Introduction
Strukturbestemmelse via røntgenkrystallografi har gjort fundamentale bidrag til alle felt av moderne biologi; som gir en atom visning av makromolekyler som støtter liv, og hvordan de samhandler med hverandre i en rekke sammenhenger; tillater oss å forstå mekanismene som forårsaker sykdom og gi muligheter til rasjonelt designe medikamenter for å behandle sykdom. Krystallografi har lenge vært den dominerende eksperimentelle teknikk for å bestemme makromolekylære struktur, og i dag utgjør 89,3% av det strukturelle databasen (www.rcsb.org). Denne teknikk har mange fordeler, deriblant muligheten for meget høy oppløsning, evnen til å visualisere makromolekyler med et bredt spekter av størrelser, relativt lett datainnsamling, og muligheten for å visualisere hvordan makromolekylet reagerer med oppløsningsmidlet, så vel som ligander.
Til tross for mange teknologiske forbedringer i rekombinant protein uttrykk 1,2, purreduser fuktighet 3, og molekylær biologi anvendt for å danne disse systemene 4, den største hindringen i den krystallografiske prosessen forblir evnen til å vokse diffraksjon kvalitet krystaller. Dette har vært spesielt sant for proteiner som inneholder store kveil-spole domener. Det har blitt anslått at så mye som 5% av alle de aminosyrer som finnes innen kveilet spoler 5,6, noe som gjør dette til en meget felles strukturelt trekk 7, men disse proteinene er ofte vanskeligere å rense og krystallisere enn globulære proteiner 8-10 . Denne blir ytterligere forsterket ved det faktum at kveil-spiral domener er ofte funnet i forhold til et større protein, derfor fullstendig forutsi grensene for disse domenene er kritisk for å unngå innlemmelse av ustrukturerte eller fleksibel sekvens som ofte er skadelig for krystallisering.
Her presenterer vi et begrepsapparat som kombinerer web-basert beregningsanalyser med Experimental data fra benken, for å hjelpe brukerne gjennom de innledende fasene av den krystallografiske prosessen inkludert: hvordan å velge proteinfragment (er) for strukturelle studier, og hvordan du kan forberede og karakterisere proteinprøver før krystallisering forsøk. Vi fokuserer vår analyse på to proteiner som inneholder store coiled-spole domener, Shroom (SHRM) og Rho-kinase (Rock). Disse proteiner ble valgt som de begge inneholder kveil-spole domener og er kjent for å danne et biologisk relevant kompleks 11-16. Shroom og Rho-kinase (Rock) er anslått å inneholde ~ 200 og 680 rester av coiled-spole henholdsvis mange deler av denne har vært preget strukturelt 17-20. Metoden som er beskrevet her tilveiebringer en strømlinjeformet arbeidsflyt for raskt å identifisere fragmenter av kveil-spiral inneholdende protein som vil være mottagelig for krystallisering, men de teknikkene som er beskrevet kan lett tilpasses for de fleste proteiner eller protein-komplekser eller modifisert til å innlemme high-throughput approaches som tilgjengelig. Til slutt, disse metodene er generelt billig og kan utføres av brukere i nesten alle erfaringsnivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Et diagram av den begrepsramme eller arbeidsflyt er beskrevet i figur 1 for referanse. Protokollen kan deles inn i fire faser: beregnings eller sekvens basert spådommer, protein uttrykk og rensing, biokjemisk karakterisering, og krystallisering. Eksemplene som er vist analysere Shroom SD2 domener og / eller Shroom-Rock-komplekser, men kan benyttes med en hvilken som helst protein.
1. Bruk Etablert webbaserte verktøy for å generere Computational Spådommer av Coiled-spiral Domain grenser
- Samle en evolusjonært mangfoldig sett av Sequence homologer.
- Gå til www.uniprot.org og skriv inn Shroom i øverste søkefeltet.
- Velg sekvenser for å laste ned ved å krysse av boksen ved siden av sin tiltredelse nummer. Sekvenser med en stjerne indikerer sekvenser anmeldt av Uniprot og er generelt mer pålitelig. Pass på å sikre at alle sekvenser er fullstendig og nøyaktig.
- Lagre de valgte sequences ved å klikke Last ned.
- Rett innsamling av Shroom sekvenser ved hjelp Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Klikk på "Browse" -knappen for å velge filen med Shroom sekvenser og deretter presse inn.
- Etter justeringen er fullført, klikker du på "Last ned Alignment File" -knappen.
- Åpne flersekvenssammenstillingen generert i 1.1.5 ved hjelp Jalview (Fil | Input Alignment | Fra fil). Innenfor den nye justeringen vindu, farge av identitet (farge | Percent Identity).
- Beregne prediksjoner av sekundær struktur, prediksjoner av fleksible eller uordnede sekvens, og forutsagte kveil-spole regioner i proteinet (r) av interesse.
- Gå til http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, for å beregne Coiled-Coil spådommer. Kopier og lim sekvensen inn i Sequence Box og klikk Send.
Merk: Det kan ta denne analysen et par timer til complete. Siden Shroom sekvenser er ganske stor, kan sekvensene må deles inn i blokker med mindre enn 1000 aminosyrer for å passe i størrelsen begrensningen av webserveren. Ved analyse Shrm2, anbefales det at de C-terminale aminosyrene 1000 blir brukt som inneholder denne delen SHRM SD2 domene som er kjent for å inneholde kveil-spole regioner. Når gjenta denne analysen med andre proteiner, er det anbefalt å bruke full-lengde proteinsekvenser når det er mulig. Hvis det ikke er et alternativ, bruker den største fragmentet mulig eller dissekere sekvensen basert på kjente biokjemiske eller funksjonelle data. - Gå til http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, for å beregne Coiled-Coil spådommer. Kopier og lim sekvensen inn i Sequence Box og klikk Send.
- Gå til http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, for å beregne Coiled-Coil spådommer. Kopier og lim sekvensen inn i Sequence Box og klikk Send.
- Kombiner resultatene fra trinn 1.1 til 1.2.2 i en enkelt omfattende annotering av Shroom sekvens.
MERK: Det er svært oppmuntret til også å omfatte enhver og all relevant jegnformasjon som kan merkes fra litteraturen eller andre kilder om protein funksjon eller rensing på dette stadiet. - Ved hjelp av denne omfattende merket sekvens, forutsi domenegrenser (eller en serie av mulige grenser) for proteinet, prøver å maksimere bevaring og predikerte strukturelle trekk, mens mengden av uordnede eller fleksibel sekvens minimaliseres. Hvis kjent, bør det resulterende protein beholde de funksjonelle egenskaper av interesse.
2. Express og rense Proteiner med domene grenser identifisert i del 1
MERK: Målet med denne delen er å bruke en rekke raske og lett målbare analyser for å skjerme hypotetiske domenenavn grenser generert i punkt 1.
- Ved bruk av standard molekylærbiologiske teknikker, generere et ekspresjonsplasmid med den ønskede kodende sekvensen i ramme innenfor His 10 -mRuby2-XH2 plasmid (se figur 3 for en vektorkartnd ytterligere detaljer).
- Test ekspresjonsnivåene for hvert ekspresjonsplasmid ved hjelp av BL21 (DE3) E.coli eller annet egnet ekspresjon belastning i Autoinduksjonen media 1 ved romtemperatur i 18-24 timer.
- Transform ekspresjonsplasmider samt et tomt plasmid kontroll i BL21 (DE3) følge instruksjonene som fulgte med cellene eller ved hjelp av robust transformasjon protokollen, slik som den her (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -transformation /).
- Fra fersktransformerte plate, velge en enkelt koloni og dyrke en 5 ml starterkultur ved 37 ° C over natten i lysogeni Broth (LB) media med 34 ug / ml kanamycin.
- Dagen etter pellet kulturen og vask pellet med fersk LB.
- Tilsett starterkultur til 50 ml autoinduksjonen media med 34 ug / ml kanamycin. Tillate kulturen å vokse til metning ved enten romtemperatur eller 37 ° C. Vanligvis vokser for ~ 18-24 timer.
- pellet cellens og fryse den resulterende cellepellets ved -80 ° C ubestemt tid før rensing.
- Sammenlign hele celleekstrakter fra hvert uttrykk belastning og den tomme vektor kontroll ved hjelp av SDS-PAGE for å bestemme den belastningen som mest effektivt frembringer det ønskede fusjonsprotein. For Hans 10 -mRuby2-Shroom SD2-fusjonsproteiner, drevet 10% SDS-PAGE-geler ved 180 V i ~ 50 minutter, eller inntil den fremre fargestoff når bunnen av gelen 22.
- Stain gel med Coomassie Blå å visual totale cellulære proteiner innen hver stamme 23.
- Utfør en innledende affinitetskromatografi skritt på hver stamme som vellykket uttrykt mRuby2-fusjonsprotein. Vanligvis utfører rensetrinn 2.3.2-2.3.7 ved romtemperatur, med mindre proteinet kan benytte seg av endrede forhold, slik som rensing ved 4 ° C.
- Tine celle pellets fra trinn 2.2.5.
- Resuspender cellepelleten i hver 1,5 ml lyseringsbuffer (10% glycerol, 500 mM NaCl, 40mM imidazol, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM beta-merkaptoetanol). Supplere lysis buffer med proteasehemmere som passer.
- Tilsett 30 ul 10 mg / ml lysozym og inkuber ved romtemperatur i 20 min. Sonicate følge instruksjonene for instrumentet som brukes.
- Overfør til et 1,5 ml rør og sentrifuger i en bordsentrifuge i 30 minutter ved 14 000 x g for å pelletere uoppløselig materiale eller ulyserte celler. Spar både supernatant og pellet for påfølgende analyse via SDS-PAGE.
- Utføre nikkel affinitetsrensing, inkubering av den løselige fraksjonen med 100 mL av Ni-NTA perler. Inkuber perler med oppløselige lysat i 5-10 min, snu flere ganger for å blande kulene.
- Sentrifuger ved 800 xg i 30 sekunder i en bord-sentrifuge for å pelletere kulene. Følg dette ved å vaske pellet 3-5 ganger med lyseringsbuffer for å rydde av ikke-spesifikke forurensninger.
- Elute Ruby fusjonsprotein fra kulene med lyseringsbuffer supplert med 1M imidazol.
- Bruk SDS-PAGE for å sammenligne oppførselen til Hans-mRuby2-Shroom proteiner i "quick and dirty" rensing ovenfor.
3. karakter Protein Prøve å identifisere de med fordelaktige egenskaper
- Bruke et spektrofotometer innstilt på 280 nm for å måle konsentrasjonen av Ruby fusjonsprotein, og deretter vurdere homogeniteten til prøven ved å laste 1-5 ug fusjonsprotein på en nativ PAGE-gel 24. Kjør 10% native PAGE-gel ved 4 ° C i 140 minutter ved 175 V.
- Bilde mors PAGE ved hjelp av en imager rustet til å visualisere fluorescens, observere hvor mRuby-merket fusjon vandrer i denne analysen.
MERK: Vær forsiktig med å observere fusjonsprotein som sitter fast i tillegg til dette proteinet er sannsynlig samlet. Hvis en fluorescens kamera ikke er tilgjengelig, kan man ofte visualisere og bilde konsentrert prøver av Ruby tagget protein under en svart lys eller med en UV lyskasse.
- Bilde mors PAGE ved hjelp av en imager rustet til å visualisere fluorescens, observere hvor mRuby-merket fusjon vandrer i denne analysen.
- Utfør begrenset proteolyse å identifisere stabilt foldet domener. Inkuber 95 mL av Ruby-SHRM SD2 fusjon på ~ 1 mg / ml med 5 mL av 0,025% Subtilisin A.
- Smak den reaksjonen ved tidspunkter på 0, 0,5, 2, 5, 15, 60 og 120 min, fjerning av 10 pl fra reaksjon for hvert tidspunkt og visualisere fremdriften av reaksjonen via SDS-PAGE ved anvendelse av en 15% akrylamidgel .
- Flekk med Coomassie Blå som i trinn 2.2.7 og vurdere om det kan identifiseres en protease resistente arter.
- Integrere data fra renseeffekt, atferd i native PAGE, og begrenset proteolyse på delvis rensede mRuby2-Shroom fusjonsproteiner i en helhetlig vurdering av den samlede oppførselen til disse proteinene i løsningen.
- (Valgfritt) Hvis en passende funksjonell analyse er tilgjengelig, se etter aktivitet på dette punktet.
4. produsere høykvalitets Krystaller av Coiled-spiral SD2Domene fra Shroom
MERK: Alle trinnene i kapittel 4.1 er utført ved romtemperatur hvis proteinet vil dra nytte av rensing på en annen temperatur, vanligvis 4 ° C.
- Ved hjelp av de 50 ml vekster som et grovt estimat av uttrykk og rensing potensial, utføre storskala uttrykk for mRuby2-Shroom SD2 med mål om å oppnå 5-20 mg helt renset prøve. Vanligvis 2 liter kultur gir tilstrekkelig utgangsmaterialet. Etter vekst pellet cellene ved sentrifugering ved 8000 xg i 10 min.
- Resuspender pelleten fra to L vekst i lyseringsbuffer som før, ved hjelp ~ 2 ml lysering per gram frosset cellepellet ved bruk av lysozym for lysering. Alternativt resuspender på ~ 8 ml / g pellets hvis du bruker en homogenisator eller fransk presse. Pellet celleavfall via sentrifugering ved 30 000 xg i 30 min.
- Batch binde den løselige fraksjonen fra 4.1.1 anvendelse av 10 ml Ni-NTA-harpiks. Hell i riktig tyngdekraften kolonneog la ubundne proteiner for å renne av.
- Vask harpiks 3-5 ganger med 40 ml lyseringsbuffer, etterfulgt av en vasking med lyseringsbuffer tilsatt til 1 M NaCl.
- Vask harpiksen med 40 ml lyseringsbuffer supplert med 80 mM imidazol.
- Eluer Ruby-Shroom fusjonsprotein med 40 ml lyseringsbuffer supplert til en M imidazol. Manuelt fraksjonere det eluerte proteinet i 4-10 ml fraksjoner.
- Bekrefte fraksjoner inneholdende Ruby-Shroom-fusjonsprotein ved anvendelse av 10% SDS-PAGE.
- Dialyser egnede fraksjoner (typisk fraksjoner 2-4) inn i 8% glycerol, 250 mM NaCl, 15 mM imidazol, 20 mM Tris pH 8,0, 1 mM β-ME, ved hjelp av 6-8 kDa MWCO dialyserør. Tilsett 1 mg TEV protease for hver 25-50 mg av fusjonsproteinet. Dialyser over natten ved romtemperatur med langsom omrøring.
- Gjenta nikkel affinitet rensing trinn 4.1.2. til 4.1.6. Den Shroom SD2 domenet skal nå være i den ubundne fraksjonen mens hans 10 -mRuby2 vil forbli bundet tilharpiksen og vil bli funnet i elueringsfraksjonene. Bekreft dette ved hjelp av 12% SDS-PAGE farging med Coomassie blå.
- Dialyser fraksjoner inneholdende Shroom SD2 domene inn i 8% glycerol, 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM beta-merkaptoetanol buffer over natten.
- Utføre anionbytterkromatografi 25 ved hjelp av et FPLC, og eluering med en NaCl-gradient 0,1 til 1,0 M NaCl. Analyser fraksjoner som bruker 12% SDS-PAGE.
- Ved hjelp av en sentrifuge konsentrator (MWCO på 10 kDa eller høyere, avhengig av proteinet som blir undersøkt), konsentrer toppfraksjoner til ~ 0 mg / ml, og deretter utføre størrelseseksklusjonskromatografi 26, analysere toppfraksjoner via 12% SDS-PAGE.
- Pool toppfraksjoner og dialyser inn i 20 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 2% glycerol, 1 mM β-ME, og konsentrer til 10 mg / ml før krystallisering.
Valgfritt: I løpet av dette trinnet, fjerne 5 ul prøver i konsentrasjoner på 1, 2, 5 og 10 mg / ml i løpet av konsentrering av prøven.Kjør en nativ PAGE lasting 2-5 mL av hver prøve for å se på atferden til prøven i løpet av dette trinnet.
- Screen et lite utvalg av 12 forhold for å identifisere en optimal proteinkonsentrasjonen for krystallisering prøvelser. Sammensetningen av disse betingelser er beskrevet i figur 7.
- Ved å bruke 24-brønners satt dråpe krystallisering skuffer, utføre krystallisering forsøk ved bruk av dampdiffusjon metode, pipettere 500 ul av hver av de 12 tilstander i separate brønner, etterfulgt av dråper som innledningsvis inneholder 1 ul av vel oppløsning og 1 ul av proteinprøven på objektglassene . Se 27 for ytterligere informasjon om denne teknikken.
- Raskt forsegle skuffen med klar tape og flytte skuffen til en passende temperatur kontrollert miljø som er vibrasjonsfri. Temperaturen som anvendes kan variere, men 4 ° C, 16 ° C, og 20 ° C er ganske vanlig.
- Undersøk dråper i skuffene over neste 3 days ved hjelp av et mikroskop med opp til 100X forstørrelse. På slutten av den 3-dagers periode, scorer hver dråpe som inneholder ingen nedbør (klar), lett nedbør, mye nedbør (brun), eller krystaller. En egnet Proteinkonsentrasjonen bør ikke inneholde mer enn 6 tunge utfellinger.
- Ved hjelp av proteinkonsentrasjonen identifisert i 4,2, screene et bredt spekter av kommersielt tilgjengelige krystallisering skjermer. Bruken av en væske håndtering eller krystallisering robot hastigheter sterkt opp denne prosess samtidig minimere feil i dråpene. Det krever langt mindre protein i tillegg, slik at brukeren kan screene flere forhold med en enkelt prøve.
- Forbedre startbetingelsene identifisert fra brede skjermer ved systematisk å variere hver av variablene innenfor krystallisering slipp ved hjelp av 24-brønn screening skuffer som før.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et diagram som viser den arbeidsflyten som benyttes i dette systemet er vist i figur 1 og omfatter tre hovedtrinn. Matematisk analyse av sekvensen blir anvendt for å utvikle hypoteser om domenegrenser av kveil-spiral proteinet av interesse. Et eksempel på en annotert analyse av Shrm2 SD2 domenet er vist i figur 2. I dette diagrammet, målet var å identifisere mulige domenenavn grenser for en konservert domene ved C-terminalen av cytoskeletal regulator Shroom kalt SD2. Fra denne analysen ble tre forskjellige sett av hypotetiske domenegrenser ble samlet inneholdende kveil-kveil-fragmenter som strekker seg over hele konserverte SD2 eller minimale fragmenter nær den C-terminale ende som endte opp som de beste kandidater for krystallisering. Kandidater identifisert fra den sekvensanalyse blir deretter raskt testet i liten målestokk ved bruk av en proteinfusjon med mRuby2 (figur 3) for effektiv analyse. Representative liten skala (50 ml kultur) rensinger fra to Hans 10 -mRuby2-merkede proteiner er vist i figur 4. I denne figur, er oppførselen til et uoppløselig protein klart fram i forhold til sin oppløselige motpart. Dårlig uttrykker eller uoppløselige proteinfusjoner blir enkelt og raskt identifiseres på denne måte. Biokjemiske analyser av proteinfragmenter ved begrenset proteolyse er vist i figur 5 for en rekke fragmenter ved hjelp av visne Ruby-system som er beskrevet, eller med isolerte og rensede Shroom SD2 domener. I figur 5A, to varianter av musa SHRM SD2 tilsvarende hypotetiske domenegrenser # 2 og # 1 i figur 3 ble spaltet ved anvendelse av en gradient av protease-konsentrasjon fra (0-1,0%) i 30 minutter ved romtemperatur. Begge disse ble effektivt degradert til en rekke mindre produkter til moderate enzymkonsentrasjoner. Figur 5B viser same eksperiment utført ved hjelp av hypotetisk grense # 3 fra Drosophila SHRM SD2. Dette proteinet har krystallisere og dets struktur er beskrevet 19. Proteolytisk analyse kan også være nyttig når undersøke Ruby-fusjoner som genereres fra protokollen over. Som vist i figur 5C, er en Ruby fusjonsprotein med human Shrm2 SD2 (1427-1610) ble spaltet med en høy konsentrasjon (0,025%) av ikke-spesifikk protease Subtilisin ved romtemperatur i de angitte tidspunkter. Her linker mellom Ruby og SHRM ble umiddelbart kløyvet som forventes. I tillegg ble mindre produkter dannet som indikerer dette proteinet har to andre protease-sensitive områder, men de nedbrytningsprodukter som ble produsert i løpet av 2 min stort sett intakt gjennom resten av forsøket indikerer at proteinet er faktisk ganske stabil.
En komplementær tilnærming er vist ved hjelp av innfødte HOVED analyser i figur 6. I figur 6A, Ruby-merket human SHRM SD2 (1427 til 1610) så vel som protein inneholdende de angitte punktmutasjoner innenfor SHRM blir analysert ved nativ PAGE. I dette eksperimentet, villtype-proteinet (som danner krystaller) løper som to adskilte bånd, mens de tre mutanter som ikke krystalliserer har dramatisk forskjellig oppførsel. For å demonstrere at systemet kan også være nyttig på protein komplekser, ble en rekke Shroom-Rock komplekser analysert ved nativ PAGE i figur 6B. I dette tilfelle ble det samme fragment av humant Shrm2 SD2 (1427-1610) som brukes for å forklare den analysen, mens forskjellige fragmenter av human Rock ble benyttet. Denne tilnærmingen antydet at komplekser dannet ved hjelp av Rock 700-906 og 746-906 hadde flere arter, var smeary, og mindre homogen. Komplekser utnytte 788-906 ble forbedret, om enn ikke dramatisk, og denne arten var i stand til å krystallisere, selv om krystaller tok mange uker å danne og conholdes degradert Rock protein. Komplekser generert ved hjelp Rock 834-913 dannet et enkelt og mer enhetlige arter på gel og lett krystallisert over natten. Figur 7 viser et sett av felles krystalliseringsbetingelser som brukes til å informere om opptreden av proteinprøven i krystallisering forsøk, og kan brukes vanligvis sammen med en hvilken som helst protein. Ideelt sett vil det være oppnådd en blanding av store og utfelles betingelser. Proteiner som ikke danner bunnfall krever høye konsentrasjoner eller strengere bufferbetingelser mens de som utfelles i mange forhold, bør det brukes en lavere proteinkonsentrasjon eller med bufferbetingelser som fremmer oppløselighet protein.
Figur 1: arbeidsflytskjema. En generalisert diagram som viser integreringen av beregningssekvensanalyse og biokjemiske ogandre våt lab teknikker i en helhetlig strategi for opptegning domenenavn grenser og identifisere proteinfragmenter for krystallisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Annotated-sekvensanalyse for kveil-spolen SD2 domene fra Shroom. Et overlegg fra beregningsanalyser for Shroom SD2 domene, inkludert en multippel sekvenssammenstilling generert av Clustal omega og farget av sekvensidentitet innenfor Jalview (trinn 1.1). Også inkludert er spådd sekundærstruktur, uordnede sekvens spådommer, og kveilet-spole spådommer for Shroom SD2 domene (Step 1,2). Hypotetisk domenenavn grenser (trinn 1.3) er indisert som er observert grenser og sekundærstrukturelementer som avslørt av påfølgende krystallografiske analyser 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Skisse av hans 10 -mRuby2 utfoldelse system. (A) Skjematisk fremstilling av ekspresjonsvektoren His 10 -mRuby2-XH2 vektor anvendt i denne studien. (B) Diagram av det multiple kloningssetet fra denne vektoren. Protein-kodende sekvenser blir typisk satt inn i denne vektoren via BamHI og EcoRI-kloningsseter. Den ekstreme C-terminalen av mRuby2 protein vises i rødt, er TEV proteasespaltningsstillingen angitt med parentes og med området cleavage vises som en rød trekant. En linker sekvens mellom mRuby2 og TEV området er vist i cyan.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representative småskala renselser av to mRuby2 tagget fusjonsproteiner. (A) Et bilde av prøver av bakteriekultur uttrykk Ruby SHRM SD2 eller et ubeslektet Ruby fusjonsproteinet er kjent for å være uoppløselig blir avbildet. En egen kultur uttrykker et protein uten et Ruby-kode er vist for sammenligning. (B) Den løselige fraksjon fra kulturene ovenfor ble fotografert etter lysering og sentrifugering ved 30 000 xg i 30 minutter, noe som viser visualiseringen av oppløselige Ruby-SHRM SD2. (C) Bilde av Ni-NTA perler etter binding og påfølgende vasketrinn indikerer at Ruby-SHRM SD2 blir immobilisert påperlene. (D) Prøver av vasking og eluering trinn som er beskrevet i trinn 2.3.6 og 2.3.7 viser at Ruby-SHRM SD2 fusjon forblir bundet til harpiksen, mens i nærvær av opp til 80 mM imidazol, og er effektivt elueres fra kolonnen med 1 M imidazol elueringsbuffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Limited proteolyse av kandidat SD2 domener fra forskjellige Shroom proteiner. En sammenligning av fire SD2 domener fra ulike Shroom proteiner. (A og B) De indikerte SHRM SD2-fragmenter ble inkubert med en konsentrasjonsgradient av proteasen trypsin 0 til 1,0%, og resultatene analysert ved SDS-PAGE. Forholdet av det proteinfragment vetth hypotetisk grenser er angitt. (C) SDS-PAGE-analyse av begrenset proteolytisk spaltning av His 10 -mRuby2-Shroom SD2-fusjonsprotein ved hjelp av tidsforløpet fremgangsmåten beskrevet i protokollen. Reaksjonen forekommet med 0,025% trypsin ved romtemperatur. Fordøyelse av linker mellom Ruby og Shroom SD2 er rask og fungerer som en intern kontroll. En antatt nedbrytningsprodukt som co-renser med His 10 -mRuby2-Shroom SD2 fusjonsproteinet er angitt (*). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Å observere endringer i protein atferd ved hjelp av innfødte gel. (A) 10% nativ PAGE som viser effekten av en mutant som endrer egenskapene til mRuby2-Shroom SD2. Under disse forholdene SHRM SD2 kjører som to adskilte bånd, mens den angitte punkt mutanter innenfor SD2 vise et utvalg av avvikende vandringsmønster. (B) En sammenligning av Shroom SD2-Rock komplekser dannet ved hjelp av ulike versjoner av Rock og analysert ved nativ PAGE. Komplekser mellom Shroom SD2 og de angitte fragmenter av Rock kinase (både coiled-spole proteiner) ble løst ved nativ PAGE. Krystaller ble oppnådd for det kompleks som inneholder Rock 788-906 etter mange uker, men kompleks som inneholder Rock 834-913 krystalliserte raskt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Hurtig primære skjermen for krystallisering. (A) En rask skjerm av felles krystallisering cold brukes til å vurdere oppførselen av proteinprøven i krystallisering forsøk. (B) Eksempler på enkle scoringsmatrise for å vurdere krystallisering dråper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet her er utviklet for å hjelpe brukeren å identifisere domenenavn grenser innenfor store coiled-spole proteiner for å lette deres krystallisering. Protokollen er basert på en helhetlig innlemmelse av en rekke data fra beregnings forutsigelsene og andre kilder for å generere en serie av mulige domenegrenser. Disse følges av et sett av biokjemiske forsøk som er rask og billig, og blir brukt for å begrense disse innledende hypoteser. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan brukeren raskt eliminere potensielle proteinfragmenter som er uønsket, og fokusere mer oppmerksomhet på bedre kandidater, og dermed bedre utsiktene til å skaffe krystaller.
Det er mange viktige trinnene i denne teknikken, men ingen som kritisk for produksjon av krystaller som utviklingen av det første sett av hypotetiske domenegrenser. Dette trinnet omfatter en rekke beregningsfremgangsmåter, samt informasjon obholdes fra litteraturen eller funksjonelle data når den er tilgjengelig. Forsiktighet bør utvises for å unngå å bruke strategi for å finpusse umiddelbart ned til singelen "beste" løsning som det er i dag ingen metode på plass for å feste en kvantifiserbare tillit verdi til noen av spådommer. I stedet er det best brukt som en metode for å raskt identifisere et lite sett av mulige domenenavn grenser som må eksperimentelt verifisert.
Egenskapene til coiled-spole proteiner som kan analyseres med denne protokollen er ganske bred. Fra en beregnings perspektiv, blir styrken av kveil-spole forutsigelser begrenset under 20 aminosyrer, og som nevnt i punkt 1.2.1, kveilet spiral-regioner større enn 1.000 aminosyrer ville måtte bli delt inn i flere seksjoner for analysen av DISOPRED. Vi ser på dette senere begrensning som midlertidig som det pålegges av webserver og kan endres etter hvert som metoden er oppgradert i fremtiden. Den påfølgende biokjemisk analyse kan imidlertid lidepå forskjellige måter. Først interne sløyfer eller regioner hypersensitive til proteaser kan gjøre prøven synes å være mindre stabil enn den faktisk er. Stabile proteiner som har spaltet sløyfer eller på annen måte bretter av protease bør likevel gi en stabil opptreden på mors PAGE, det er derfor det anbefales at brukeren utforske begge strategier. Native SIDE kan være vanskelig for noen proteiner, men heller fordi de er veldig lang og migrere sakte inn gel eller fordi deres spesielle kostnader kan gjøre dem kjøre i motsatt retning ut av gelen helt. I dette tilfelle kan det være nyttig å utforske ulike buffer vilkår for den innfødte PAGE gel systemet.
Mens fokus for arbeidet som presenteres her har vært på store coiled-spole som inneholder proteiner, kan denne protokollen brukes til nesten alle protein med svært få tilpasninger. Den primære tillegg for globular proteiner ville være tillegg av domene prediksjon programvare som pDomTHREADER 28 </ sup> eller DomPred 29 for å lete etter domenenavn grenser, og tertiær struktur spådommer som Phyre2 30 for å forbedre den prediktive kraft av sekvensanalyse. I tillegg er det mange algoritmer er tilgjengelige for å utføre sekundære struktur spådommer og uordnede spådommer, og inkludering av flere algoritmer kan være nyttig. Globular proteiner har ofte enzymatisk aktivitet eller andre funksjonelle leselig som ville gi viktig tilleggsinformasjon under målet utvalg. Videre kan moderate eller high-throughput teknikker inkorporeres etter behov. For eksempel, billige anlegg for 1-2 ml kulturer og metall affinitet rens i 96-brønners format er lett tilgjengelige 31. Endelig er bruken av roboter for å sette opp et stort antall krystallisering forsøk under anvendelse av minimalt prøven blir rutinemessig, men effektiv drift av robotsystemer er betinget av oppførselen til godt karakteriserte proteinprøver. Addisjonal modifikasjoner av denne protokollen kan inkludere prøvetaking en rekke affinitet tagger. Mange ulike fluorescerende koder er tilgjengelige, eller His, GST, Thioredoxin-, Strep-, og MBP- er blant dusinvis av tilgjengelige alternativer hvis en fluorescerende tag ikke er nødvendig eller nyttig.
Når du utfører denne prosedyren, må brukeren være oppmerksom på den virkning at mRuby2 tag kan ha på brukernes protein av interesse. Anekdotiske bevis fra å bruke denne koden på en rekke forskjellige fusjoner støtter det faktum at mRuby2 vil noen ganger binde ganske tett til protein av interesse, forble bundet gjennom flere kromatografiske trinn. Denne oppførselen er selvsagt uønsket, men utilsiktede Ruby komplekser kan vanligvis skilles ut og fjernes kromatografisk. Det er uklart om dette er en anstand-lignende oppførsel som har blitt observert for MBP 32.
Etter å ha fått krystaller, er det fortsatt mange utfordringer som ofte møtt med coiled-spiral proteiner som ikke er adressert i denne protokollen. Det mest vanlige er dårlig kvalitet diffraksjon, enten på grunn av ufullkomment dannet gittere eller anisotropisk diffraksjon. Det finnes verktøy på plass for å bistå med anisotropisk diffraksjon 33, og disse har vært avgjørende for å løse noen coiled-viklingskonstruksjonene 18,20. Mange krystall patologi er dessverre vanskelig å overvinne fort, derfor er det ofte klokt å søke etter flere krystallformer med forbedrede diffraksjon egenskaper. Dette er tilrettelagt av robot screening av tusenvis av forholdene. Alternativt finnes det mange post-krystallisering teknikker for å forbedre diffraksjon kvalitet som dehydrering, eller seeding 34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
References
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Chapman, T. Protein purification: pure but not simple. Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. Predicting coiled coils from protein sequences. Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).
- Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils. J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).
- Lupas, A. N., Gruber, M. The structure of alpha-helical coiled coils. Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).
- Hernandez Alvarez, B., et al. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).
- Slabinski, L., et al. The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics. Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).
- Slabinski, L., et al. XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
- Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure. Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).
- Hildebrand, J. D. Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network. J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).
- Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins. J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).
- Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction. Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).
- Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis. Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).
- Das, D., et al. The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice. Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).
- Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA. J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).
- Mohan, S., et al. Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology. PLoS One. 8 (12), e81075 (2013).
- Mohan, S., et al. Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction. Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).
- Tu, D., et al. Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I. PLoS One. 6 (3), e18080 (2011).
- Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Jungbauer, A., Hahn, R.
- Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography. J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).
- Giege, R. A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day. FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).
- Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination. Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).
- Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure. Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
- Elsliger, M. A., et al. The JCSG high-throughput structural biology pipeline. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).
- Bach, H., et al. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies. J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).
- Strong, M., et al. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Heras, B., Martin, J. L. Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).
