Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الجمع بين الرطب وتقنيات مختبر الجافة لتوجيه بلورة البروتينات كبيرة ملفوف لفائف تحتوي على

Published: January 6, 2017 doi: 10.3791/54886
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 2Institute of Structural Biology, German Research Center for Environmental Health

Introduction

جعلت تحديد هيكل عبر البلورات بالأشعة السينية مساهمات أساسية في كل ميدان من ميادين علم الأحياء الحديث. تقديم وجهة نظر الذري من الجزيئات التي تدعم الحياة وكيفية تفاعلها مع بعضها البعض في مجموعة متنوعة من السياقات. مما يتيح لنا فهم الآليات التي تسبب المرض، وتوفير فرص لتصميم بعقلانية الأدوية لعلاج المرض. وقد البلورات منذ فترة طويلة تقنية تجريبية المهيمنة لتحديد بنية الجزيئات، ويمثل في الوقت الحالي 89.3٪ من قاعدة البيانات الهيكلية (www.rcsb.org). هذه التقنية لديها العديد من المزايا، بما في ذلك القدرة على دقة عالية جدا، والقدرة على تصور الجزيئات مع مجموعة واسعة من الأحجام، وجمع البيانات بسهولة نسبيا، وإتاحة الفرصة لتصور كيف يتفاعل جزيء مع المذيبات وكذلك بروابط.

وعلى الرغم من التحسينات التكنولوجية عديدة في المؤتلف تعبير البروتين 1،2، بورification 3، والبيولوجيا الجزيئية المستخدمة لتوليد هذه الأنظمة 4، وأكبر عقبة واحدة في عملية البلورات لا تزال القدرة على بلورات نوعية الحيود. وقد كان هذا ينطبق بشكل خاص على البروتينات التي تحتوي على مجالات ملفوف لفائف كبيرة. وتشير التقديرات إلى أن ما يصل إلى 5٪ من جميع الأحماض الأمينية وجدت داخل لفائف الملفوف 5،6، مما يجعل هذا سمة هيكلية شائعة جدا 7، ولكن هذه البروتينات غالبا ما تكون أكثر صعوبة لتنقية وبلورة من البروتينات الكروية 8-10 . ومما يفاقم ذلك من حقيقة أن المجالات ملفوف لفائف وغالبا ما توجد في إطار بروتين أكبر، لذلك بشكل صحيح التنبؤ حدود هذه المجالات أمر بالغ الأهمية لتجنب إدراج تسلسل غير منظم أو مرن التي غالبا ما تكون مضرة للتبلور.

يحلل هنا نقدم الجمع بين الإطار المفاهيمي على شبكة الإنترنت الحاسوبية مع experimentaبيانات ل من على مقاعد البدلاء، لمساعدة المستخدمين على دليل من خلال المراحل الأولى من عملية البلورات بما في ذلك: كيفية تحديد جزء من البروتين (ق) للدراسات الهيكلية، وكيفية إعداد وتوصيف عينات البروتين قبل محاولات التبلور. ونحن نركز تحليلنا على اثنين من البروتينات التي تحتوي على مجالات ملفوف لفائف كبيرة، شروم (SHRM) ورو-كيناز (الصخرة). وقد تم اختيار هذه البروتينات لأن كلا منهما يحتوي على المجالات ملفوف لفائف ومعروفة لتشكيل معقد 11-16 بيولوجيا. ومن المتوقع شروم ورو-كيناز (روك) لاحتواء ~ 200 و 680 مخلفات ملفوف لفائف على التوالي، العديد من الأجزاء التي تم التعرف هيكليا 17-20. الطريقة الموصوفة هنا يوفر تبسيط العمل لتحديد أجزاء من ملفوف لفائف تحتوي على البروتين من شأنها أن تكون قابلة للتبلور بسرعة، ومع ذلك، فإن الأساليب المذكورة يمكن بسهولة أن تتكيف لمعظم البروتين أو البروتين المجمعات أو تعديل لدمج الإنتاجية العالية approaالكولينستراز المتاحة و. وأخيرا، وهذه الأساليب هي غير مكلفة عموما، ويمكن أداؤها من قبل المستخدمين في مستويات الخبرة تقريبا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يتم وصف الرسم البياني للإطار المفاهيمي أو سير العمل في الشكل رقم 1 لتكون مرجعا. ويمكن تقسيم البروتوكول إلى أربع مراحل: التوقعات الحسابية أو تسلسل القائمة، وتعبير البروتين وتنقية وتوصيف والكيمياء الحيوية، والتبلور. الأمثلة يظهر تحليل المجالات شروم SD2 و / أو المجمعات شروم روك، ولكن يمكن الاستفادة منها مع أي بروتين.

1. استخدام تأسست أدوات على شبكة الإنترنت لتوليد التوقعات الحسابية من حدود المجال ملفوف لفائف

  1. جمع مجموعة متنوعة من النشوء تسلسل Homologs.
    1. الذهاب إلى www.uniprot.org واكتب في شروم في شريط البحث العلوي.
    2. حدد متواليات لتحميل عن طريق التحقق من مربع بجانب عدد انضمامها. تسلسل مع نجم تشير تسلسل مراجعتها من قبل يونيبروت وعادة ما تكون أكثر موثوقية. الحرص على التأكد من أن جميع سلاسل كاملة ودقيقة.
    3. حفظ الصورة المختارةequences عن طريق النقر على زر تحميل.
    4. محاذاة جمع متواليات شروم باستخدام كلوستال أوميغا 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). انقر فوق الزر "استعراض" لتحديد الملف مع تسلسل شروم ومن ثم دفع إرسال.
    5. بعد محاذاة كاملة، انقر فوق "تحميل محاذاة ملف" زر.
    6. فتح تسلسل متعددة محاذاة ولدت في 1.1.5 باستخدام Jalview (ملف | الإدخال محاذاة | من الملف). ضمن إطار جديد محاذاة، اللون من الهوية (اللون | المئة الهوية).
  2. حساب التنبؤات هيكل الثانوي، والتنبؤات من تسلسل مرن أو المختلين، وتوقع المناطق ملفوف لفائف داخل البروتين (ق) من الفائدة.
    1. الذهاب إلى http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi، لحساب التنبؤات ملفوف-لفائف. نسخ ولصق تسلسل في صندوق تسلسل وانقر على إرسال.
      ملاحظة: هذا التحليل قد يستغرق بضع ساعات لتراكبوليته. منذ متواليات شروم كبيرة جدا، قد تحتاج إلى تقسيمها إلى كتل من أقل من 1000 الأحماض الأمينية لتناسب داخل حجم القيد من خادم متواليات. عند تحليل Shrm2، فمن المستحسن أن يتم استخدام الأحماض الأمينية C-الطرفية 1000 كما يحتوي هذا القسم على نطاق SHRM SD2 والذي يعرف لاحتواء المناطق ملفوف لفائف. عندما تكرار هذا التحليل مع بروتينات أخرى، فمن المستحسن استخدام سلاسل بروتين كامل طول عندما يكون ذلك ممكنا. إذا كان هذا ليس خيارا، واستخدام أكبر جزء ممكن أو تشريح تسلسل استنادا إلى البيانات الحيوية أو وظيفية معروفة.
    2. الذهاب إلى http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi، لحساب التنبؤات ملفوف-لفائف. نسخ ولصق تسلسل في صندوق تسلسل وانقر على إرسال.
  3. الجمع بين نتائج الخطوات 1.1 إلى 1.2.2 إلى شرح شامل واحد للتسلسل شروم.
    ملاحظة: يتم تشجيع بشدة لتشمل أيضا أي وكل ما ذات الصلةتفقد المعلومات التي يمكن استخلاصها من الأدب أو مصادر أخرى عن وظيفة البروتين أو تنقية في هذه المرحلة.
  4. باستخدام هذا التسلسل المشروح شامل، التنبؤ حدود المجال (أو مجموعة من الحدود الممكنة) للبروتين، في محاولة لتحقيق أقصى قدر من الحفاظ على وتوقع السمات الهيكلية مع التقليل من كمية تسلسل المختلين أو مرنة. إذا كان معروفا، يجب أن البروتين الناتج الإبقاء على الخصائص الفنية للاهتمام.

2. صريحة وتنقية البروتينات مع حدود المجال التي تم تحديدها في القسم 1

ملاحظة: إن الهدف من هذا القسم هو استخدام سلسلة من فحوصات سريعة وقابلة للقياس بسهولة للكشف حدود نطاق افتراضية ولدت في القسم 1.

  1. باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية، توليد التعبير البلازميد مع تسلسل الترميز المطلوب في إطار ضمن له 10 -mRuby2-XH2 البلازميد (انظر الشكل 3 لناقلات خريطة لالثانية تفاصيل إضافية).
  2. مستويات التعبير اختبار لكل التعبير البلازميد باستخدام BL21 (DE3) كولاي أو غيرها من سلالة التعبير مناسبة في وسائل الإعلام autoinduction 1 في درجة حرارة الغرفة ل18-24 ساعة.
    1. تحويل البلازميدات التعبير فضلا عن السيطرة البلازميد فارغة إلى BL21 (DE3) باتباع الإرشادات التي جاءت مع الخلايا أو باستخدام بروتوكول التحول القوي، مثل واحد هنا (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -تحويل/).
    2. من لوحة تحولت حديثا، واختيار مستعمرة واحدة وتنمو ثقافة كاتب 5 مل عند 37 درجة مئوية خلال الليل في استذابة مرق (LB) وسائل الاعلام مع 34 ميكروغرام / مل الكانامايسين.
    3. في اليوم التالي، بيليه الثقافة ويغسل بيليه مع LB. جديدة
    4. إضافة الثقافة بداية ل50 مل من وسائل الاعلام autoinduction مع 34 ميكروغرام / مل الكانامايسين. السماح للثقافة ليصل إلى تشبع في أي درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية. عادة، وتنمو ل~ 18-24 ساعة.
    5. خلية بيليهالصورة وتجميد الكريات خلية مما يؤدي إلى -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى قبل التنقية.
    6. قارن مقتطفات خلية كاملة من كل سلالة التعبير ومكافحة ناقلات الفارغة التي كتبها SDS-PAGE لتحديد السلالة التي تنتج أكثر كفاءة البروتين الانصهار المطلوب. لصاحب 10 البروتينات الانصهار -mRuby2-شروم SD2، تشغيل 10٪ والمواد الهلامية SDS-PAGE في 180 V ل~ 50 دقيقة أو حتى الجبهة صبغ يصل إلى الجزء السفلي من هلام 22.
    7. هلام وصمة عار مع Coomassie الأزرق لتصور مجموع البروتينات الخلوية داخل كل سلالة 23.
  3. إجراء خطوة تقارب اللوني الأولية على كل سلالة أن أعرب بنجاح البروتين mRuby2 الانصهار. عادة، نفذ تنقية خطوات 2.3.2-2.3.7 في درجة حرارة الغرفة، ما لم سيستفيد البروتين من الظروف المتغيرة مثل تنقية في 4 درجات مئوية.
    1. الكريات خلية ذوبان الجليد من الخطوة 2.2.5.
    2. resuspend كل بيليه خلية في 1.5 مل من تحلل العازلة (10٪ الجلسرين، 500 مم كلوريد الصوديوم، و 40ملي إميدازول 20 ملي تريس pH8.0، 1 ملم بيتا المركابتويثانول). تكملة تحلل العازلة مع مثبطات الأنزيم البروتيني حسب الاقتضاء.
    3. إضافة 30 ميكرولتر من 10 ملغ / مل الليزوزيم ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. يصوتن اتباع التعليمات لأداة المستخدمة.
    4. نقل في أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في أعلى الجدول الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 14000 x ج لتكوير المواد غير القابلة للذوبان أو خلايا unlysed. حفظ كل وطاف بيليه لتحليلها لاحقا عبر SDS-PAGE.
    5. أداء تنقية النيكل تقارب، احتضان جزء قابل للذوبان مع 100 ميكرولتر من الخرز ني NTA. احتضان حبات مع المحللة للذوبان لمدة 5-10 دقائق، عكس عدة مرات لخلط حبات.
    6. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 30 ثانية في جهاز للطرد المركزي الطاولة لتكوير حبات. اتبع هذا عن طريق غسل بيليه 3-5 مرات مع العازلة تحلل لتنظيف قبالة الملوثات غير محددة.
    7. أزل روبي انصهار بروتين من الخرز مع العازلة تحلل تستكمل مع 1M ايميدازول.
    8. استخدام SDS-PAGE لمقارنة سلوك صاحب-mRuby2-شروم البروتينات في تنقية "سريعة وقذرة" أعلاه.

3. تميز البروتين عينة لتحديد تلك مع خصائص مفيدة

  1. استخدام مجموعة معمل في 280 نانومتر لقياس تركيز البروتين الانصهار روبي، ومن ثم تقييم تجانس العينة عن طريق تحميل 1-5 ميكروغرام من البروتين الانصهار على هلام الصفحة الأصلي 24. تشغيل 10٪ هلام الصفحة الأصلية عند 4 درجة مئوية لمدة 140 دقيقة في 175 V.
    1. صورة PAGE الأم باستخدام تصوير مجهزة لتصور مضان، ومراقبة حيث يهاجر الانصهار الموسومة mRuby في هذا الاختبار.
      ملاحظة: كن حذرا لمراقبة البروتين الانصهار التي عالق في وكذلك من المرجح تجميع هذا البروتين. إذا كان تصوير مضان غير متوفر، يمكن للمرء أن غالبا ما تصور وصورة تتركز عينات من روبي الموسومة البروتين تحت ضوء أسود أو مع مربع ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  2. أداء التحلل البروتيني محدود لتحديد المجالات مطوية ثابت. احتضان 95 ميكرولتر من روبي SHRM SD2 الانصهار في ~ 1 ملغ / مل مع 5 ميكرولتر من 0.025٪ سبتيليزين أ.
    1. أخذ عينات من رد فعل في نقطة زمنية من 0، 0.5، 2، 5، 15، 60، و 120 دقيقة، وإزالة 10 ميكرولتر من رد فعل لكل نقطة زمنية وتصور التقدم من رد فعل عبر SDS-PAGE باستخدام هلام الأكريلاميد 15٪ .
    2. وصمة عار مع Coomassie الأزرق كما في الخطوة 2.2.7 وتقييم ما إذا كانت الأنواع المقاومة البروتيني يمكن تحديدها.
  3. دمج البيانات من كفاءة تنقية والسلوك في الصفحة الأم، والتحلل البروتيني محدود على البروتينات الانصهار mRuby2-شروم النقاء جزئيا إلى إجراء تقييم شامل للسلوك العام لهذه البروتينات في الحل.
    1. (اختياري) إذا مقايسة وظيفية مناسبة متاحة، تحقق من وجود نشاط في هذه المرحلة.

4. إنتاج بلورات عالية الجودة للملفوف لفائف SD2المجال من شروم

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في القسم 4.1 في درجة حرارة الغرفة ما لم سيستفيد البروتين من تنقية في درجة حرارة مختلفة، وعادة 4 درجات مئوية.

  1. استخدام 50 مل زوائد كتقدير تقريبي التعبير وإمكانية تنقية، أداء تعبيرات واسعة النطاق من mRuby2-شروم SD2 بهدف تحقيق 5-20 ملغ من عينة النقاء تماما. عادة 2 لتر للثقافة ويوفر المواد انطلاق كافية. بعد خلايا بيليه النمو عن طريق الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 10 دقيقة.
    1. resuspend الكرية من النمو 2 لتر في تحلل العازلة كما كان من قبل، وذلك باستخدام ~ 2 مل من تحلل في كل غرام من بيليه الخلية المجمدة في حالة استخدام الليزوزيم للتحلل. بدلا من ذلك، و resuspend في ~ 8 مل / ز من بيليه إذا يستخدم الخالط أو الصحافة الفرنسية. بيليه الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي في 30000 x ج لمدة 30 دقيقة.
    2. ربط دفعة الكسر للذوبان من 4.1.1 باستخدام 10 مل من راتنج ني NTA. تصب في عمود الثقل المناسبوتسمح البروتينات غير منضم إلى استنزاف قبالة.
    3. غسل الراتنج 3-5 مرات مع 40 مل من تحلل العازلة، تليها يغسل مع العازلة تحلل تستكمل إلى 1 M كلوريد الصوديوم.
    4. الراتنج غسل مع 40 مل من تحلل العازلة تستكمل مع 80 ملي ايميدازول.
    5. أزل البروتين الانصهار روبي شروم مع 40 مل من العازلة تحلل تستكمل إلى 1 M ايميدازول. يجزئ يدويا بروتين مزال إلى 4-10 مل الكسور.
    6. تأكيد الكسور التي تحتوي روبي شروم انصهار بروتين باستخدام 10٪ SDS-PAGE.
    7. Dialyze كسور المناسبة (عادة كسور 2-4) إلى 8٪ الجلسرين، 250 مم كلوريد الصوديوم، و 15 ملي إميدازول 20 ملي تريس pH8.0، 1 ملم β-ME، وذلك باستخدام 6-8 كيلو دالتون MWCO غسيل الكلى الأنابيب. إضافة 1 ملغ من TEV البروتيني لكل 25-50 ملغ من البروتين الانصهار. Dialyze بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع التحريك البطيء.
    8. كرر تنقية النيكل تقارب خطوات 4.1.2. إلى 4.1.6. وينبغي أن تظل المجال شروم SD2 الآن في جزء غير منضم في حين أن صاحب 10 -mRuby2 ستبقى ملزمة لسيتم العثور على الراتنج وفي الكسور شطف. تأكيد ذلك باستخدام 12٪ SDS-PAGE تلطيخ مع Coomassie الأزرق.
    9. Dialyze الكسور التي تحتوي نطاق شروم SD2 إلى 8٪ الجلسرين، و 100 مم كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 5 ملي العازلة بيتا المركابتويثانول بين عشية وضحاها.
    10. أداء أنيون تبادل اللوني 25 باستخدام FPLC، ويبلغ حجمه مع التدرج كلوريد الصوديوم 0،1-1،0 M كلوريد الصوديوم. تحليل الكسور باستخدام 12٪ SDS-PAGE.
    11. باستخدام مكثف تدور (MWCO من 10 كيلو دالتون أو أكثر اعتمادا على بروتين قيد الدراسة)، والتركيز الكسور الذروة إلى ~ 0 ملغ / مل، ثم قم بإجراء حجم الإقصاء اللوني 26، تحليل الكسور الذروة عبر 12٪ SDS-PAGE.
    12. تجمع الكسور الذروة وdialyze إلى 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 2٪ الجلسرين، 1 ملم β-ME، والتركيز على 10 ملغ / مل قبل التبلور.
      اختياري: خلال هذه الخطوة، وإزالة 5 عينات ميكرولتر بتركيزات 1، 2، 5، و 10 ملغ / مل خلال تركيز العينة.تشغيل الأصلي PAGE تحميل 2-5 ميكرولتر من كل عينة للنظر في سلوك عينة خلال هذه الخطوة.
  2. كشف مجموعة صغيرة من 12 شروط لتحديد تركيز البروتين الأمثل للمحاكمات التبلور. يوصف تكوين هذه الشروط في الشكل 7.
    1. باستخدام 24-جيدا يجلس صواني بلورة قطرة، نفذ التجارب تبلور باستخدام طريقة بخار نشرها، pipetting ل500 ميكرولتر من كل الظروف 12 في آبار منفصلة تليها قطرات تحتوي في البداية 1 ميكرولتر من حل جيد و 1 ميكرولتر من عينة البروتين على لل coverslips . يرجى الاطلاع على 27 للحصول على معلومات إضافية حول هذه التقنية.
    2. بسرعة ختم صينية مع الشريط واضح ونقل صينية في بيئة درجة حرارة مناسبة للرقابة التي هي الاهتزاز الحرة. درجة الحرارة المستخدمة يمكن أن تختلف، ولكن 4 درجات مئوية، 16 درجة مئوية، و 20 درجة مئوية شائعة جدا.
    3. دراسة قطرات في الأدراج على د 3 القادمآيس باستخدام مجهر تصل إلى 100X التكبير. في نهاية الفترة لمدة 3 أيام، والنتيجة كل قطرة كما لا تحتوي على هطول الأمطار (واضح)، وهطول الأمطار الخفيفة، والأمطار الغزيرة (البني)، أو البلورات. يجب أن تحتوي على تركيز البروتين مناسب لا يزيد عن 6 الامطار الغزيرة.
    4. باستخدام تركيز البروتين المحددة في 4.2، وشاشة مجموعة واسعة من الشاشات تبلور متاحة تجاريا. استخدام المناولة أو بلورة سائلة الروبوت بسرعة كبيرة في هذه العملية مع التقليل أيضا خطأ في قطرات. ويتطلب ذلك أقل بكثير من البروتين أيضا، مما يتيح للمستخدم الشاشة أكثر الظروف مع عينة واحدة.
    5. تحسين الظروف الأولية التي تم تحديدها من شاشات واسعة من خلال تغيير منهجي لكل متغير من المتغيرات داخل قطرة بلورة باستخدام 24-جيدا صواني الفرز كما كان من قبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويظهر رسم تصور سير العمل المستخدمة في هذا النظام في الشكل (1) ويتضمن ثلاث مراحل رئيسية. ويستخدم التحليل الحسابي للتسلسل لتطوير الفرضيات حول حدود المجال من البروتين ملفوف لفائف من الفائدة. ويرد مثال لتحليل المشروح المجال Shrm2 SD2 في الشكل 2. في هذا المخطط، كان الهدف هو تحديد حدود نطاق ممكن لمجال محفوظ في محطة سي المنظم هيكل الخلية يسمى شروم SD2. من هذا التحليل كان تم إنشاء ثلاث مجموعات متميزة من حدود نطاق افتراضية تحتوي على شظايا ملفوف لفائف التي تغطي SD2 الحفاظ بأكمله أو الحد الأدنى من الشظايا بالقرب من محطة سي التي انتهت كأفضل المرشحين للتبلور. ثم يتم اختبار المرشحين التي تم تحديدها من تحليل تسلسل بسرعة في نطاق صغير باستخدام مزيج من البروتين مع mRuby2 (الشكل 3) FOص تحليل كفاءة. على نطاق وتمثيلية صغيرة (50 مل الثقافة) التنقيات من اثنين وترد له 10 البروتينات -mRuby2 الموسومة في الشكل (4). في هذا الرقم، وسلوك من البروتين غير قابلة للذوبان واضح بسهولة بالمقارنة مع نظيرتها القابلة للذوبان. معربا عن سوء أو يتم تحديدها اندماج بروتين غير قابلة للذوبان بسهولة وبسرعة في هذه الطريقة. وتظهر التحاليل البيوكيميائية من شظايا البروتين عن طريق التحلل البروتيني محدود في الشكل (5) لمجموعة متنوعة من شظايا باستخدام يذبل النظام روبي وصفها أو مع المجالات شروم SD2 معزولة والنقاء. في الشكل 5A، نوعين مختلفين من الماوس SHRM SD2 المقابلة لحدود نطاق افتراضية رقم 2 ورقم 1 في الشكل (3) تم هضمها باستخدام التدرج من تركيز الأنزيم البروتيني من (0-1،0٪) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وقد تدهورت كل من هذه بفعالية في مجموعة من المنتجات الصغيرة في تركيزات الانزيم المعتدلة. ويبين الشكل 5B وسامالبريد تجربة أداء باستخدام افتراضية الحدود # 3 من ذبابة الفاكهة SHRM SD2. هذا البروتين لم تتبلور وصفت هيكلها 19. ويمكن أيضا أن يكون تحليل بروتين مفيد عند النظر روبي اندماج كما ولدت من بروتوكول أعلاه. كما هو مبين في الشكل 5C، وهو بروتين الانصهار روبي مع Shrm2 SD2 الإنسان (1427-1610) كان يتفاعل مع تركيز عال (0.025٪) من سبتيليزين البروتيني غير محددة في درجة حرارة الغرفة لنقاط الزمنية المشار إليها. هنا رابط بين روبي وSHRM كان المشقوق على الفور كما هو متوقع. بالإضافة إلى ذلك، تم تشكيل المنتجات الثانوية مشيرا إلى هذا البروتين قد اثنين من المناطق الحساسة البروتيني أخرى، ومع ذلك، ظلت منتجات التدهور التي أنتجت في 2 دقيقة سليمة إلى حد كبير خلال الفترة المتبقية من التجربة تشير إلى البروتين هو في الواقع مستقر تماما.

ويرد نهج متكامل باستخدام محللة بيانات الصفحة الأمفي الشكل (6). ويتم تحليل في الشكل 6A، روبي الموسومة-SHRM SD2 الإنسان (1427-1610)، وكذلك البروتين الذي يحتوي على الطفرات نقطة المشار إليها في SHRM في الصفحة الأم. في هذه التجربة، والبروتين من النوع البري (الذي يشكل بلورات) يعمل كما شريطين متميزة، في حين أن المسوخ الثلاثة التي لا تتبلور لديهم سلوك مختلف بشكل كبير. لإثبات أن النظام يمكن أن تكون مفيدة أيضا في المجمعات بروتين، وقد تم تحليل مجموعة متنوعة من المجمعات شروم روك في الصفحة الأم في الشكل 6B. في هذه الحالة، تم استخدام نفس جزء من Shrm2 SD2 الإنسان (1427-1610) للمساعدة في توضيح التحليل، في حين استخدمت أجزاء مختلفة من الصخور البشري. اقترح هذا النهج الذي المجمعات شكلت باستخدام كان روك 700-906 و746-906 أنواع متعددة، كان ملطخ، وأقل تجانسا. وتحسنت المجمعات الاستفادة 788-906، وإن لم يكن بشكل كبير، وكان هذا النوع قادرة على بلورة، على الرغم من بلورات اتخذت عدة أسابيع لتشكيل ويخدعتدهورت tained البروتين الصخرة. المجمعات إنشاؤها باستخدام روك 834-913 شكلت نوع واحد وأكثر موحدة بشأن جل وتبلورت بسهولة بين عشية وضحاها. ويبين الشكل 7 مجموعة من الشروط بلورة المشتركة التي يتم استخدامها للإبلاغ عن سلوك عينة البروتين في المحاكمات تبلور، ويمكن أن تستخدم عادة مع أي بروتين. من الناحية المثالية، وسيتم الحصول على مزيج من شروط واضحة وعجل. البروتينات التي لا تشكل رواسب تتطلب تركيزات عالية أو شروط التخزين المؤقت أكثر صرامة بينما تلك التي تترسب في العديد من الشروط التي يجب أن تستخدم في تركيز البروتين أقل أو مع شروط التخزين المؤقت التي تعزز قابلية ذوبان البروتين.

شكل 1
الشكل 1: سير العمل مخطط. رسم تخطيطي المعمم تصور دمج تحليل تسلسل الحسابية والكيمياء الحيوية وتقنيات مختبر الرطب أخرى في إطار استراتيجية شاملة لترسيم الحدود نطاق وتحديد أجزاء البروتين لبلورة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: المشروح تحليل تسلسل للمجال SD2 ملفوف لفائف من شروم. تراكب الحاسوبية تحليل للمجال شروم SD2، بما في ذلك تسلسل المحاذاة متعددة الناتجة عن أوميغا كلوستال والملونة التي الهوية تسلسل داخل Jalview (الخطوة 1.1). وتوقع هيكل الثانوي، المختلين التنبؤات تسلسل، والتنبؤات ملفوف لفائف المجال شروم SD2 (الخطوة 1.2) وشملت أيضا. يشار إلى حدود نطاق افتراضية (الخطوة 1.3) كما هي حدود لوحظ وهيكل الثانويالعناصر كما يتضح من تحليل البلورات لاحق 19. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: رسم تخطيطي لنظامه 10 -mRuby2 في التعبير. (A) تخطيطي لناقلات التعبير صاحب 10 -mRuby2-XH2 ناقلات المستخدمة في هذه الدراسة. (ب) رسم تخطيطي لموقع استنساخ متعددة من هذه النواقل. عادة يتم إدراج ترميز البروتين متواليات في هذا متجه عبر مواقع الاستنساخ BamHI وEcoRI. يظهر المتطرفة C-محطة من البروتين mRuby2 باللون الأحمر، وأشار الموقع البروتيني انشقاق TEV مع الأقواس ومع الموقع من الانقسام كما هو موضح مثلث أحمر. ويرد تسلسل رابط بين mRuby2 وموقع TEV في السماوي.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: التمثيلية التنقيات الصغيرة اثنين mRuby2 الموسومة البروتينات الانصهار. (A) هي الصورة صورة لعينات من التعبير ثقافة البكتيرية روبي SHRM SD2 أو لا علاقة لها روبي انصهار بروتين يعرف غير قابلة للحل. ويرد ثقافة منفصلة تعبر عن البروتين دون روبي العلامة للمقارنة. (ب) القابلة للذوبان جزء من ثقافات تم تصوير فوق بعد تحلل والطرد المركزي في 30000 x ج لمدة 30 دقيقة، مما يدل على تصور للذوبان روبي SHRM SD2. (ج) صورة من الخرز ني NTA بعد ملزم والخطوات اللاحقة غسل مشيرا إلى أن روبي SHRM SD2 يتم يجمد علىالخرز. (D) عينات من غسل وشطف الخطوات كما هو موضح في الخطوات 2.3.6 و2.3.7 تدل على أن الانصهار روبي SHRM SD2 يبقى منضمة إلى الراتنج أثناء وجوده في وجود ما يصل إلى 80 ملي ايميدازول ومزال فعليا على عمود مع شطف العازلة 1 M ايميدازول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: التحلل البروتيني محدودة من مرشح المجالات SD2 من البروتينات شروم مختلفة. مقارنة بين أربعة مجالات SD2 من مختلف البروتينات شروم. (A و B) وحضنت شظايا SHRM SD2 أشار مع التدرج تركيز التربسين البروتيني 0-1،0٪ ونتائج تحليلها بواسطة SDS-PAGE. علاقة ذلك البروتين جزء خفة دمح يشار إلى حدود افتراضية. تحليل (C) SDS-PAGE من يقتصر الهضم بروتين صاحب انصهار بروتين 10 -mRuby2-شروم SD2 باستخدام طريقة الوقت بالطبع هو موضح في البروتوكول. حدث رد فعل مع 0.025٪ التربسين في درجة حرارة الغرفة. هضم رابط بين روبي وشروم SD2 سريع، وتعد بمثابة الرقابة الداخلية. وأشار المنتج تدهور يفترض أنه مع صاحب 10 -mRuby2-شروم SD2 البروتين الانصهار ينقي شارك (*). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: مراقبة التغيرات التي تحدث في سلوك البروتين باستخدام هلام الأصلي. (أ) 10٪ PAGE الأم مما يدل على تأثير المسخ الذي يغير خصائص mRuby2-Shrooم SD2. في ظل هذه الظروف يدير SHRM SD2 كما شريطين منفصلة، ​​في حين المسوخ نقطة المشار إليها ضمن SD2 عرض مجموعة من أنماط الهجرة الشاذة. (ب) مقارنة بين المجمعات شروم SD2 روك شكلت استخدام إصدارات مختلفة من الصخور وتحليلها بواسطة PAGE الأم. تم حل المجمعات بين شروم SD2 وشظايا أشار روك كيناز (سواء البروتينات ملفوف لفائف) في الصفحة الأم. تم الحصول على بلورات للمجمع التي تحتوي على الصخرة 788-906 بعد عدة أسابيع ولكنها معقدة تحتوي على الصخرة 834-913 تبلورت بسرعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7: الشاشة الرئيسية سريعة لبلورة. (A) شاشة سريعة المشترك بلورة المشتركيستخدم nditions لتقييم سلوك عينة البروتين في محاكمات التبلور. (ب) أمثلة على التهديف مصفوفة بسيطة لتقييم قطرات التبلور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تصميم البروتوكول الموصوفة هنا لمساعدة المستخدم على تحديد حدود نطاق داخل البروتينات ملفوف لفائف كبيرة لتسهيل بلورة بهم. يعتمد البروتوكول على دمج كلي من مجموعة متنوعة من البيانات من التوقعات الحسابية ومصادر أخرى لتوليد سلسلة من حدود نطاق المحتملة. هذه هي تليها مجموعة من التجارب الكيميائية الحيوية التي هي سريعة وغير مكلفة، وتستخدم لزيادة تحسين هذه الفرضيات الأولية. باستخدام هذا النهج، يمكن للمستخدم القضاء بسرعة شظايا البروتين المحتملة التي هي غير مرغوب فيه، وتركز المزيد من الاهتمام على أفضل المرشحين، وبالتالي تحسين فرص الحصول على بلورات.

هناك العديد من الخطوات الهامة في هذا الأسلوب، ومع ذلك، أي أمر في غاية الأهمية لإنتاج بلورات مثل تطوير مجموعة أولية من حدود نطاق افتراضية. وتتضمن هذه الخطوة مجموعة متنوعة من الأساليب الحسابية، وكذلك الحريق المكشوف المعلوماتtained من الأدب أو بيانات وظيفية عندما تكون متاحة. يجب توخي الحذر لتجنب استخدام استراتيجية لصقل فورا وصولا الى حل "أفضل" واحد كما أن هناك حاليا أي طريقة في مكان لإرفاق قيمة الثقة قابلة للقياس إلى أي من التوقعات. بدلا من ذلك، يتم استخدام أفضل على أنها طريقة لتحديد بسرعة مجموعة صغيرة من حدود نطاق المحتملة التي تحتاج إلى التحقق منها تجريبيا.

خصائص البروتينات ملفوف لفائف التي يمكن تحليلها مع هذا البروتوكول واسعة جدا. من منظور الحسابية، يقتصر على قوة التوقعات ملفوف لفائف أقل من 20 الأحماض الأمينية، وكما ذكر في الخطوة 1.2.1، فإن المناطق ملفوف لفائف تحتاج إلى أن تنقسم إلى عدة أقسام لتحليلها من قبل DISOPRED أكبر من 1000 الأحماض الأمينية. ونحن ننظر إلى هذا الحد لاحق مؤقت كما تفرض من قبل خادم وقد تتغير كما يتم ترقية الأسلوب في المستقبل. التحليل الكيميائي الحيوي لاحق ومع ذلك، يمكن أن تعانيبطرق مختلفة. أولا، يبدو أن الحلقات أو المناطق شديدة الحساسية لالبروتياز قد جعل عينة الداخلية لتكون أقل استقرارا مما هو عليه في الواقع. البروتينات المستقرة التي المشقوق الحلقات أو رصدت خلاف ذلك الأنزيم البروتيني يجب أن لا تزال تعطي مظهر ثابت على الصفحة الأم، وهذا هو السبب فمن المستحسن أن المستخدم استكشاف كلا من الاستراتيجيات. قد يكون PAGE الأم من الصعب على بعض البروتينات، ومع ذلك، إما لأنها طويلة جدا والهجرة ببطء إلى هلام أو بسبب عهدتهم معين قد جعلها تعمل في الاتجاه المعاكس من هلام تماما. في هذه الحالات، قد يكون من المفيد لاستكشاف الظروف التخزين المؤقت مختلفة لنظام هلام الصفحة الأصلي.

في حين انصب التركيز في الأعمال التي عرضت هنا على ملفوف لفائف البروتينات الكبيرة التي تحتوي على هذا البروتوكول يمكن استخدامها لأي بروتين تقريبا مع عدد قليل جدا من التعديلات. وإضافة الأساسية للبروتينات كروية يكون إضافة للبرمجيات التنبؤ نطاق مثل pDomTHREADER 28 </ سوب> أو DomPred 29 للبحث عن حدود نطاق، والتنبؤات هيكل التعليم العالي مثل Phyre2 30 لتعزيز القوة التنبؤية لتحليل تسلسل. بالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من الخوارزميات المتاحة لأداء التنبؤات هيكل الثانوي والتنبؤات المختلين، وإدراج خوارزميات إضافية يمكن أن تكون مفيدة. غالبا ما تمتلك البروتينات الكروية النشاط الأنزيمي أو قراءات الفنية الأخرى التي من شأنها أن تقدم معلومات إضافية مهمة خلال اختيار الهدف. وعلاوة على ذلك، وتقنيات متوسطة أو عالية الإنتاجية يمكن إدراجها حسب الاقتضاء. على سبيل المثال، تتوفر بسهولة 31 أنظمة غير مكلفة لمدة 1-2 مل الثقافات والتنقيات تقارب المعادن في أشكال 96-جيدا. وأخيرا، واستخدام الروبوتات لإنشاء أعداد كبيرة من التجارب تبلور باستخدام الحد الأدنى من عينة أصبحت روتينية، ولكن ويعتمد كفاءة تشغيل الأنظمة الآلية على سلوك عينات البروتين جيدا اتسم. إضافةويمكن أن تشمل آل تعديلات على هذا البروتوكول أخذ العينات مجموعة متنوعة من العلامات تقارب. والعديد من العلامات الفلورية المختلفة المتاحة، أو أصول أمريكية لاتينية، GST-، Thioredoxin-، Strep-، وMBP- من بين عشرات الخيارات المتاحة إذا لم يكن هناك حاجة أو مفيدة علامة الفلورسنت.

عند تنفيذ هذا الإجراء، يجب أن يكون المستخدم تضع في اعتبارها تأثير هذا قد يكون علامة mRuby2 على البروتين المستخدمين من الفائدة. وتشير الأدلة من استخدام هذه العلامة على مجموعة متنوعة من اندماج مختلفة يدعم حقيقة أن mRuby2 سوف تربط أحيانا بإحكام جدا للبروتين من الفائدة، تبقى ملزمة من خلال الخطوات الكروماتوغرافي متعددة. هذا السلوك غير مرغوب فيه واضح، ولكن يمكن عادة المجمعات روبي غير مقصودة يمكن فصلها وإزالة chromatographically. ومن غير الواضح ما إذا كان هذا هو سلوك مثل كوصي كما لوحظ لم ب ب 32.

بعد الحصول على بلورات، لا تزال هناك العديد من التحديات التي تواجه عادة مع لجنة المحيط الهنديالبروتينات التي تقودها لفائف التي لم يتم تناولها في هذا البروتوكول. والأكثر شيوعا هو سوء نوعية الحيود، إما بسبب شكلت ناقص المشابك أو الحيود متباين الخواص. هناك أدوات في المكان للمساعدة في متباين الخواص الحيود 33 عاما، وكانت هذه حاسم من أجل حل بعض الهياكل ملفوف لفائف 18،20. العديد من الأمراض وضوح الشمس هي صعبة لسوء الحظ للتغلب بسرعة، لذلك غالبا ما يكون من الحكمة للبحث عن أشكال الكريستال إضافية مع خصائص الحيود المحسنة. ومما يسهل ذلك عن طريق فحص الروبوتية الآلاف من الظروف. بدلا من ذلك هناك العديد من التقنيات ما بعد تبلور لتحسين نوعية الحيود مثل الجفاف، أو بذر 34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21(DE3) Rosetta Emd Millipore 70954-3
BL21(DE3) Star ThermoFisher Scientific C601003
BL21(DE3) Codon Plus Agilent Technologies 230245
Lysozyme Spectrum Chemical Mfg Corp L3008-5GM
Ni-NTA resin Life Technologies 25216
SubtilisinA Spectrum Chemical Mfg Corp S1211-10ML
24 well Cryschem Plate Hampton research HR3-160
INTELLI-PLATE  96: Art Robbins Instruments 102-0001-03
PEG 3350 Hampton research HR2-591
PEG 8000 Hampton research HR2-515
PEG 400 Hampton research HR2-603
PEG 4000 Hampton research HR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2 Addgene 49089
Overnight Express Autoinduction System 1 Emd Millipore 71300
Lysogeny Broth powder ThermoFisher Scientific 12795027 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  2. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  3. Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
  4. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  5. Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
  6. Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
  7. Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
  8. Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
  9. Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
  10. Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
  11. Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
  12. Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
  13. Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
  14. Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
  15. Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
  16. Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
  17. Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
  18. Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).
  19. Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
  20. Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).
  21. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
  22. Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
  23. Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
  24. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
  25. Jungbauer, A., Hahn, R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).
  26. Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
  27. Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
  28. Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
  29. Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
  30. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
  31. Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
  32. Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
  33. Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  34. Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 119، الأشعة السينية البلورات، وتحديد هيكل، ملفوف لفائف، والبروتين، رو-كيناز، شروم
الجمع بين الرطب وتقنيات مختبر الجافة لتوجيه بلورة البروتينات كبيرة ملفوف لفائف تحتوي على
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zalewski, J. K., Heber, S., Mo, J.… More

Zalewski, J. K., Heber, S., Mo, J. H., O'Conor, K., Hildebrand, J. D., VanDemark, A. P. Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins. J. Vis. Exp. (119), e54886, doi:10.3791/54886 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter