu'à ce que le compte total Plateau (après environ 36 h).
- plaques thermiques pour 15 min dans un bloc de chauffage avec un couvercle chauffé à 33 ° C. Mesurer la liaison à nouveau après le chauffage [3 H] citalopram comme décrit dans 2.4.
- Répétez l'étape 02.04 à 02.05 et de modifier l'étape de chauffage à 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C et 51 ° C. Régler la température de chauffage en fonction de la température de fusion apparente (Tm)de la protéine cible et la stabilité thermique de la construction la plus stable. Continuer à chauffer les plaques jusqu'à ce que toutes les constructions ont une faible numération spécifiques.
- Analyser les données pour déterminer les valeurs Tm.
- Déterminer le total des comptes moyens par minute (CPM) de chaque construction pour les puits qui ne contiennent pas sertraline en faisant la moyenne des 3 puits réplicats. Déterminer le CPM non spécifique en faisant la moyenne du CPM de chaque puits contenant sertraline dans une seule plaque.
- Calculer CPM spécifique en soustrayant le CPM non spécifique de la CPM totale.
- Calculer la Tm par un ajustement non linéaire à une fonction sigmoïde de Boltzmann. Constructs avec une faible CPM spécifique à la température ambiante (<10% du WT) ne disposent généralement pas des valeurs précises Tm. Les mutations de la plupart des constructions thermostables peuvent être combinés ensemble et criblés pour additifs augmente en thermostabilité.
3. Expression du Transporter Serotonin humain dans HEK293S GnTI 4. Affinity Purification de la Serotonin Transporter de l'immunisation et Cristallisation 5. Reconstitution du transporteur dans des liposomes pour la vaccination 6. Le dépistage des anticorps reconnaissant des épitopes 3D 7. Expression des anticorps Fragment dans les cellules Sf9 9. Formation des Complexes et séparation Transporter-anticorps par chromatographie d'exclusion stérique 10. Cristallisation de Transporter-anticorps Complexes de Drop Hanging
REMARQUE: Bacmid ADN doit être transfecté dans des cellules Sf9 immédiatement pour obtenir les meilleurs résultats, mais peut également être conservé à -20 ° C pendant plusieurs semaines. <li> Supprimer les médias à partir de cellules et ajouter 2 ml de milieu Sf9 frais. Ajouter 5 ug d'ADN de bacmide à 100 ul de milieux Sf9 (solution A).
NOTE: Il est recommandé de ne pas utiliser plus de 80 ml de virus P2 depuis le HEK293S GnTI - cellules vont croître lentement et peut devenir non viable en raison d'un changement de pH. Sf9 médias est plus acide que les médias 293 d'expression.
NOTE: Le rendement total sera de 3 -4 mg de CC et SERT 1 mg de SERT IC. Une absorbance de 2 UA à 280 nm est égale à 1 mg / ml SERT.
REMARQUE: Utilisez Tris ajusté avec NaOH à pH 8,5 comme tampon. Ne pas utiliser une base Tris ajusté avec HCl. L'écran peut être préparé dans des tubes de 2 ml et utilisé jusqu'à la fin. Prenez soin de la pipette avec précision PEG 400 à l'aide d'une pipette à déplacement positif car il est extrêmement visqueux!
NOTE: La plaque a été acheté avec du mastic déjà appliqué sur le rebord des puits.
NOTE: monocristaux apparaîtront dans un délai d'environ 3 jours et atteindre 100-175 pm après 14 jours.
Representative Results
Une bibliothèque de mutants à point unique dans l'arrière - plan a été créé TC SERT à l' écran pour thermostabilizing mutations. mutants individuels ont été générés en utilisant la mutagenèse standard. Le protocole de criblage utilise des transitoirement transfectées cellules HEK293S et un écran de thermostabilité basé à proximité de scintillation à l' identité rapidement des mutations utiles pour la cristallisation , comme indiqué sur la figure 1A. Valeurs Traçage Tm par rapport lié [3 H] citalopram à TA révèle des constructions avec des niveaux appropriés de haute thermostabilité et d' expression pour la purification de la protéine (figure 1B). Trois mutants (Y110A, I291A, et T439S) ont été combinés pour produire une construction très stable (figure 1C). Thermostabilité est également corrélée à une augmentation de la stabilité dans les détergents courts nécessaires à la cristallisation du complexe SERT-Fab à chaîne.
L'expression à grande échelle de SERT humain à l'aide de baculovirus-transduced HEK293S GnTI - cellules peut prendre moins de 2 semaines et peut produire des quantités de milligramme, comme illustré sur la figure 2A. Utilisation de la protéine CC SERT-GFP étiqueté permet de SERT être commodément suivie pendant l' expression et la purification par fluorescence (figure 2B). Notre stratégie de purification impliqué 1) solubilisation du SERT lié à S -citalopram de HEK293S GnTI - cellules en C12M en présence du SHC comme un lipide stabilisant; 2) la liaison du SERT à une matrice d'affinité streptocoque; 3) l'élimination des contaminants protéines par lavage extensif; et 4) l' élution de la SERT fonctionnelle avec un tampon contenant de la desthiobiotine (figure 2C). La protéine éluée est essentiellement exempte d'autres protéines détectables par coloration au bleu de Coomassie et monodispersé comme jugé par FSEC (figure 2D, E).
Une stratégie similaire a été prise pour purifier SERT avec une étiquette Strep II qui a été utilisé pour reconstitution et l' immunisation (figure 3A, B). L'incorporation de SERT en protéoliposomes augmente la demi-vie sérique et la stabilité du SERT et améliore la probabilité d'isoler des anticorps à haute affinité. En outre, l' inclusion du lipide A, un composant de la paroi cellulaire bactérienne, sert d'adjuvant puissant 9. Les liposomes multilamellaires ont été préparées par l'addition d'un tampon à un mélange lipidique séché dans des tubes en verre et remis en suspension dans un tampon. Extrusion des liposomes à travers des filtres de 200 nm de taille de pores monodispersés produit des suspensions de liposomes unilamellaires. Les liposomes sont ensuite saturées avec un détergent, suivi par l'addition d'un détergent dans le SERT purifié. Enfin, le détergent est éliminé par addition de résine d'absorption hydrophobe, le lipide: mélange de détergent. ligand supplémentaire doit être ajouté à l'échantillon reconstitué pour sélectionner des anticorps qui reconnaissent la conformation liée antidépresseur. La présence de SERT dans les protéoliposomes doit être confirmée parsolubilisation d' un petit échantillon avec un colorant SDS-PAGE chargement ou C12M et fonctionne sur SDS-PAGE et FSEC (figure 3C, D).
des lignées cellulaires d'hybridomes exprimant des anticorps SERT peuvent être criblés pour des liants de haute affinité qui reconnaissent des épitopes 3D. Ces propriétés sont cruciales pour le succès éventuel de cristallisation, que l'anticorps doit rester fermement lié à une région structurée pour promouvoir le cristal d'emballage homogènes, des domaines bien ordonnés. Dans la première étape, des anticorps qui reconnaissent des régions non structurées sont identifiées. Le SERT est dénaturé et transféré sur une membrane de nitrocellulose; anticorps qui se lient SERT dénaturé seront ouest-positifs et susceptibles de reconnaître des épitopes linéaires. Dans la figure 4A, nous montrons 2 exemples d'anticorps qui sont western-positif et probablement pas utile pour promouvoir la cristallogenèse. Sur la figure 4B, les anticorps western-négatives restantes sont incubées avec 100 nM de SERT-GFP et séparés parFSEC. Les anticorps qui se lient SERT se déplacera le pic de la GFP-positive à une position antérieure. Les complexes SERT-anticorps peuvent être diluées en outre dans un détergent pour déterminer si elles peuvent se lier avec une affinité nanomolaire, suivie d'une analyse par FSEC. Addition des résultats de la sérotonine dans les changements conformationnels dans le transporteur et donc les anticorps peut être retamisé pour déterminer si elles peuvent reconnaître spécifiquement la conformation ISRS lié. Sur la figure 4C, les anticorps sont présentés pour lier le SERT en présence de sérotonine, indiquant que l'épitope (s) ne change pas par rapport au substrat SSRI état lié. Enfin, sur la figure 4D combinaisons d'anticorps sont testés pour leur capacité à se lier à des épitopes distincts, ce qui entraîne un nouveau décalage vers la gauche. Ici, le 15B8 ou 8A11 anticorps reconnaissent un épitope qui est différent de 8B6.
L'anticorps 8B6 a été choisi pour une analyse structurale basée sur le dépistage préliminaire de cristal avec de la papaïne treated Fab. Les gènes de la 8B6 Fab ont été clonés dans un vecteur d'expression de cellules d'insecte. Fab peut être exprimé et sécrété à partir de cellules Sf9 croissance en suspension. 8B6 le Fab peut être purifié à partir de cellules Sf9 surnageant par His-tag d' affinité (Figure 5A, B) et la Chromatographie d'échange de cations (Figure 5C, D) , résultant en une protéine qui apparaît exempte de contaminants sur des gels de SDS-PAGE. Sur la figure 5E, le recombinant 8B6 Fab est montré pour se lier SERT et est utilisé dans des expériences biochimiques et biophysiques ultérieures.
L'affinité purifiée SERT CC est digéré par la thrombine et EndoH et mélangé avec 8B6 Fab pour former un complexe en présence de S -citalopram. Le complexe de transporteur-anticorps est ensuite séparé par SEC C8M (figure 6A) et les fractions de pic contiennent à la fois du SERT et Fab , comme indiqué par SDS-PAGE (figure 6B). L'utilisation de C8M est crucial pour la formation de cristaux probablement parce quele détergent à chaîne courte permet une meilleure garniture entre les molécules dans le réseau cristallin. FSEC est utilisé pour déterminer les fractions doivent être mises en commun pour la cristallisation (Figure 6C); Les fractions qui ne sont pas monodisperses et / ou contiennent de grandes quantités de SERT libre ou Fab ne doivent pas être combinés.
En forme de prisme de cristaux de SERT-anticorps peuvent être cultivés en présence de S -citalopram en utilisant ce protocole en suspendant la diffusion de vapeur à goutte (figure 7A). Les cristaux résultants diffractent les rayons X à une résolution de 3,15 Å 10 (figure 7B).
Figure 1: Scintillation Proximity-base Thermostabilité Assay A.. Vue d' ensemble du protocole de criblage de thermostabilité en présence de [3 H] citalopram. B. Maximum lié [3 (Tm). Les lignes pointillées représentent des valeurs pour le transporteur WT. Les 3 mutants les plus thermostables sont étiquetés. Zone grise représente les mutants qui ont moins de 10% de [3 H] citalopram par rapport à WT et les valeurs Tm ainsi inexactes liaison en raison d'un faible rapport signal à bruit. C. Les courbes de Thermostabilité pour WT SERT TC et les 3 premiers mutants. Les barres d'erreur représentent l' écart - type (SD). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Vue d'ensemble des Mammifères hétérologue Protein Expression A.. Aperçu schématisé de BacMam génération de virus et l' expression de SERT en HEK293S GnTI -. Cellules B. ILK293S GnTI - cellules exprimant le SERT CC (GFP fluorescence) C.. Profil d'élution de SERT CC sur une résine d'affinité Strep. Trace verte représente la concentration de desthiobiotine, 0 - 100% (0-5 mM) D.. Analyse d'affinité purifiée CC SERT sur un 4 - gel 15% SDS-PAGE E.. FSEC d'affinité CC SERT purifiée détectée par fluorescence de la GFP (Excitation: 480 nm; émission: 510 nm). Le pic d' élution à 15 ml est SERT (#) et 18 ml est GFP libre (*). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Représentant Affinity Purification et Reconstitution du SERT IC A.. Aperçu schématique de la production d'anticorps. <strong> B. Profil d'élution observé à 280 nm de la purification par affinité de SERT IC sur une résine d'affinité Strep. Trace verte représente la concentration de desthiobiotine, 0 - 100%. (0-5 mM) C. Analyse d'affinité purifiée et reconstituée SERT sur un 4 - gel 15% SDS-PAGE D.. FSEC du SERT solubilisé après reconstitution. La fluorescence des résidus tryptophane a été utilisé pour détecter le SERT (Excitation: 280 nm; émission: 335 nm). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Analyse des représentatifs SERT anticorps A. Le dépistage d'anticorps par western blot. Environ 1 pg de SERT CC avec ou sans GFP a été appliquée à un 4-15% SDS-gel PAGE et transférés sur une membrane de nitrocellulose. La liaison a été détectée en utilisant un anticorps de chèvre anti-souris conjugué à de colorant IR. 2G4 et 10f2 sont ouest positive. B. La liaison des anticorps à 100 nM et la détection GFP SERT marqués par FSEC détectée en utilisant la fluorescence de la GFP. C. La liaison de fragments d' anticorps sélectionnés à 100 nM GFP-étiqueté SERT en présence de 1 mM de sérotonine. D. La liaison de 8A11 ou 15B8 Fabs à SeRT-8B6 Fab. Pics mineurs éluant à 18 ml sont GFP gratuitement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Purification Représentant du 8B6 Fab à partir de cellules Sf9 A.. Profil d'élution observé à 280 nm de la purification du Fab par 8B6 His-tag d'affinité chromatograp hy. Trace verte représente la concentration d'imidazole, 0 - 50% (0-250 mM) B.. Non réductrices et réductrices gel SDS-PAGE après étiquette His purification par affinité. Protéine qui passe près de 50 kDa est Fab non réduite (#) et des espèces mineures à 25 kDa est réduite Fab (*). C. Profil d'élution observé à 280 nm de la purification du Fab 8B6 par échange de cations, l'affichage d'un pic unique symétrique, ce qui est élué sous un gradient linéaire de chlorure de sodium. Trace verte représente la concentration de NaCl, 0 - 100%. (0-500 mM) D. L' analyse du 8B6 Fab sur un gel SDS-PAGE à 12,5% , après purification par échange de cations. E. La liaison du 8B6 Fab 10 nM GFP-tagged SERT, détecté par fluorescence de la GFP. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 6: Gel Représentant Filtration Chromatographie du Complexe-8B6 SERT en présence de S -citalopram A.. Gel profil filtration d'élution purifié complexe SERT-8B6. pic principal éluant à 11,5 ml est le complexe SERT-8B6. Haute à 15 - 17 ml contient GFP et Fab B.. L'analyse du complexe SERT-8B6 purifié sur une 4 - gel de SDS-PAGE à 15%. Les positions de SERT et les chaînes lourdes et légères des Fab sont représentés par un tiret. C. FSEC des fractions de tailles séparées. complexes SERT-8B6 ont été détectés en utilisant la fluorescence du tryptophane. Fraction 17 contient une plus grande quantité de SERT qui n'a pas complexe avec Fab. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: Cristallisation du complexe SERT-8B6 Bound to S -citalopram A.. la microscopie optique de cristaux parallélépipédiques du complexe SERT-8B6 après 2 semaines de croissance. La barre d'échelle est égal à 200 um. B. cristaux SERT-8B6 diffractent les rayons X à 3,15 Å. anneau bleu représente 3,15 Å. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1:. Un écran de cristallisation pour le complexe SERT-8B6 Bound to S -citalopram S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Discussion
Détermination de la structure des protéines de la membrane par des techniques biophysiques reste un défi de taille pour de nombreux transporteurs médicalement significatifs, des récepteurs et des canaux 11. Ici , nous partageons l' expertise détaillée élaborée pour la détermination de la structure du transporteur de la sérotonine humaine lié à S -citalopram. Nous prévoyons que ces méthodes seront utiles pour déterminer les structures de SERT dans d'autres états conformationnels ainsi que des structures d'autres protéines membranaires difficiles. En outre, les techniques biochimiques décrites ici peuvent également être utilisés pour fonction de SERT purifiée dans un détergent et un environnement quasi-native lipidique étudier.
SERT cristallisation articulée sur le développement de plusieurs outils et techniques. Tout d' abord, l' amélioration de transporteur thermostabilité produites variantes SERT qui ont été bien comportés dans divers micelles de détergent après l' extraction du transporteur à partir de membranes 6. En second lieu, l'utilisationdu ligand S -citalopram haute affinité à travers la purification et la cristallisation améliorée davantage la stabilité et de l' hétérogénéité conformationnelle réduite. En troisième lieu , la mise au point du système d'expression de BacMam 7 a permis de produire de grandes quantités de SERT dans une courte période de 2 semaines, ce qui facilite à la fois l' immunisation et la cristallisation. Enfin, le développement de stratégies pour sélectionner des anticorps de haute affinité qui reconnaissent les épitopes 3D ont permis la découverte de l'anticorps 8B6 qui favorise l'emballage bien ordonnée de complexes anticorps-SERT en cristaux.
Il existe un certain nombre d'étapes critiques et des réactifs ainsi que les problèmes courants qui se produisent souvent à travers le protocole. Tout d'abord, la génération de virus à titre élevé SERT P2 peut être problématique. Ajout de faibles concentrations de virus P1 pour générer le virus de la P2 comme décrit dans ce protocole atténue généralement ce problème, et dans les cas où le titre du virus de la P2 est faible, le virus P3 peut être using virus à une MOI de 0,0001. Les virus ayant un titre inférieur à 1 x 10 8 particules virales / ml ne doivent pas être utilisés et seront presque toujours à des rendements faibles en protéines. Pour l' expression, HEK293S GnTI - cellules ont été choisis car ils manquent N -acetylglucosaminyltransferase I activité et ne peuvent donc pas synthétiser N -glycans complexes, au lieu produisant seulement N -glycans haute mannose. Clive EndoH N glycosylation lié en des glycanes riches en mannose sur deux sites en boucle extracellulaire 2 (EL2), laissant une N - acétylglucosamine attaché à asparagine. La digestion des sucres N lié en entropie réduit EL2 de surface qui est probablement important pour la cristallisation. Pour la production d'anticorps, le SERT circuit intégré doit être utilisé pour l' immunisation. GFP est hautement immunogène 12 et ne doit pas être utilisé comme une balise de fusion pour générer des anticorps car il est difficile de supprimer complètement par SEC. N- flexible et C-terminale du SERT sont pas non plusinclus dans le produit d'assemblage afin d'éviter des anticorps contre ces régions. Les souris peuvent être immunisées avec 30 ug de protéine reconstituée; continuer à immuniser des souris jusqu'à ce que les concentrations sériques élevés d'anticorps peuvent être détectés et produire des cellules d'hybridome 13 comme décrit. Une construction thermostabilisés est habituellement le meilleur choix pour la vaccination; si le transporteur est bien élevé et conserve une activité biologique après purification, ce qui est souvent suffisante pour produire des anticorps. L'anticorps 8B6 a été soulevée contre WT SERT. Pour la cristallisation, seules les fractions de pic provenant de la SEC contenant un complexe monodispersé comme jugé par FSEC doivent être combinées et concentrées. cristaux SERT-8B6 poussent dans une gamme étroite de conditions et il y a un certain nombre de mesures qui devraient être prises pour résoudre les problèmes spécifiquement liés à la croissance des cristaux de SERT. base Tris ajusté avec HCl ne doit pas être utilisé dans la solution réservoir, étant donné que ce tampon ne supporte pas la croissance cristalline; il est donc critical à utiliser au lieu Tris ajusté avec NaOH. cristaux de SERT se développent dans une gamme étroite de concentrations de PEG 400, donc si les cristaux ne se développent pas ou si de nombreux petits cristaux sont observés, même une petite augmentation ou une diminution de la concentration du PEG 400 seraient avisés. En outre, l'acide 6-aminohexanoïque additif a également été utilisé dans l'écran optimisé pour améliorer la nucléation. Le ratio de la chute de la protéine: La solution de puits est aussi un facteur déterminant pour la croissance cristalline. Baisse des ratios de 1,5 à 2: 1 sont recommandées, avec des rapports plus proches de 2 drop: 1 supportant généralement la croissance des cristaux plus gros 3 dimensions. Enfin, l'utilisation d'une faible profil des plaques 24 puits est également cruciale pour la croissance cristalline, vraisemblablement en raison de la modification de la vitesse de diffusion de vapeur.
Une approche alternative à la méthode de SPA a été développé à l' écran pour les mutants qui stabilisent le transporteur de la sérotonine de rat dans une conformation de cocaïne liée à l' aide d' un dosage 5 de liaison filtre. En revanche, les ba SPAsed dosage permet d'étapes de chauffage successives suivantes par la détermination de la fraction du SERT qui reste lié au ligand. Ainsi, cela permet la détermination rapide de la température de fusion à partir d'un petit nombre d'échantillons. La méthode SPA repose sur la disponibilité d'un ligand de haute affinité et radiomarqués si aucun ligand sont connus qui se lient avec une affinité sous-micromolaire alors une approche alternative sera nécessaire. De nombreuses autres méthodes sont couramment utilisées pour mesurer la stabilité des protéines telles que la liaison de colorants fluorescents et calorimétrie 14 , mais sont à faible débit et sont incapables de mesurer directement la fonction ou nécessitent de grandes quantités de protéines. Si la méthode de SPA ne peut pas être utilisé, une approche à haut débit alternative est un Thermostabilité dosage à base de FSEC 15 (FSEC-TS), où l'échantillon est chauffé suivie d' une séparation de la fraction du transporteur restant. FSEC-TS est une approche utile pour accéder à un comportement chromatographique et de l'état oligomérique et est apoutil complémentaire uissance qui peut être utilisé aux côtés de la méthode SPA.
Une comparaison des différents systèmes d'expression de protéines commune a également été trouvé pour favoriser l'utilisation de cellules de mammifères pour l' expression de 16 et sans surprise SERT cela est probablement le cas pour de nombreuses protéines d'origine mammifère. Les méthodes que nous avons utilisées pour l'expression ont été adaptés pour le SERT, mais sont susceptibles facilement adaptables. Des conditions qui favorisent des niveaux élevés d'expression doivent être soigneusement identifiés en faisant varier le temps de l'expression, la température, la concentration virale et la présence d'inhibiteurs d'histone désacétylase tels que le butyrate de sodium.
Nous privilégions généralement la purification d'affinité dans un détergent à longue chaîne légère, comme C12M ensemble avec le SHC avant la reconstitution de conserver la liaison du ligand à haute affinité. La reconstitution à l'aide d'absorption hydrophobe est une technique douce que nous avons trouvé être efficace pour d'autres transporteurs et récepteurs. Si cen'a pas été couronnée de succès, l' élimination des détergents à des concentrations micellaires critiques élevées par dialyse, la dilution, ou SEC peut être utilisé 17 pourvu de l'antigène est suffisamment stable dans les détergents. Dans les cas où aucun anticorps appropriés sont trouvés, on trouve presque toujours la question est due à la perte de fonction ou de dénaturation de l'antigène et dans de tels cas, nous avons réalisé avec succès de nouveaux vaccins en accordant une attention particulière à la biochimie des protéines. Enfin, les ligands et les anticorps qui se lient avec de haute affinité devraient constituer la base d'une expérience de cristallisation rationnellement planifiée et en tirant profit d'une variante thermostable, on peut cribler une plus large gamme de conditions en faisant varier les propriétés des différents détergents. En outre, la cristallisation dans une mésophase lipidique 18 ou en utilisant bicelles 19 doivent toujours être considérés comme une alternative à la cristallisation dans les micelles.
Ces principes et méthodes peuvent être utilisées avec certains modification pour de nombreuses autres protéines transmembranaires qui sont difficiles à exprimer et purifier les autres hôtes d'expression, et sera particulièrement utile pour la détermination de la structure des cibles de médicaments de haute affinité.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DH10Bac | Invitrogen | 10361-012 | |
| Kanamycin | Fisher | BP906-5 | |
| Gentamicin | Fisher | BP918-1 | |
| Tetracycline | Sigma | T-7660 | |
| Bluo-gal | Invitrogen | 15519-028 | 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside |
| Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside | Anatrace | I1003 | IPTG |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Cellfectin II | Invitrogen | 10362-100 | Sf9 transfection reagent |
| Sf9 | ATCC | CRL-1711 | |
| Sf-900 III SFM media | Life Technologies | 12658-027 | |
| HEK-293S GnTI- | ATCC | CRL-3022 | |
| Freestyle 293 media | Life Technologies | 12338-018 | 293 expression media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 0984018DJ | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410 | |
| S-citalopram | Sigma | E4786 | Anagrade |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| Cholesteryl hemmisuccinate | Sigma | C6013 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457P | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757P | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol | Avanti Polar Lipids | 840457P | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Desthiobiotin | Iba Life Sciences | 2-1000-05 | |
| Asolectin | Sigma | 11145 | |
| Cholesterol | Sigma | C-8667 | |
| Lipid A | Sigma | L5399 | |
| Brain polar lipid | Avanti Polar Lipids | 141101C | |
| Biobeads | Biorad | 152-3920 | Hydrophobic absorption resin |
| Goat anti-mouse IRDye 680RD | Odyssey | 926-68070 | Used as secondary antibody for western blotting |
| Lauryl maltose neopentyl glycol | Anatrace | NG310 | Anagrade |
| Serotonin | Sigma | H9523 | |
| pFastBac 8B6 | Available from authors | ||
| pEG Bacmam SERT Strep II | SERTIC, Available from authors | ||
| pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His | SERTTC, Available from authors | ||
| pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His | SERTCC, Available from authors | ||
| Imidazole | Sigma | 56749 | |
| n-Octyl β-D-maltoside | Anatrace | O310 | Anagrade |
| Thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| EndoH | New England Biolabs | P0702 | |
| Trizma-HCl | Sigma | T5941 | Tris is used for preparation of crystallization reservoirs |
| PEG 400 | Sigma | 91893 | |
| 6-aminohexanoic acid | Sigma | 7260 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher | MT25052CV | |
| Isoplate-96 TC | PerkinElmer | 6005070 | |
| PolyJet | SignaGen | SL100688 | Polymer transfection reagent for mamalian cells |
| Copper HIS-Tag YSI SPA Beads | PerkinElmer | RPNQ0096 | His-tag affinity SPA beads |
| Citalopram, [N-Methyl-3H] | PerkinElmer | NET1039250UC | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | heating block for thermostability assay |
| ThermoTop | Eppendorf | 5308000003 | |
| SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates | Eppendorf | 5306000006 | |
| 0.2 µm syringe filter | Olympus Plastics | 25-243 | |
| 1 L filter system | Corning | 430517 | |
| 2 L flat bottom tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000 | |
| 2 L baffled tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000B | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Forma Orbital Shaker | Thermo Scientific | 416 | |
| Strep-Tactin resin | Iba Life Sciences | 2-1208-025 | Strep affinity resin |
| Extruder | Northern Lipids | ||
| Li-Cor imaging system | Odyssey | western blot imaging system | |
| XK16 column | GE Healthcare | 28-9889-37 | column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton |
| 100 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC910096 | |
| 30 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC903024 | |
| Äkta FPLC | GE Healthcare | UPC-900 | |
| HPLC | Shimadzu | 51476 | |
| Superose 6 (10/300) column | GE Healthcare | 17-5172-01 | Used for FSEC |
| Tangential flow apparatus | Pall Filtron | ||
| 0.2 µm filter tangential flow cell | Pall Filtron | PSM20C11 | |
| 30 kDa MWCO tangential flow concentrator | Pall Filtron | OS030T12 | |
| Talon resin | Clonetech | 635504 | His-tag affinity resin used for Fab purification |
| 1 mL HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | Cation exchanger used for Fab purification |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | Used for SEC separation of SERT-8B6 |
| 24-well VDXm plate | Hampton Research | HR3-306 | |
| 18 mm coverslips | Hampton Research | HR3-239 | |
| Virocyt virus counter | Virocyt | 2100 | |
| MicroBeta Trilux | PerkinElmer | 1450 | 96-well scintillation counter |
| HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | |
| Sertraline | Sigma | S6319 |
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