Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Termostabilisering, Expression, Rensning, og Krystallisation af Human Serotonin Transporter Bundet til Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/54792
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Vollum Institute, Oregon Health & Science University, 2Graduate Group in Biophysics, University of California, San Francisco, 3Howard Hughes Medical Institute, Oregon Health & Science University

Summary

Dette håndskrift beskriver, hvordan man screene for thermostabilizing mutationer, oprense det humane serotonin transporteren, generere antistoffer med høj affinitet, og krystallisere serotonintransporteren-antistof komplekset bundet til det antidepressive lægemiddel S -citalopram. Denne protokol kan tilpasses til studiet af andre udfordrende membrantransportører, receptorer og kanaler.

Abstract

Serotonintransportøren er en natrium og chlorid-koblede transportør, at "pumper" ekstracellulær serotonin i celler. S -citalopram er et lægemiddel til behandling af depression og angst ved binding til serotonin transporteren med høj affinitet, blokering serotoningenoptagelse. Her rapporterer vi en effektiv procedure og et sæt værktøjer til at stabilisere, express, rense, og krystallisere serotonin transportør-antistof-komplekser bundet til S -citalopram og andre antidepressiva. Mutationer, som stabiliserer serotonintransporteren blev identificeret under anvendelse af en S -citalopram bindingsassay. Serotonintransporter udtrykt i Baculovirus-transducerede HEK293S GNTI - celler, blev rekonstitueret i proteoliposomer og anvendes til at hæve højaffinitetsantistoffer. Vi har udviklet en strategi til at opdage antistoffer, som er anvendelige til strukturelle studier. Der er også etableret en enkel tilgang til ekspression af antistoffragmenter i Sf9 celler.Transporter-antistof-komplekser renset ved hjælp af denne procedure er velopdragen og let krystallisere, der producerer komplekser med S -citalopram der diffrakterer røntgenstråler til 3-4 Å opløsning. Strategierne her udviklede kan anvendes til at bestemme strukturen af ​​andre udfordrende membranproteiner.

Introduction

Serotonin transporter (SERT) er et integreret membranprotein, der letter transporten af serotonin over cellulære membraner 1. SERT tilhører en familie af Neurotransmitter Natrium Symporters (NSS'er), som også omfatter dopamin og noradrenalin transportører 2. SERT er det molekylære mål for bredt ordineret antidepressive og angstdæmpende medicin, der virker til kompetitivt hæmme serotonin transport 3. SERT udnytter energetisk gunstige cotransport af natrium for at fjerne neurotransmitter fra den synaptiske kløft. Omfattende karakterisering af det serotonerge system, har vist, at ændringer i serotonin stofskifte synes at påvirke næsten alle neurologiske processer, herunder humør, søvn, smerter, kognition, og aggression behaviors 4. SERT funktion kan ændres ved brug af antidepressiva og selektive serotonin reuptake hæmmere (SSRI) ligesom S -citalopram, samt ved psychostimulaNTS og narkotika for afhængighed såsom amfetamin og 3,4-methylenedioxy- N -methylamphetamine eller "ecstasy" 1,2.

SSRI er uhyre vigtige for behandling af affektive lidelser, men den præcise strukturelle grundlag for deres indsats er ikke godt forstået. WT SERT er ustabil i vaskemiddel miceller, hvilket hindrer fremskridt i retning af en tredimensional (3D) struktur SERT 5,6. For nylig udviklede vi varianter af SERT som er robust stabilt i en lang række detergenter og fastholde SSRI bindingsaktivitet 6. Disse termostabile SERT varianter blev udvalgt under anvendelse af en scintillationsproximitetstest-baserede termostabilitet assay. Her beskriver vi en fremgangsmåde til generering af højaffinitetsantistoffer der kan binde SERT, og oprensning og krystallisering af termostabil SERT, i kompleks med antistof og S -citalopram.

Denne protokol ud fra, at SERT og 8B6 gener er blevet lykkedesy klonet ind i BacMam 7 og insekt ekspressionsvektorer hhv. At danne antistoffer, blev cDNA, der koder resterne 73-616 af WT SERT klonet i BacMam vektor med en C-terminal Strep II tag (SERT IC). For termostabiliteten skærmen, blev SERT resterne 73-616 med C-terminale GFP, Strep II, og 10-Hans tags (SERT TC), der anvendes. Individuelle punktmutationer blev dannet i SERT TC baggrund. For krystallisering protokollen blev SERT-GFP fusionsprotein bruges med Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] og 10-Hans tags, bærer de varmestabile mutanter, Y110A, I291A, og T439S og mutationer af overfladen cysteiner C554A, C580A og C622A (SERT CC). Thrombin spaltningssekvenser (LVPRGS) blev også indsat i SERT CC efter Q76 og T618 at tillade fjernelse af de N- og C-terminale ender. Plasmidet koder for 8B6 Fab blev manipuleret til at udtrykke både tunge og lettekæder af antistoffet med gp67 sekretionssignaler sekvenser under kontrol af to separate Polyhedrinsekvenserne promotorer. C-terminalen af ​​den tunge kæde af 8B6-antistoffet blev tagget med en 8-His-tag og et trombinspaltningssted blev indsat mellem den tunge kæde og tagget.

Protocol

1. Transfektion for vedhængende HEK293S GNTI - Celler til Termostabilitet Screen

  1. Forbered Poly-D-Lysin (PDL) -belagt plader med 96 brønde. Udfør alt arbejde i en steril laminar flow hætte.
    1. Filter en 25 ug / ml opløsning af (PDL), molekylvægt 70,000-150,000 Da, ved anvendelse af en 0,2 um sterilt filter. Tilsæt 50 pi PDL til hver brønd i en 96-brønd vævskultur (TC) plade, sikrer bunden er jævnt belagt, og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter.
    2. Aspirer PDL-opløsning og vaskes med 200 pi sterilt vand.
    3. Tillad plade at lufttørre i 2 timer før opbevaring ved 4 ° C. PDL coatede plader kan opbevares ved 4 ° C i adskillige uger.
  2. Trypsinisering af adhærente HEK293S celler.
    1. Grow HEK293S til 80% konfluens i en 10 cm skål holdt ved 37 ° C med 8% CO2. En enkelt 10 cm skål bør have ca. 10 millioner HEK293S celler. Brug ikke celler efter 30 passager! Aspirer medier og vask med 5 ml phosphatbufret saltvand (PBS). Tilsæt 1 ml trypsin-EDTA-opløsning (0,25% trypsin, 0,02% EDTA) til celler og inkuberes i 2 minutter ved 37 ° C.
    2. Der tilsættes 10 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS) og resuspender cellerne ved gentagen pipettering op og ned ved en serologisk pipette.
    3. Afpipetteres 10 pi celler og blandes med 10 pi trypanblåt-opløsning (0,4%). Bestem celletæthed anvendelse af et hæmocytometer og et lysmikroskop. Må ikke regne celler, der er farvet blå, som de er døde. Sikre, at cellelevedygtigheden er over 90%.
  3. Grundigt resuspender trypsiniseret HEK293S GNTI - celler i DMEM suppleret med 10% FBS til en tæthed på 0,5 x 10 6 celler / ml i en engangs pipette reservoir. bliver brug for omkring 5 millioner HEK293S celler for hver plade. I alt 24 konstruktioner kan transficeres på hver plade ved hjælp af denne protocol.
  4. Under anvendelse af en multikanalpipette, tilsættes 100 pi celler til hver brønd i en PDL belagt plade. Resuspender celler i pipetten reservoir efter påfyldning hver plade for at sikre en jævn fordeling af celler. Cellerne inkuberes i et 37 ° C inkubator med 8% CO2. Efter 24 timer bør cellerne når ca. 80% konfluens.
  5. 1 time før transfektion erstatte medier. Forbered DNA-transfektionsreagens komplekser til transfektion.
    1. For hver konstruktion i SERT TC baggrund, der skal screenes, blandes 450 ng DNA med 45 pi serum-frit DMEM og blandes. Tilføj 1,6 pi af transfektionsreagens til 45 pi serum-frit DMEM og blandes.
    2. Tilføj straks fortyndet transfektionsreagens løsning på DNA-opløsning og blandes. Bland ikke løsninger i omvendt rækkefølge. Vent 10 - 15 min og tilsættes 20 pi af transfektionsreagens / DNA-blandingen til 4 brønde.
  6. Når alle brønde er blevet transficeret, bland plade ryst forsigtigt tilbage etnd frem og tilbage til 37 ° C inkubator.
  7. Efter 16 - 24 timer erstatte medier med DMEM indeholdende serum og 10 mM natriumbutyrat.
  8. Ca. 48 timer efter transfektion fjerne mediet, og enten straks videre med termostabilitet skærm eller fryse cellerne ved -80 ° C, der skal anvendes senere. Celler kan opbevares ved -80 ° C i flere uger.

2. Scintillation Proximity-baserede Termostabilitet skærm med S -citalopram

  1. Cellerne inkuberes med 200 nM S -citalopram i 25 pi TBS (Tris-saltvand - 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl) i 5 minutter ved stuetemperatur.
  2. Solubilisere cellerne ved tilsætning af 25 pi 8 mM n-dodecyl-β-D-maltopyranosid (C12M), 1 mM cholesteryl hemmisuccinate (CHS), protease inhibitor cocktail (2 mM phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), 0,1 mg / ml aprotinin, 4 g / ml pepstatin A, og 4 ug / ml leupeptin) i TBS og inkubering i 1 time ved stuetemperatur.
  3. Der tilsættes 50 pi TBS with 20 nM [3H] citalopram (81,7 Ci / mmol), 0,1% bovint serumalbumin, og 2 mg / ml His-mærke affinitet Scintillation Proximity assayet (SPA) beads til tre brønde til hver konstruktion. For den sidste godt tilføje den samme løsning, der er anført, men supplere med 100 uM sertralin for at bestemme uspecifik binding. Sikre, at His-mærke affinitet SPA-perler blandes grundigt ved tilsætning til 96-brønds plade.
  4. Måle [3H] citalopram binding under anvendelse af en 96-brønds scintillationstæller ved stuetemperatur med en 1 min tælletid per brønd. Fortsæt tælle plader indtil totale tællinger plateau (ca. efter 36 timer).
  5. Heat plader til 15 minutter i en varmeblok med et opvarmet låg ved 33 ° C. Måle [3H] citalopram binding igen efter opvarmning som beskrevet i 2.4.
  6. Gentag trin 2.4 - 2.5 og ændre opvarmningstrinnet til 36 ° C, 39 ° C, 45 ° C, 48 ° C, og 51 ° C. Juster opvarmningstemperaturer afhængigt af tilsyneladende smeltetemperatur (Tm)af målproteinet og termostabiliteten af ​​de mest stabile konstruktion. Fortsæt med at varme plader, indtil alle konstruktioner har lave specifikke tæller.
  7. Analysere data til at bestemme Tm værdier.
    1. Bestem den gennemsnitlige totale tællinger pr minut (CPM) af hver konstruktion for brønde der ikke indeholder sertralin ved midling af 3 replikatbrønde. Bestem den uspecifikke CPM ved at midle CPM for hver brønd indeholdende sertralin i en enkelt plade.
    2. Beregn specifik CPM ved at subtrahere den ikke-specifikke CPM fra den samlede CPM.
    3. Beregn Tm af en ikke-lineær tilpasning til en Boltzmann S-formet funktion. Konstruktioner med lav specifik CPM ved stuetemperatur (<10% af WT) generelt ikke har nøjagtige Tm-værdier. Mutationer fra de mest termostabile konstruktioner kan kombineres sammen og screenet for additive stigninger i termostabilitet.

3. Angivelse af Human Serotonin Transporter i HEK293S GNTI

  1. Transform kemisk kompetente DH10Bac celler med 1 ng plasmid.
    1. Tilføj plasmid til 50 pi DH10Bac celler og inkuberes på is i 30 minutter.
    2. Varmechok DH10Bac celler ved 42 ° C i 30 sek. Tilsæt 200 pi SOC-medium og inkuberes ved 37 ° C i 4 timer under omrystning.
    3. Plade alle bakterierne ned på en Luria Broth (LB) plade indeholdende 50 ug / ml kanamycin, 7 pg / ml gentamicin, 10 ug / ml tetracyclin, 100 ug / ml 5-brom-3-indolyl β-D-galactopyranosid, og 40 pg / ml isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG).
  2. Isoler lacZ - kolonier (hvide kolonier) dyrket ved 37 ° C i 2 d på LB-agarplader.
  3. Grow flere kolonier O / N ved 37 ° C i 5 ml LB indeholdende antibiotika og isolere bacmid DNA.
    1. Spin ned bakterier ved 1.000 xg i en centrifuge i 5 minutter. Supernatanten kasseres. Resuspender bakterier med 200 pi miniprep resuspension puffer.
    2. Lyserer bakterier ved tilsætning af 200 pi miniprep lysepuffer og vende røret forsigtigt 10 gange. Tilsæt 200 pi af neutraliseringsbuffer.
    3. Fjern uopløselige fraktion ved centrifugering ved 14.000 xg i 10 minutter i en centrifuge. Tilsæt 1 ml isopropanol til supernatanten og chill ved -20 ° C i 20 min for at udfælde DNA.
    4. Spin ved 14.000 xg i 15 min i en centrifuge og kassér supernatanten.
    5. Vask DNA-pelleten med 70% EtOH og spin igen ved 14.000 xg i 15 min. Supernatanten kasseres. Lufttør DNA indtil alt EtOH er fordampet og resuspender i 50 pi vand.
      BEMÆRK: Bacmid DNA bør transficeres i Sf9-celler straks for de bedste resultater, men kan også opbevares ved -20 ° C i flere uger.
  4. Transficere bacmid DNA i 1x10 6 celler af vedhængende Sf9 dyrket i et fugtigt kammer ved 27 ° C i en 6-brønds skål. Udføre alle cellekultur manipulationer i en steril laminar flow hætte.
      <li> Fjern medier fra celler og tilsæt 2 ml frisk Sf9- medier. Tilsæt 5 ug bacmid DNA til 100 pi Sf9 medier (opløsning A).
    1. Tilføj 8 pi af en kationisk lipid Sf9 transfektionsreagens til 100 pi Sf9 medier (Opløsning B). Inkuber rør indeholdende Opløsning B i 5 min.
    2. Bland rør indeholdende opløsning A med opløsning B og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter og tilsæt hele opløsningen til Sf9-celler.
    3. Efter 96 timer, høst supernatant (P1-virus) ved passage gennem en 0,2 um filter. P1 virus kan opbevares i flere måneder ved 4 ° C i mørke og genbruges til at gøre P2 virus efter behov.
  5. Tilsæt 100 pi P1-virus til 1 I Sf9 celler ved en densitet på 1 x 10 6 celler / ml i Sf9 medier. Inficere celler i 96 timer, vokser ved 27 ° C på et rysteapparat ved 100 rpm.
  6. Spin ned celler i en centrifuge ved 4.000 xg i 15 minutter og filter supernatant indeholdende viruspartikler gennem et 0,2 um filter. Kassér cellepellet. Determine viral densitet ved anvendelse af en viral plaque-assay eller en virus tæller. Viruset densitet bør være> 1 x 10 8 viruspartikler per milliliter. P2 virus kan opbevares ved 4 ° C i mørke og anvendes i flere måneder.
  7. Inficere 10 I HEK293S GNTI - celler 7 vokser i suspension ved 37 ° C med 8% CO2 og 85% fugtighed på et rysteapparat ved 130 rpm i 293 ekspressions medium suppleret med 2% FBS ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 2 og en densitet på 3 x 10 6 celler / ml, typisk 30 - 50 ml P2-virus pr 800 ml af celler i en 2 L forvirret kolbe.
    BEMÆRK: Det anbefales ikke at bruge mere end 80 ml P2 virus siden HEK293S GNTI - celler vil vokse langsomt og kan blive urentable på grund af en ændring i pH. Sf9 medier er mere sure end 293 Expression Media.
  8. 12 - 16 timer efter infektion, tilføj natriumbutyrat til en koncentration på 10 mM fra en 1 M stamopløsning. 48-60 timer efter infektion, høst cellerne ved centrifugering ved4.000 xg i 15 min. Fjern supernatanten.
  9. Resuspender cellerne i 150 ml TBS, 2 uM S -citalopram eller andre SERT hæmmere og opbevares ved -80 ° C indtil den er klar til rensning.

4. Affinitetsrensning af serotonintransporteren til immunisering og krystallisation

  1. Tø celler fra 10 I kultur i varmt vand (ca. 30 ° C) og resuspender ved hurtigt at passere gennem en 10 ml pipette indtil homogenitet.
  2. Forbered detergentopløsning til solubilisering (150 ml): 80 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl indeholdende 40 mM C12M, 5 mM CHS, og protease inhibitor cocktail.
  3. Tilføj alle cellerne til et bægerglas med en omrører og tilsæt alle de rengøringsmiddel til cellerne under omrøring. Solubilisere ved 4 ° C i 1 time under omrøring.
  4. Spin lysat ved 8.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Kassér pellet og dekanteres supernatanten i rene ultracentrifugerør. Spin ved 100.000 xg i 1 time i et ultracentrifuge. Kassér pellet og filter supernatanten gennem et 0,2 um filter.
  5. Pass lysat over 10 ml Strep affinitetsharpiks pakket i en søjle under anvendelse af en peristaltisk pumpe ækvilibreret i vaskepuffer: 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, 5% glycerol, 25 uM lipid (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycero- 3-phosphocholin, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol i et molært forhold på 1: 1: 1), og 1 uM S -citalopram eller SSRI i TBS.
  6. Tilslut Strep affinitetssøjle til et Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system, og vask søjle ved 2 ml / min med 66 ml (6,6 søjlevolumener) vaskebuffer. Eluerer oprenset protein i samme puffer suppleret med 5 mM desthiobiotin 0.5 ml / min ved anvendelse 33 ml (3,3 søjlevolumener) af puffer. Saml 1 ml fraktioner; Topfraktionerne vil være ~ 10 ml. Oprenset protein kan opbevares ved 4 ° C i 2 - 3 i d hvis det ønskes.
    BEMÆRK: Totalt udbytte vil være 3 -4 mg SERT CC og 1 mg SERT IC. En absorbans på 2 AU ved 280 nm er lig med 1 mg / ml SERT.

5. Rekonstituering af Transporter i liposomer til immunisering

  1. Forbered liposomer indeholdende asolectin: cholesterol: lipid A: hjerne polært lipid (molforhold 60: 17: 3: 20). Opløs lipider i 1 ml chloroform, og der tilsættes 40 mg total lipid til et 100 ml glas rundbundet kolbe ved den angivne molforhold.
    1. Fordampe chloroform i mindst 1 time under vakuum, idet rundbundet kolbe roterer i varmt vand, ca. 30 ° C.
    2. Rehydrere lipider ved at tilsætte 10 ml af TBS. Inkuber i puffer i 10 min.
    3. Frys lipidet ved at anbringe kolben i flydende N2.
    4. Tø. Fordybe sfærisk bunden af ​​kolben i et bæger fyldt med varmt vand, ca. 30 ° C. Soniker i et bad-sonikator i 5 min.
    5. Vortex og gentage trin 5.1.3 - 5.1.4 10 gange, eller indtil lipider fuldstændigt resuspenderes fra bunden og danner en uklar suspension.
    6. Ekstrudere hele lipidblanding to gange gennem 200 nm filtre. Lipidet vil fremstå som en mælkeagtig suspension før ekstrudering; bagefter vil det blive gennemsigtige. Tilsæt ikke hele lipidblandingen til ekstruderen på én gang som det kan blive tilstoppet, hvilket resulterer i tab af prøven.
    7. Spin lipider ved 100.000 xg i 20 minutter og resuspenderes i 0,5 - 1 ml af TBS i en koncentration på 40 mg / ml.
  2. Koncentrer oprenset SERT IC til 250 - 500 pi under anvendelse af en 100 kDa MWCO centrifuge protein koncentrator til 2 - 4 mg / ml og mætte liposomer med 5 mM C12M. Tilføj oprenset SERT til vaskemiddel: lipidblandingen i 1 ml slutvolumen.
  3. Fjern C12M ved 3 successive tilsætninger af 80 mg / ml hydrofob absorption harpiks. For de første 2 tilføjelser, inkuberes med harpiks med rotation i 2 timer ved 4 ° C. Fjern harpiks ved at passere gennem glasuld. Foretage den afsluttende inkubering med harpiksnatten over.
  4. Koncentrer proteoliposomer ved centrifugering ved 100.000 xg i 20 min. Kassér supernatanten og resuspender pellet i 250-500 pi TBS.
  5. Tilsæt 10 uM slutkoncentration på S -citalopram til den rekonstituerede protein efter den endelige fjernelse af harpiks.
  6. Opløseliggøre 2,5 pi af proteoliposomer i SDS-PAGE loading buffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 10% glycerol, 2% SDS, 0,01% bromphenolblåt, 100 mM DTT) og kørt på en SDS-PAGE-gel ved 200 V i 1 h for at sikre, at SERT er blevet rekonstitueret. Proteoliposomer kan opbevares ved -80 ° C i alikvoter til langtidsopbevaring og optøet på is før hver immunisering.

6. Screening for antistoffer, som genkender 3D Epitoper

  1. Screen hybridomcellelinier ved Western blot. Antistoffer, der genkender SERT ved Western blot sandsynligvis binder lineære epitoper og vil sandsynligvis ikke være nyttigt for strukturelle studier.
    1. Bland 1 ug purifiered SERT IC eller SERT CC og kørt på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel ved 200 V i 1 time.
    2. Overførsel til en nitrocellulosemembran ved 200 mA i 30 minutter under anvendelse af Towbin-buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 20% (v / v) methanol, 0,1% SDS). Membranen kan tørres og opbevares i ubegrænset tid ved stuetemperatur.
    3. Genbefugtning membran med 10% methanol, og vask med PBS (10 mM phosphat, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI).
    4. Bloker med 5% mælkepulver i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur.
    5. Vask med PBS og inkuberes med 1 ug / ml antistof i PBS med 0,1% mælk.
    6. Vask grundigt med PBS indeholdende 0,1% Tween-20.
    7. Inkuber med gede-anti-muse-antistof konjugeret til en IR-farve fortyndet 1: 10.000 i PBS med 0,1% Tween 20 og 0,1% mælk.
    8. Vask udførligt og scanne ved hjælp af et billeddannende system.
  2. Bland hybridoma supernatant indeholdende vestlige negative antistoffer med 100 nM SERT CC-protein under anvendelse af et molforhold på 1: 2 (SERT: mAb) i 200 pi TBS med 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, og 1 uM S -citalopram. Centrifuger ved 100.000 xg i 20 min. Analyser supernatant indeholdende SERT-mAb komplekser og analysere ved hjælp af fluorescens-påvisning gelpermeationskromatografi (FSEC) 8. Kassér pelleten.
    1. Kør 100 pi supernatant på en størrelse eksklusion søjle ved 0,5 ml / minut under anvendelse af en (HPLC) -system højtryksvæskekromatografi udstyret med en fluorescensdetektor (excitation: 480 nm, emission: 510 nm) ved anvendelse af en løbebuffer indeholdende TBS, 0,4 mM lauryl maltose neopentylglycol, og 1 uM S -citalopram. Antistoffer, som danner komplekser vil få GFP-fusionsproteinet til eluering tidligere end det frie transportør fra kolonnen størrelsesudelukkelseschromatografi.
    2. Fortynd komplekser til 10, 1, 0,1 nM i 200 uL TBS med 1 mM C12M, 0,2 mM CHS, og 1 uM S -citalopram og gentagelsen FSEC. Antistoffer, som stadig kan flytte toppen transportør ved lave koncentrationer nanomolære erhøj affinitet bindemidler og gode kandidater til strukturelle studier.
  3. Retest binding af FSEC i nærvær af 1 mM serotonin. Antistoffer, som specifikt genkender SSRI bundet konformation vil ikke binde i nærvær af substratet. Antistoffer, som genkender en 3D-epitop, som ikke ændre sig som følge af kropsbygning vil binde uafhængigt af tilstedeværende ligand.
  4. Bland parvise forskellige kombinationer af antistoffer og teste binding af FSEC. Antistoffer, som genkender distinkte epitoper vil forårsage SERT til eluering tidligere, når de kombineres i forhold til binding af et enkelt antistof.
  5. For første strukturelle studier, skal du vælge den højeste affinitet antistoffer, som genkender 3D epitoper.

7. Ekspression af antistoffragment i Sf9-celler

  1. Klon variable og konstante domæner af Fab ved PCR ind i insekt ekspressionssystem til ekspression i Sf9-celler under anvendelse af standardprotokoller.
  2. Transficere 1 x 10 6 Sf9 celler med 5 pg Bacmid DNA, der koder de lette og tunge kæder af den 8-His-mærkede 8B6 Fab med en gp67 sekretion sekvens (som anført i afsnit 3.4).
  3. Harvest P1 virus 96 h efter transfektion og tilsæt 500 pi P1-virus til 1 I Sf9 celler ved en densitet på 1 x 10 6 celler / ml i en 2 liters kolbe at gøre P2 virus. Inficere celler i 96 timer ved 27 ° C.
  4. Harvest P2-virus (som pr afsnit 3.6).
  5. Inficere 6 L af Sf9-celler med en tæthed på 2 - 3 x 10 6 celler / mL med en MOI på 2 med P2-virus, typisk 40 - 50 ml pr kolbe med 1 I Sf9 celler i hver 2 L kolbe.
  6. Harvest celler ca. 96 h efter infektion. Der tilsættes 50 ml phosphatbuffer, pH 8 ved en slutkoncentration på 50 mM til cellerne og centrifugering ved 4.000 xg i 20 min. Kassér cellepelleten og filter supernatanten gennem et 0,2 um filter tangential flow-celle. Saml supernatanten og opbevares ved 4 ° C i 2 - 3 dage, hvis det ønskes.

  1. Koncentrat Sf9 supernatant anvendelse af en 30 kDa molekylvægtsafskæring (MWCO) tangential flow-celle til ca. 400 - 800 ml.
  2. Tilføj imidazol, pH 8 ved en endelig koncentration på 10 mM og 10 ml His-mærke affinitetsharpiks. Omrør i et bægerglas i 1 time ved 4 ° C.
  3. Indsamle His-mærke affinitetsharpiksen ved centrifugering ved 2.000 x g i 5 min. Supernatanten kasseres.
  4. Pack His-tag affinitet harpiks i en kolonne og oprette forbindelse til en FPLC.
  5. Vask His-mærke affinitet harpiks ved 2 ml / min med 66 ml (6,6 søjlevolumener) af 50 mM phosphat pH 8, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol.
  6. Elute 8B6 Fab i 33 ml 50 mM phosphat, pH 8, 150 mM NaCl, 250 mM imidazol. Opsaml fraktioner på 1 ml.
  7. Fortynd affinitetsoprenset Fab med en 10-folds volumen iskold 20 mM acetat, pH 5.
  8. Binde Fab til en 1 ml kationbyttersøjle under anvendelse af en peristaltisk pumpe ved 1 ml / min.
  9. Separat Fab anvendelse af en 30 ml linøre gradient af NaCl (0 - 500 mM) i 20 mM acetat pH 5,5 under anvendelse af et FPLC. Fab vil eluere som en enkelt top ved ~ 300 mM NaCl.
  10. Analyser på en 12,5% SDS-PAGE-gel under anvendelse af prøvebuffer indeholdende 100 mM DTT. De tunge og lette kæder af 8B6 Fab vil køre ved 27 og 25 kDa, på en reducerende SDS-PAGE-gel.
  11. Saml fraktioner indeholdende Fab og koncentreres til mindst 10 - 15 mg / ml under anvendelse af en 30 kDa MWCO protein koncentrator i en svingende spand centrifuge ved 3000 x g.
  12. Juster til pH 8 ved tilsætning af 1 M Tris pH 8 til en slutkoncentration på 50 mM og opbevares oprenset Fab for langsigtet ved 4 ° C. Totalt udbytte vil være 25 - 30 mg. En absorbans på 1,4 AU ved 280 nm er lig med 1 mg / ml 8B6 Fab.

9. Dannelse af Transporter-antistof-komplekser og separation ved gelpermeationskromatografi

  1. For krystallisering, rense SERT CC ved Strep affinitetskromatografi i C12M som beskrevet tidligere (afsnit 4).
  2. Bland koncentreret SERT med Fab i et molært forhold på 1: 1,2 i et volumen mindre end 500 pi. Der centrifugeres ved 100.000 xg ved 4 ° C i 20 min. Samle bundfald indeholdende SERT-Fab-komplekset. Kassér pellet.
  3. Separat ved gelpermeationskromatografi (SEC) under anvendelse af et FPLC på en størrelse eksklusion søjle ækvilibreret i TBS suppleret med 40 mM n-octyl-β-D-maltosid (C8M), 0,5 mM CHS, 5% glycerol, 25 uM lipid (samme som i trin 4.5) og 1 uM S -citalopram på 0,5 ml / min.
  4. Opsaml fraktioner på 0,5 ml og analysere den 4. - 15% SDS-PAGE geler og ved tryptophanfluorescens ved SEC. GFP tagged SERT vil køre med ca. 80 kDa på en SDS-PAGE-gel. Efter fjernelse af termini og N-bundne sukkere det vil køre som et 45 kDa-protein.
  5. Determine hvilke fraktioner til at kombinere ved at samle kun de fraktioner, som er monodisperse som bedømt ved analyse af fraktionerne ved tryptofan fluorescens SEK (Excitation: 280, emission: 335 nm).
  6. Store oprenset SERT-8B6 kompleks ved 4 ° C i op til 1 uge.

10. Krystallisation af Transporter-antistof komplekser ved hængning Drop

  1. Før krystallisation, koncentrere topfraktioner fra SEC separation af SERT-8B6-komplekset til 2 mg / ml under anvendelse af en 100 kDa MWCO centrifuge protein koncentrator. En absorbans på 2 AU ved 280 nm er lig med 1 mg / ml.
  2. Tilsæt yderligere Fab i et forhold på 1: 0,05 kompleks: frit Fab. Tilsæt 10 uM fri S -citalopram.
  3. Der centrifugeres ved 100.000 xg ved 4 ° C i 20 min. Samle bundfald indeholdende SERT-Fab-komplekset. Kassér pellet.
  4. Opsæt en hængende dråbe skærm 24-brønd ved 4 ° C i henhold til tabel 1. Grow diffraktion kvalitet krystaller løbet reservoir løsningerindeholdende 100 mM Tris-NaOH, pH 8,5 blev 25 - 125 mM KCI, 32,5 - 34% PEG 400 og 0,5% 6-aminohexansyre.
    BEMÆRK: Brug Tris justeret med NaOH til pH 8,5 som en buffer. Brug ikke Tris-base justeres med HCI. Skærmen kan fremstilles i 2 ml rør og anvendes indtil færdig. Pas til præcist pipettere PEG 400 ved hjælp af en positiv fortrængning pipette, da det er ekstremt tyktflydende!
    1. Pipetter 500 pi hvert reservoir opløsning i en lav profil 24-brønds plade med tætningsmiddel påført til hver brønd. Pipette 1.5, 1,75, og 2 pi af SERT-8B6 kompleks på en 18 mm silikoniseret glas dækglas. Pipetter 1 pi reservoir opløsning oven af ​​proteinet prøven.
      BEMÆRK: Pladen blev købt med fugemasse allerede anvendes til kanten af ​​brøndene.
    2. Påfør dækglas til 24-brønd med dråberne står reservoiret opløsning og forsegle samme ved at trykke dækglas på tætningsmiddel forvejen påført til hver brønd.
    3. Fortsæt, indtil alle 24-brønde er blevet oprettet. Efterlad den færdige plade i et velisoleret rum ved 4 ° C. Forstyr ikke pladerne i mindst 3 dage
      BEMÆRK: Enkelte krystaller vil blive vist inden ca. 3 dage, og vokse til 100-175 um efter 14 dage.
  5. Harvest krystaller i cryoloops og direkte flash-cool i flydende N2 før X-ray samling diffraktion data.
  6. Hvis det er nødvendigt, at finde yderligere krystallisationsbetingelser ved bred screening med hængende dråber. Bruge tre dråber med protein: fældningsmiddel forhold på 2: 1, 1,5: 1, 1: 1. Hvis en robot er tilgængelig, derefter oprette 100-150 nL dråber over 70 uL af reservoir løsning i en 96-brønds plade. Større 3D krystaller kan dyrkes i 24-brønde.
  7. Score baseret på udseendet af dråben: 0, klar; 1, støv; 2, granulært præcipitat; 3, faseseparation; 4, mikrokrystallinsk; 5, nåle; 6, plader; 7, 3D krystaller.
  8. Opsæt krystallisering ved at hænge drop metoder i 24-brønde som beskrevet ovenfor omkring nyligt identificerede condlinger.

Representative Results

Et bibliotek af enkelt punkt mutanter i SERT TC baggrund blev oprettet for at skærm til thermostabilizing mutationer. Individuelle mutanter blev genereret ved anvendelse af standard mutagenese. Screeningen protokollen bruger forbigående transficeret HEK293S celler og en scintillationsproximitetstest-baserede termostabilitet skærm til hurtigt identitet nyttige mutationer til krystallisation som beskrevet i figur 1A. Plotting Tm-værdier versus bundet [3H] citalopram ved stuetemperatur afslører konstruktioner med høj termostabilitet og ekspressionsniveauer egnede for proteinoprensning (figur 1B). Tre mutanter (Y110A, I291A, og T439S) blev kombineret til frembringelse af en yderst stabil konstruktion (figur 1C). Termostabilitet er også korreleret med øget stabilitet i kortkædede detergenter nødvendige for krystallisering af SERT-Fab-komplekset.

Den store skala ekspression af human SERT hjælp baculovirus-transduced HEK293S GNTI - celler kan tage mindre end 2 uger og kan producere milligram mængder, som illustreret i figur 2A. Anvendelse af GFP-mærkede SERT CC protein tillader SERT hensigtsmæssigt kan følges under ekspression og oprensning ved fluorescens (figur 2B). Vores oprensning strategi involveret 1) solubilisering af SERT bundet til S -citalopram fra HEK293S GNTI - celler i C12M i nærvær af CHS som en stabiliserende lipid; 2) binding af SERT til en Strep affinitetsmatrix; 3) fjernelse af forurenende proteiner ved omfattende vask; og 4) eluering af den funktionelle SERT med buffer indeholdende desthiobiotin (figur 2C). Det eluerede protein er stort set fri for andre påviselige proteiner ved Coomassie blue-farvning og monodisperse som vurderet ved FSEC (figur 2D, E).

En lignende strategi blev taget at oprense SERT med en Strep II-tag, som blev anvendt til reconstitution og immunisering (figur 3A, B). Inkorporering af SERT i proteoliposomer øger serum halveringstid og stabilitet SERT og forbedrer sandsynligheden for isolation af højaffinitetsantistoffer. Endvidere optagelse af lipid A, en komponent af den bakterielle cellevæg, fungerer som en potent adjuvans 9. Multilamellare liposomer blev fremstillet ved tilsætning af puffer til en tørret lipidblanding i glasrør og resuspenderes i puffer. Ekstrudering af liposomerne gennem 200 nm porestørrelsesfiltre producerer monodisperse unilamellære liposomale suspensioner. Liposomerne derefter mættet med detergent efterfulgt af tilsætning af renset SERT i detergent. Endelig er detergent fjernet ved tilsætning af hydrofob absorption harpiks til lipidet: blanding vaskemiddel. Supplerende ligand bør sættes til den rekonstituerede prøve at selektere for antistoffer, der genkender den antidepressive bundne konformation. Tilstedeværelsen af ​​SERT i proteoliposomer bør bekræftes vedsolubilisering en lille prøve med SDS-PAGE lastning farvestof eller C12M og kører på SDS-PAGE og FSEC (figur 3C, D).

Hybridomacellelinier udtrykker SERT antistoffer kan screenes for høj affinitet bindere som genkender 3D epitoper. Disse egenskaber er afgørende for et vellykket resultat af krystallisering, som antistoffet skal forblive fast bundet til en struktureret region til at fremme krystal pakning af homogene, velordnede domæner. I det første trin, er antistoffer, som genkender ustrukturerede regioner identificeret. SERT er denatureret og blottet på en nitrocellulosemembran; antistoffer, der binder denatureret SERT vil være western-positive og sandsynligvis genkender lineære epitoper. I figur 4A viser vi 2 eksempler på antistoffer, som er western-positive og sandsynligvis ikke hensigtsmæssigt at fremme crystallogenesis. I figur 4B, er de resterende western-negative antistoffer inkuberet med 100 nM SERT-GFP og separeret vedFSEC. Antistoffer, som binder SERT vil flytte GFP-positive spidsværdi til en tidligere position. De SERT-antistof-komplekser kan fortyndes yderligere i detergent at bestemme, om de kan binde med nanomolær affinitet efterfulgt af analyse ved FSEC. Tilsætning af serotonin resulterer i konformationelle ændringer i transportøren og således de antistoffer kan screenes igen for at bestemme om de specifikt kan genkende SSRI-bundne konformation. I figur 4C antistofferne vist sig at binde SERT i nærvær af serotonin, hvilket viser, at epitopen (er) ikke ændrer fra SSRI til substrat bundne tilstand. Endelig i figur 4D kombinationer af antistoffer testes for deres evne til at binde forskellige epitoper, hvilket resulterer i yderligere venstregående forskydning. Her 15B8 eller 8A11 antistoffer genkender en epitop, som er forskellig fra 8B6.

Den 8B6 antistof blev valgt til yderligere strukturel analyse baseret på foreløbige krystal screening med papain skaTed Fab. Generne af 8B6 Fab blev klonet ind i en insektcelle ekspressionsvektor. Fab kan udtrykkes og secerneres fra Sf9 celler, der vokser i suspension. Den 8B6 Fab kan oprenses fra Sf9 cellesupernatanten ved His-mærke affinitet (figur 5A, B) og kationbytterkromatografi (figur 5C, D) resulterer i protein, som forekommer forurenende stoffer på SDS-PAGE geler. I figur 5E er den rekombinante 8B6 Fab vist at binde SERT og anvendes i efterfølgende biokemiske og biofysiske eksperimenter.

Det affinitetsoprensede SERT CC fordøjes med thrombin og EndoH og blandes med 8B6 Fab at danne et kompleks i nærvær af S -citalopram. Transportøren-antistof-kompleks derefter adskilt ved SEC i C8M (figur 6A) og toppen fraktioner indeholder både SERT og Fab som vist ved SDS-PAGE (figur 6B). Anvendelse af C8M er afgørende for krystaldannelse sandsynligvis fordiden kortkædede vaskemiddel giver bedre pakning mellem molekyler i krystalgitteret. FSEC er ansat til at bestemme, hvilke fraktioner skulle samles til krystallisering (figur 6C); fraktioner, som ikke er monodisperse og / eller indeholder store mængder frit SERT eller Fab bør ikke kombineres.

Prism formet SERT-antistof krystaller kan dyrkes i tilstedeværelsen af S -citalopram ved hjælp af denne protokol ved at hænge dråbedampdiffusion (figur 7A). De resulterende krystaller diffrakterer røntgenstråler til en opløsning på 3,15 Å 10 (figur 7B).

figur 1
Figur 1: Scintillation Proximity-baserede Termostabilitet Assay A.. Oversigt over protokol til screening termostabilitet i tilstedeværelsen af [3 H] citalopram. B. Maksimal bundet [3 (Tm). Stiplede linjer repræsenterer værdier for WT transporteren. De 3 mest termostabile mutanter er mærket. Grå område repræsenterer mutanter, der har mindre end 10% af [3H] citalopram bindende i forhold til WT og dermed unøjagtige Tm-værdier på grund af et lavt signal-til-støj. C. Termostabilitetsforsøg kurver for WT SERT TC og top 3 mutanter. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse (SD). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Oversigt over Mammalian heterologt protein Expression A.. Skematiseret oversigt over BacMam virus generering og udtryk for SERT i HEK293S GNTI -. Celler B. HANK293S GNTI - celler, der udtrykker SERT CC (GFP-fluorescens) C.. Elueringsprofil af SERT CC på Strep affinitetsharpiks. Grøn spor repræsenterer koncentrationen af desthiobiotin 0 - 100% (med 0 - 5 mM) D.. Analyse af affinitetsoprenset SERT CC på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel E.. FSEC affinitet renset SERT CC opdaget af GFP-fluorescens (excitation: 480 nm; Emission: 510 nm). Toppen eluering ved 15 ml er SERT (#) og 18 ml er gratis GFP (*). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Repræsentativ Affinitetsrensning og Rekonstituering af SERT IC A.. Skematisk oversigt over antistof generation. <strong> B. Elueringsprofil observeret ved 280 nm af affinitetsoprensning af SERT IC om Strep affinitetsharpiks. Grøn spor repræsenterer koncentrationen af desthiobiotin 0 - 100%. (0 - 5, mM) C. Analyse af affinitetsoprenset og rekonstitueret SERT på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel D.. FSEC af opløst SERT efter rekonstituering. Den fluorescens af tryptophan rester blev brugt til at detektere SERT (Excitation: 280 nm; Emission: 335 nm). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Analyse af Repræsentative SERT antistoffer A. Screening af antistoffer ved western-blot. Ca. 1 ug SERT CC med eller uden GFP blev påført en 4 - 15% SDS-PAGE-gel og blottet på en nitrocellulosemembran. Binding blev detekteret ved anvendelse af et gede-anti-muse-antistof konjugeret til IR-farve. 2G4 og 10F2 er vestlige positive. B. Binding af antistoffer mod 100 nM GFP-mærkede SERT og påvisning ved FSEC detekteret ved anvendelse GFP-fluorescens. C. Binding af udvalgte Fabs til 100 nM GFP-mærkede SERT i nærvær af 1 mM serotonin. D. Binding af 8A11 eller 15B8 Fabs til SERT-8B6 Fab. Mindre toppe eluerer ved 18 ml er gratis GFP. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Repræsentativ Oprensning af 8B6 Fab fra Sf9 Cells A.. Elueringsprofil observeret ved 280 nm af oprensning af 8B6 Fab ved His-mærke affinitet chromatograp hy. Grøn spor repræsenterer koncentrationen af imidazol 0 - 50% (0 - 250 mM) B.. Ikke-reducerende og reducerende SDS-PAGE gel efter His-mærke affinitetsoprensning. Protein, der kører nær 50 kDa er ikke-reducerede Fab (#) og mindre arter på 25 kDa er reduceret Fab (*). C. Elueringsprofil observeret ved 280 nm af oprensning af 8B6 Fab ved kationbytning vise en enkelt symmetrisk som eluerer under en lineær natriumchlorid gradient. Grøn spor repræsenterer koncentrationen af NaCl 0 - 100%. (0 - 500 mM) D. Analyse af 8B6 Fab på en 12,5% SDS-PAGE-gel efter oprensning ved kationbytning. E. Binding af 8B6 Fab til 10 nM GFP-mærkede SERT, påvises ved anvendelse af fluorescens af GFP. Klik her for at se en større version af dette tal.

e 6 "src =" / files / ftp_upload / 54.792 / 54792fig6.jpg "/>
Figur 6: Repræsentativ Gelfiltrering Kromatografi af SERT-8B6 Complex i nærvær af S -citalopram A.. Gelfiltrering elueringsprofilen for oprenset SERT-8B6 kompleks. Main elueredes efter 11,5 ml er SERT-8B6-kompleks. Peak ved 15 - 17 ml indeholder GFP og Fab B.. Analyse af det oprensede SERT-8B6 kompleks på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel. Positionerne af SERT og de tunge og lette kæder af Fab er vist med en tankestreg. C. FSEC af størrelse-separeret fraktioner. SERT-8B6 komplekser blev detekteret ved anvendelse af tryptofan fluorescens. Fraktion 17 indeholder en større mængde SERT som ikke kompleks med Fab. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7 Figur 7: Krystallisation af SERT-8B6-komplekset bundet til S -citalopram A.. Lysmikroskopi af parallelepipedumformede formede krystaller af SERT-8B6 kompleks efter 2 ugers vækst. Scale bar lig 200 B um.. SERT-8B6 krystaller afbøje røntgenstråler til 3,15 Å. Blå ring repræsenterer 3,15 Å. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1:. En Krystallisation skærm til SERT-8B6 Complex Bound til S -citalopram Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Bestemmelse af membranprotein struktur ved biofysiske teknikker stadig en skræmmende virksomhed for mange medicinsk signifikante transportører, receptorer og kanaler 11. Her deler vi detaljeret ekspertise udviklet til strukturen bestemmelse af humane serotonin transporteren bundet til S -citalopram. Vi forventer, at disse metoder vil være hensigtsmæssigt at bestemme strukturer af SERT i andre konformationelle stater samt strukturer af andre vanskelige membranproteiner. Endvidere kan de biokemiske teknikker beskrevet her også anvendes til at studere funktionen af ​​oprenset SERT i detergent og et nær-nativ lipid miljø.

SERT krystallisering hængslet på udviklingen af ​​flere værktøjer og teknikker. Først forbedringer transportør termostabilitet produceret SERT varianter, der var velopdragen i forskellige vaskemiddel miceller efter udvinding af transportøren fra membraner 6. Desuden indebærer anvendelsenaf high-affinitetsligand S -citalopram hele oprensning og krystallisation yderligere forbedret stabilitet og reduceret konformationel heterogenitet. Tredje, udvikling af BacMam ekspressionssystemet 7 tilladt for produktion af store mængder af SERT i en kort periode på 2 uger, hvilket letter både immunisering og krystallisation. Endelig til udvikling af strategier selektere for høj affinitet antistoffer, som genkender 3D epitoper tilladt for opdagelsen af ​​8B6-antistof, som fremmer velordnet pakning af SERT-antistof-komplekser i krystaller.

Der er en række kritiske trin og reagenser samt fælles problemer, der ofte opstår i hele protokollen. For det første kan dannelsen af ​​høj titer SERT P2 virus være problematisk. Tilføjelse lave koncentrationer af P1-virus for at generere P2 virus som beskrevet i denne protokol afbøder normalt dette problem, og i tilfælde, hvor P2 virustiteren er lav, kan P3-virus gøres using virus ved en MOI på 0,0001. Virus med en titer mindre end 1 x 10 8 viruspartikler / ml bør ikke anvendes og vil næsten altid resultere i lave proteinudbytter. For udtryk, HEK293S GNTI - celler blev valgt, fordi de mangler N -acetylglucosaminyltransferase I-aktivitet og kan derfor ikke syntetisere komplekse N -glycans stedet producerer kun høj mannose N -glycans. EndoH spalter N-forbundet glycosylering af høj mannose glycaner på to steder i ekstracellulær løkke 2 (EL2), hvilket efterlader et N -acetylglucosamine knyttet til asparagin. Fordøjelse af N-bundet sukker reducerer overflade entropi EL2 som sandsynligvis vigtig for krystallisation. Til generering af antistoffer, bør SERT IC anvendes til immunisering. GFP er meget immunogen 12 og bør ikke anvendes som en fusion tag at danne antistoffer, da det er vanskeligt fuldstændigt at fjerne ved SEC. Den fleksible N- og C-terminale ende af SERT var også ikkeinkluderet i konstruktionen for at undgå antistoffer mod disse regioner. Mus kan immuniseres med 30 ug rekonstitueret protein; fortsætte immuniserende mus, indtil der kan påvises høje serumkoncentrationer af antistoffer og producere hybridomceller som beskrevet 13. En thermostabilized konstruktion er normalt det bedste valg for immunisering; hvis transportøren er godt behaved og bevarer biologisk aktivitet efter oprensning, er dette ofte tilstrækkeligt til at frembringe antistoffer. Den 8B6-antistof blev fremstillet mod WT SERT. Til krystallisation, bør kun topfraktionerne fra SEC indeholdende monodispers kompleks som vurderet ved FSEC kombineres og koncentreres. SERT-8B6 krystaller vokse i et snævert interval af betingelser, og der er en række skridt, der bør træffes for at fejlfinding af problemer, der specifikt vedrører SERT krystal vækst. Tris-base justeret med HCI bør ikke anvendes i reservoiret løsning, da denne buffer ikke understøtter krystalvækst; det er derfor critisk til stedet bruge Tris justeret med NaOH. SERT krystaller vokser i et smalt koncentrationsområde af PEG 400, så hvis krystaller ikke vokser, eller hvis der observeres mange små krystaller, ville selv en lille stigning eller fald i PEG 400 koncentrationen tilrådes. Endvidere blev tilsætningsstoffet 6-aminohexansyre også anvendes i den optimerede skærmen for at forbedre nukleering. Faldet Forholdet protein: godt løsning er også en afgørende faktor for krystal vækst. Drop-forhold på 1,5 - 2: 1 anbefales, med drop-forhold tættere på 2: 1 typisk understøtte væksten af ​​større 3-dimensionelle krystaller. Endelig er anvendelsen af ​​lavprofil plader med 24 brønde er også afgørende mod krystalvækst, formodentlig på grund af ændringen af ​​hastigheden for dampdiffusion.

En alternativ tilgang til SPA metode er udviklet til screening for mutanter, som stabiliserer rotte serotonin transporteren i en kokain-bundet konformation anvendelse af et filter bindingsassay 5. Derimod SPA based assay tillader sekventielle opvarmningstrin følgende ved bestemmelse af den del af SERT som forbliver bundet til ligand. Dette muliggør således for hurtig bestemmelse af smeltepunktet fra et lille antal prøver. SPA Metoden bygger på tilgængeligheden af ​​et radioaktivt mærket høj-affinitetsliganden og hvis der ikke ligander er kendte som binder med mikromolære affinitet derefter en alternativ tilgang vil være nødvendig. Mange andre fremgangsmåder er almindeligt anvendt til at måle proteinstabilitet såsom binding af fluorescerende farvestoffer og kalorimetri 14, men er lav-throughput og er enten ikke i stand til direkte at måle funktion eller kræver store mængder protein. Hvis der ikke kan bruges SPA metoden, en alternativ high-throughput tilgang er en FSEC-baserede Termostabilitet Assay 15 (FSEC-TS), hvor prøven opvarmes efterfulgt af adskillelse af den del af resterende transporter. FSEC-TS er en nyttig metode til at få adgang til kromatografisk adfærd og oligomere tilstand og er apowerful supplerende værktøj, som kan bruges sammen med SPA-metoden.

En sammenligning af forskellige fælles protein ekspressionssystemer viste sig også at fremme anvendelsen af mammale celler til SERT ekspression 16 og ikke overraskende dette sandsynligvis tilfældet for mange proteiner af pattedyr-oprindelse. De metoder, som vi har anvendt til ekspression er blevet skræddersyet til SERT men sandsynligvis let kan tilpasses. Betingelser, der fremmer høje niveauer af ekspression bør nøje identificeres ved at variere den tid af ekspression, temperatur, viruskoncentration, og tilstedeværelsen af ​​histondeacetylaseinhibitorer såsom natriumbutyrat.

Vi generelt begunstiger affinitetsoprensning i en mild langkædet detergent såsom C12M sammen med CHS før rekonstitution at bevare høj affinitet ligandbinding. Rekonstitution hjælp hydrofob absorption er en mild teknik, som vi har fundet at være effektive i flere andre transportører og receptorer. Hvis detteikke lykkes, fjernelse af vaskemidler med høje kritiske micelle koncentrationer ved dialyse, fortynding eller SEC kan anvendes 17 forudsat antigenet er tilstrækkeligt stabilt i sådanne vaske- og rengøringsmidler. I tilfælde, hvor der ikke er egnede antistoffer findes, vi næsten altid finde problemet skyldes tab af funktion eller denaturering af antigenet og i sådanne tilfælde vi med succes udført nye immuniseringer med særlig vægt på protein biokemi. Endelig bør ligander og antistoffer, der binder med høj affinitet danne grundlag for en rationel planlagt krystallisation eksperiment og ved at udnytte en termostabil variant, kan man screene et bredere område af betingelser ved at variere egenskaberne af forskellige detergenter. Endvidere bør krystallisation i en lipid mesofase 18 eller ved hjælp bicelles 19 altid betragtes som et alternativ til krystallisation i miceller.

Disse principper og metoder kan anvendes med en vis modifikation for mange andre transmembrane proteiner, som er vanskelige at udtrykke og oprense fra andre ekspressionsværter, og vil være særlig nyttig for strukturen bestemmelse af mål for høj affinitet lægemidler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DH10Bac Invitrogen 10361-012
Kanamycin Fisher BP906-5
Gentamicin Fisher BP918-1
Tetracycline Sigma T-7660
Bluo-gal Invitrogen 15519-028 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside
Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside Anatrace I1003 IPTG
Miniprep kit Qiagen 27106
Cellfectin II Invitrogen 10362-100 Sf9 transfection reagent
Sf9 ATCC CRL-1711
Sf-900 III SFM media Life Technologies 12658-027
HEK-293S GnTI- ATCC CRL-3022
Freestyle 293 media Life Technologies 12338-018 293 expression media
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 0984018DJ
Sodium butyrate Sigma 303410
S-citalopram Sigma E4786 Anagrade
n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside Anatrace D310
Cholesteryl hemmisuccinate Sigma C6013
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757P
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol Avanti Polar Lipids 840457P
Leupeptin Sigma L2884
Pepstatin A Sigma P5318
Aprotinin Sigma A1153
PMSF Sigma P7626
Desthiobiotin Iba Life Sciences 2-1000-05
Asolectin Sigma 11145
Cholesterol Sigma C-8667
Lipid A Sigma L5399
Brain polar lipid Avanti Polar Lipids 141101C
Biobeads Biorad 152-3920 Hydrophobic absorption resin
Goat anti-mouse IRDye 680RD Odyssey 926-68070 Used as secondary antibody for western blotting
Lauryl maltose neopentyl glycol Anatrace NG310 Anagrade
Serotonin Sigma H9523
pFastBac 8B6 Available from authors
pEG Bacmam SERT Strep II SERTIC, Available from authors
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His SERTTC, Available from authors
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His SERTCC, Available from authors
Imidazole Sigma 56749
n-Octyl β-D-maltoside Anatrace O310 Anagrade
Thrombin Haematologic Technologies HCT-0020
EndoH New England Biolabs P0702
Trizma-HCl Sigma T5941 Tris is used for preparation of crystallization reservoirs
PEG 400 Sigma 91893
6-aminohexanoic acid Sigma 7260
Trypsin-EDTA Fisher MT25052CV
Isoplate-96 TC PerkinElmer 6005070
PolyJet SignaGen SL100688 Polymer transfection reagent for mamalian cells
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads PerkinElmer RPNQ0096 His-tag affinity SPA beads
Citalopram, [N-Methyl-3H] PerkinElmer NET1039250UC
ThermoMixer C Eppendorf 5382000023 heating block for thermostability assay
ThermoTop Eppendorf 5308000003
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates Eppendorf 5306000006
0.2 µm syringe filter Olympus Plastics 25-243
1 L filter system Corning 430517
2 L flat bottom tissue culture flask Genemate F-5909-2000
2 L baffled tissue culture flask Genemate F-5909-2000B
CO2 incubator Thermo Scientific 3950
Forma Orbital Shaker Thermo Scientific 416
Strep-Tactin resin Iba Life Sciences 2-1208-025 Strep affinity resin
Extruder Northern Lipids
Li-Cor imaging system Odyssey western blot imaging system
XK16 column GE Healthcare 28-9889-37 column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton
100 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC910096
30 kDa MWCO protein concentrator Millipore UFC903024
Äkta FPLC GE Healthcare UPC-900
HPLC Shimadzu 51476
Superose 6 (10/300) column GE Healthcare 17-5172-01 Used for FSEC
Tangential flow apparatus Pall Filtron
0.2 µm filter tangential flow cell Pall Filtron PSM20C11
30 kDa MWCO tangential flow concentrator Pall Filtron OS030T12
Talon resin Clonetech 635504 His-tag affinity resin used for Fab purification
1 mL HiTrap SP column GE Healthcare 17115101 Cation exchanger used for Fab purification
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17-5175-01 Used for SEC separation of SERT-8B6
24-well VDXm plate Hampton Research HR3-306
18 mm coverslips Hampton Research HR3-239
Virocyt virus counter Virocyt 2100
MicroBeta Trilux PerkinElmer 1450 96-well scintillation counter
HiTrap SP column GE Healthcare 17115101
Sertraline Sigma S6319

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).
  2. Broer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters. Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).
  3. Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters. Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).
  4. Hahn, M. K., Blakely, R. D. The functional impact of SLC6 transporter genetic variation. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).
  5. Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation. J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).
  6. Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation. Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).
  7. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  8. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  9. De Becker, G., et al. The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells. Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).
  10. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. , (2016).
  11. White, S. H. The progress of membrane protein structure determination. Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).
  12. Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).
  13. Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines. Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).
  14. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  16. Tate, C. G., et al. Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter. Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).
  17. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
  18. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
  19. Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).

Tags

Biokemi strukturel biologi krystallisering membranprotein antistof immunisering rekonstituering serotonin transporteren neurotransmitter antidepressive selektive serotoningenoptagshæmmere termostabilitet
Termostabilisering, Expression, Rensning, og Krystallisation af Human Serotonin Transporter Bundet til<em&gt; S</em&gt; -citalopram
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coleman, J. A., Green, E. M.,… More

Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J. Vis. Exp. (117), e54792, doi:10.3791/54792 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter