Summary
Questo manoscritto descrive come schermo per thermostabilizing mutazioni, purificare il trasportatore della serotonina umano, generare anticorpi ad alta affinità, e cristallizzare il complesso trasportatore della serotonina-anticorpo legato alla antidepressivo della droga S -citalopram. Questo protocollo può essere adattato allo studio di altri trasportatori di membrana impegnativi, recettori e canali.
Abstract
Il trasportatore della serotonina è un trasportatore di sodio e cloruro-coupled che "pompe" serotonina extracellulare in cellule. S -citalopram è un farmaco usato per trattare la depressione e l'ansia legandosi al trasportatore della serotonina con alta affinità, il blocco della ricaptazione della serotonina. Qui riportiamo una procedura efficace e una serie di strumenti per stabilizzare, espresso, purificare, e cristallizzare serotonina complessi trasportatore-anticorpo legato a S -citalopram e altri antidepressivi. Le mutazioni che stabilizzano il trasportatore della serotonina sono stati identificati usando un saggio di legame -citalopram S. Trasportatore della serotonina espressa in baculovirus-trasdotte HEK293S GnTI - cellule, è stata ricostituita in proteoliposomi e utilizzato per aumentare gli anticorpi ad alta affinità. Abbiamo sviluppato una strategia per scoprire anticorpi che sono utili per studi strutturali. è stato anche istituito un approccio diretto per l'espressione di frammenti di anticorpi nelle cellule Sf9.Complessi Transporter-anticorpo purificato mediante questa procedura sono ben educati e facilmente cristallizzano, la produzione di complessi con S -citalopram che diffract raggi X per 3-4 risoluzione A. Le strategie sviluppate qui possono essere utilizzati per determinare la struttura di altre proteine di membrana impegnativi.
Introduction
Il trasportatore della serotonina (SERT) è una proteina di membrana integrale che facilita il trasporto della serotonina attraverso le membrane cellulari 1. SERT appartiene ad una famiglia di neurotrasmettitori sodio Symporters (SSN), che comprende anche la dopamina e noradrenalina trasportatori 2. SERT è il bersaglio molecolare di antidepressivi e anti-ansia farmaci ampiamente prescritti che agiscono per inibire in modo competitivo il trasporto della serotonina 3. SERT sfrutta il cotrasporto energeticamente favorevole di sodio per rimuovere neurotrasmettitore dalla fessura sinaptica. Caratterizzazione estesa del sistema serotoninergico ha dimostrato che i cambiamenti nel metabolismo della serotonina sembrano influenzare praticamente tutti i processi neurologici, tra cui umore, il sonno, il dolore, la cognizione, e l'aggressione comportamenti 4. Funzione SERT può essere modificato attraverso l'uso di antidepressivi e selettivo della ricaptazione della serotonina (SSRI), come S -citalopram, nonché da psychostimulanti e farmaci di dipendenza come l'anfetamina e -methylamphetamine N 3,4-methylenedioxy- o "ecstasy" 1,2.
SSRI sono estremamente importanti per il trattamento di disturbi dell'umore, ma la base strutturale preciso per la loro azione non è ben compreso. WT SERT è instabile in micelle detergenti, impedendo in tal modo il progresso verso una (3D) struttura tridimensionale del SERT 5,6. Recentemente, abbiamo sviluppato varianti di SERT, che sono robusta stabile in una vasta gamma di detergenti e mantenere l'attività SSRI 6 vincolante. Queste varianti SERT termostabili sono stati selezionati usando un test stabilità termica a base di prossimità scintillazione. Qui si descrive un procedimento per la generazione di anticorpi ad alta affinità che possono legarsi SERT e la purificazione e cristallizzazione di SERT termostabile, in complesso con l'anticorpo e S -citalopram.
Questo protocollo presuppone che il SERT e 8B6 geni sono stati successoy clonato in vettori BacMam 7 e insetti di espressione, rispettivamente. Per generare anticorpi, cDNA codificante residui 73-616 di WT SERT è stato clonato in vettore BacMam con un Strep II tag C-terminale (SERT IC). Per la schermata termostabilità, residui SERT 73-616 con GFP C-terminale, Strep II, e 10-His tag (SERT TC) è stato utilizzato. Mutazioni puntiformi individuali sono stati generati in background SERT TC. Per il protocollo di cristallizzazione, la proteina di fusione SERT-GFP è stato utilizzato con TWIN-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] e 10-Le sue etichette, portando i mutanti termostabili, Y110A, I291A, e T439S e le mutazioni di cisteine superficie C554A, C580A e C622A (SERT CC). Sequenze trombina scissione (LVPRGS) sono stati anche inseriti nel SERT CC dopo Q76 e T618 per consentire la rimozione della N- e C-termini. Il plasmide codificante la 8B6 Fab è stato progettato per esprimere sia il pesante e leggeracatene dell'anticorpo con GP67 sequenze secrezione sotto il controllo di due promotori poliedrina separati. Il C-terminale della catena pesante dell'anticorpo 8B6 è stato etichettato con un 8-His tag e un sito di trombina scissione è stato inserito tra la catena pesante e il tag.
Protocol
1. Trasfezione di Adherent HEK293S GnTI - Celle per termostabilità schermo
- Preparare Poly-D-lisina (PDL) Rivestiti piastre da 96 pozzetti. Eseguire il lavoro in una cappa a flusso laminare sterile.
- Filtrare una soluzione 25 mg / mL di (PDL), peso molecolare 70,000-150,000 Da, utilizzando un filtro sterile da 0,2 micron. Aggiungere 50 ml di PDL a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti Tissue Culture (TC), assicurando il fondo è uniformemente rivestita, ed incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Aspirare soluzione PDL e lavare con 200 ml di acqua sterile.
- Lasciare asciugare la piastra all'aria per 2 ore prima di conservazione a 4 ° C. piastre rivestite PDL possono essere conservati a 4 ° C per diverse settimane.
- Tripsinizzazione delle cellule HEK293S aderenti.
- Grow HEK293S al 80% di confluenza in 10 cm piatto mantenuta a 37 ° C con 8% di CO 2. Un piatto unico 10 centimetri dovrebbe avere circa 10 milioni di cellule HEK293S. Non utilizzare le cellule dopo 30 passaggi! mezzi Aspirare e lavare con 5 ml di Phosphate-Buffered Saline (PBS). Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25% tripsina, 0,02% EDTA) alle cellule e incubare per 2 minuti a 37 ° C.
- Aggiungere 10 ml di Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e risospendere le cellule ripetutamente pipettando su e giù con una pipetta sierologica.
- Pipettare 10 ml di cellule e mescolare con 10 ml di soluzione Trypan blu (0,4%). Determinare la densità delle cellule utilizzando un emocitometro e un microscopio ottico. Non contare le cellule che sono di colore blu come sono morti. Assicurarsi che la vitalità delle cellule è al di sopra del 90%.
- Accuratamente risospendere tripsinizzati HEK293S GnTI - cellule in DMEM supplementato con 10% FBS ad una densità di 0,5 x 10 6 cellule / ml in un serbatoio pipetta monouso. Circa 5 milioni di cellule HEK293S saranno necessari per ogni piatto. Un totale di 24 costrutti può essere trasfettato su ciascuna piastra usando questo protocol.
- Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di cellule in ciascun pozzetto di una piastra rivestita PDL. Risospendere le cellule in serbatoio della pipetta dopo riempiendo ogni piatto per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° con l'8% di CO 2. Dopo 24 ore, le cellule devono raggiungere circa l'80% di confluenza.
- 1 h prima di trasfezione sostituire i media. Preparare DNA-trasfezione complessi reagenti per la trasfezione.
- Per ogni costrutto in background SERT TC ad essere proiettato, mescolare 450 DNA ng con 45 ml di DMEM senza siero e mescolare. Aggiungere 1,6 ml di reagente di trasfezione per 45 ml di DMEM privo di siero e mescolare.
- Immediatamente aggiungere la soluzione di trasfezione reagente diluita di soluzione di DNA e mescolare. Non mescolare soluzioni in ordine inverso. Attendere 10 - 15 minuti e aggiungere 20 ml di trasfezione miscela reagente / DNA a 4 pozzi.
- Una volta che tutti i pozzetti sono state trasfettate, mescolare piatto agitandola lentamente indietro di unnd avanti e tornare alla incubatore a 37 °.
- Dopo 16 - 24 ore sostituire il supporto con DMEM contenente siero e 10 mm butirrato di sodio.
- Circa 48 ore dopo la trasfezione rimuovere il supporto e sia procedere immediatamente con termostabilità schermo o congelare le cellule a -80 ° C per essere utilizzato in seguito. Le celle possono essere conservati a -80 ° C per diverse settimane.
Schermo termostabilità 2. scintillazione di prossimità-based con S -citalopram
- Incubare le cellule con 200 nM S -citalopram in 25 ml di TBS (Tris-Buffered Saline - 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl) per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Solubilizzare le cellule con l'aggiunta di 25 ml di 8 mm n-dodecil-β-D-maltopyranoside (C12M), 1 mM colesterolo hemmisuccinate (CHS), cocktail di inibitori della proteasi (2 mm phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF), 0,1 mg / ml aprotinina, 4 g / mL pepstatina a, e 4 mg / ml leupeptina) in TBS, e incubando per 1 ora a RT.
- Aggiungere 50 ml di TBS wiesimo 20 nM [3 H] citalopram (81,7 Ci / mmol), 0,1% di albumina sierica bovina, e 2 mg / mL His-tag saggio di affinità scintillazione di prossimità (SPA) perle a tre pozzetti per ciascuno costrutto. Per l'ultimo anche aggiungere la stessa soluzione elencato ma integrare con 100 micron sertralina per determinare legami non specifici. Assicurarsi che le microsfere His-tag di affinità SPA sono accuratamente miscelati quando si aggiunge alla piastra a 96 pozzetti.
- Provvedimento vincolante [3 H] citalopram utilizzando un contatore a scintillazione 96 pozzetti a temperatura ambiente con un tempo di conteggio 1 min per bene. Continuare piastre conteggio fino conteggi totali plateau (dopo circa 36 h).
- piastre di calore per 15 minuti in un blocco di riscaldamento con un coperchio riscaldato a 33 ° C. Misurare [3 H] citalopram vincolante dopo riscaldamento come descritto al punto 2.4.
- Ripetere il passaggio 2,4-2,5 e cambiare la fase di riscaldamento a 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C, e 51 ° C. Regolare temperature di riscaldamento in funzione della temperatura apparente di fusione (Tm)della proteina bersaglio e la termostabilità del costrutto più stabile. Continuare a riscaldare piatti fino a quando tutti i costrutti hanno bassi conteggi specifici.
- Analizzare i dati per determinare i valori Tm.
- Determinare i conteggi totali medi per minuto (CPM) di ogni costruzione di pozzi che non contengono sertralina facendo la media dei 3 pozzi replicati. Determinare il CPM non specifica la media della CPM di ogni sertralina pozzetto contenente in un unico piatto.
- Calcolare il CPM specifica sottraendo il CPM non specifico dal CPM totale.
- Calcolare la Tm da un accesso non lineare ad una funzione sigmoidale Boltzmann. Costruisce con un basso CPM specifico a temperatura ambiente (<10% del WT) generalmente non hanno valori precisi Tm. Le mutazioni dei maggior parte dei costrutti termostabili possono essere combinati insieme e sottoposti a screening per additivi aumenti di termostabilità.
3. L'espressione del trasportatore della serotonina umano in HEK293S GnTI 4. affinità purificazione del trasportatore della serotonina per le vaccinazioni e cristallizzazione 5. Ricostituzione del trasportatore in liposomi per l'immunizzazione 6. Screening per anticorpi Riconoscere epitopi 3D 7. L'espressione di anticorpi Frammento in cellule Sf9 9. formazione di complessi Transporter-anticorpo e la separazione da Size Exclusion Chromatography 10. La cristallizzazione di complessi Transporter-anticorpo per impiccagione di goccia
NOTA: Bacmid DNA dovrebbe essere trasfettato in cellule Sf9 subito per i migliori risultati, ma può anche essere conservato a -20 ° C per diverse settimane. <li> Rimuovere supporti dalle cellule e aggiungere 2 ml di mezzi freschi Sf9. Aggiungere 5 mg di DNA bacmid a 100 l di Sf9 supporti (soluzione A).
NOTA: Non è consigliabile usare più di 80 ml di virus P2 poiché il HEK293S GnTI - le cellule crescono lentamente e può diventare impraticabile a causa di un cambiamento di pH. SF9 media è più acida rispetto al supporto 293 espressione.
NOTA: Resa totale sarà di 3 -4 mg di SERT CC e 1 mg di SERT IC. Un'assorbanza di 2 AU a 280 nm è pari a 1 mg / mL SERT.
NOTA: Utilizzare Tris regolato con NaOH a pH 8,5 come un buffer. Non utilizzare Tris base regolare con HCl. Lo schermo può essere preparato in 2 mL e utilizzato fino al termine. Fare attenzione a pipetta accuratamente PEG 400 con una pipetta a spostamento positivo in quanto è estremamente viscoso!
NOTA: La piastra è stata acquistata con sigillante già applicato al bordo dei pozzetti.
NOTA: cristalli singoli appariranno entro circa 3 giorni e crescere per 100-175 micron dopo 14 giorni.
Representative Results
Una libreria di mutanti puntiformi nei precedenti SERT TC è stato creato allo schermo per thermostabilizing mutazioni. mutanti individuali sono stati generati utilizzando mutagenesi standard. Il protocollo di screening utilizza trasfettate cellule HEK293S e uno schermo stabilità termica a base di vicinanza scintillazione all'identità rapidamente mutazioni utili per la cristallizzazione come illustrato nella figura 1A. I valori di tracciato Tm rispetto al limite [3 H] citalopram a temperatura ambiente rivela costruzioni con elevati livelli di termostabilità e di espressione adatti per la purificazione della proteina (Figura 1B). Tre mutanti (Y110A, I291A, e T439S) sono stati combinati per generare una costruzione altamente stabile (Figura 1C). Termostabilità è anche correlata con una maggiore stabilità in brevi detergenti catena necessari per la cristallizzazione del complesso SERT-Fab.
L'espressione su larga scala di SERT umano per mezzo di baculovirus-TRansduced HEK293S GnTI - cellule può richiedere meno di 2 settimane e può produrre quantità milligrammo, come illustrato nella Figura 2A. Uso della proteina SERT CC GFP-tagged permette SERT essere convenientemente seguita durante espressione e purificazione mediante fluorescenza (Figura 2B). La nostra strategia di purificazione coinvolto 1) solubilizzazione del SERT legato a S -citalopram da HEK293S GnTI - cellule in C12M in presenza di CHS come un lipide di stabilizzazione; 2) legame di SERT ad una matrice di affinità Strep; 3) la rimozione delle proteine contaminanti da ampi lavaggio; e 4) eluizione del SERT funzionale con tampone contenente desthiobiotin (Figura 2C). La proteina eluita è in gran parte privo di altre proteine rilevabili di Coomassie blu colorazione e monodisperse come giudicato da FSEC (Figura 2D, E).
Una strategia simile è stata presa per purificare SERT con un tag Strep II che è stato utilizzato per reconstitution e l'immunizzazione (Figura 3A, B). L'incorporazione di SERT nel proteoliposomi aumenta la emivita plasmatica e la stabilità del SERT e migliora la probabilità di isolamento di anticorpi ad alta affinità. Inoltre, l'inclusione di lipide A, un componente della parete cellulare batterica, serve come un potente adiuvante 9. liposomi multilamellari sono stati preparati con l'aggiunta di tampone ad una miscela di lipidi essiccati in tubi di vetro e risospese in tampone. Estrusione dei liposomi attraverso filtri di dimensione dei pori 200 nm produce monodisperse sospensioni liposomiali unilamellari. I liposomi vengono poi saturati con detergente seguita dall'aggiunta di SERT purificato detergente. Infine, il detersivo viene rimosso mediante aggiunta di resina di assorbimento idrofoba al lipide: miscela detergente. Ulteriori ligando deve essere aggiunto al campione ricostituito per selezionare gli anticorpi che riconoscono la conformazione legato antidepressivo. La presenza dei SERT nelle proteoliposomi deve essere confermata dasolubilizzare un piccolo campione con SDS-PAGE carico dye o C12M e in esecuzione su SDS-PAGE e FSEC (Figura 3C, D).
linee cellulari derivate da ibridomi che esprimono anticorpi SERT possono essere sottoposti a screening per leganti ad alta affinità che riconoscono epitopi 3D. Queste proprietà sono cruciali per il successo finale di cristallizzazione, come l'anticorpo deve rimanere saldamente legato a una regione strutturato per promuovere imballaggio di cristallo di omogenei, domini ben ordinate. Nella prima fase, vengono identificati anticorpi che riconoscono regioni non strutturati. SERT è denaturato e cancellato su una membrana di nitrocellulosa; anticorpi che si fissano SERT denaturato saranno occidentale-positivi e probabilmente riconoscere epitopi lineari. Nella Figura 4A, mostriamo 2 esempi di anticorpi che sono occidentali-positivi e probabilmente non utile a promuovere crystallogenesis. Nella Figura 4B, i restanti anticorpi occidentale-negativi vengono incubate con 100 nM SERT-GFP e separati daFSEC. Gli anticorpi che si legano SERT si sposterà il picco GFP-positivi ad una posizione precedente. I complessi SERT-anticorpo può essere diluito ulteriormente in un detergente per determinare se essi possono legarsi con affinità nanomolari seguita da analisi da FSEC. Aggiunta di risultati serotonina a cambiamenti conformazionali il trasportatore e quindi gli anticorpi possono essere nuovo controllo per determinare se possono riconosce specificamente la conformazione SSRI-bound. In Figura 4C, gli anticorpi sono mostrati di impegnare SERT in presenza di serotonina, dimostrando che l'epitopo (s) non cambiano dal SSRI al substrato stato legato. Infine, nella Figura 4D combinazioni di anticorpi sono testati per la loro capacità di legare epitopi distinti, determinando un ulteriore spostamento verso sinistra. Qui il 15B8 o 8A11 anticorpi riconoscono un epitopo che è diverso da 8B6.
L'anticorpo 8B6 è stato scelto per ulteriori analisi strutturale basato sullo screening di cristallo preliminare con papaina treaTed Fab. I geni della 8B6 Fab sono stati clonati in un insetto vettore di espressione cellulare. Fab può essere espresso e secreto dalle cellule Sf9 crescono in sospensione. Il 8B6 Fab può essere purificato dal surnatante delle cellule Sf9 da His-tag affinità (Figura 5A, B) e la cromatografia a scambio cationico (Figura 5C, D) con conseguente proteina che appare privo di contaminanti su gel SDS-PAGE. Nella Figura 5E, ricombinante 8B6 Fab è mostrato di legarsi SERT e viene utilizzato in successivi esperimenti biochimici e biofisici.
L'affinità purificato SERT CC viene digerito con trombina e Endoh e miscelato con 8B6 Fab per formare un complesso in presenza di S -citalopram. Il complesso transporter-anticorpo viene quindi separato dalla SEC in C8M (Figura 6A) e le frazioni di picco contiene sia SERT e Fab come mostrato mediante SDS-PAGE (Figura 6B). Uso di C8M è cruciale per la formazione di cristalli probabilmente perchéil detersivo catena corta permette una migliore imballaggio tra le molecole nel reticolo cristallino. FSEC è impiegato per determinare quale frazioni devono essere aggregate per la cristallizzazione (figura 6C); frazioni che non sono monodisperse e / o contengono grandi quantità di SERT libero o Fab non dovrebbero essere combinati.
Prism cristalli SERT-anticorpo forma possono essere coltivate in presenza di S -citalopram utilizzare questo protocollo per impiccagione diffusione del vapore goccia (Figura 7A). I cristalli risultanti diffrangono i raggi X per una risoluzione di 3,15 Å 10 (Figura 7B).
Figura 1: scintillazione di prossimità basati termostabilità Assay A.. Sommario del protocollo per lo screening termostabilità in presenza di [3 H] citalopram. B. Massima bound [3 (Tm). Le linee tratteggiate rappresentano i valori per il trasportatore WT. I 3 mutanti più termostabili sono etichettati. Zona grigia rappresenta mutanti che hanno meno del 10% di [3 H] citalopram rispetto al WT e valori Tm così imprecise vincolante causa di un basso. C segnale-rumore. Curve termostabilità per WT SERT TC e le prime 3 mutanti. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica dei mammiferi eterologa espressione della proteina A.. Panoramica schematizzato della generazione di virus BacMam ed espressione di SERT in HEK293S GnTI -. Le cellule B. HEK293S GnTI - cellule che esprimono il SERT CC (fluorescenza GFP) C.. Profilo di eluizione del SERT CC di resina di affinità Strep. Verde traccia rappresenta la concentrazione di desthiobiotin, 0 - 100% (0 - 5 mm) D.. Analisi di affinità purificato SERT CC su 4 - gel 15% SDS-PAGE E.. FSEC di affinità purificato SERT CC rilevato da GFP fluorescenza (eccitazione: 480 nm; emissione: 510 nm). Il picco eluizione a 15 mL è SERT (#) e 18 ml è GFP gratuita (*). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentante affinità purificazione e Ricostituzione del SERT IC.. Schema di generazione di anticorpi. <strong> B. Profilo di eluizione osservata a 280 nm della purificazione per affinità di SERT IC di resina di affinità Strep. Verde traccia rappresenta la concentrazione di desthiobiotin, 0 - 100%. (0 - 5 mm) C. Analisi di affinità purificato e ricostituito SERT su un 4 - gel 15% SDS-PAGE D.. FSEC di SERT solubilizzato dopo la ricostituzione. La fluorescenza dei residui di triptofano è stato utilizzato per rilevare SERT (Eccitazione: 280 nm; emissione: 335 nm). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Analisi dei rappresentanti SERT anticorpi A. Lo screening di anticorpi da Western Blot. Circa 1 mg di SERT CC con o senza GFP è stato applicato ad un 4 - 15% SDSgel PAGE e cancellato su una membrana di nitrocellulosa. Binding è stato rilevato utilizzando un anticorpo di capra anti-topo coniugata con IR Dye. 2G4 e 10F2 sono occidentali positivo. B. Il legame di anticorpi a 100 nM SERT GFP-tagged e l'individuazione da FSEC rilevato utilizzando GFP fluorescenza. C. Il legame di Fabs selezionati e 100 nm SERT GFP-tagged in presenza di 1 mm serotonina. D. Il legame di 8A11 o 15B8 Fabs al Sert-8B6 Fab. Picchi minori eluizione a 18 mL sono GFP gratuito. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Purificazione Rappresentante del 8B6 Fab da cellule Sf9 A.. profilo di eluizione osservata a 280 nm della purificazione del 8B6 Fab da His-tag affinità chromatograp hy. Verde traccia rappresenta la concentrazione di imidazolo, 0 - 50% (0 - 250 mm) B.. Non riducente e riducendo gel SDS-PAGE dopo His-tag purificazione di affinità. Proteine che corre vicino a 50 kDa non è ridotta Fab (#) e specie minori a 25 kDa è ridotta Fab (*). C. profilo Elution osservata a 280 nm della purificazione del 8B6 Fab mediante scambio cationico visualizzando un singolo picco simmetrico che eluisce con un gradiente di cloruro di sodio lineare. Verde traccia rappresenta la concentrazione di NaCl, 0 - 100%. (0 - 500 mm) D. Analisi della 8B6 Fab su un gel SDS-PAGE 12,5% dopo purificazione mediante scambio cationico. E. Binding della 8B6 Fab 10 Nm SERT GFP-tagged, rilevato utilizzando la fluorescenza della GFP. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 6: Rappresentante del gel filtrazione Cromatografia del Complesso SERT-8B6 in presenza di S -citalopram A.. Gel profilo filtrazione eluizione di purificato complesso SERT-8B6. cima principale eluizione a 11,5 mL è il complesso SERT-8B6. Picco a 15 - 17 ml contiene GFP e Fab B.. Analisi del purificato complesso SERT-8B6 su un 4 - gel SDS-PAGE 15%. Le posizioni dei SERT e le catene pesanti e leggere dei Fab sono indicati da un trattino. C. FSEC delle frazioni di dimensioni separate. complessi SERT-8B6 sono stati rilevati utilizzando la fluorescenza del triptofano. Frazione 17 contiene una quantità maggiore di SERT che non ha complesso con Fab. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: La cristallizzazione del Complesso SERT-8B6 Bound to S -citalopram A.. La microscopia ottica di parallelepipedo cristalli a forma del complesso SERT-8B6 dopo 2 settimane di crescita. Barra della scala è uguale a 200 micron. B. cristalli SERT-8B6 diffrangono i raggi X per 3.15 Å. anello blu rappresenta 3.15 Å. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1:. Una schermata di cristallizzazione per il Complesso SERT-8B6 Bound to S -citalopram Cliccate qui per scaricare questa tabella.
Discussion
Determinazione della struttura delle proteine di membrana con tecniche biofisiche rimane un'impresa scoraggiante per molti trasportatori clinicamente significativi, recettori e canali 11. Qui condividiamo esperienza dettagliata sviluppato per la determinazione della struttura del trasportatore della serotonina umano legato a S -citalopram. Prevediamo che questi metodi saranno utili per determinare strutture di SERT in altri stati conformazionale, nonché strutture di altre proteine di membrana difficili. Inoltre, le tecniche biochimiche descritte qui possono essere utilizzati anche per la funzione di SERT purificata detersivo e un ambiente lipidico quasi native studiare.
SERT cristallizzazione incernierato sullo sviluppo di diversi strumenti e tecniche. In primo luogo, i miglioramenti nel trasportatore stabilità termica prodotte varianti SERT che sono stati ben educati in varie micelle detergenti Dopo l'estrazione del trasportatore dalle membrane 6. In secondo luogo, l'usodel -citalopram ad alta affinità ligando S in tutta la purificazione e cristallizzazione ulteriormente migliorato la stabilità e ridurre l'eterogeneità conformazionale. In terzo luogo, lo sviluppo del sistema di espressione BacMam 7 consentito per la produzione di grandi quantità di SERT in un breve periodo di 2 settimane, facilitando sia l'immunizzazione e cristallizzazione. Infine, lo sviluppo di strategie per selezionare gli anticorpi ad alta affinità che riconoscono epitopi 3D consentiti per la scoperta di anticorpi 8B6 che promuove imballaggio ben ordinata di complessi SERT-anticorpo in cristalli.
Ci sono un certo numero di passaggi critici e reagenti nonché problemi comuni che spesso si verificano durante il protocollo. In primo luogo, la generazione di alta titolo virale SERT P2 può essere problematico. Aggiunta di basse concentrazioni di virus P1 per generare virus P2 come descritto in questo protocollo solito attenua questo problema, e nei casi in cui il titolo del virus P2 è bassa, virus P3 può essere fatta usinvirus g ad una MOI di 0,0001. I virus con un titolo inferiore a 1 x 10 8 particelle virali / ml non devono essere utilizzati e quasi sempre luogo a basse rese di proteine. Per l'espressione, HEK293S GnTI - le cellule sono stati scelti in quanto mancano N -acetylglucosaminyltransferase I attività e, quindi, non può sintetizzare complessi -glycans N, invece produrre solo alta mannosio N -glycans. Unirà Endoh N linked glicosilazione di alte glicani mannosio in due siti a ciclo extracellulare 2 (EL2), lasciando un -acetylglucosamine N attaccato al asparagina. Digestione di N -linked zuccheri riduce l'entropia superficie EL2 che rischia importante per la cristallizzazione. Per la generazione di anticorpi, il SERT IC deve essere utilizzato per l'immunizzazione. GFP è altamente immunogenica 12 e non deve essere utilizzato come tag di fusione per generare anticorpi poiché è difficile da rimuovere completamente SEC. La N- flessibile e C-terminale di SERT anche non eranoincluso nel costrutto per evitare anticorpi contro queste regioni. I topi possono essere immunizzati con 30 mcg di proteine ricostituita; continuare topi immunizzanti fino elevate concentrazioni sieriche di anticorpi possono essere rilevati e produrre cellule ibridomi come descritto 13. Un costrutto termostabilizzato è di solito la scelta migliore per l'immunizzazione; se il trasportatore è ben educati e mantiene l'attività biologica dopo la purificazione, questo è spesso sufficiente a sollevare gli anticorpi. L'anticorpo 8B6 è stata sollevata contro WT SERT. Per cristallizzazione, solo le frazioni di picco da SEC contenenti complesso monodisperse come giudicato da FSEC dovrebbero essere combinati e concentrati. cristalli SERT-8B6 crescono in una ristretta gamma di condizioni e ci sono una serie di passaggi che dovrebbero essere adottate per risolvere i problemi specificamente legati alla crescita dei cristalli SERT. Tris base regolato con HCl non deve essere usato nella soluzione serbatoio, poiché questo buffer non supporta la crescita di cristalli; è quindi critico utilizzare al posto di Tris regolato con NaOH. cristalli SERT crescere in un intervallo di concentrazione ristretta di PEG 400, quindi se i cristalli non crescono o in presenza di tanti piccoli cristalli, sarebbe consigliato anche un piccolo aumento o una diminuzione della concentrazione di PEG 400. Inoltre, l'acido additivo 6-amminoesanoico è stato utilizzato anche nella schermata ottimizzata per migliorare nucleazione. Il rapporto goccia di proteine: soluzione bene è anche un fattore determinante per la crescita dei cristalli. Goccia rapporti di 1,5 - 2: 1 sono raccomandati, con rapporti goccia più vicino a 2: 1 tipicamente sostenere la crescita di cristalli più grandi 3-dimensionale. Infine, l'uso di basso profilo piastre da 24 pozzetti è anche fondamentale verso la crescita dei cristalli, presumibilmente a causa di modifiche del tasso di diffusione del vapore.
Un approccio alternativo al metodo SPA è stato sviluppato per schermo per i mutanti che stabilizzano il trasportatore della serotonina topo in una conformazione di cocaina-bound utilizzando un filtro saggio di 5 vincolante. Per contro, il ba SPAsaggio SED consente di passi sequenziali di riscaldamento seguito da determinazione della frazione di SERT, che rimane legato al ligando. Così, questo consente la rapida determinazione della temperatura di fusione da un piccolo numero di campioni. Il metodo SPA si basa sulla disponibilità di un radiomarcato ligando ad alta affinità e se non sono noti ligandi che legano con affinità submicromolari allora sarà necessario un approccio alternativo. Molti altri metodi sono comunemente usati per misurare la stabilità della proteina come legame di coloranti fluorescenti e calorimetria 14, ma sono a basso throughput e sono sia in grado di misurare direttamente la funzione o richiedono grandi quantità di proteine. Se non è possibile utilizzare il metodo SPA, un approccio alternativo ad alta produttività è un FSEC basato termostabilità Assay 15 (FSEC-TS), dove il campione viene riscaldato seguita dalla separazione della frazione del trasportatore rimanente. FSEC-TS è un approccio utile per accedere comportamento cromatografico e lo stato oligomerico ed è apstrumento complementare owerful che può essere utilizzato insieme al metodo di SPA.
Un confronto tra i vari sistemi di espressione della proteina comune è stato anche trovato per favorire l'uso di cellule di mammifero per l'espressione del SERT 16 e non sorprende questo è probabile che il caso di molte proteine di origine mammifera. I metodi che abbiamo usato per l'espressione sono stati adattati per il SERT, ma è probabile facilmente adattabile. Condizioni che favoriscono alti livelli di espressione devono essere attentamente identificati variando il tempo di espressione, temperatura, concentrazione di virus, e la presenza di inibitori delle istone deacetilasi quali butirrato di sodio.
In genere privilegiamo purificazione di affinità in un detergente a catena lunga come C12M insieme con CHS prima della ricostituzione di mantenere alta affinità di legame ligando. Ricostituzione mediante assorbimento idrofoba è una tecnica mite che abbiamo trovato per essere efficace per molti altri trasportatori e recettori. Se questonon ha esito positivo, la rimozione di detergenti con elevate concentrazioni micellari critiche per dialisi, diluizione o SEC può essere impiegato 17 purché l'antigene è sufficientemente stabile in tali detergenti. Nei casi in cui non vengono rilevati anticorpi adeguati, abbiamo quasi sempre il problema è dovuto alla perdita di funzione o denaturazione dell'antigene e in tali casi ci eseguita con successo nuove vaccinazioni con particolare attenzione alla biochimica delle proteine. Infine, leganti e anticorpi che si legano con alta affinità dovrebbero costituire la base per un esperimento di cristallizzazione razionalmente pianificata e sfruttando una variante termostabile, si può programmare una più ampia gamma di condizioni variando le proprietà dei diversi detergenti. Inoltre, la cristallizzazione in un mesofase lipidico 18 o utilizzando bicelle 19 dovrebbero sempre essere considerati come alternativa alla cristallizzazione in micelle.
Questi principi e metodi possono essere utilizzati con una certa modificationi per molte altre proteine transmembrana che sono difficili da esprimere e purificare da altri host di espressione, e sarà particolarmente utile per la determinazione della struttura dei bersagli di farmaci ad alta affinità.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DH10Bac | Invitrogen | 10361-012 | |
| Kanamycin | Fisher | BP906-5 | |
| Gentamicin | Fisher | BP918-1 | |
| Tetracycline | Sigma | T-7660 | |
| Bluo-gal | Invitrogen | 15519-028 | 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside |
| Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside | Anatrace | I1003 | IPTG |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Cellfectin II | Invitrogen | 10362-100 | Sf9 transfection reagent |
| Sf9 | ATCC | CRL-1711 | |
| Sf-900 III SFM media | Life Technologies | 12658-027 | |
| HEK-293S GnTI- | ATCC | CRL-3022 | |
| Freestyle 293 media | Life Technologies | 12338-018 | 293 expression media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 0984018DJ | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410 | |
| S-citalopram | Sigma | E4786 | Anagrade |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
| Cholesteryl hemmisuccinate | Sigma | C6013 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457P | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757P | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol | Avanti Polar Lipids | 840457P | |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | |
| Pepstatin A | Sigma | P5318 | |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Desthiobiotin | Iba Life Sciences | 2-1000-05 | |
| Asolectin | Sigma | 11145 | |
| Cholesterol | Sigma | C-8667 | |
| Lipid A | Sigma | L5399 | |
| Brain polar lipid | Avanti Polar Lipids | 141101C | |
| Biobeads | Biorad | 152-3920 | Hydrophobic absorption resin |
| Goat anti-mouse IRDye 680RD | Odyssey | 926-68070 | Used as secondary antibody for western blotting |
| Lauryl maltose neopentyl glycol | Anatrace | NG310 | Anagrade |
| Serotonin | Sigma | H9523 | |
| pFastBac 8B6 | Available from authors | ||
| pEG Bacmam SERT Strep II | SERTIC, Available from authors | ||
| pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His | SERTTC, Available from authors | ||
| pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His | SERTCC, Available from authors | ||
| Imidazole | Sigma | 56749 | |
| n-Octyl β-D-maltoside | Anatrace | O310 | Anagrade |
| Thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| EndoH | New England Biolabs | P0702 | |
| Trizma-HCl | Sigma | T5941 | Tris is used for preparation of crystallization reservoirs |
| PEG 400 | Sigma | 91893 | |
| 6-aminohexanoic acid | Sigma | 7260 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher | MT25052CV | |
| Isoplate-96 TC | PerkinElmer | 6005070 | |
| PolyJet | SignaGen | SL100688 | Polymer transfection reagent for mamalian cells |
| Copper HIS-Tag YSI SPA Beads | PerkinElmer | RPNQ0096 | His-tag affinity SPA beads |
| Citalopram, [N-Methyl-3H] | PerkinElmer | NET1039250UC | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | heating block for thermostability assay |
| ThermoTop | Eppendorf | 5308000003 | |
| SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates | Eppendorf | 5306000006 | |
| 0.2 µm syringe filter | Olympus Plastics | 25-243 | |
| 1 L filter system | Corning | 430517 | |
| 2 L flat bottom tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000 | |
| 2 L baffled tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000B | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Forma Orbital Shaker | Thermo Scientific | 416 | |
| Strep-Tactin resin | Iba Life Sciences | 2-1208-025 | Strep affinity resin |
| Extruder | Northern Lipids | ||
| Li-Cor imaging system | Odyssey | western blot imaging system | |
| XK16 column | GE Healthcare | 28-9889-37 | column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton |
| 100 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC910096 | |
| 30 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC903024 | |
| Äkta FPLC | GE Healthcare | UPC-900 | |
| HPLC | Shimadzu | 51476 | |
| Superose 6 (10/300) column | GE Healthcare | 17-5172-01 | Used for FSEC |
| Tangential flow apparatus | Pall Filtron | ||
| 0.2 µm filter tangential flow cell | Pall Filtron | PSM20C11 | |
| 30 kDa MWCO tangential flow concentrator | Pall Filtron | OS030T12 | |
| Talon resin | Clonetech | 635504 | His-tag affinity resin used for Fab purification |
| 1 mL HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | Cation exchanger used for Fab purification |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | Used for SEC separation of SERT-8B6 |
| 24-well VDXm plate | Hampton Research | HR3-306 | |
| 18 mm coverslips | Hampton Research | HR3-239 | |
| Virocyt virus counter | Virocyt | 2100 | |
| MicroBeta Trilux | PerkinElmer | 1450 | 96-well scintillation counter |
| HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | |
| Sertraline | Sigma | S6319 |
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