Introduction
determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X ha dato un contributo fondamentale a tutti i campi della biologia moderna; fornendo una vista atomico delle macromolecole che sostengono la vita e come interagiscono tra loro in una varietà di contesti; che ci permette di comprendere i meccanismi che causano la malattia e che offrono opportunità di progettare razionalmente farmaci per il trattamento della malattia. Cristallografia è stata a lungo la tecnica sperimentale dominante per determinare la struttura macromolecolare, che rappresentano attualmente il 89,3% della base di dati strutturale (www.rcsb.org). Questa tecnica ha molti vantaggi, compreso il potenziale molto alta risoluzione, la capacità di visualizzare macromolecole con una vasta gamma di dimensioni, di relativamente facile raccolta dei dati, e la possibilità di visualizzare come macromolecola interagisce con solventi e leganti.
Nonostante i numerosi miglioramenti tecnologici nel espressione della proteina ricombinante 1,2, purification 3, e della biologia molecolare utilizzato per generare questi sistemi 4, il vero grande ostacolo nel processo cristallografica rimane la capacità di crescere cristalli di qualità diffrazione. Questo è stato particolarmente vero per le proteine che contengono domini di grandi dimensioni avvolto a spirale. E 'stato stimato che ben il 5% di tutti gli aminoacidi si trovano all'interno di bobine a spirale 5,6, rendendo questa una caratteristica strutturale molto comune 7, eppure queste proteine sono spesso più difficili da purificare e cristallizzare di proteine globulari 8-10 . Questo è ulteriormente aggravato dal fatto che i domini coiled-coil trovano spesso nel contesto di una proteina più grande, quindi prevedere correttamente i confini di questi domini è fondamentale per evitare l'inclusione di sequenza non strutturata o flessibile che spesso è dannosa per la cristallizzazione.
Qui vi presentiamo un quadro concettuale che unisce web-based computazionale analisi con Experimental dati dalla panchina, per aiutare gli utenti di guida attraverso le fasi iniziali del processo cristallografica, tra cui: Come selezionare frammento di proteina (s) per studi strutturali, e come preparare e caratterizzare campioni di proteine prima di tentativi di cristallizzazione. Ci concentriamo la nostra analisi su due proteine contenenti domini di grandi dimensioni avvolto a spirale, Shroom (SHRM) e Rho-chinasi (Rock). Queste proteine sono stati scelti come entrambi contengono domini coiled-coil e sono noti per formare un complesso biologicamente rilevante 11-16. Shroom e Rho-chinasi (Rock) sono previsti per contenere rispettivamente ~ 200 e 680 residui di avvolto a spirale, molte parti della quale sono state caratterizzate strutturalmente 17-20. Il metodo qui descritto fornisce un flusso di lavoro per identificare rapidamente frammenti di coiled-coil contenenti proteine che saranno suscettibili per la cristallizzazione, tuttavia, le tecniche descritte possono essere facilmente adattati per la maggior parte della proteina o proteina complessi o modificati per incorporare high-throughput avvicinamenches come disponibili. Infine, questi metodi sono generalmente poco costosi e possono essere eseguite dagli utenti a quasi tutti i livelli di esperienza.
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Protocol
NOTA: Un diagramma del quadro concettuale o workflow è descritta nella figura 1 per riferimento. Il protocollo può essere suddiviso in quattro fasi: previsioni basate computazionali o di sequenza, di espressione proteica e purificazione, caratterizzazione biochimica e cristallizzazione. Gli esempi mostrati analizzano domini Shroom SD2 e / o complessi Shroom-rock, ma possono essere utilizzati con qualsiasi proteina.
1. Utilizzare Fondata strumenti basati sul Web per generare previsioni computazionali di dominio confini avvolto a spirale
- Raccogliere un Set evolutivo vario di sequenza omologhi.
- Vai a www.uniprot.org e digitare Shroom nella barra di ricerca in alto.
- Selezionare le sequenze di scaricare selezionando la casella accanto al loro numero di registrazione. Sequenze con una stella indicano sequenze recensiti da UniProt e sono generalmente più affidabili. Fare attenzione a garantire che tutte le sequenze sono complete e accurate.
- Salvare le s selezionatiequences facendo clic sul pulsante Download.
- Allineare la raccolta di sequenze Shroom usando Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Fare clic sul pulsante "Sfoglia" per selezionare il file con le sequenze Shroom e poi premere Invia.
- Dopo l'allineamento è completo, fare clic sul pulsante "Scarica Allineamento file".
- Aprire la allineamento di sequenze multiple generate in 1.1.5 usando jalview (File | ingresso di allineamento | Da file). All'interno della nuova finestra di allineamento, il colore per identità (colore | Percentuale di identità).
- Calcolare le previsioni di struttura secondaria, previsioni di sequenza flessibile o disordinato, e previsto regioni avvolto a spirale all'interno della proteina (s) di interesse.
- Vai a http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, per calcolare le previsioni avvolto a spirale. Copiare e incollare la sequenza nella casella Sequence e fare clic su Invia.
NOTA: Questa analisi può richiedere un paio d'ore di compLete. Dal momento che le sequenze Shroom sono abbastanza grandi, possono avere bisogno di essere diviso in blocchi di meno di 1.000 aminoacidi per rientrare nel vincolo dimensioni del server web le sequenze. Nell'analizzare Shrm2, si raccomanda che gli acidi C-terminale 1,000 aminoacidi sono usati come questa sezione contiene il dominio SHRM SD2 che è noto per contenere regioni coiled-coil. Ripetendo questa analisi con altre proteine, si raccomanda di utilizzare le sequenze di proteine integrali quando possibile. Se questo non è un'opzione, utilizzare il più grande frammento possibile o sezionare la sequenza in base ai dati biochimici e funzionali noti. - Vai a http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, per calcolare le previsioni avvolto a spirale. Copiare e incollare la sequenza nella casella Sequence e fare clic su Invia.
- Vai a http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, per calcolare le previsioni avvolto a spirale. Copiare e incollare la sequenza nella casella Sequence e fare clic su Invia.
- Combinare i risultati delle fasi 1.1 a 1.2.2 in un'unica annotazione completa della sequenza Shroom.
NOTA: E 'altamente incoraggiati a includere anche qualsiasi e tutti i rilevantinformazioni che si può ricavare dalla letteratura o da altre fonti circa la funzione delle proteine o di purificazione in questa fase. - Utilizzando questa sequenza annotata completa, prevedere dominio confini (o una serie di possibili confini) per la proteina, cercando di massimizzare conservazione e predetto caratteristiche strutturali minimizzando la quantità di successione disordinata o flessibile. Se noto, la proteina risultante dovrebbe mantenere le proprietà funzionali di interesse.
2. espresso e purificare proteine con i confini del dominio indicata nella sezione 1
NOTA: L'obiettivo di questa sezione è quello di utilizzare una serie di test rapidi e facilmente quantificabili per lo screening confini del dominio ipotetici generati nella sezione 1.
- Usando tecniche standard di biologia molecolare, generare un plasmide di espressione con la sequenza codificante desiderata nel frame all'interno della sua 10 -mRuby2-XH2 plasmide (vedere Figura 3 per la mappa vettoriale unND ulteriori dettagli).
- I livelli di espressione di test per ogni plasmide di espressione usando BL21 (DE3) E. coli o di altro idoneo ceppo di espressione nei mezzi di autoinduzione 1 a temperatura ambiente per 18-24 ore.
- Trasforma plasmidi di espressione, nonché un controllo plasmide vuoto in BL21 (DE3) seguendo le istruzioni fornite con le cellule o utilizzando robusto protocollo di trasformazione, come quella qui (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -trasformazione/).
- Dal piatto appena trasformato, scegliere una singola colonia e far crescere una cultura di avviamento 5 ml a 37 ° C durante la notte in lisogenia Broth (LB) media con 34 ug / ml kanamicina.
- Il giorno seguente, pellet la cultura e lavare il pellet con LB. fresco
- Aggiungere la coltura starter a 50 ml di mezzi di autoinduzione con 34 ug / ml kanamicina. Lasciare che la cultura di crescere alla saturazione sia a temperatura ambiente o 37 ° C. Tipicamente, crescere per ~ 18-24 ore.
- cell pellets e congelare i pellet cellulari risultanti a -80 ° C indefinitamente prima purificazione.
- Confronto estratti di cellule intere da ogni ceppo espressione e il controllo vettore vuoto mediante SDS-PAGE per determinare il ceppo che produce più efficiente della proteina di fusione desiderata. Per il suo 10 proteine di fusione -mRuby2-Shroom SD2, eseguire 10% gel SDS-PAGE a 180 V per ~ 50 minuti o fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel 22.
- Gel Stain con Coomassie Blu per visualizzare le proteine cellulari totali all'interno di ogni ceppo 23.
- Eseguire una fase iniziale cromatografia di affinità su ogni ceppo che ha espresso con successo proteina mRuby2-fusion. Tipicamente, eseguire i passaggi di purificazione 2.3.2-2.3.7 a temperatura ambiente, a meno che la proteina beneficerà mutate condizioni quali la depurazione a 4 ° C.
- pellet cellulari Scongelare dal punto 2.2.5.
- Risospendere ogni pellet di cellule in 1,5 ml di tampone di lisi (10% glicerolo, 500 mM NaCl, 40mM imidazolo, 20 mM Tris pH8.0, 1 mM beta-mercaptoetanolo). Integrare il tampone di lisi con inibitori della proteasi a seconda dei casi.
- Aggiungere 30 ml di 10 mg / ml di lisozima e incubare a temperatura ambiente per 20 min. Sonicare seguendo le istruzioni per lo strumento in uso.
- Trasferire in una provetta da 1,5 ml e centrifugare in una tabella centrifuga per 30 minuti a 14.000 xg per pellet materiale insolubile o cellule non lisate. Salvare sia il surnatante e pellet per la successiva analisi mediante SDS-PAGE.
- Eseguire la purificazione di nichel affinità, incubando la frazione solubile con 100 ml di perline Ni-NTA. Incubare le perline con lisato solubile per 5-10 minuti, invertendo più volte per mescolare perline.
- Centrifugare a 800 xg per 30 secondi in una centrifuga da tavolo per sedimentare le perline. Seguire questa lavando il pellet 3-5 volte con tampone di lisi per pulire contaminanti non specifici.
- Elute Rubino proteina di fusione dalle perline con tampone di lisi integrata con 1M imidazolo.
- Utilizzare SDS-PAGE per confrontare il comportamento dei Suoi-mRuby2-Shroom proteine nella purificazione "veloce e sporco" di cui sopra.
3. Caratterizzare proteine di esempio per identificare quelli con proprietà vantaggiose
- Utilizzare un set spettrofotometro a 280 nm per misurare la concentrazione della proteina di fusione rubino, e quindi valutare l'omogeneità del campione caricando 1-5 mg di proteina di fusione su un gel nativo PAGE 24. Eseguire il gel PAGE nativa 10% a 4 ° C per 140 min a 175 V.
- La pagina in immagine nativo utilizzando un imager dotato di visualizzare la fluorescenza, osservando dove la fusione mRuby-tag migra in questo saggio.
NOTA: Fare attenzione a rispettare proteina di fusione che è bloccato nel pozzo come questa proteina è probabile aggregato. Se un imager a fluorescenza non è disponibile, si può spesso visualizzare e campioni di immagini concentrato di Rubino tagged proteine sotto una luce nera o con una scatola di luce UV.
- La pagina in immagine nativo utilizzando un imager dotato di visualizzare la fluorescenza, osservando dove la fusione mRuby-tag migra in questo saggio.
- Eseguire proteolisi limitata per identificare domini stabilmente piegato. Incubare 95 ml di Ruby-SHRM SD2 fusione a ~ 1 mg / ml con 5 ml di 0,025% Subtilisina A.
- Campione la reazione in momenti di 0, 0,5, 2, 5, 15, 60, e 120 min, rimuovendo 10 microlitri dalla reazione per ciascun punto di tempo e visualizzando l'andamento della reazione tramite SDS-PAGE su gel di acrilammide 15% .
- Macchia con Coomassie blu come al punto 2.2.7 e valutare se una specie resistenti della proteasi possono essere identificati.
- Integrare dati da l'efficienza di purificazione, il comportamento in PAGE nativo, e proteolisi limitata sulle parzialmente purificate proteine di fusione mRuby2-Shroom in una valutazione globale del comportamento complessivo di queste proteine in soluzione.
- (Facoltativo) Se un test funzionale adatto è disponibile, verificare la presenza di attività a questo punto.
4. Produrre cristalli di alta qualità del coiled-coil SD2Dominio da Shroom
NOTA: tutte le iniziative in paragrafo 4.1 vengono eseguite a temperatura ambiente a meno che la proteina potrebbe beneficiare di purificazione ad una temperatura diversa, di solito 4 ° C.
- Utilizzando i 50 ml crescite come una stima approssimativa di espressione e di potenziale di purificazione, eseguire le espressioni su larga scala di mRuby2-Shroom SD2 con l'obiettivo di raggiungere 5-20 mg di campione completamente purificato. Tipicamente 2 L della cultura fornisce un adeguato materiale di partenza. Dopo che le cellule di crescita pellet per centrifugazione a 8.000 xg per 10 min.
- Risospendere il pellet dalla crescita 2 L in tampone di lisi come prima, utilizzando ~ 2 ml di lisi per grammo di pellet congelato se si utilizza il lisozima per lisi. In alternativa, risospendere in ~ 8 ml / g di pellet se si utilizza un omogeneizzatore o di stampa francese. Pellet detriti cellulari mediante centrifugazione a 30.000 xg per 30 min.
- Batch impegna la frazione solubile da 4.1.1 utilizzando 10 ml di resina Ni-NTA. Versare in colonna gravità del casoe permettono proteine non legate a sgocciolare.
- Lavare resina 3-5 volte con 40 ml di tampone di lisi, seguita da un lavaggio con tampone di lisi integrato a 1 M NaCl.
- resina lavata con 40 ml di tampone di lisi supplementato con 80 mM imidazolo.
- Eluire la proteina di fusione Ruby-Shroom con 40 ml di tampone di lisi integrate per 1 M imidazolo. frazionare manualmente la proteina eluita in 4-10 ml frazioni.
- Confermare frazioni contenenti Ruby-Shroom proteina di fusione con il 10% SDS-PAGE.
- Dializzare frazioni appropriate (in genere frazioni 2-4) in 8% glicerolo, 250 mM NaCl, 15 mM imidazolo, 20 mM Tris pH8.0, 1 mm β-ME, utilizzando 6-8 kDa MWCO tubi di dialisi. Aggiungere 1 mg di TEV proteasi per ogni 25-50 mg di proteina di fusione. Dializzare notte a temperatura ambiente con lenta agitazione.
- Ripetere la purificazione nichel affinità passi 4.1.2. a 4.1.6. Il dominio Shroom SD2 dovrebbe ora rimanere nella frazione non legata mentre il suo 10 -mRuby2 rimarrà legato ala resina e si trovano nelle frazioni di eluizione. Confermare con il 12% di colorazione SDS-PAGE con Coomassie blu.
- Dializzare frazioni contenenti dominio Shroom SD2 in 8% glicerolo, 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM tampone beta-mercaptoetanolo durante la notte.
- Eseguire anionico cromatografia a scambio 25 tramite un FPLC, ed eluendo con un gradiente di NaCl dal 0.1-1.0 M NaCl. Analizzare le frazioni con il 12% SDS-PAGE.
- Utilizzando un concentratore di spin (MWCO di 10 kDa o maggiore a seconda della proteina studiata), concentrato frazioni di picco a ~ 0 mg / ml, e quindi eseguire cromatografia ad esclusione sterica 26, analizzando frazioni di picco con il 12% SDS-PAGE.
- Pool frazioni di picco e Dializzare in 20 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 2% glicerolo, 1 mM β-ME, e si concentrano a 10 mg / ml prima cristallizzazione.
Opzionale: Durante questa fase, rimuovere 5 campioni microlitri a concentrazioni di 1, 2, 5 e 10 mg / ml nel corso della concentrazione del campione.Eseguire un nativo di caricamento delle pagine 2-5 ml di ogni campione a guardare il comportamento del campione durante questa fase.
- Schermo una piccola serie di 12 condizioni per identificare una concentrazione proteica ottimale per prove di cristallizzazione. La composizione di queste condizioni è descritto nella Figura 7.
- Utilizzando 24-well seduta vassoi cristallizzazione goccia, eseguire prove di cristallizzazione utilizzando il metodo di diffusione del vapore, pipettaggio 500 ml di ciascuna delle 12 condizioni in pozzetti separati seguiti da gocce che inizialmente contenenti 1 ml di soluzione ben e 1 ml di campione proteico sui vetrini . Vedere 27 per ulteriori informazioni su questa tecnica.
- Chiudere immediatamente il vassoio con nastro adesivo trasparente e spostare il vassoio per un ambiente a temperatura controllata adatto che è privo di vibrazioni. La temperatura utilizzata può variare, ma 4 ° C, 16 ° C e 20 ° C sono abbastanza comuni.
- Esaminare le gocce nei vassoi per il prossimo 3 dAYS utilizzando un microscopio fino a ingrandimento 100X. Alla fine del periodo di 3 giorni, segnare ogni goccia come contenete senza precipitazione (chiaro), precipitazione luce, precipitazioni pesanti (marrone), o cristalli. Una concentrazione proteica adatto dovrebbe contenere non più di 6 precipitazioni pesanti.
- Utilizzando la concentrazione proteina identificata in 4.2, programmare una vasta gamma di schermi cristallizzazione disponibili in commercio. L'uso di una manipolazione o cristallizzazione robot liquido accelera notevolmente questo processo riducendo al minimo errore nelle gocce. Esso richiede molto meno proteine pure, permettendo all'utente di schermo più condizioni con un singolo campione.
- Migliorare le condizioni iniziali individuati dagli schermi ampi variando sistematicamente ciascuna delle variabili all'interno della goccia di cristallizzazione con 24 pozzetti vassoi di screening come prima.
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Representative Results
Un diagramma raffigurante il workflow utilizzato in questo sistema è mostrato in figura 1 e comprende tre fasi principali. analisi computazionale della sequenza è utilizzato per sviluppare ipotesi circa i confini dominio della proteina coiled-coil di interesse. Un esempio di analisi annotata del dominio Shrm2 SD2 è mostrato in Figura 2. In questo schema, l'obiettivo era quello di individuare possibili confini del dominio per un dominio conservato presso il C-terminale del regolatore del citoscheletro Shroom chiamato SD2. Da questa analisi è stato tre gruppi distinti di dominio confini ipotetici sono stati generati contenenti frammenti doppia spiralizzazione che abbracciano l'intero conservato SD2 o frammenti minimi in prossimità del C-terminale che ha finito per come i migliori candidati per la cristallizzazione. I candidati identificati dall'analisi di sequenza vengono poi rapidamente testati in scala ridotta utilizzando una proteina di fusione con mRuby2 (Figura 3) for analisi efficiente. Piccola scala rappresentante (50 ml di cultura) purificazioni da due suoi 10 proteine -mRuby2-targhette sono mostrati in Figura 4. In questa figura, il comportamento di una proteina insolubile è evidente rispetto al suo omologo solubile. Mal esprimere o fusioni di proteine insolubili sono facilmente e rapidamente identificate in questo modo. Analisi biochimiche di frammenti proteici di proteolisi limitata sono mostrati in Figura 5 per una varietà di frammenti utilizzando appassire sistema rubino descritto o con i domini isolati e purificati Shroom SD2. In Figura 5A, due varianti di topo SHRM SD2 corrispondente al dominio confini ipotetici # 2 e # 1 in figura 3 sono stati digeriti con un gradiente di concentrazione di proteasi da (0-1,0%) per 30 min a temperatura ambiente. Entrambi di questi sono stati effettivamente degradati in una serie di prodotti più piccoli a concentrazioni enzimatiche moderate. La figura 5B mostra il same esperimento eseguito utilizzando ipotetico confine # 3 da Drosophila SHRM SD2. Questa proteina si cristallizza e la sua struttura è stata descritta 19. Analisi proteolitici può essere utile anche in sede di esame Ruby-fusioni come generato dal protocollo di cui sopra. Come mostrato in Figura 5C, una proteina di fusione rubino con umana Shrm2 SD2 (1427-1610) è stato digerito con un'alta concentrazione (0,025%) del non-specifica subtilisina proteasi a temperatura ambiente per i punti di tempo indicati. Qui il linker tra Ruby e SHRM è stato immediatamente scisso come ci si aspetterebbe. Inoltre, prodotti minori sono formate indicante questa proteina ha altre due regioni sensibili proteasi, tuttavia, i prodotti di degradazione che sono stati prodotti entro 2 min rimasti sostanzialmente intatto durante il resto dell'esperimento indica la proteina è in realtà abbastanza stabile.
Un approccio complementare è dimostrata utilizzando analys PAGE nativiè in Figura 6. Nella Figura 6A, Ruby-tagged umano SHRM SD2 (1427-1610) oltre che di proteine contenenti le mutazioni punto indicato all'interno SHRM sono analizzati da PAGE nativo. In questo esperimento, la proteina wild-type (che forma cristalli) viene eseguito come due bande distinte, mentre i tre mutanti che non cristallizzano hanno un comportamento notevolmente diverso. Per dimostrare che il sistema può anche essere utile su complessi proteici, una varietà di complessi Shroom-rock sono stati analizzati mediante PAGE nativa nella Figura 6B. In questo caso, lo stesso frammento di umana Shrm2 SD2 (1427-1610) è stato utilizzato per aiutare a chiarire l'analisi, mentre diversi frammenti di roccia umana sono stati utilizzati. Questo approccio ha suggerito che i complessi formati utilizzando rock 700-906 e 746-906 hanno più specie, erano smeary, e meno omogenea. Complessi utilizzano 788-906 sono stati migliorati, anche se non in modo drammatico, e questa specie è stato in grado di cristallizzare, anche se i cristalli hanno preso molte settimane per formare e connuto degradato proteine Rock. Complessi generati utilizzando roccia 834-913 formano una singola specie e più uniformi sul gel e prontamente cristallizzati durante la notte. La figura 7 mostra una serie di condizioni di cristallizzazione comuni utilizzati per informare sul comportamento del campione proteico in prove di cristallizzazione, e potrebbe essere usato generalmente con qualsiasi proteina. Idealmente, si otterrà un mix di condizioni chiare e precipitanti. Le proteine che non formano precipitati richiedono concentrazioni elevate o condizioni tamponanti più rigorose mentre quelli che precipitano in molte condizioni dovrebbe essere utilizzato ad una concentrazione proteica inferiore o con condizioni di buffering che promuovono proteina solubilità.
Figura 1: flusso di lavoro Diagramma. Un diagramma generalizzato raffigurante l'integrazione di analisi di sequenza computazionale e biochimica ealtre tecniche di laboratorio bagnato in una strategia globale per delineare i confini del dominio e di individuare frammenti di proteine per la cristallizzazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Annotated analisi della sequenza per il coiled-coil dominio SD2 da Shroom. Una sovrapposizione di calcolo di analisi per il dominio Shroom SD2, tra cui un allineamento di sequenze multiple generate da omega CLUSTAL e colorata da identità di sequenza all'interno jalview (Passo 1.1). Sono inclusi anche predetto struttura secondaria, le previsioni sequenza disordinati, e le previsioni a doppia spiralizzazione del dominio Shroom SD2 (Passo 1.2). confini ipotetico dominio (punto 1.3) sono indicati come lo sono i confini osservati e struttura secondariaElementi come rivelato dalla successiva analisi cristallografica 19. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Schema del suo sistema 10 -mRuby2-espressione. (A) Schema del vettore di espressione sua 10 -mRuby2-XH2 vettore utilizzato in questo studio. (B) Schema del sito di clonaggio multiplo di questo vettore. Proteine sequenze codificanti sono in genere inseriti in questo vettore via BamHI e EcoRI siti clonazione. L'estrema C-terminale della proteina mRuby2 è mostrato in rosso, il sito di clivaggio della proteasi TEV è indicato con staffe e con il sito di clivaggio mostrato come un triangolo rosso. Una sequenza linker tra la mRuby2 e il sito TEV è mostrato in ciano.Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rappresentante purificazioni scala ridotta di due mRuby2 tag proteine di fusione. (A) Un'immagine di campioni di batteri cultura espressione rubino SHRM SD2 o un estraneo proteina di fusione rubino noto per essere insolubile sono raffigurati. Una cultura separata che esprime una proteina senza Ruby-tag è mostrato per il confronto. (B) La frazione solubile dalle colture sopra sono stati impressi seguente lisi e centrifugazione a 30.000 xg per 30 min, dimostrando la visualizzazione di solubile rubino-SHRM SD2. (C) L'immagine delle perline Ni-NTA dopo il legame e le successive fasi di lavaggio indicano che Ruby-SHRM SD2 è stato immobilizzato sule perline. (D) campioni di lavaggio e di eluizione passaggi descritti nei passi 2.3.6 e 2.3.7 dimostrano che la fusione rubino SHRM SD2 rimane legato alla resina mentre in presenza di fino a 80 mM imidazolo ed è efficace eluito off colonna con tampone di eluizione 1 M imidazolo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: proteolisi limitata di candidati domini SD2 provenienti da diverse proteine Shroom. Un confronto di quattro domini SD2 da varie proteine Shroom. (A e B) I frammenti SHRM SD2 indicate sono state incubate con un gradiente di concentrazione della tripsina della proteasi 0 1,0% ei risultati analizzati mediante SDS-PAGE. Il rapporto di quel frammento di proteina ingegnoh i confini ipotetici sono indicati. Analisi (C) SDS-PAGE di limitata digestione proteolitica dei suoi 10 -mRuby2-Shroom SD2 proteina di fusione con il metodo corso tempo descritto nel protocollo. La reazione si è verificato con 0,025% tripsina a temperatura ambiente. Digestione del linker tra Ruby e Shroom SD2 è rapido e serve come controllo interno. Un prodotto di degradazione presume che co-purifica con la sua 10 proteina di fusione -mRuby2-Shroom SD2 è indicato (*). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Osservando i cambiamenti nel comportamento delle proteine usando il gel nativo. (A) 10% PAGE nativa dimostrare l'effetto di un mutante che modifica le proprietà di mRuby2-Shroom SD2. In queste condizioni SHRM SD2 viene eseguito come due bande discrete, mentre i mutanti punto indicato all'interno del SD2 mostrano una serie di modelli di migrazione aberranti. (B) Un confronto di complessi Shroom SD2-roccia formata utilizzando diverse versioni di roccia e analizzati da PAGE nativo. Complessi tra Shroom SD2 e frammenti indicati of Rock chinasi (entrambe le proteine a doppia spiralizzazione) sono stati risolti PAGE nativo. I cristalli sono stati ottenuti per il complesso contenente roccia 788-906 dopo molte settimane, ma complesso contenente roccia 834-913 cristallizzate rapidamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: schermata principale rapido per la cristallizzazione. (A) Un rapido dello schermo di comune cristallizzazione colli operativi viene utilizzato per valutare il comportamento del campione proteico in prove di cristallizzazione. (B) Esempi di semplice matrice di punteggio per valutare gocce di cristallizzazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto è stato progettato per aiutare l'utente a identificare i confini del dominio all'interno di grandi proteine avvolto a spirale per facilitare la loro cristallizzazione. Il protocollo si basa su una incorporazione olistica di una varietà di dati da predizioni computazionali ed altre fonti per generare una serie di potenziali dominio confini. Seguono una serie di esperimenti biochimici che sono veloce e poco costoso, e che sono utilizzati per raffinare ulteriormente queste ipotesi iniziali. Usando questo approccio, l'utente potrebbe eliminare rapidamente potenziali frammenti di proteine che sono indesiderabili, e concentrarsi maggiormente l'attenzione sui candidati migliori, migliorando in tal modo le prospettive di ottenere cristalli.
Ci sono molti passi importanti in questa tecnica, tuttavia, nessuno come critica per la produzione di cristalli come lo sviluppo del set iniziale di dominio confini ipotetiche. Questo passaggio incorpora una varietà di approcci computazionali, nonché informazioni obnuto dalla letteratura o dati funzionali se disponibili. Si deve prestare attenzione per evitare di utilizzare la strategia per affinare immediatamente verso la singola soluzione "migliore", come non esiste attualmente alcun metodo in atto per collegare un valore di confidenza quantificabile a qualsiasi delle previsioni. Invece, è meglio utilizzato come metodo per identificare rapidamente un piccolo insieme di possibili dominio confini che devono essere verificato sperimentalmente.
Le proprietà delle proteine a doppia spiralizzazione, che possono essere analizzati con questo protocollo sono abbastanza ampio. Dal punto di vista computazionale, la forza di previsioni avvolto a spirale è limitata al di sotto di 20 aminoacidi, e come detto al punto 1.2.1, le regioni avvolto a spirale più grande di 1.000 amminoacidi dovrebbe essere suddiviso in più sezioni per l'analisi DISOPRED. Riteniamo che questa limitazione più tardi come temporanea in quanto è imposta dal server web e può cambiare come il metodo viene aggiornato in futuro. La successiva analisi biochimica tuttavia, può soffrirein vari modi. In primo luogo, loop o regioni ipersensibili alle proteasi possono rendere il campione interni sembrano essere meno stabile di quanto non sia in realtà. proteine stabili che sono spaccati loop o sono comunque rovinati dalla proteasi devono ancora dare un aspetto stabile a pagina nativo, che è il motivo per cui si raccomanda che l'utente esplorare entrambe le strategie. PAGE nativa può essere difficile per alcune proteine, tuttavia, sia perché sono molto lunghi e migrano lentamente in gel o perché la loro carica particolare può farli funzionare direzione opposta su gel interamente. In questi casi, può essere utile per esplorare diverse condizioni di buffer per il sistema gel PAGE nativa.
Mentre il focus del lavoro qui presentato è stato in grandi avvolto a spirale contenenti proteine, questo protocollo può essere utilizzato per quasi tutte le proteine con pochissimi adattamenti. L'aggiunta primaria per proteine globulari sarebbe l'aggiunta di software dominio previsione come pDomTHREADER 28 </ sup> o DomPred 29 da cercare i confini del dominio, e del terziario predizione della struttura, come Phyre2 30 per migliorare il potere predittivo della analisi di sequenza. Inoltre, ci sono molti algoritmi disponibili per l'esecuzione di predizione della struttura secondaria e predizioni disordinati, e l'inclusione di algoritmi aggiuntivi potrebbero essere utili. proteine globulari spesso possiedono attività enzimatica o altre letture funzionali che potrebbero fornire importanti informazioni aggiuntive durante la selezione di destinazione. Inoltre, le tecniche moderati o high-throughput possono essere incorporati a seconda dei casi. Ad esempio, i sistemi economici per 1-2 ml culture e purificazioni metallo affinità nei formati 96 pozzetti sono facilmente disponibili 31. Infine, l'uso della robotica per la creazione di un gran numero di esperimenti di cristallizzazione utilizzando campione minimo sta diventando di routine, ma il funzionamento efficiente dei sistemi robotici si basa sul comportamento dei campioni di proteine ben caratterizzati. aggiuntaAl modifiche a questo protocollo potrebbe includere la campionatura una varietà di tag di affinità. Molti tag fluorescenti differenti sono disponibili, o historisches, GST-, Thioredoxin-, Strep- e MBP- sono tra decine di opzioni disponibili, se un tag fluorescenti non è necessario o utile.
Quando si esegue questa procedura, l'utente deve essere consapevole degli effetti che il tag mRuby2 potrebbe avere sulla proteina di interesse degli utenti. Prove aneddotiche di utilizzare questo tag su una varietà di diverse fusioni supporta il fatto che mRuby2 talvolta legare in maniera strettamente alla proteina di interesse, rimanendo vincolato attraverso molteplici passaggi cromatografici. Questo comportamento è ovviamente auspicabile, ma non intenzionali di Ruby complessi di solito può essere separato e rimosso cromatograficamente. Non è chiaro se si tratta di un comportamento chaperone simile a come è stato osservato per MBP 32.
Dopo aver ottenuto i cristalli, ci sono ancora molte sfide che sono comunemente affrontate con COIproteine led-coil che non vengono affrontati in questo protocollo. Il più comune è di scarsa qualità di diffrazione, sia a causa di formato imperfettamente reticoli o anisotropico diffrazione. Ci sono strumenti in atto per assistere con anisotropico di diffrazione 33, e questi sono stati critici per la risoluzione di alcune strutture avvolto a spirale 18,20. Molte patologie cristallo sono purtroppo difficili da superare rapidamente, quindi è spesso prudente cercare forme cristalline supplementari con proprietà di diffrazione migliorate. Ciò è facilitato dallo screening robotizzato di migliaia di condizioni. In alternativa ci sono molte tecniche di post-cristallizzazione per migliorare la qualità di diffrazione, come la disidratazione, o semina 34.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
References
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