Introduction
Structuurbepaling via röntgenkristallografie heeft fundamentele bijdragen aan elk gebied van de moderne biologie gemaakt; verschaffen van een atomaire aanzicht van de macromoleculen die het leven en hoe zij met elkaar in diverse situaties; zodat we de mechanismen die leiden tot de ziekte en het bieden van mogelijkheden om rationeel ontwerpen van geneesmiddelen voor de behandeling van de ziekte te begrijpen. Kristallografie is al lange tijd de dominante experimentele techniek voor het bepalen van macromoleculaire structuur, en op dit moment goed voor 89,3% van de structurele database (www.rcsb.org). Deze techniek heeft vele voordelen, waaronder de mogelijkheden voor hoge resolutie, de mogelijkheid om macromoleculen te visualiseren met een breed scala aan formaten relatief eenvoudig gegevensverzameling, en de mogelijkheid te visualiseren hoe het macromolecuul interageert met oplosmiddel en liganden.
Ondanks talrijke technologische verbeteringen in recombinante eiwitexpressie 1,2, purification 3, en moleculaire biologie gebruikt om deze systemen 4, de grootste obstakel in het kristallografische proces te genereren blijft de mogelijkheid om diffractie kwaliteit kristallen groeien. Dit is vooral het geval geweest eiwitten die grote coiled-coil domeinen bevatten. Er wordt geschat dat zo'n 5% van alle aminozuren binnen coiled-coils 5,6, waardoor dit een zeer gemeenschappelijk structureel kenmerk 7, maar deze eiwitten zijn vaak moeilijk te zuiveren en kristalliseren dan globulaire eiwitten 8-10 . Dit wordt nog verergerd doordat coiled-coil domeinen vaak gevonden binnen de context van een groter eiwit, dus het correct voorspellen van de grenzen van deze domeinen is cruciaal voor het opnemen van ongestructureerde of flexibele sequentie die vaak schadelijk is voor kristallisatie te voorkomen.
Hier presenteren we een conceptueel raamwerk te combineren web-based computational analyses Experimental de gegevens van de bank, te begeleiden gebruikers te helpen door middel van de eerste stadia van het proces, inclusief kristallografische: hoe eiwitten fragment (en) voor structurele studies, en hoe voor te bereiden en te karakteriseren eiwit monsters voorafgaande aan kristallisatie pogingen te selecteren. We richten onze analyse van twee eiwitten met grote opgerolde-coil domeinen, Shroom (SHRM) en Rho-kinase (Rock). Deze eiwitten werden gekozen omdat ze allebei bevatten coiled-coil domeinen en is bekend dat biologisch relevante 11-16 complex vormen. Shroom en Rho-kinase (Rock) wordt voorspeld ~ 200 en 680 residuen van coiled-coil respectievelijk bevatten, veel waarvan gedeelten zijn structureel gekarakteriseerd 17-20. De hier beschreven methode heeft een gestroomlijnde workflow snel fragmenten van coiled-coil bevattend eiwit dat vatbaar is voor kristallisatie identificeren echter de beschreven technieken kunnen gemakkelijk worden aangepast voor de meeste eiwitten of eiwit-complexen of aangepast voor high-throughput approa incorporerenches zoals beschikbaar. Tenslotte zijn deze werkwijzen in het algemeen goedkoop en kan worden uitgevoerd door de gebruikers in bijna alle niveaus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Een schema van het conceptuele raamwerk of workflow wordt beschreven in figuur 1 voor referentie. Het protocol kan worden onderverdeeld in vier fasen: computational of sequentie gebaseerde voorspellingen, eiwitexpressie en zuivering, biochemische karakterisering en kristallisatie. De getoonde voorbeelden analyseren Shroom SD2 domeinen en / of Shroom Rock-complexen, maar kan worden gebruikt met elk eiwit.
1. Gebruik Gevestigde web-gebaseerde tools om Computational Voorspellingen van Coiled-coil Domain Grenzen Genereer
- Verzamel een Evolutionarily Diverse Set van Sequence Homologen.
- Ga naar www.uniprot.org en typ in Shroom in de bovenste zoekbalk.
- Selecteer sequenties te downloaden door het vakje naast hun toetreding nummer. Sequenties met een ster te geven sequenties beoordeeld door Uniprot en zijn over het algemeen betrouwbaarder. Let erop dat alle reeksen volledig en juist zijn.
- Sla de geselecteerde sequences door te klikken op de knop Downloaden.
- Lijn de collectie van Shroom sequenties met behulp van Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Klik op de knop "Browse" om het bestand met de Shroom sequenties te selecteren en druk op Verzenden.
- Nadat de uitlijning is voltooid, klikt u op de "Download Alignment File" knop.
- Open de multiple sequence alignment gegenereerd in 1.1.5 met behulp van Jalview (File | Invoer Alignment | Uit bestand). Binnen de nieuwe uitlijning venster, kleur door identiteit (kleur | Procent Identity).
- Bereken voorspellingen van secundaire structuur, voorspellingen van flexibel of wanordelijke sequentie en voorspelde coiled-coil regio's binnen het eiwit (s) van belang.
- Ga naar http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, om Opgerold-Coil voorspellingen te berekenen. Kopieer en plak de sequentie in de Sequence Box en klik op Verzenden.
LET OP: Deze analyse kan een paar uur duren complete. Aangezien Shroom sequenties vrij groot kunnen de sequenties moeten worden opgesplitst in blokken van minder dan 1000 aminozuren binnen de omvang beperking van de webserver te passen. Bij het analyseren van Shrm2, wordt aanbevolen dat de C-terminale 1000 aminozuren worden gebruikt, omdat dit gedeelte bevat de SHRM SD2 domein waarvan bekend is dat gewonden spiraal gebieden bevatten. Bij herhaling van deze analyse met andere eiwitten, is het raadzaam om het eiwit van volledige lengte sequenties gebruiken indien mogelijk. Als dat geen optie is, gebruik maken van de grootste fragment mogelijk of ontleden de volgorde op basis van bekende biochemische of functionele gegevens. - Ga naar http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, om Opgerold-Coil voorspellingen te berekenen. Kopieer en plak de sequentie in de Sequence Box en klik op Verzenden.
- Ga naar http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, om Opgerold-Coil voorspellingen te berekenen. Kopieer en plak de sequentie in de Sequence Box en klik op Verzenden.
- Combineer de resultaten van de stappen 1.1 tot 1.2.2 in één allesomvattende annotatie van het Shroom reeks.
LET OP: Het wordt sterk aangemoedigd om ook de enige en alle relevante i omvattennformatie die kan worden afgeleid uit de literatuur of andere bronnen over eiwitfunctie of zuivering in dit stadium. - Gebruik van deze uitgebreide geannoteerde sequentie voorspellen domeingrenzen (of een reeks mogelijke grenzen) voor eiwit, probeert behoud maximaliseren en voorspelde structurele kenmerken tegelijk de hoeveelheid ongeordende of flexibele sequentie. Als bekend is, moet het resulterende eiwit de functionele eigenschappen van belang te behouden.
2. Express en Zuiver Eiwitten met het Domain grenzen genoemd in paragraaf 1
LET OP: Het doel van deze sectie is een reeks snelle en eenvoudig te kwantificeren assays gebruiken om hypothetische domeingrenzen gegenereerd in deel 1 te screenen.
- Middels standaard moleculair biologische technieken, wordt een expressieplasmide met de gewenste coderende sequentie in het raamwerk in de His 10 -mRuby2 XH2-plasmide (zie figuur 3 voor een vector mapnd aanvullende informatie).
- Test expressieniveaus voor elk expressieplasmide via BL21 (DE3) E. coli of andere geschikte expressiestreng in zelfinductie media 1 bij kamertemperatuur gedurende 18-24 uur.
- Transformeer expressieplasmiden evenals een lege plasmide controle in BL21 (DE3) volgens de instructies die met de cellen kwam of het gebruik van robuuste transformatie protocol, zoals die hier (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -transformation /).
- Vanaf de vers getransformeerd plaat, kies een enkele kolonie en te groeien van een 5 ml startercultuur bij 37 ° C gedurende de nacht in lysogenie bouillon (LB) media met 34 ug / ml kanamycine.
- De volgende dag, pellet de cultuur en was de pellet met verse LB.
- Voeg de starter cultuur tot 50 ml autoinductie media met 34 ug / ml kanamycine. Laat de kweek te groeien tot verzadiging bij ofwel kamertemperatuur of 37 ° C. Gewoonlijk groeien ~ 18-24 uur.
- pellet cels en vries de resulterende celpellets bij -80 ° C voor onbepaalde tijd voorafgaand aan zuivering.
- Vergelijk volledige celextracten van elkaar expressiestreng en de lege vectorcontrole door SDS-PAGE om de stam die het meest efficiënt produceert het gewenste fusie-eiwit te bepalen. Zijn 10 -mRuby2-Shroom SD2 fusieproteïnen, run 10% SDS-PAGE-gels bij 180 V ~ 50 minuten of totdat het kleurstoffront de onderkant van de gel 22 bereikt.
- Vlek gel met Coomassie Blue aan totale cellulaire eiwitten te visualiseren binnen elke stam 23.
- Voer een eerste affiniteitschromatografie stap op iedere soort die succesvol tot expressie mRuby2-fusieproteïne. Gewoonlijk voeren zuiveringsstappen 2.3.2-2.3.7 bij kamertemperatuur, tenzij het eiwit kunnen gebruikmaken van veranderde omstandigheden, zoals zuivering bij 4 ° C.
- Dooi celpellets uit stap 2.2.5.
- Resuspendeer elke cel pellet in 1,5 ml lysis buffer (10% glycerol, 500 mM NaCl, 40mM imidazool, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM beta-mercaptoethanol). Supplement de lysisbuffer met proteaseremmers indien nodig.
- Voeg 30 ul van 10 mg / ml lysozym en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Ultrasone trillingen volgens de instructies voor het instrument wordt gebruikt.
- Over in een 1,5 ml buis en centrifugeer in een tafelblad centrifuge gedurende 30 minuten bij 14.000 xg onoplosbare materiaal of niet-gelyseerde cellen te pelleteren. Bespaart bovendrijvende en pellet voor verdere analyse via SDS-PAGE.
- Voer nikkel affiniteitszuivering, incuberen van de oplosbare fractie met 100 pl Ni-NTA-parels. Incubeer de kralen met oplosbare lysaat gedurende 5-10 min, herhaaldelijk omkeren kralen te mengen.
- Centrifugeren bij 800 g gedurende 30 seconden in een tafelblad centrifuge om de kralen te pelleteren. Volg deze door het wassen van de pellet 3-5 maal met lysisbuffer om niet-specifieke verontreinigingen schoon te maken.
- Elueer Ruby fusie-eiwit van de bolletjes met lysis buffer aangevuld met 1M imidazool.
- Gebruik SDS-PAGE om het gedrag van His-mRuby2-Shroom eiwitten te vergelijken in de "quick and dirty" zuivering hierboven.
3. karakteriseren Protein Sample om Degenen met voordelige eigenschappen te identificeren
- Gebruik een spectrofotometer ingesteld op 280 nm en de concentratie van de Ruby fusieproteïne meten en beoordelen van de homogeniteit van het monster door het laden van 1-5 ug fusieproteïne op een natief PAGE gel 24. Voer het 10% inheemse PAGE gel bij 4 ° C gedurende 140 minuten bij 175 V.
- Het imago van de inheemse PAGE met behulp van een imager uitgerust om fluorescentie te visualiseren, observeren waar de mRuby-tag fusie migreert in deze test.
LET OP: Wees voorzichtig om fusie-eiwit dat zit vast in de put omdat dit eiwit wordt waarschijnlijk samengevoegd observeren. Als een fluorescentie imager niet beschikbaar is, kan men vaak zichtbaar beeld en geconcentreerde monsters Ruby gelabeld eiwit onder een zwart licht of een UV lichtbak.
- Het imago van de inheemse PAGE met behulp van een imager uitgerust om fluorescentie te visualiseren, observeren waar de mRuby-tag fusie migreert in deze test.
- Voer beperkte proteolyse stabiele gevouwen domeinen te identificeren. Incubeer 95 ui Ruby-SHRM SD2 fusie bij ~ 1 mg / ml met 5 gl van 0,025% subtilisine A.
- Proef de reactie op tijdstippen van 0, 0,5, 2, 5, 15, 60 en 120 min, het verwijderen van 10 gl van de reactie voor elk tijdstip en visualiseren van de voortgang van de reactie via SDS-PAGE onder toepassing van een 15% acrylamidegel .
- Kleuren met Coomassie Blue volgens stap 2.2.7 en beoordelen of een protease resistente soorten kunnen worden geïdentificeerd.
- Integreer gegevens van de zuivering efficiëntie, het gedrag in de moedertaal PAGE, en beperkte proteolyse op het gedeeltelijk gezuiverd mRuby2-Shroom fusie-eiwitten in een uitgebreide evaluatie van het algemene gedrag van deze eiwitten in oplossing.
- (Optioneel) Als een geschikte functionele test beschikbaar is, controleren of de activiteit op dit punt.
4. produceren van hoge kwaliteit Kristallen van de gewonden spiraal SD2Domein uit Shroom
Opmerking: Alle stappen in sectie 4.1 wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij het eiwit zouden profiteren van de reiniging bij een andere temperatuur, meestal 4 ° C.
- Met behulp van de 50 ml gezwellen als een ruwe schatting van meningsuiting en zuivering potentieel, uit te voeren op grote schaal uitingen van mRuby2-Shroom SD2 met als doel het bereiken van 5-20 mg van volledig gezuiverd monster. Normaal 2 L van cultuur biedt voldoende uitgangsmateriaal. Na groei pellet cellen door centrifugeren bij 8000 xg gedurende 10 min.
- Resuspendeer de pellet van de 2 L groei van lysisbuffer zoals tevoren, met behulp ~ 2 ml lysis per gram bevroren celpellet bij gebruik van lysozym voor lysis. Als alternatief, resuspendeer bij ~ 8 ml / g pellet bij gebruik van een homogenisator of Franse pers. Pellet celresten via centrifugatie bij 30.000 xg gedurende 30 min.
- Batch binden de oplosbare fractie van 4.1.1 10 ml Ni-NTA hars. Giet het mengsel in geschikte zwaartekracht kolomen laat ongebonden eiwitten af te voeren.
- Wassen hars 3-5 maal met 40 ml lysis buffer, gevolgd door een wassing met lysisbuffer aangevuld met 1 M NaCl.
- Wassen hars met 40 ml lysis buffer gesupplementeerd met 80 mM imidazool.
- Elueer het Ruby-Shroom fusie-eiwit met 40 ml lysis buffer aangevuld tot 1 M imidazol. Handmatig fractioneren het geëlueerde eiwit in 4-10 ml fracties.
- Bevestigen fracties die Ruby-Shroom fusieproteïne middels 10% SDS-PAGE.
- Dialyseren geschikte fracties (gewoonlijk fracties 2-4) in 8% glycerol, 250 mM NaCl, 15 mM imidazool, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM β-ME, gebruik 6-8 kDa MWCO dialyseslang. Voeg 1 mg TEV protease voor elke 25-50 mg fusieproteïne. Dialyseer overnacht bij kamertemperatuur onder langzaam roeren.
- Herhaal nikkel affiniteitszuivering stappen 4.1.2. naar 4.1.6. De Shroom SD2 domein moet nu blijven in de ongebonden fractie, terwijl de His 10 -mRuby2 gebonden blijven aanen de hars wordt in de elutiefracties. Bevestigen middels 12% SDS-PAGE kleuring met Coomassie Blue.
- Dialyseren fracties die Shroom SD2 domeinnaam in 8% glycerol, 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM beta-mercaptoethanol buffer 's nachts.
- Voer anionenuitwisselingschromatografie 25 met een FPLC en geëlueerd met een NaCl gradiënt 0,1-1,0 M NaCl. Analyseer fracties middels 12% SDS-PAGE.
- Via een spin concentrator (MWCO van 10 kDa of meer, afhankelijk van het eiwit werd onderzocht), concentreer piekfracties tot ~ 0 mg / ml, en voer gelpermeatiechromatografie 26, analyseren piekfracties via 12% SDS-PAGE.
- Zwembad piekfracties en dialyze in 20 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 2% glycerol, 1 mM β-ME, en concentreer tot 10 mg / ml voorafgaand aan kristallisatie.
Optioneel: Tijdens deze stap verwijdert 5 ul monsters in concentraties van 1, 2, 5 en 10 mg / ml tijdens het concentreren van het monster.Voer een natieve PAGE loading 2-5 pi van elk monster te kijken naar het gedrag van het monster tijdens deze stap.
- Screenen van een kleine reeks 12 voorwaarden voor een optimale eiwitconcentratie identificeren kristallisatie trials. De samenstelling van deze voorwaarden beschreven in figuur 7.
- Gebruik 24 putjes zit druppel kristallisatie trays Voer kristallisatie proeven met de damp diffusie methode pipetteren 500 pi van elk van de 12 omstandigheden in afzonderlijke putjes gevolgd door druppels die aanvankelijk bevatten 1 pl goed oplossing en 1 pl eiwitmonster op dekglaasjes . Zie 27 voor meer informatie over deze techniek.
- Snel sluit de lade met duidelijke tape en zet de lade om een geschikte temperatuur gecontroleerde omgeving die trillingsvrij. De toegepaste temperatuur kan variëren, maar 4 ° C, 16 ° C en 20 ° C zijn vrij algemeen.
- Onderzoek de druppels in de bakken in de komende 3 degen behulp van een microscoop bij tot 100X vergroting. Aan het eind van de 3-daagse periode, scoren elke druppel als die geen neerslag (duidelijke), lichte neerslag, zware neerslag (bruin), of kristallen. Een geschikte eiwitconcentratie mag niet meer dan 6 zware neerslag bevatten.
- Met de eiwitconcentratie die in 4,2, screenen van een groot aantal commercieel verkrijgbare kristallisatie schermen. Het gebruik van een vloeistofverwerking of kristallisatie robot aanzienlijk versnelt dit proces maar ook geminimaliseerd fout in de druppels. Het vereist veel minder eiwit ook, zodat de gebruiker meer condities screenen met een enkel monster.
- Verbetering van de initiële voorwaarden geïdentificeerd uit brede schermen door het systematisch variëren van elk van de variabelen in de kristallisatie neer te zetten in 24-well screening trays als voorheen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een diagram dat de werkstroom gebruikt in dit systeem wordt getoond in figuur 1 en omvat drie hoofdfasen. Geautomatiseerde analyse van de sequentie wordt gebruikt om hypotheses over het domein grenzen van het coiled-coil eiwit van belang te ontwikkelen. Een voorbeeld van een analyse van de geannoteerde Shrm2 SD2 domein is getoond in figuur 2. In dit diagram, was het doel om mogelijke domeingrenzen identificeren een geconserveerd domein aan de C-terminus van het cytoskelet regulator Shroom genoemd SD2. Uit deze analyse was drie aparte reeksen hypothetische domeingrenzen gegenereerd die gewonden spiraal die fragmenten die de gehele geconserveerde SD2 of minimale fragmenten nabij de C-terminus die eindigde als de beste kandidaten voor kristallisatie. Kandidaten die vanuit de sequenties worden vervolgens snel getest kleine schaal met een eiwitfusie met mRuby2 (figuur 3) for efficiënte analyse. Representatieve kleine schaal (50 ml kweek) zuiveringen uit twee His 10 -mRuby2-gemerkte eiwitten zijn weergegeven in figuur 4. In deze figuur is het gedrag van een onoplosbaar eiwit gemakkelijk duidelijk ten opzichte van de oplosbare tegenhanger. Slecht tot expressie of onoplosbaar eiwit fusies worden gemakkelijk en snel op deze wijze geïdentificeerd. Biochemische analyses van eiwit fragmenten door beperkte proteolyse worden getoond in Figuur 5 voor diverse fragmenten middels het verwelken Ruby systeem beschreven of met geïsoleerde en gezuiverde Shroom SD2 domeinen. In figuur 5A zijn twee varianten van muis SHRM SD2 gevonden volgens hypothetische domeingrenzen # 2 en # 1 in figuur 3 werden gedigereerd met een gradiënt van protease concentratie van (0-1,0%) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Beide waren effectief gedegradeerd tot een groot aantal kleinere producten schappelijke enzymconcentraties. Figuur 5B toont de same experiment uitgevoerd met behulp van hypothetische grens # 3 van Drosophila SHRM SD2. Dit eiwit heeft kristalliseren en zijn structuur is beschreven 19. Proteolytische analyse kan ook nuttig zijn bij het onderzoek van Ruby-fusies als gegenereerd op basis van het protocol hierboven. Zoals getoond in figuur 5C, een Ruby fusie-eiwit met humaan Shrm2 SD2 (1427-1610) werd gedigereerd met een hoge concentratie (0,025%) van de niet-specifieke protease Subtilisine bij kamertemperatuur gedurende de aangegeven tijdstippen. Hier de linker tussen Ruby en SHRM werd onmiddellijk gesplitst zoals verwacht. Bovendien werden kleine gevormde aangeeft dit eiwit heeft twee andere protease kwetsbare gebieden, maar de afbraakproducten die zijn geproduceerd in 2 minuten bleef grotendeels intact in de rest van het experiment vermelding van het eiwitgehalte is eigenlijk heel stabiel.
Een complementaire aanpak wordt weergegeven met behulp van inheemse PAGE analysis figuur 6. In figuur 6A, Ruby-gelabeld humaan shrm SD2 (1427-1610) en eiwit dat het aangegeven puntmutaties binnen shrm worden geanalyseerd door natieve PAGE. In dit experiment werd het wild-type eiwit (welke kristallen vormt) wordt uitgevoerd als twee afzonderlijke banden, terwijl de drie mutanten die niet kristalliseren zijn dramatisch verschillend gedrag. Om te demonstreren dat het bovendien handig op eiwitcomplexen kan een verscheidenheid van Shroom Rock-complexen werden geanalyseerd door natieve PAGE in figuur 6B. In dit geval hetzelfde fragment van humaan Shrm2 SD2 (1427-1610) werd gebruikt om duidelijk de analyse, terwijl andere fragmenten van menselijke Rock werden gebruikt. Deze aanpak gesuggereerd dat complexen gevormd met behulp van Rock 700-906 en 746-906 hadden meerdere soorten, waren morsig, en minder homogeen. Complexen met behulp van 788-906 werden verbeterd, zij het niet dramatisch, en deze soort was in staat kristalliseren, hoewel kristallen vele weken duurde om te vormen en congehandhaafd afgebroken Rock eiwit. Complexen gegenereerd met behulp van Rock 834-913 vormden een enkele en meer uniforme soorten op de gel en gemakkelijk 's nachts uitgekristalliseerd. Figuur 7 toont een aantal gemeenschappelijke kristallisatieomstandigheden die worden gebruikt om te informeren over het gedrag van het eiwitmonster kristallisatie onderzoeken en kan meestal worden gebruikt met elk eiwit. Idealiter zal een combinatie van helder en precipiterende omstandigheden worden verkregen. Eiwitten die niet neerslagen behoren, vereisen een hoge concentratie of strengere voorwaarden buffering terwijl degenen die neerslaan in vele voorwaarden moet worden gebruikt bij een lagere eiwit concentratie of met buffering voorwaarden dat eiwit oplosbaarheid te promoten.
Figuur 1: Workflow Diagram. Een gegeneraliseerd diagram dat de integratie van computationele sequentieanalyse en biochemische enandere natte lab technieken in een alomvattende strategie voor de afbakening van de grenzen domein en het identificeren van eiwitfragmenten voor kristallisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Geannoteerde sequentie-analyse voor de opgerolde-coil SD2 domein van Shroom. Een overlay van de computationele analyses voor de Shroom SD2 domein, met inbegrip van een multiple sequence alignment gegenereerd door CLUSTAL omega en gekleurd door sequentie-identiteit binnen Jalview (Stap 1.1). Ook inbegrepen zijn voorspelde secundaire structuur, ongeordende volgorde voorspellingen en gewonden spiraal voorspellingen van de Shroom SD2 domein (Stap 1.2). Hypothetische domeingrenzen (stap 1,3) worden aangeduid als de waargenomen grenzen en secundaire structuurelementen onthuld door daaropvolgende kristallografische analyse 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schematische weergave van de His 10 -mRuby2-expressie-systeem. (A) Schematische voorstelling van de expressievector His 10 -mRuby2 XH2-vector gebruikt in deze studie. (B) Schematische weergave van de meervoudige kloneringsplaats van de vector. Coderende sequenties worden kenmerkend geïnsereerd in de vector via BamHI en EcoRI kloneringsplaatsen. De uiterste C-terminus van het eiwit mRuby2 rood wordt weergegeven, is de TEV protease splitsingsplaats aangeduid met haken en met de plaats van splitsing weergegeven als een rode driehoek. Een linkersequentie tussen mRuby2 en TEV plaats wordt in cyaan.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vertegenwoordiger kleine schaal zuiveringen van twee mRuby2 tag fusie-eiwitten. (A) Een beeld van monsters van bacteriecultuur meningsuiting Ruby SHRM SD2 of een niet verwant Ruby fusie-eiwit bekend onoplosbaar te zijn afgebeeld. Een aparte cultuur expressie van een eiwit zonder Ruby-tag wordt ter vergelijking getoond. (B) De oplosbare fractie van de bovengenoemde kweken werden afgebeeld na lysis en centrifugeren bij 30.000 xg gedurende 30 min, waaruit de visualisatie van oplosbare Ruby-SHRM SD2. (C) Afbeelding van de Ni-NTA-parels na binding en daaropvolgende wasstappen aangeeft dat Ruby-SHRM SD2 wordt geïmmobiliseerd opde kralen. (D) Voorbeelden van was- en elutiestappen zoals beschreven in stap 2.3.6 en 2.3.7 tonen dat de Ruby-SHRM SD2 fusie gebonden blijft aan de hars, terwijl in de aanwezigheid van 80 mM imidazool en effectief de kolom geëlueerd met 1 M imidazol elutiebuffer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Beperkte proteolyse van kandidaat SD2 domeinen van verschillende Shroom eiwitten. Een vergelijking van vier SD2 domeinen Shroom verschillende eiwitten. (A en B) De aangegeven SHRM SD2 fragmenten werden geïncubeerd met een concentratiegradiënt van de protease trypsine 0-1,0% en de resultaten van SDS-PAGE geanalyseerd. De relatie van deze eiwitfragment with de hypothetische grenzen worden aangegeven. (C) SDS-PAGE analyse van beperkte proteolytische vertering van Zijn 10 -mRuby2-Shroom SD2 fusie-eiwit met behulp van het tijdsverloop methode beschreven in het protocol. De reactie trad met 0,025% trypsine bij kamertemperatuur. Digestie van de linker tussen Ruby en Shroom SD2 is snel en dient als een interne controle. Een veronderstelde afbraakproduct dat bij de His 10 -mRuby2-Shroom SD2 fusie-eiwit-zuivert mede wordt aangeduid (*). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Het waarnemen van veranderingen in het gedrag van eiwitten met behulp van inheemse gel. (A) 10% inheemse PAGE die het effect van een mutant die de eigenschappen van mRuby2-Shroo verandertm SD2. Onder deze omstandigheden SHRM SD2 draait als twee afzonderlijke banden, terwijl de aangeduide punt mutanten binnen de SD2 een bereik van afwijkende migratiepatronen weer te geven. (B) Een vergelijking van Shroom SD2-Rock complexen gevormd met behulp van verschillende versies van Rock en geanalyseerd door native PAGE. Complexen tussen Shroom SD2 en de aangegeven fragmenten van Rock kinase (zowel opgerold-coil eiwitten) werden opgelost door native PAGE. Kristallen werden verkregen voor het complex met Rock 788-906 na vele weken, maar complex met Rock 834-913 snel gekristalliseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Quick primaire scherm voor kristallisatie. (A) Een snelle scherm van gemeenschappelijke kristallisatie conditions wordt gebruikt om het gedrag van het eiwitmonster kristallisatie studies evalueren. (B) Voorbeelden van de eenvoudige scoring matrix kristallisatie druppels beoordelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven protocol is ontworpen om de gebruiker domein grenzen te identificeren in grote opgerold-coil eiwitten om hun kristallisatie te vergemakkelijken. Het protocol is gebaseerd op een holistische opname van verschillende gegevens van computersimulaties en andere bronnen om een reeks van potentiële domeingrenzen genereren. Deze worden gevolgd door een aantal biochemische experimenten die snel en goedkoop zijn, en worden gebruikt om deze eerste hypothese te verfijnen. Met deze aanpak kan de gebruiker snel te elimineren potentiële eiwitfragmenten die ongewenst zijn, en meer aandacht besteden aan betere kandidaten, waardoor de vooruitzichten van het verkrijgen van kristallen te verbeteren.
Er zijn veel belangrijke stappen in deze techniek, maar geen als essentieel voor de productie van kristallen als de ontwikkeling van de eerste reeks hypothetische domeingrenzen. Deze stap omvat verschillende Computerbenaderingen, evenals informatie obgehandhaafd uit de literatuur of functionele gegevens indien beschikbaar. Zorg moet worden voorkomen met behulp van de strategie om onmiddellijk scherpen beneden om een enkel "beste" oplossing is er nog geen methode getroffen om een meetbare vertrouwenswaarde hechten aan één van de voorspellingen. In plaats daarvan wordt het best gebruikt als een methode om een kleine set van mogelijke domeingrenzen die moeten experimenteel worden geverifieerd snel te identificeren.
De eigenschappen van opgerolde-coil eiwitten die kunnen worden geanalyseerd met dit protocol zijn vrij breed. Vanuit het computationeel model, is de sterkte van coiled-coil voorspellingen beperkt dan 20 aminozuren, zoals vermeld in stap 1.2.1, coiled-coil gebieden groter dan 1000 aminozuren nodig in meerdere secties te verdelen voor analyse door DISOPRED. Wij zien dit later beperking als tijdelijke als het wordt opgelegd door de webserver en kunnen veranderen als de methode wordt opgewaardeerd in de toekomst. De volgende biochemische analyse kan echter lijdenop verschillende manieren. Eerst, interne lussen of gebieden overgevoelig zijn proteasen het monster laten lijken minder stabiel dan het werkelijk is om. Stabiele eiwitten die lussen hebben gesplitst of anderszins gejat door de protease moet geven nog steeds een stabiele verschijning op inheemse PAGE, dat is waarom het wordt aanbevolen dat de gebruiker beide strategieën te verkennen. Inheemse PAGE kan moeilijk zijn voor sommige eiwitten, echter, hetzij omdat ze zijn erg lang en migreren langzaam in gel of omdat hun bijzondere heffing kan ze te laten draaien de tegenovergestelde richting uit de gel geheel. In deze gevallen kan het nuttig zijn om verschillende buffering omstandigheden onderzoeken om de natieve PAGE gelsysteem.
Hoewel de focus van het werk hier wordt gepresenteerd op een groot opgerold-coil bevattende eiwitten is geweest, kan dit protocol worden gebruikt voor bijna elk eiwit met zeer weinig aanpassingen. De belangrijkste toevoeging voor bolvormige eiwitten zou de toevoeging van domein voorspelling software zoals pDomTHREADER 28 <worden/ sup> of DomPred 29 om te zoeken naar domein grenzen en tertiaire structuur voorspellingen zoals Phyre2 30 naar de voorspellende kracht van de sequentie-analyse te verbeteren. Daarnaast zijn er vele algoritmen beschikbaar voor het uitvoeren van secundaire structuur voorspellingen en gestoorde voorspellingen, en het opnemen van aanvullende algoritmen kunnen nuttig zijn. Bolvormige eiwitten vaak bezitten enzymatische activiteit of andere functionele informatie, die belangrijke aanvullende informatie zou bieden tijdens doel selectie. Verder kan matige of hoge throughput technieken, voor zover relevant. Bijvoorbeeld, goedkope systemen voor 1-2 ml kweken en metaal affiniteit zuiveringen in 96-well formaat zijn beschikbaar 31. Tenslotte het gebruik van robotica voor het opzetten van grote aantallen kristallisatie-experimenten met minimale monster steeds routine, maar efficiënte werking van robotsystemen is gebaseerd op het gedrag van goed gekarakteriseerde eiwitmonsters. toevoegingal aanpassingen aan dit protocol kan onder het bemonsteren van een verscheidenheid van affiniteit-tags. Veel verschillende fluorescerende labels beschikbaar zijn, of His, GST, Thioredoxin-, Strep- en MBP zijn enkele tientallen van de beschikbare opties als een fluorescerend label niet nodig of nuttig.
Bij het uitvoeren van deze procedure, moet de gebruiker zich bewust van het effect dat de mRuby2 tag op eiwit van het belang van de gebruikers zou kunnen hebben zijn. Anekdotisch bewijs van gebruik van deze tag op verschillende fusies ondersteunt dat mRuby2 soms binden zeer stevig aan het eiwit van belang gebonden blijft door meerdere chromatografische stappen. Dit gedrag is duidelijk ongewenst, maar onbedoelde Ruby complexen kunnen gewoonlijk worden gescheiden en chromatografisch verwijderd. Het is onduidelijk of dit een chaperone-achtige gedrag als is waargenomen voor MBP 32.
Na het verkrijgen van kristallen, zijn er nog vele uitdagingen die vaak worden geconfronteerd met coiled-coil eiwitten die niet in dit protocol worden aangepakt. De meest voorkomende is slechte diffractie kwaliteit, hetzij als gevolg van gebrekkig gevormd roosters of anisotroop diffractie. Er zijn instrumenten die voorhanden zijn om te helpen met anisotrope diffractie 33, en deze zijn van cruciaal belang voor het oplossen van een aantal opgerolde-coil structuren 18,20 geweest. Veel kristallen pathologieën zijn helaas moeilijk om snel te overwinnen, dan is het vaak verstandig om te zoeken naar extra kristalvormen met verbeterde diffractie eigenschappen. Dit wordt vergemakkelijkt door robotische screening van duizenden omstandigheden. Als alternatief zijn er vele post-kristallisatie technieken om diffractie kwaliteit te verbeteren, zoals uitdroging, of zaaien 34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
References
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
- Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
- Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
- Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
- Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
- Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
- Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
- Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
- Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
- Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
- Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
- Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
- Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
- Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).
- Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
- Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).
- Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jungbauer, A., Hahn, R.
- Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
- Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
- Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
- Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
- Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
- Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
- Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).
