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Biochemistry

संयोजन गीले और सूखे प्रयोगशाला तकनीकों बड़े दबाई-तार युक्त प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण गाइड करने के लिए

Published: January 6, 2017 doi: 10.3791/54886
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 2Institute of Structural Biology, German Research Center for Environmental Health

Introduction

एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के माध्यम से संरचना निर्धारण आधुनिक जीव विज्ञान के हर क्षेत्र के लिए मौलिक योगदान दिया है; अणुओं है कि जीवन का समर्थन है और वे संदर्भों की एक किस्म में एक दूसरे के साथ कैसे बातचीत की एक परमाणु दृश्य प्रदान; तंत्र का कारण है कि रोग और उपलब्ध कराने के अवसरों के तर्क से रोग के इलाज के लिए दवाओं के डिजाइन करने के लिए समझने के लिए हमें की अनुमति है। क्रि लंबे macromolecular संरचना का निर्धारण करने के लिए प्रमुख प्रयोगात्मक तकनीक से किया गया है, और वर्तमान में संरचनात्मक डेटाबेस (www.rcsb.org) की 89.3% के लिए खातों। यह तकनीक बहुत ही उच्च संकल्प के लिए संभावित सहित कई फायदे हैं, अपेक्षाकृत आसान डेटा संग्रह आकार के एक विस्तृत रेंज है, और कैसे macromolecule विलायक के रूप में अच्छी तरह से ligands के साथ सूचना का आदान कल्पना करने के लिए अवसर के साथ बड़े अणुओं कल्पना करने की क्षमता।

पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति 1,2, पुर में कई तकनीकी सुधार के बावजूदवर्गीकरण 3, और आणविक इन प्रणालियों 4, क्रिस्टेलोग्राफिक प्रक्रिया में एक सबसे बड़ी बाधा उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है जीव विज्ञान विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल विकसित करने की क्षमता बनी हुई है। यह प्रोटीन है जो बड़े कुंडलित-तार डोमेन होते हैं के लिए विशेष रूप से सच हो गया है। यह अनुमान लगाया गया है कि सभी अमीनो एसिड के% के रूप में ज्यादा के रूप में 5 coiled-कॉयल 5,6 के भीतर पाया जाता है, यह एक बहुत ही आम संरचनात्मक सुविधा 7 बना रही है, अभी तक इन प्रोटीनों अक्सर अधिक शुद्ध और गोलाकार प्रोटीन 8-10 से मणिभ करना मुश्किल है । यह और बात है कि coiled-तार डोमेन अक्सर एक बड़ा प्रोटीन के संदर्भ में पाए जाते हैं, इसलिए सही ढंग से इन डोमेन की सीमाओं की भविष्यवाणी असंरचित या लचीला अनुक्रम अक्सर क्रिस्टलीकरण के लिए हानिकारक है कि के शामिल किए जाने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है से बढ़ रहा है।

यहाँ हम संयोजन एक वैचारिक ढांचे को पेश वेब आधारित कम्प्यूटेशनल Experimenta साथ विश्लेषण करती हैसंरचनात्मक अध्ययन, और कैसे तैयार करने और क्रिस्टलीकरण के प्रयास करने से पहले प्रोटीन के नमूने को चिह्नित करने के लिए प्रोटीन टुकड़ा (ओं) का चयन करने के लिए कैसे: बेंच से एल डेटा, सहित क्रिस्टेलोग्राफिक प्रक्रिया के प्रारंभिक चरणों के माध्यम से गाइड उपयोगकर्ताओं को मदद करने के लिए। हम दो बड़े कुंडलित-तार डोमेन युक्त प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित करने के हमारे विश्लेषण, Shroom (SHRM) और रो-काइनेज (रॉक)। ये प्रोटीन के रूप में वे दोनों coiled-तार डोमेन होते हैं और एक जैविक रूप से प्रासंगिक जटिल 11-16 फार्म के लिए जाना जाता है चुने गए हैं। Shroom और रो-काइनेज (रॉक) क्रमश coiled-कुंडली के ~ 200 और 680 के अवशेष होते हैं भविष्यवाणी कर रहे हैं, कई भागों जिनमें से संरचनात्मक रूप से 17-20 विशेषता किया गया है। विधि यहाँ वर्णित एक सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह जल्दी coiled-तार युक्त प्रोटीन के टुकड़े कि क्रिस्टलीकरण के लिए उत्तरदायी हो जाएगा की पहचान करने के लिए प्रदान करता है, हालांकि, तकनीक वर्णित आसानी से सबसे अधिक प्रोटीन या प्रोटीन परिसरों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या उच्च throughput approa को शामिल करने के लिए संशोधितटांके के रूप में उपलब्ध है। अन्त में, इन तरीकों में आम तौर पर सस्ती कर रहे हैं और लगभग सभी अनुभव के स्तर पर उपयोगकर्ताओं द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: वैचारिक ढांचे या कार्यप्रवाह का एक चित्र संदर्भ के लिए चित्र 1 में वर्णित है। कम्प्यूटेशनल या अनुक्रम आधारित भविष्यवाणियों, प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि, जैव रासायनिक लक्षण, और क्रिस्टलीकरण: प्रोटोकॉल चार चरणों में विभाजित किया जा सकता है। दिखाए गए उदाहरण Shroom SD2 डोमेन और / या Shroom-रॉक परिसरों का विश्लेषण, लेकिन किसी भी प्रोटीन के साथ उपयोग किया जा सकता है।

1. इस्तेमाल स्थापित वेब आधारित उपकरण दबाई-तार डोमेन सीमाओं के कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणियों उत्पन्न करने के लिए

  1. अनुक्रम homologs के एक evolutionarily विविध सेट ले लीजिए।
    1. www.uniprot.org पर जाएं और ऊपरी खोज पट्टी में Shroom में टाइप करें।
    2. दृश्यों का चयन उनके परिग्रहण संख्या के लिए अगले बॉक्स को चेक करके डाउनलोड करने के लिए। एक स्टार के साथ दृश्यों Uniprot द्वारा समीक्षा दृश्यों से संकेत मिलता है और आम तौर पर अधिक विश्वसनीय हैं। सुनिश्चित करें कि सभी दृश्यों पूर्ण और सही कर रहे हैं ख्याल रखना।
    3. सहेजें का चयन किया रोंडाउनलोड बटन क्लिक करके equences।
    4. Clustal-ओमेगा 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) का उपयोग Shroom दृश्यों का संग्रह संरेखित करें। Shroom दृश्यों के साथ फ़ाइल का चयन करने के लिए बटन "ब्राउज" क्लिक करें और उसके बाद सबमिट धक्का।
    5. संरेखण पूर्ण होने पर, "डाउनलोड संरेखण फाइल" बटन पर क्लिक करें।
    6. (फ़ाइल से | | इनपुट संरेखण फाइल) Jalview का उपयोग कर 1.1.5 में उत्पन्न एकाधिक अनुक्रम संरेखण खोलें। (| प्रतिशत पहचान रंग) नई संरेखण खिड़की, पहचान करके रंग के भीतर।
  2. माध्यमिक संरचना की भविष्यवाणियों, लचीला या अव्यवस्थित अनुक्रम की भविष्यवाणियों की गणना, और ब्याज की प्रोटीन (एस) के भीतर कुंडलित-तार क्षेत्रों की भविष्यवाणी की।
    1. http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi के पास जाओ, दबाई-कुंडल भविष्यवाणियों की गणना करने के लिए। कॉपी और अनुक्रम बॉक्स में अनुक्रम चिपकाएं और सबमिट करें क्लिक करें।
      नोट: इस विश्लेषण कंप्यूटर अनुप्रयोग को कुछ घंटों के लिए ले सकता हैlete। चूंकि Shroom दृश्यों काफी बड़े हैं, दृश्यों वेबसर्वर का आकार बाधा के भीतर फिट करने के लिए कम से कम 1,000 अमीनो एसिड के ब्लॉक में विभाजित करने की आवश्यकता हो सकती है। जब Shrm2 का विश्लेषण, यह सिफारिश की है कि सी टर्मिनल 1,000 अमीनो एसिड उपयोग किया जाता है के रूप में इस खंड SHRM SD2 डोमेन जो coiled-तार क्षेत्रों को शामिल करने के लिए जाना जाता है। जब अन्य प्रोटीन के साथ इस विश्लेषण दोहरा, यह संभव है जब पूर्ण लंबाई प्रोटीन दृश्यों का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। अगर वह एक विकल्प नहीं है, सबसे बड़ा टुकड़ा संभव का उपयोग करें या काटना जाना जाता जैव रासायनिक या कार्यात्मक डेटा के आधार पर अनुक्रम।
    2. http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi के पास जाओ, दबाई-कुंडल भविष्यवाणियों की गणना करने के लिए। कॉपी और अनुक्रम बॉक्स में अनुक्रम चिपकाएं और सबमिट करें क्लिक करें।
  3. Shroom अनुक्रम का एक भी व्यापक एनोटेशन में 1.2.2 के लिए कदम 1.1 के परिणामों का मिश्रण।
    नोट: यह अत्यधिक भी किसी भी और सभी प्रासंगिक मैं शामिल करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता हैnformation कि साहित्य या प्रोटीन समारोह या इस स्तर पर शुद्धि के बारे में अन्य स्रोतों से बटोरा जा सकता है।
  4. इस व्यापक एनोटेट दृश्य का उपयोग कर, प्रोटीन के लिए डोमेन सीमाओं (या संभव सीमाओं की एक श्रृंखला) की भविष्यवाणी, संरक्षण को अधिकतम करने की कोशिश कर रहा है और ढांचागत सुविधाओं की भविष्यवाणी की है, जबकि अव्यवस्थित या लचीला अनुक्रम की राशि कम से कम। अगर जाना जाता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन ब्याज के कार्यात्मक गुणों को बनाए रखने चाहिए।

2. एक्सप्रेस और शुद्ध प्रोटीन धारा 1 में पहचाना डोमेन सीमाओं के साथ

नोट: इस खंड के लक्ष्य धारा 1 में उत्पन्न काल्पनिक डोमेन सीमाओं स्क्रीन करने के लिए जल्दी और आसानी से quantifiable assays की एक श्रृंखला का उपयोग करने के लिए है।

  1. मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीक का उपयोग करना, उनकी 10 -mRuby2-XH2 प्लाज्मिड भीतर फ्रेम में वांछित कोडिंग अनुक्रम के साथ एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड उत्पन्न (चित्रा 3 देखें वेक्टर नक्शा एक के लिएएन डी अतिरिक्त विवरण)।
  2. 18-24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर autoinduction मीडिया 1 में BL21 (DE3) ई कोलाई या अन्य उपयुक्त अभिव्यक्ति तनाव का उपयोग कर प्रत्येक प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के लिए टेस्ट अभिव्यक्ति के स्तर।
    1. अभिव्यक्ति plasmids के साथ ही BL21 (DE3) में एक खाली प्लाज्मिड नियंत्रण निर्देश, इस तरह के एक यहाँ (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial रूप में है कि कोशिकाओं के साथ आया है या मजबूत परिवर्तन प्रोटोकॉल का उपयोग निम्न रूपांतरण -transformation /)।
    2. हौसले से बदल प्लेट से एक भी कॉलोनी लेने के लिए और के साथ 34 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन Lysogeny शोरबा में 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात (पौंड) मीडिया पर एक 5 मिलीलीटर स्टार्टर संस्कृति बढ़ता है।
    3. अगले दिन, संस्कृति गोली और ताजा पौंड के साथ गोली धोने
    4. 34 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन साथ autoinduction मीडिया के 50 मिलीलीटर स्टार्टर संस्कृति जोड़ें। संस्कृति या तो कमरे के तापमान या 37 डिग्री सेल्सियस पर संतृप्ति को विकसित करने के लिए अनुमति दें। आमतौर पर, ~ के लिए 18-24 मानव संसाधन बढ़ता है।
    5. गोली सेलऔर शुद्धि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जिसके परिणामस्वरूप सेल छर्रों फ्रीज अनिश्चित काल के पहले।
    6. प्रत्येक अभिव्यक्ति तनाव और एसडीएस पृष्ठ से खाली वेक्टर नियंत्रण से पूरे सेल के अर्क की तुलना तनाव है कि सबसे अधिक कुशलता से वांछित संलयन प्रोटीन का उत्पादन निर्धारित करने के लिए। उनकी 10 -mRuby2-Shroom SD2 संलयन प्रोटीन के लिए, ~ के लिए 50 मिनट या जब तक डाई सामने जेल 22 के नीचे तक पहुँच 180 वी पर 10% एसडीएस पृष्ठ जैल चला रहे हैं।
    7. Coomassie ब्लू के साथ दाग जेल प्रत्येक तनाव 23 के भीतर कुल सेलुलर प्रोटीन कल्पना करने के लिए।
  3. प्रत्येक तनाव है कि सफलतापूर्वक mRuby2 संलयन प्रोटीन व्यक्त पर एक प्रारंभिक आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कदम प्रदर्शन। आमतौर पर, प्रदर्शन शुद्धि चरणों कमरे के तापमान पर 2.3.2-2.3.7, जब तक इस तरह के प्रोटीन 4 डिग्री सेल्सियस पर शुद्धि के रूप में बदल शर्तों से लाभ होगा।
    1. कदम 2.2.5 से पिघलना सेल छर्रों।
    2. lysis बफर (10% ग्लिसरॉल, 500 मिमी NaCl, 40 की 1.5 मिलीलीटर में प्रत्येक कोशिका गोली Resuspendमिमी imidazole, 20 मिमी Tris pH8.0, 1 मिमी बीटा-mercaptoethanol)। उचित रूप में प्रोटीज अवरोधकों के साथ lysis बफर अनुपूरक।
    3. 10 मिलीग्राम / एमएल लाइसोजाइम के 30 μl जोड़ें और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। साधन के लिए निर्देशों का पालन Sonicate इस्तेमाल किया जा रहा है।
    4. 14,000 XG पर 30 मिनट के लिए एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरण अघुलनशील सामग्री या unlysed गोली कोशिकाओं। दोनों सतह पर तैरनेवाला और एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से बाद के विश्लेषण के लिए गोली बचाओ।
    5. निकल आत्मीयता शुद्धि नी NTA मोतियों की 100 μl के साथ घुलनशील अंश incubating प्रदर्शन करना। 5-10 मिनट के लिए घुलनशील lysate के साथ मोती सेते हैं, कई बार inverting मोती मिश्रण करने के लिए।
    6. एक tabletop अपकेंद्रित्र में 30 सेकंड के लिए 800 XG पर अपकेंद्रित्र मोती गोली। गोली lysis बफर के साथ 3-5 बार धोने गैर विशिष्ट दूषित पदार्थों को साफ करके इस का पालन करें।
    7. lysis बफर के साथ मोतियों से Elute रूबी संलयन प्रोटीन 1 के साथ पूरकएम imidazole।
    8. ऊपर "त्वरित और गंदे" शुद्धि में उनकी mRuby2-Shroom प्रोटीन के व्यवहार की तुलना करने के लिए एसडीएस पृष्ठ का प्रयोग करें।

3. विशेषताएँ प्रोटीन नमूना लाभप्रद संपत्तियों के साथ उन लोगों की पहचान करने के लिए

  1. 280 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर सेट का प्रयोग करें रूबी संलयन प्रोटीन की एकाग्रता को मापने के लिए, और फिर एक देशी पृष्ठ जेल 24 पर संलयन प्रोटीन की 1-5 माइक्रोग्राम लोड करके नमूना की एकरूपता का आकलन करें। 175 वी पर 140 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10% मूल निवासी पृष्ठ जेल भागो
    1. छवि मूल निवासी पृष्ठ प्रतिदीप्ति कल्पना करने के लिए, देख रहा है, जहां mRuby टैग संलयन इस परख में migrates लैस एक इमेजर का उपयोग कर।
      नोट: संलयन प्रोटीन है कि में अच्छी तरह के रूप में इस प्रोटीन की संभावना एकत्रित है अटक गई है निरीक्षण करने के लिए सावधान रहें। एक प्रतिदीप्ति इमेजर उपलब्ध नहीं है, तो एक बार कल्पना कर सकते हैं और रूबी की छवि केंद्रित नमूने एक काले रंग की रोशनी के नीचे या एक यूवी प्रकाश बॉक्स के साथ टैग प्रोटीन।
  2. स्थिरतापूर्वक मुड़ा डोमेन की पहचान करने के लिए सीमित प्रोटियोलिसिस प्रदर्शन करना। 0.025% subtilisin ए के 5 μl के साथ / ~ 1 मिलीग्राम पर रूबी-SHRM SD2 संलयन के 95 μl सेते मिलीलीटर
    1. के समय बिंदुओं पर प्रतिक्रिया नमूना 0, 0.5, 2, 5, 15, 60, और 120 मिनट, हर समय बिंदु के लिए प्रतिक्रिया से 10 μl हटाने और एक 15% एक्रिलामाइड जेल का उपयोग एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से प्रतिक्रिया की प्रगति visualizing ।
    2. कदम 2.2.7 के रूप में Coomassie ब्लू के साथ दाग और मूल्यांकन क्या एक प्रोटीज प्रतिरोधी प्रजातियों की पहचान की जा सकती है।
  3. समाधान में इन प्रोटीनों के समग्र व्यवहार का एक व्यापक मूल्यांकन में शुद्धि दक्षता, व्यवहार मूल निवासी पृष्ठ में, और सीमित प्रोटियोलिसिस आंशिक रूप से शुद्ध mRuby2-Shroom संलयन प्रोटीन पर से डेटा को एकीकृत।
    1. (वैकल्पिक) यदि एक उपयुक्त कार्यात्मक परख उपलब्ध है, इस बिंदु पर गतिविधि के लिए जाँच करें।

4. दबाई-तार SD2 की उच्च गुणवत्ता क्रिस्टल उत्पादनShroom से डोमेन

नोट: धारा 4.1 के भीतर सभी कदम कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं, जब तक कि प्रोटीन 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर एक अलग शुद्धि से लाभ, आम तौर पर होता है।

  1. अभिव्यक्ति और शुद्धि की क्षमता का एक मोटा अनुमान के रूप में 50 मिलीलीटर वृद्धि का उपयोग करना, पूरी तरह से शुद्ध नमूना की 5-20 मिलीग्राम प्राप्त करने के लक्ष्य के साथ mRuby2-Shroom SD2 के बड़े पैमाने पर भाव प्रदर्शन करते हैं। आमतौर पर संस्कृति के 2 एल पर्याप्त शुरुआती सामग्री प्रदान करता है। 10 मिनट के लिए 8000 XG पर centrifugation द्वारा विकास गोली कोशिकाओं के बाद।
    1. के रूप में पहले lysis बफर में 2 एल विकास से गोली Resuspend, ~ 2 जमे हुए सेल गोली के ग्राम प्रति सेल की एमएल का उपयोग करता है, तो सेल के लिए लाइसोजाइम का उपयोग कर। वैकल्पिक रूप से, अगर एक homogenizer या फ्रेंच प्रेस का उपयोग ~ 8 मिलीग्राम / छ गोली के कम से resuspend। 30 मिनट के लिए 30,000 XG पर centrifugation के माध्यम से सेलुलर मलबे गोली।
    2. बैच नी NTA राल के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर 4.1.1 से घुलनशील अंश बाँध। उचित गुरुत्वाकर्षण स्तंभ में डालोऔर अपार प्रोटीन बंद पलायन करने की अनुमति देते हैं।
    3. धो lysis बफर के 40 मिलीलीटर, lysis बफर 1 एम NaCl के पूरक के साथ एक धोने के द्वारा पीछा के साथ 3-5 बार राल।
    4. lysis बफर 80 मिमी imidazole के साथ पूरक के 40 मिलीलीटर के साथ धो राल।
    5. 1 एम imidazole करने के लिए पूरक lysis बफर के 40 मिलीलीटर के साथ रूबी-Shroom संलयन प्रोटीन Elute। मैन्युअल 4-10 मिलीलीटर भागों में eluted प्रोटीन fractionate।
    6. रूबी-Shroom संलयन प्रोटीन 10% एसडीएस पृष्ठ का उपयोग करते हुए युक्त भिन्न पुष्टि करें।
    7. उचित अंशों Dialyze (आम तौर पर 2-4 अंशों) 8% ग्लिसरॉल, 250 मिमी NaCl, 15 मिमी imidazole, 20 मिमी Tris pH8.0 में, 1 मिमी β-एमई, 6-8 केडीए MWCO डायलिसिस ट्यूबिंग का उपयोग कर। TEV प्रोटीज की 1 मिलीग्राम संलयन प्रोटीन के हर 25-50 मिलीग्राम के लिए जोड़ें। धीमी गति से सरगर्मी के साथ कमरे के तापमान पर रात भर Dialyze।
    8. दोहराएँ निकल आत्मीयता शुद्धि 4.1.2 कदम। 4.1.6 करने के लिए। Shroom SD2 डोमेन अब अनबाउंड अंश में रहना चाहिए, जबकि उसकी 10 -mRuby2 के लिए बाध्य रहेगाराल और क्षालन भागों में मिल जाएगा। Coomassie ब्लू के साथ इस का उपयोग कर 12% एसडीएस पृष्ठ धुंधला की पुष्टि करें।
    9. 8% ग्लिसरॉल, 100 मिमी NaCl, 20 मिमी Tris पीएच 8.0, 5 मिमी बीटा-mercaptoethanol बफर रात भर में Shroom SD2 डोमेन युक्त भिन्न Dialyze।
    10. आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी 25 एक FPLC का उपयोग कर प्रदर्शन करना, और 0.1-1.0 एम NaCl से एक NaCl ढाल के साथ एल्यूटिंग। 12% एसडीएस पृष्ठ का उपयोग करते हुए अंशों का विश्लेषण।
    11. एक स्पिन concentrator का उपयोग (10 केडीए के MWCO या अधिक से अधिक प्रोटीन अध्ययन किया जा रहा है पर निर्भर करता है), शिखर अंशों ध्यान केंद्रित ~ 0 मिलीग्राम / एमएल, और फिर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी 26 प्रदर्शन करने के लिए, 12% एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से चोटी अंशों का विश्लेषण।
    12. पूल चोटी भिन्न और 20 मिमी Tris पीएच 8.0, 50 मिमी NaCl, 2% ग्लिसरॉल, में dialyze 1 मिमी β-एमई, और 10 मिलीग्राम क्रिस्टलीकरण के लिए / मिलीलीटर से पहले ध्यान देना।
      वैकल्पिक: इस कदम के दौरान की सांद्रता में 5 μl नमूने निकालें 1, 2, 5, और 10 मिलीग्राम / एमएल नमूना ध्यान केंद्रित के दौरान।इस कदम के दौरान नमूने के व्यवहार को देखने के लिए प्रत्येक नमूने की एक देशी पेज लोड 2-5 μl चलाएँ।
  2. 12 शर्तों में से एक छोटा सा सरणी स्क्रीन crystallization परीक्षण के लिए एक इष्टतम प्रोटीन एकाग्रता की पहचान। इन शर्तों की संरचना चित्रा 7 में वर्णित है।
    1. 24 अच्छी तरह से बैठे बूंद क्रिस्टलीकरण ट्रे का उपयोग करना, वाष्प प्रसार विधि, pipetting का उपयोग कर crystallization परीक्षण प्रदर्शन बूंदों के द्वारा पीछा अलग कुओं कि शुरू में अच्छी तरह से समाधान के 1 μl और coverslips पर प्रोटीन नमूने के 1 μl शामिल में 12 शर्तों में से प्रत्येक के 500 μl । कृपया इस तकनीक पर अतिरिक्त जानकारी के लिए 27 देखें।
    2. जल्दी से स्पष्ट टेप के साथ ट्रे मुहर और एक उपयुक्त तापमान नियंत्रित वातावरण है कि कंपन मुक्त करने के लिए ट्रे ले जाते हैं। तापमान भिन्न हो सकते थे, लेकिन 4 डिग्री सेल्सियस, 16 डिग्री सेल्सियस और 20 डिग्री सेल्सियस बहुत आम हैं।
    3. अगले ओवर में 3 डी ट्रे में बूंदों की जांच करना100X बढ़ाई अप करने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग ays। 3 दिन की अवधि के अंत में, के रूप में बर्फबारी (स्पष्ट), प्रकाश वर्षा, भारी वर्षा (ब्राउन), या क्रिस्टल युक्त एक बूंद स्कोर। एक उपयुक्त प्रोटीन एकाग्रता कोई अधिक से अधिक 6 भारी वर्षा को शामिल करना चाहिए।
    4. प्रोटीन एकाग्रता 4.2 में पहचान का उपयोग करना, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्रिस्टलीकरण स्क्रीन की एक विस्तृत रेंज स्क्रीन। एक तरल से निपटने या क्रिस्टलीकरण रोबोट का उपयोग बहुत इस प्रक्रिया को गति करते हुए भी बूंदों में त्रुटि कम से कम। यह उपयोगकर्ता एक भी नमूना के साथ और अधिक की स्थिति स्क्रीन करने के लिए अनुमति के रूप में अच्छी तरह से अब तक कम प्रोटीन की आवश्यकता है।
    5. व्यवस्थित रूप से पहले 24 अच्छी तरह से स्क्रीनिंग ट्रे का उपयोग कर क्रिस्टलीकरण बूंद के भीतर चर के प्रत्येक अलग से व्यापक स्क्रीन से पहचान प्रारंभिक स्थिति में सुधार।

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Representative Results

एक चित्र कार्यप्रवाह इस प्रणाली में उपयोग चित्रण चित्र 1 में दिखाया गया है और तीन मुख्य चरणों में शामिल किया जाता है। अनुक्रम का विश्लेषण कम्प्यूटेशनल ब्याज की coiled-तार प्रोटीन के डोमेन सीमाओं के बारे में परिकल्पना विकसित करने के लिए उपयोग किया जाता है। Shrm2 SD2 डोमेन की एक एनोटेट विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है। इस चित्र में, लक्ष्य cytoskeletal नियामक Shroom SD2 कहा जाता है की सी टर्मिनस पर एक संरक्षित डोमेन के लिए संभव डोमेन सीमाओं की पहचान के लिए किया गया था। इस विश्लेषण से काल्पनिक डोमेन सीमाओं के तीन अलग सेट coiled तार के टुकड़े कि पूरे संरक्षित SD2 या न्यूनतम टुकड़े सी टर्मिनस जो क्रिस्टलीकरण के लिए सर्वश्रेष्ठ उम्मीदवार के रूप में समाप्त पास फैले युक्त उत्पन्न किया गया था। अनुक्रम विश्लेषण से पहचान उम्मीदवारों को फिर जल्दी mRuby2 के साथ एक प्रोटीन संलयन (चित्रा 3) के लिए उपयोग कर छोटे पैमाने में परीक्षण कर रहे हैंr कुशल विश्लेषण। प्रतिनिधि छोटे पैमाने (संस्कृति की 50 मिलीलीटर) दो से शुद्धिकरण उनकी 10 -mRuby2 टैग प्रोटीन चित्रा 4 में दिखाया जाता है। इस चित्र में, एक अघुलनशील प्रोटीन के व्यवहार के रूप में अपनी घुलनशील समकक्ष की तुलना में आसानी से स्पष्ट है। खराब व्यक्त या अघुलनशील प्रोटीन fusions आसानी से और जल्दी से इस ढंग से पहचाने जाते हैं। सीमित प्रोटियोलिसिस द्वारा प्रोटीन टुकड़े की जैव रासायनिक विश्लेषण में वर्णित या अलग-थलग और शुद्ध Shroom SD2 डोमेन के साथ रूबी प्रणाली का उपयोग करते हुए सूख टुकड़े की एक किस्म के लिए चित्रा 5 में दिखाया जाता है। चित्रा 5 ए में, माउस SHRM SD2 के दो वेरिएंट काल्पनिक डोमेन सीमाओं को इसी # 2 और 3 चित्र में # 1 कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए (0-1.0%) से प्रोटीज एकाग्रता की एक ढाल का उपयोग कर पचा रहे थे। इन दोनों को प्रभावी ढंग से मध्यम एंजाइम सांद्रता में छोटे उत्पादों के एक मेजबान में अपमानित किया गया। चित्रा 5 ब सैम से पता चलताई प्रयोग ड्रोसोफिला SHRM SD2 से का उपयोग कर काल्पनिक सीमा # 3 प्रदर्शन किया। इस प्रोटीन मणिभ था और इसकी संरचना 19 में वर्णित किया गया है। प्रोटिओलिटिक विश्लेषण भी जब रूबी-fusions की जांच के ऊपर प्रोटोकॉल से उत्पन्न के रूप में उपयोगी हो सकता है। जैसा कि चित्र 5C, मानव Shrm2 SD2 (1427-1610) के साथ एक रूबी संलयन प्रोटीन में दिखाया गया है कि एक उच्च संकेत समय बिंदुओं के लिए कमरे के तापमान पर गैर विशिष्ट प्रोटीज subtilisin की एकाग्रता (0.025%) के साथ पचा गया था। यहाँ रूबी और SHRM के बीच लिंकर तुरंत cleaved था के रूप में की उम्मीद होगी। इसके अतिरिक्त, नाबालिग उत्पादों का गठन किया गया इस प्रोटीन दो अन्य प्रोटीज संवेदनशील क्षेत्रों का संकेत दिया है, हालांकि, गिरावट के उत्पादों जो 2 मिनट के भीतर तैयार किए गए प्रयोग प्रोटीन का संकेत के बाकी भर में काफी हद तक बरकरार वास्तव में काफी स्थिर है बने रहे।

एक पूरक दृष्टिकोण मूल निवासी पृष्ठ Analys का उपयोग करते हुए दिखाया गया हैचित्रा 6 में है। चित्रा 6A, में रूबी टैग मानव SHRM SD2 (1427-1610) के साथ ही प्रोटीन SHRM भीतर संकेत बिंदु उत्परिवर्तन युक्त मूल निवासी पृष्ठ से विश्लेषण कर रहे हैं। इस प्रयोग में, जंगली प्रकार के प्रोटीन (जो क्रिस्टल रूपों), दो अलग-अलग बैंड के रूप में चलाता है, जबकि तीन म्यूटेंट जो मणिभ नहीं है नाटकीय रूप से अलग व्यवहार किया है। प्रदर्शित करने के लिए है कि इस प्रणाली को भी प्रोटीन परिसरों पर उपयोगी हो सकता है, Shroom-रॉक परिसरों की एक किस्म चित्रा 6B में देशी पृष्ठ से विश्लेषण किया गया। इस मामले में, मानव Shrm2 SD2 का एक ही टुकड़ा (1427-1610) विश्लेषण स्पष्ट है, जबकि मानव रॉक के विभिन्न टुकड़ों का उपयोग किया गया मदद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह दृष्टिकोण सुझाव दिया है कि परिसरों का उपयोग कर रॉक 700-906 और 746-906, कई प्रजातियों था मैला, और कम समरूप थे गठन किया था। 788-906 का उपयोग परिसर में सुधार किया गया है, न कि नाटकीय रूप से यद्यपि, और इस प्रजाति मणिभ करने में सक्षम था, हालांकि क्रिस्टल कई हफ्ते लग गए फार्म और चोरtained रॉक प्रोटीन अपमानित। रॉक 834-913 का उपयोग कर उत्पन्न परिसर जेल पर एक एकल और अधिक समान प्रजातियों का गठन किया और आसानी से रातों-रात सघन। चित्रा 7 आम क्रिस्टलीकरण की स्थिति है कि crystallization परीक्षण में प्रोटीन नमूना के व्यवहार पर सूचित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं का एक सेट से पता चलता है, और किसी भी प्रोटीन के साथ आम तौर पर इस्तेमाल किया जा सकता है। आदर्श रूप में, स्पष्ट और precipitating की स्थिति की एक मिश्रण प्राप्त किया जाएगा। प्रोटीन है कि अवक्षेप फार्म नहीं है उच्च सांद्रता या अधिक कड़े बफरिंग स्थितियों की आवश्यकता है कि उन लोगों के कई परिस्थितियों में वेग एक कम प्रोटीन एकाग्रता में या बफरिंग की स्थिति है कि प्रोटीन घुलनशीलता को बढ़ावा देने के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए, जबकि।

आकृति 1
चित्रा 1: कार्यप्रवाह आरेख। एक सामान्यीकृत आरेख कम्प्यूटेशनल अनुक्रम विश्लेषण और जैव रासायनिक और के एकीकरण का चित्रणडोमेन सीमाओं की रूपरेखा और क्रिस्टलीकरण के लिए प्रोटीन टुकड़े की पहचान करने के लिए एक व्यापक रणनीति में अन्य गीला प्रयोगशाला तकनीकों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: एनोटेट Shroom से coiled-तार SD2 डोमेन के लिए अनुक्रम विश्लेषण। कम्प्यूटेशनल के ओवरले Shroom SD2 डोमेन के लिए विश्लेषण करती है, CLUSTAL Omega से उत्पन्न होता है और Jalview (1.1 कदम) के भीतर अनुक्रम पहचान से रंग का एक बहु अनुक्रम संरेखण भी शामिल है। इसके अलावा माध्यमिक संरचना, अव्यवस्थित अनुक्रम भविष्यवाणियों, और Shroom SD2 डोमेन के coiled-तार भविष्यवाणियों (1.2 चरण) भविष्यवाणी कर रहे हैं शामिल थे। काल्पनिक डोमेन सीमाओं (1.3 चरण) संकेत कर रहे हैं के रूप में मनाया चौके और माध्यमिक संरचना रहे हैंतत्व के रूप में बाद में क्रिस्टेलोग्राफिक विश्लेषण 19 से पता चला। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: उनके 10 -mRuby2-अभिव्यक्ति प्रणाली का आरेख। अभिव्यक्ति वेक्टर के (ए) योजनाबद्ध उनकी 10 -mRuby2-XH2 वेक्टर इस अध्ययन में इस्तेमाल किया। (ख) इस वेक्टर से कई क्लोनिंग साइट का आरेख। प्रोटीन कोडिंग दृश्यों आम तौर पर BamHI और EcoRI क्लोनिंग साइटों के माध्यम से इस सदिश में डाला जाता है। mRuby2 प्रोटीन के चरम सी टर्मिनस लाल रंग में दिखाया गया है, TEV प्रोटीज दरार साइट कोष्ठक के साथ और दरार की साइट पर एक लाल त्रिकोण के रूप में दिखाया के साथ संकेत दिया है। mRuby2 और TEV साइट के बीच एक linker अनुक्रम सियान में दिखाया गया है।यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: दो mRuby2 के प्रतिनिधि छोटे पैमाने शुद्धिकरण टैग संलयन प्रोटीन। (ए) जीवाणु संस्कृति अभिव्यक्ति रूबी SHRM SD2 या एक असंबंधित रूबी संलयन प्रोटीन अघुलनशील होने के लिए जाना जाता है के नमूने की एक छवि कल्पना कर रहे हैं। एक अलग संस्कृति एक रूबी-टैग के बिना एक प्रोटीन व्यक्त की तुलना के लिए दिखाया गया है। (बी) संस्कृतियों के ऊपर से imaged थे घुलनशील अंश 30 मिनट के लिए 30,000 XG पर सेल और centrifugation के बाद, घुलनशील रूबी-SHRM SD2 के दृश्य का प्रदर्शन है। बाध्यकारी के बाद नी NTA मोतियों की (सी) छवि और बाद में धोने कदम का संकेत है कि रूबी-SHRM SD2 पर स्थिर किया जा रहा हैमोती। (घ) 2.3.6 और 2.3.7 में वर्णित के रूप में कपड़े धोने और क्षालन कदम के नमूने है कि रूबी-SHRM SD2 संलयन राल के लिए बाध्य रहता है, जबकि अप करने के लिए 80 मिमी imidazole की उपस्थिति में और प्रभावी ढंग से कॉलम बंद eluted है प्रदर्शित 1 एम imidazole क्षालन बफर के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: अलग Shroom प्रोटीन से उम्मीदवार SD2 डोमेन के सीमित प्रोटियोलिसिस। विभिन्न Shroom प्रोटीन से चार SD2 डोमेन की एक तुलना। (ए और बी) ने संकेत दिया SHRM SD2 टुकड़े एक एकाग्रता 1.0% करने के लिए 0 से प्रोटीज trypsin की ढाल और परिणाम एसडीएस पृष्ठ द्वारा विश्लेषण के साथ incubated रहे थे। कि प्रोटीन टुकड़ा बुद्धि का संबंधज काल्पनिक सीमाओं संकेत कर रहे हैं। उनकी 10 -mRuby2-Shroom SD2 संलयन प्रोटीन समय पाठ्यक्रम विधि प्रोटोकॉल में वर्णित का उपयोग करने का सीमित प्रोटिओलिटिक पाचन की (सी) एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण। प्रतिक्रिया 0.025% कमरे के तापमान पर trypsin के साथ हुई। रूबी और Shroom SD2 के बीच लिंकर की पाचन तेजी से होता है और एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। एक प्रकल्पित गिरावट उत्पाद है कि सह-शुद्ध उनकी 10 -mRuby2-Shroom SD2 संलयन प्रोटीन के साथ संकेत दिया है (*)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: देशी जेल का उपयोग प्रोटीन व्यवहार में परिवर्तन देख। (ए) 10% मूल निवासी पृष्ठ एक उत्परिवर्ती कि mRuby2-Shroo के गुणों में परिवर्तन के प्रभाव का प्रदर्शनएम SD2। इन शर्तों के तहत SHRM SD2 जबकि SD2 भीतर संकेत बिंदु म्यूटेंट न्यायपालिका प्रवास पैटर्न की एक श्रृंखला प्रदर्शन, दो असतत बैंड के रूप में चलाता है। (बी) के रॉक के विभिन्न संस्करणों का उपयोग का गठन और देशी पृष्ठ से विश्लेषण Shroom SD2-रॉक परिसरों की एक तुलना। Shroom SD2 और रॉक काइनेज का संकेत दिया टुकड़े (दोनों coiled-तार प्रोटीन) के बीच परिसर मूल निवासी पृष्ठ से सुलझाया गया। क्रिस्टल कई हफ्तों लेकिन रॉक 834-913 युक्त जटिल तेजी से सघन बाद रॉक 788-906 युक्त परिसर के लिए प्राप्त किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: क्रिस्टलीकरण के लिए त्वरित प्राथमिक स्क्रीन। (ए) आम क्रिस्टलीकरण सह की एक त्वरित स्क्रीनnditions crystallization परीक्षण में प्रोटीन नमूना के व्यवहार का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (बी) सरल स्कोरिंग मैट्रिक्स के उदाहरण क्रिस्टलीकरण बूंदों का आकलन करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता बड़े कुंडलित-तार प्रोटीन के भीतर डोमेन सीमाओं की पहचान उनकी क्रिस्टलीकरण की सुविधा के लिए मदद करने के लिए बनाया गया है। प्रोटोकॉल कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणियों और अन्य स्रोतों से डेटा की एक किस्म के लिए एक समग्र समावेश पर निर्भर करता है संभावित डोमेन सीमाओं की एक श्रृंखला उत्पन्न करने के लिए। ये जैव रासायनिक प्रयोगों जो त्वरित और सस्ता कर रहे हैं, और आगे इन प्रारंभिक परिकल्पना को परिष्कृत करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं का एक सेट द्वारा पीछा कर रहे हैं। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, उपयोगकर्ता जल्दी संभावित प्रोटीन टुकड़े कि अवांछनीय हैं खत्म करने, और बेहतर उम्मीदवारों पर अधिक ध्यान केन्द्रित है, जिससे क्रिस्टल प्राप्त करने की संभावनाओं में सुधार हो सकता है।

वहाँ, काल्पनिक डोमेन सीमाओं की प्रारंभिक सेट के विकास के रूप में क्रिस्टल के उत्पादन के लिए के रूप में महत्वपूर्ण कोई भी इस तकनीक के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं, लेकिन। इस कदम के बारे में जानकारी ओबी के साथ ही कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण की एक किस्म को शामिल किया गया,साहित्य या कार्यात्मक डेटा उपलब्ध है जब से tained। जॉब एकल "सर्वश्रेष्ठ" समाधान करने के लिए नीचे तुरंत सुधारने के लिए वहाँ के रूप में वर्तमान में जगह भविष्यवाणियों में से किसी को एक quantifiable आत्मविश्वास महत्व देते में कोई विधि है रणनीति का उपयोग कर से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। इसके बजाय, यह सबसे अच्छा जल्दी संभव डोमेन सीमाओं जो प्रयोगात्मक सत्यापित करने की आवश्यकता का एक छोटा सा सेट की पहचान करने के लिए एक विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है।

कुंडलित-तार प्रोटीन का गुण है जो इस प्रोटोकॉल के साथ विश्लेषण किया जा सकता है काफी व्यापक हैं। एक कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण से, कुंडलित-तार भविष्यवाणियों की ताकत 20 एमिनो एसिड नीचे सीमित है, और के रूप में कदम 1.2.1 में उल्लेख किया है, कुंडलित-तार क्षेत्रों से बड़ा 1,000 अमीनो एसिड DISOPRED द्वारा विश्लेषण के लिए कई वर्गों में विभाजित करने की आवश्यकता होगी। हम इस पर बाद में सीमा के रूप में अस्थायी रूप में यह वेबसर्वर द्वारा लगाया गया है और के रूप में विधि भविष्य में उन्नत बनाया है बदल सकता है देखने के लिए। बाद में जैव रासायनिक विश्लेषण हालांकि, ग्रस्त कर सकते हैंविभिन्न तरीकों से। सबसे पहले, आंतरिक छोरों या proteases नमूना बना सकते हैं करने के लिए अतिसंवेदनशील क्षेत्रों कम स्थिर से यह वास्तव में होना दिखाई देते हैं। स्थिर प्रोटीन है कि छोरों cleaved है या अन्यथा nicked रहे हैं प्रोटीज द्वारा अभी भी है यही वजह है कि यह सिफारिश की है कि उपयोगकर्ता दोनों रणनीतियों का पता लगाने, देशी पृष्ठ पर एक स्थिर उपस्थिति देना चाहिए। मूल निवासी पृष्ठ कुछ प्रोटीन के लिए मुश्किल हो सकता है, तथापि, क्योंकि या तो वे बहुत लंबे होते हैं और जेल में धीरे-धीरे विस्थापित या क्योंकि उनके विशेष प्रभारी बना सकता है उन्हें पूरी तरह से जेल के बाहर विपरीत दिशा चलाते हैं। इस मामलों में यह देशी पृष्ठ जेल प्रणाली के लिए अलग बफरिंग की स्थिति का पता लगाने के लिए उपयोगी हो सकता है।

यहाँ प्रस्तुत काम का ध्यान बड़े कुंडलित-तार युक्त प्रोटीन पर किया गया है, इस प्रोटोकॉल बहुत कुछ रूपांतरों के साथ लगभग किसी भी प्रोटीन के लिए उपयोग किया जा सकता है। गोलाकार प्रोटीन के लिए प्राथमिक इसके अलावा इस तरह के pDomTHREADER 28 <के रूप में डोमेन भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर के अलावा होगा/ sup> या DomPred 29 डोमेन सीमाओं लिए देखने के लिए, और इस तरह के रूप में 30 Phyre2 तृतीयक संरचना भविष्यवाणियों अनुक्रम विश्लेषण की भविष्यवाणी करने की शक्ति को बढ़ाने के लिए। इसके अतिरिक्त, वहाँ कई एल्गोरिदम माध्यमिक संरचना भविष्यवाणियों और अव्यवस्थित भविष्यवाणियों के प्रदर्शन के लिए उपलब्ध हैं, और अतिरिक्त एल्गोरिदम के शामिल किए जाने के लिए सहायक हो सकता है। गोलाकार प्रोटीन अक्सर enzymatic गतिविधि या अन्य कार्यात्मक readouts कि लक्ष्य के चयन के दौरान महत्वपूर्ण अतिरिक्त जानकारी प्रदान करेगा अधिकारी। इसके अलावा, मध्यम या उच्च throughput तकनीक उचित रूप में शामिल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 1-2 मिलीलीटर संस्कृतियों और 96 अच्छी तरह स्वरूपों में धातु आत्मीयता के शुद्धिकरण के लिए सस्ती सिस्टम आसानी से उपलब्ध 31 हैं। अन्त में, कम से कम नमूने का उपयोग कर क्रिस्टलीकरण प्रयोगों की बड़ी संख्या की स्थापना के लिए रोबोटिक्स के उपयोग दिनचर्या होता जा रहा है, लेकिन रोबोट सिस्टम के कुशल संचालन अच्छी तरह से विशेषता प्रोटीन के नमूने के व्यवहार पर predicated है। इसके अलावाइस प्रोटोकॉल के लिए अल संशोधनों समानता टैग की एक किस्म के नमूने शामिल हो सकते हैं। कई अलग अलग फ्लोरोसेंट टैग उपलब्ध हैं, या His-, GST-, Thioredoxin-, Strep-, और MBP- अगर एक फ्लोरोसेंट टैग की जरूरत है या उपयोगी नहीं है उपलब्ध विकल्पों के दर्जनों शामिल हैं।

जब इस प्रक्रिया का प्रदर्शन, उपयोगकर्ता प्रभाव mRuby2 टैग ब्याज की उन 'प्रोटीन पर हो सकता है कि के प्रति जागरूक होना चाहिए। अलग fusions की एक किस्म पर इस टैग का उपयोग करने से वास्तविक सबूत तथ्य यह है कि कभी कभी mRuby2, ब्याज की प्रोटीन के लिए काफी कसकर बाध्य होगा कई chromatographic कदम के माध्यम से बंधे हुए शेष का समर्थन करता है। यह व्यवहार जाहिर अवांछनीय है, लेकिन अनायास ही रूबी परिसरों आम तौर पर अलग कर दिया और chromatographically हटाया जा सकता है। यह इस एक निगरानी की तरह व्यवहार है, चाहे के रूप में MBP 32 के लिए देखा गया है स्पष्ट नहीं है।

क्रिस्टल प्राप्त करने के बाद, वहाँ अभी भी कई चुनौतियों है कि आमतौर पर COI साथ सामना कर रहे हैंनेतृत्व-तार प्रोटीन है कि इस प्रोटोकॉल में संबोधित नहीं कर रहे हैं। सबसे आम गरीब विवर्तन गुणवत्ता, या तो अपूर्ण का गठन करने के लिए lattices या anisotropic विवर्तन वजह से है। वहाँ जगह anisotropic विवर्तन 33 के साथ सहायता के लिए उपकरण हैं, और ये कुछ कुंडलित-तार संरचनाओं 18,20 को सुलझाने के लिए आलोचना की गई है। कई क्रिस्टल विकृतियों जल्दी काबू पाने के लिए दुर्भाग्य से मुश्किल हो जाता है, इसलिए यह अक्सर बढ़ाया विवर्तन गुणों के साथ अतिरिक्त क्रिस्टल रूपों के लिए खोज करने के लिए समझदारी है। इस स्थिति की हजारों की रोबोटिक स्क्रीनिंग से मदद की है। वैकल्पिक रूप से वहाँ इस तरह निर्जलीकरण, या 34 बोने के रूप में कई पद के क्रिस्टलीकरण तकनीक विवर्तन गुणवत्ता में सुधार करने के लिए कर रहे हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21(DE3) Rosetta Emd Millipore 70954-3
BL21(DE3) Star ThermoFisher Scientific C601003
BL21(DE3) Codon Plus Agilent Technologies 230245
Lysozyme Spectrum Chemical Mfg Corp L3008-5GM
Ni-NTA resin Life Technologies 25216
SubtilisinA Spectrum Chemical Mfg Corp S1211-10ML
24 well Cryschem Plate Hampton research HR3-160
INTELLI-PLATE  96: Art Robbins Instruments 102-0001-03
PEG 3350 Hampton research HR2-591
PEG 8000 Hampton research HR2-515
PEG 400 Hampton research HR2-603
PEG 4000 Hampton research HR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2 Addgene 49089
Overnight Express Autoinduction System 1 Emd Millipore 71300
Lysogeny Broth powder ThermoFisher Scientific 12795027 

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References

  1. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  2. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  3. Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
  4. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  5. Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
  6. Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
  7. Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
  8. Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
  9. Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
  10. Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
  11. Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
  12. Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
  13. Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
  14. Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
  15. Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
  16. Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
  17. Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
  18. Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).
  19. Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
  20. Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).
  21. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
  22. Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
  23. Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
  24. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
  25. Jungbauer, A., Hahn, R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).
  26. Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
  27. Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
  28. Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
  29. Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
  30. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
  31. Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
  32. Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
  33. Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  34. Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).

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जैव रसायन अंक 119 एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी संरचना निर्धारण कुंडलित-कुंडल प्रोटीन रो-काइनेज Shroom
संयोजन गीले और सूखे प्रयोगशाला तकनीकों बड़े दबाई-तार युक्त प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण गाइड करने के लिए
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