Summary
단일 셀의 순서는 고해상도 게놈 변화를 해결하기위한 점점 인기 액세스 도구입니다. 우리는 하나의 셀에 복사 번호 변경을 식별하기 위해 단일 셀 시퀀싱을 사용하는 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
단일 셀 해상도 게놈 변화의 검출은 정상 조직, 암 및 미생물 집단의 유전 적 이질성과 진화를 특징 짓는 중요하다. 유전 적 이질성을 평가하기위한 전통적인 방법은 낮은 해상도, 낮은 감도 및 / 또는 낮은 특이성에 의해 제한되고있다. 단일 셀의 순서를 적절하게 분석 고해상도, 고감도, 높은 특이성과 유전 적 이질성을 검출하기위한 강력한 도구로 떠오르고있다. 여기에서 우리는 단일 세포의 분리, 전체 게놈 증폭 시퀀싱 및 분석을위한 프로토콜을 제공합니다. 우리의 접근 방식은 하나의 세포에서 megabase 규모의 카피 수 변이의 신뢰성 식별 할 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜의 양태는 단일 세포에서 유전 적 변형의 다른 유형을 조사하기 위해 적용될 수있다.
Introduction
DNA의 복제 수의 변화는 몇 가지 기본 쌍의 크기 범위는 전체 염색체 (염색체)에 (CNVs) (복사 번호 변형). 게놈의 큰 영역에 영향을 카피 수 변화 닫 유전자 1,2 수천의 발현을 변화시켜 표현형 상당한 영향을 미칠 수있다. 벌크 서열 또는 마이크로 어레이 기반의 방법 (3) (4)에 의해 검출 될 수 집단의 모든 세포에 존재 CNVs. 그러나, 인구는 집단 또는 심지어 단일 세포의 서브 세트에 존재 CNVs으로 이종 유전자 일 수있다. 유전 적 이질성 불명 결과 5, 6, 7, 8, 9,도 정상 조직에 존재하는 종양의 발전을 구동 암에 공통이며
전통적으로, 유전 적 이질성은 세포 학적 접근 방법 또는 대량 염기 서열 중 하나를 평가 하였다. 이러한 현장 하이브리드 (FISH), 염색체 확산 및 스펙트럼 핵형 (SKY)에서 형광으로 세포 학적 접근 방법은, 각각의 세포에 존재하는 식별 변경의 이점을 가지고 있지만 하이브리드 및 (11) 확산의 이슈로 인해 높은 오류율이 있습니다. 이러한 접근 방식은 또한 그들의 해상도 만 공개 카피 수에 제한이 몇 메가베이스에 걸친 변경합니다. 시퀀싱 또는 대량의 DNA 마이크로 어레이, 정확성, 해상도하지만 더는 덜 민감하다. 인구 기반 접근법에 의해 유전 적 이질성을 검출하기 위해, 변형 인구 세포의 상당한 부분에 있어야한다. 단일 세포로부터 게놈 DNA를 증폭하는 방법의 출현이 가능한 단일 세포의 게놈 시퀀싱했다. 단일 셀 sequencing 적절한 품질 관리 방법이 적용되는 높은 해상도, 높은 감도와, 높은 정밀도 (12)의 이점을 갖는다.
여기서는 하나의 셀에서 megabase 스케일 카피 수의 변화를 검출하는 방법을 설명한다. 우리는 링커 어댑터 PCR을 이용하여 게놈 DNA를 증폭 차세대 시퀀싱을위한 라이브러리를 준비하고 사본 번호가 숨겨진 마르코프 모델과 원형 이진 분할 모두에 의해 변형 감지, microaspiration에 의해 단일 세포를 분리.
Protocol
1. 단일 세포 격리를
- microaspirator 준비
- 흡입기 튜브 어셈블리에서 투명한 플라스틱 끝을 제거하고 3/16 "내부 직경 1 피트 길이의 PVC 튜브의 한쪽 끝으로 좁은 끝을 삽입합니다.
- 3/6 "내부 직경 1 피트 길이의 PVC 튜브의 다른 쪽 끝으로 0.2 μm의 주사기 필터의 출구를 삽입합니다.
- 5/16 "내경 6 인치 길이의 PVC 호스의 일단에 0.2 μm의 주사기 필터의 입구를 삽입한다.
- 옵션 : 반 5/16 "내부 직경 6 인치 길이의 PVC 튜브를 잘라 두 부분 사이에 인라인 워터 트랩을 삽입합니다.
- 1 ML의 졸업에 5 mL의 플라스틱 혈청 학적 피펫을 깨고 5/16 "내경을 가진 PVC 튜브의 개방 단부에 깨진 끝을 삽입합니다.
- 흡인기 튜브 어셈블리의 유연한 끝 (투명 플라스틱 끝으로 5 ㎖ 플라스틱 혈청 학적 피펫의 출구를 삽입)가 제거되었다.
- 저장 용 멸균 플라스틱 튜브 흡입기 튜브 조립체의 적색 피스 커버.
- 분젠 버너의 화염 튜브 근처의 중앙을 가져 상기 튜브의 양단에 장력을 적용하여 10 내지 30 ㎛, 내경 유리 모세관을 그린다. 두 전위 흡입기 바늘을 만드는 중간에 그려진 튜브 브레이크. 같은 일부 튜브 단일 세포를 따기에 적합한 내부 직경이 종료됩니다 여러 튜브이 단계를 반복합니다.
- 스토리지를 들어, 15cm 페트리 접시에서 모델링 점토의 두 개의 스트립을 배치하고 스트립에 걸쳐 흡입기 바늘을 고정합니다.
- 셀 선택
- 셀 타입 및 실험 적절한 단일 세포 현탁액을 준비한다. 예를 들어, 적절한 매체를 함유하는 원뿔형 튜브에 트립신 처리 및 전송 세포에 의한 인간 섬유 아세포 세포주 수확 세포로서 부착 세포를 제조 하였다.
- 전, 도중, 또는따고는 단일 세포 현탁액 (그것은 단일 세포 현탁액을 제조하는 데 걸리는 시간)에 따라 설치 전체 게놈 증폭 용 후드의 제조.
- 10 % 표백제와 후드, 피펫 팁 상자 및 피펫 팁의 표면을 스프레이하고 종이 타월로 닦아냅니다. 70 % 에탄올로이 단계를 반복합니다.
- 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 전체 게놈 증폭 (WGA) 키트에서 물 8 μL를 추가, 각 셀에 대한 하나의 웰 서열합니다. 얼음에 96 웰 조직 배양 플레이트 장소에서 뚜껑을 96 웰 PCR 플레이트를 커버.
- 15cm 페트리 접시에 10 mL의 미디어 또는 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 1,000 셀을 추가하고 접시에 부착 세포를 방지하기 위해 얼음에 접시를 놓습니다.
- 10X 목표와 광학 현미경으로 얼음에 뚜껑을 페트리 접시에서 세포와 96 - 웰 PCR 플레이트를 가져옵니다.
- 부드럽게 번째의 인출 끝을 눌러 흡입기 바늘의 개방을 증가하드 표면에 전자 흡인기 바늘 끝이 끊기는하도록. microaspirator의 맑은 끝으로 흡인기 바늘의 넓은 끝을 삽입합니다.
- 현미경 무대에서 세포를 포함하는 페트리 접시를 놓습니다. 입에 흡입기의 붉은 마우스 피스를 놓습니다. 세포를 포함하는 페트리 접시를 이동 흡입기 니들 한편 이동 한 손을 사용한다. 하나의 세포를 확인하는 염기 서열합니다.
- 입 흡입을 사용하여 미디어 또는 PBS의 ~ 1-2 μL와 함께 흡입기 바늘에 단일 셀을 그립니다. 96 웰 PCR 플레이트의 한 웰 내의 수분 8 μL로 셀을 전송. 셀 전송시 기포를 도입 피한다.
- 세포의 원하는 번호가 격리 될 때까지 단계를 반복 1.2.7. 얼음에 PCR 플레이트를 유지하고 따기 세포 사이에 뚜껑으로 덮여있다. 세포를받은 우물을 표시합니다.
- 단셀 따기 동안 전체 g에서 10X 단일 세포 용해 버퍼 단편화 해동enome 증폭 키트. 세포의 수를 수확 한 후, 전체 게놈 증폭 즉시 진행.
2. 전체 게놈 증폭
- 전체 게놈 증폭 동안 오염을 방지 조직 문화 후드 내부의 모든 시약을 추가, 필터 피펫 팁을 사용하고, 우물 사이에 피펫 팁을 변경합니다.
- 전체 게놈 증폭 (WGA) 키트에서 작업 용해 및 조각 완충 용액을 준비합니다. 최대 32 개의 셀들의 각각의 세트를 들면, 마이크로 원심 튜브에 테 K 용액을 10 배 단일 세포 용해 단편화 완충액 2 μL의 32 μL를 결합한다. 솔루션을 혼합 튜브를 소용돌이.
- 각 웰에 용해하고 분열 완충 용액 작업의 1 μL를 추가하고 최대 피펫 아래로 혼합.
- 접시를 덮고 플라스틱 필름 모든 우물을 봉인. 간단히 미니 플레이트 스피너에서 접시를 원심 분리기.
- FOLL로 열 사이클OWS : 50 ° C, 1 시간 99 ° C, 4 분.
- 얼음에 플레이트를 냉각시키고 간단히 미니 플레이트 스피너에서 접시를 원심 분리기.
- 전체 게놈 증폭 키트에서 작업 라이브러리 준비 완충 용액을 준비합니다. 각 셀에 대해, 1 배 단일 셀 라이브러리 제제 완충액 2 μL 및 미세 원심 분리 튜브에서 라이브러리 안정화 용액을 1 μL를 결합한다. 같은 microcentrifuge 관의 여러 세포의 작업 솔루션을 준비합니다.
- 플라스틱 필름을 제거하고 각 웰에 라이브러리 준비 완충 용액 작업의 3 μL를 추가합니다. 섞어 잘 위아래의 내용을 피펫. 플라스틱 필름을 교체합니다.
주 : 웰 필름의 보어 홀을 시작할 때까지 플라스틱 필름 전체 게놈 증폭 과정을 통해 재사용 될 수있다. 이 때, 새로운 플라스틱 필름으로 전환. - 간단히 미니 플레이트 스피너의 판을 원심 분리하고 2 분 동안 95 ° C에서 품어.
- 얼음에 잠시 플레이트를 냉각미니 플레이트 스피너에서 접시를 원심 분리기.
- 플라스틱 필름을 제거 각 웰에 1 μL를 라이브러리 제조 효소를 추가까지 웰의 내용물을 피펫 다운 믹스. 얼음 또는이 단계에 걸쳐 추운 블록에 도서관 준비 효소를 유지합니다. 플라스틱 필름을 교체합니다.
- 16 ° C, 20 분, 24 ° C, 20 분, 37 ° C, 20 분, 75 ° C, 5 분, 4 ℃에서 길게 간단히 다음과 같이 미니 플레이트 회 전자 및 열 사이클에 접시를 원심 분리기.
- 얼음에 플레이트를 냉각시키고 간단히 미니 플레이트 스피너에서 접시를 원심 분리기.
- 전체 게놈 증폭 키트에서 작업 증폭 믹스를 준비합니다. 각 셀에 대해, 48.5 μL, 물 7.5 μL 배 증폭 마스터 믹스 및 microcentrifuge 관 5 μL WGA DNA 중합 효소를 결합한다. 같은 microcentrifuge 관에 여러 셀에 대한 작업 믹스를 준비합니다. 얼음에 작업 믹스를 유지합니다.
- 플라스틱 필름을 제거 증폭 혼합 작업 61 μL를 추가잘 아래 위로의 각 웰, 피펫의 내용을 혼합합니다. 얼음 또는이 단계에 걸쳐 감기 블록에서 작업 증폭 믹스를 유지합니다. 플라스틱 필름을 교체합니다.
- 95 ° C, 3 분, 94 ° C의 25주기, 30 초, 65 ° C, 5 분, 4 ℃에서 길게 간단히 다음과 같이 미니 플레이트 스피너에서 판과 열 사이클을 원심 분리기.
- 3 단계에서 사용하기 위해 20 ° C -에서 별도의 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 각 샘플의 양도 60 μL.
- 각 샘플 (시료 15 μL에 즉 3 μL 6 배의 DNA 로딩 염료)의 나머지 볼륨에 DNA 로딩 염료를 추가하고 1 % 아가로 오스 겔의 각 반응에서 5 μL를 실행합니다.
참고 : 성공적으로 250에서 1,000 bp의에 얼룩으로 표시됩니다 증폭 세포. 얼룩을 표시하거나 단지 희미한 얼룩을 표시하지 않습니다 샘플은 유용한 시퀀싱 데이터를 얻을 가능성이 있습니다.
3. 시퀀싱
- 상자성 구슬 샘플을 정화.
- 타얼음 w DNA 샘플. 용액을 균질하고 적어도 30 분 동안 실온에서 비드를 부화 소용돌이 상자성 비드까지.
- 깨끗한 microcentrifuge 관에 각각의 DNA 샘플의 20 μL를 전송합니다. 샘플의 나머지는 -20 ° C에서 저장 될 수있다.
- 각각의 DNA 샘플과 혼합하는 소용돌이에 상자성 구슬 30 μL (1.5 배)를 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 샘플을 인큐베이션. 단계 3.4에서 사용하기에 실온에서 구슬의 원액을 그대로 둡니다.
- 2 분 동안 자기 튜브 스트립에 튜브를 배치하거나, 비드를 펠릿을 형성 할 때까지 상청액은 분명하다.
- P200 피펫을 사용하여 비드를 교란시키지 않고 가능한 한 상등액만큼 제거한다.
- DNA를 비드 혼합물에 80 % 에탄올 180 μL를 추가합니다. 튜브를 에탄올 용액을 통해 비즈 "를 씻어"에 자석을 기준으로 여러 번 회전합니다.
- P200 피펫을 사용하여, possi와 에탄올 세척의 정도를 제거구슬을 방해하지 않고 BLE.
- 3.1.6과 3.1.7를 반복합니다.
- 공기는 약 10 분 동안이나 더 이상의 에탄올을 볼 수 없을 때까지 구슬을 건조. 구슬이 금이 나타날 때 다음 단계로 진행 또는 튜브의 벽을 넘어.
- 자기 스트립에서 샘플을 제거합니다. 구슬의 DNA를 용출하고 구슬을 재현 탁하기 위해 샘플을 와동 10 mM 트리스 산도 8.0의 40 μL를 추가합니다. 실온에서 2 분 동안 인큐베이션.
- 간단히 튜브의 바닥에 액체를 수집 및 적어도 두 분 동안 자기 튜브 스트립에 튜브를 배치하기 위해 원심 분리. 구슬을 방해하지 않고 깨끗한의 microcentrifuge 튜브에 용리액을 전송합니다.
- 샘플 정상화
- 분광 광도계를 사용하여 각 시료의 농도를 정량화. 농도는 10 ~ 30 NG / μL의 범위해야합니다.
- 10 mM 트리스 산도 8.0을 사용하여 0.2 NG / μL 각 샘플을 희석. 다음 단계는 최소한 내가 필요합니다이 희석 5 μL의 nput.
- 도서관 준비
- 라이브러리 준비 키트 (13)의 지침에 따라 시퀀싱 라이브러리를 준비합니다.
- 최종 정리
- 3.1 단계에 따라 샘플을 청소합니다. 50 염기쌍, 75 염기쌍, 150 염기쌍의 판독 길이는 각각 1.5 배, 1 배 또는 0.6 배의 부피를 샘플링하는 입자의 비율을 사용한다. 10 mM 트리스 산도 8.0의 15 μL로 용출.
- 라이브러리 (14)의 입도 분포를 확인할 단편 분석기에 시료를 실행. 크기 분포를 균일하게 150 내지 900 bp의 확산한다.
- qPCR에를 사용하여 샘플을 정량화
- 도서관 정량 키트를 사용하여 키트 지침 (15)에 따라 qPCR에 반응을 설정합니다. 긍정적 인 표준 (키트에서 DNA 표준) 및 음의 기준 (물 또는 다른 빈 솔루션을) 추가 열을 비워 둡니다.
- FOL로 열 사이클기온 : 95 ° C, 5 분 (4.8 ° C / 초 램프 속도) 및 95 ° C, 30 초 (4.8 ° C / 초 램프 속도) 2.5 60 ° C, 45 초 (램프 속도의 35주기 ° C / 초).
- 풀링
- flowcell에 많은 차선이 필요한 방법을 결정하고 레인 당 하나의 그룹으로, 그룹으로 샘플을 나눕니다.
- 샘플의 각 그룹에 대해, 단계 3.5.2의 qPCR의 데이터에 기초하여, 낮은 농도를 갖는 샘플을 선택하고 10 mM 트리스 pH가 8.0를 이용하여 그 농도에 해당 그룹의 모든 샘플들을 정규화.
- 함께 각 그룹의 샘플을 풀.
- 시퀀싱
- 표준 절차 (16) 다음 차세대 시퀀싱 시스템에로드 풀.
4. 데이터 분석
참고 : 유닉스 기반 환경이이 섹션의 프로그램과 스크립트를 실행하는 데 필요합니다. 자신의 다음과 같은 프로토콜에 언급 된 소프트웨어를 설치 줄어들어 설치 가이드. 모든 스크립트는 https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/에서 찾을 수 있습니다.
- (가) FASTX-툴킷 버전 0.0.13 17 fastx_trimmer를 사용하여 40-NT를 읽어 낸다.
fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l (40) -o example.trim.fastq - (가) 기본 옵션 18 BWA 버전 0.6.1을 사용하여 적절한 참조 게놈 (마우스 mm9, 인간에 대한 hg19)에 읽어 맞 춥니 다.
광대역 무선 접속의 AlN mm9.fa example.trim.fastq> example.sai
광대역 무선 접속 samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam - 다음 정렬하고 인덱스 생성 된 BAM 파일 SAMTools 버전 0.1.19 (19)를 사용하여, chrM 및 임의의 염색체에 정렬을 제거합니다.
그렙 -v -w chrM example.sam | 그렙 -v 랜덤> example.filtered.sam
| samtools는 -uSh example.filtered.sam을 볼 수 samtools 정렬 - example.filtered
samtools 인덱스 example.filtered.bam - CNVs를 감지하는 HMMcopy를 실행= "외부 참조"> (20)
- 게놈에 대한 GC 비율 참조 파일을 생성 HMMcopy에 gcCounter를 사용합니다. 창 크기를 지정하는 "500000 -w '옵션을 사용합니다. 단계 4.2에서 사용되는 FASTA 참조 파일의 동일한 버전을 사용하지만, 확인 chrM을 확인하고 임의의 염색체는 FASTA 파일에서 제거됩니다.
gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig - mappability에 대한 호기심 파일을 생성 HMMcopy에 generateMap.pl를 사용합니다. 길이를 읽을 지정 "40 -w '옵션을 사용합니다. 단계 4.4.1에서 사용되는 동일한 FASTA 참조 파일을 사용합니다.
generateMap.pl -b mm9.fa
generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig - 게놈에 대한 mappability 참조 파일을 생성 HMMcopy에 mapCounter를 사용합니다. 창 크기를 지정하는 "500000 -w '옵션을 사용합니다.
mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig - 각각의 BAM 파일에 대한 호기심 파일을 생성 HMMcopy에 readCounter를 사용합니다.
readCounter 500000 example.filtered.bam> input.wig -w 상기 R 스크립트에서 참조 파일에 대한 경로 수정 (run_hmmcopy.mm9.r 또는 run_hmmcopy.hg19.r), 4.4.1 (예를 들어, mm9_gc.wig) 및 4.4.3 (예를 들어, mm9_map 위에서 생성 된 파일을 사용합니다. 각각 GC 비율 참조 파일과 mappability 참조 파일을 참조 변수의 GFILE 및 MFILE를위한 가발). 그런 다음 제공된 R 스크립트 "run_hmmcopy.mm9.r"또는 "run_hmmcopy.hg19.r"를 실행합니다.
R CMD 배치 run_hmmcopy.mm9.r
또는
R CMD 배치 run_hmmcopy.hg19.r - BAM 파일 세트의 배치 처리의 경우, (VS)에 세그먼트를 호출 가변성 점수를 계산하기 위해 패키지에 제공되는 스크립트 "HMMpipe.pl"을 하나의 폴더에 BAM 파일을 넣고 실행. 형식을 따르십시오 :
펄 HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles mm9
- 게놈에 대한 GC 비율 참조 파일을 생성 HMMcopy에 gcCounter를 사용합니다. 창 크기를 지정하는 "500000 -w '옵션을 사용합니다. 단계 4.2에서 사용되는 FASTA 참조 파일의 동일한 버전을 사용하지만, 확인 chrM을 확인하고 임의의 염색체는 FASTA 파일에서 제거됩니다.
- CNVs (21)를 검출하는 DNAcopy를 실행합니다.
- 고유 각 BAM 파일에서 읽어 매핑 추출 SAMtools 버전 0.1.19을 사용합니다.
samtools보기 -h -F 0x0004의 example.filtered.bam | egrep을 -i "^ @ | XT : A : U"| samtools가 -Shu를 볼 -> example.mapped.bam - BAM에서 PCR 중복 22 파일 표시 피카 버전 1.94에서 MarkDuplicates를 사용합니다.
MarkDuplicates.jar의 INPUT -jar 자바 = example.mapped.bam 출력 = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = 사실 - 버전 2.17.0 매핑 계산 bedtools에 coveragebed 사용은 제공 BED 파일 "mm9.500k.dynamic.win.bed"또는 "hg19.500k.dynamic.win.bed"23 미리 정의 된 동적 5백킬로바이트의 매핑 할 윈도우의 각 읽고 .
coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | 종류 -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts - 제공된 GC 함량 참조 파일 "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt"또는 "hg19.500k.dynamic.win.fa에 기초하여 판독 횟수를 정상화 제공된 펄 스크립트"normalizeGC.pl "를 사용한다. gc.txt ".
펄 normalizeGC.PL mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts - 세그먼트를 호출 제공 R 스크립트 "dnacopy.r"를 사용합니다.
R CMD 배치 dnacopy.r
- 고유 각 BAM 파일에서 읽어 매핑 추출 SAMtools 버전 0.1.19을 사용합니다.
- CNVs를 확인
- 4.4.6에서 계산 된 VS가 0.26을 초과하는 세포를 제외합니다.
- 하는 중간 로그 2 비율보다 큰 0.4 (추정 이득) 이하보다 -0.35 (추정 손실)입니다 만 포함 4.4.6에 HMMcopy에 의해 호출 된 세그먼트를 필터링합니다.
- 세그먼트는 평균 0.6 이상 초과 1.32 이하 만되는 포함 4.5.5에 DNAcopy에 의해 호출 된 세그먼트를 필터링합니다.
- 만 HMMcopy 및 DNAcopy 모두가 추정 손익 추정 손실을 식별 지역에서 CNVs를 호출, 4.6.2과 4.6.3에서 세그먼트를 겹칩니다.
Representative Results
조립 흡입기는 그림 1A에있는 것과 유사하게 나타납니다. 바늘은 아니지만 너무 넓은 다량이 단일 셀에 작성되어 하나의 셀을 수용하기에 충분히 넓게되도록 그려 질 것이다. 10 배 필드 (그림 1B) 한 사이 오 세포가있을 때 하나의 세포를 흡입하는 것이 가장 쉬운 방법입니다.
전체 게놈 증폭에 성공하면, 샘플은 아가 로스 겔상에서 스미어으로 표시 (도 2, 레인 1, 2, 4, 5, 6, 7)된다. 희미한 또는 부재 스미어는 실패 증폭 반응을 나타내며 샘플 순서가되어서는 안된다 (그림 2, 3 레인과 8).
라이브러리를 제조 후, 샘플의 단편 크기 분포 단편 분석기 모세관 전기 영동에 의해 평가되어야한다.성공적으로 제조 된 라이브러리 (150)로부터 900 bp의 단편을 크기의 비교적 균일 한 분포를 가질 것이다 (도 3, A, B). 실패 라이브러리 준비는 왜곡 조각 크기 분포가 발생합니다 및 라이브러리 (그림 3C) 염기 서열을 할 수 없습니다.
숨겨진 마르코프 모델 (HMMcopy) 및 순환 이진 분할 (DNAcopy)를 통해 시퀀싱 데이터를 처리하면 추정 카피 수의 세그먼트로 각 셀의 게놈을 분석합니다. 이 부분은 다음 단일 셀 (표 1)의 손익과 일치 추정 카피 수있는 사람을 식별하기 위해 필터링 할 수 있습니다. HMMcopy 및 DNAcopy에서이 필터링 된 세그먼트는 높은 신뢰 CNVs를 식별하기 위해 중복되어야한다.
1. 단일 세포 격리 그림. ( a)는이 microaspirator 조립. (B) 10 배 필드 보여주는 세포 (화살표)과 microaspirator 바늘 (오른쪽 아래 모서리)을 분해. 10 배 필드에 한 사이 오 세포가있을 때 하나의 세포를 흡입하는 것이 가장 쉬운 방법입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 전체 게놈 증폭 그림. 전체 게놈 증폭 산물의 5 μL의 아가 로스 겔 전기 영동. 성공적 1킬로바이트 100 염기쌍으로부터 밝은 얼룩 나타날 것이다 증폭 샘플 (레인 1, 2, 4, 5, 6, 7) 및 시퀀싱 될 수있다. 성공적으로 희미한 얼룩 또는 전혀 스미어 (레인 3, 8)를 생산할 예정 증폭하지 않고 염기 서열을해서는 안 샘플.large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 라이브러리 준비. 조각 분석기에서 대표 결과. 그래프는 Y 축의 X 축 및 상대적인 형광 단위 (RFU)에 (BP)에 단편의 크기를 나타낸다. 각 그래프의 오른쪽 시뮬레이션 겔 차선이다. (A)는 150과 900 bp의 사이에 날카로운 봉우리 또는 한쪽 방향으로 편향없이 고른 분포로, 이상적인 샘플 결과. 이 샘플 시퀀싱 허용됩니다. 크기 분포 괜찮은 샘플에서 (B) 결과, 낮은 조각 크기를 향해 기울어. 이 최적은 아니지만, 샘플은 여전히 서열화 될 수있다. (C)은 주로 작은 단편 크기가 실패한 샘플 결과. 이것은 가능성이 tagmentation 단계에서 장기간 배양에 의해 발생라이브러리 준비. 이 샘플은 순서가되어서는 안된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| HMMcopy | |||||||
| 견본 | 분절 | 대하 | 스타트 | 종료 | 상태 | 중앙값 | |
| D15-4998 | (23) | chr8 | 144500001 | 146500000 | 6 | 0.5008794 | |
| D15-4998 | (29) | chr10 | 67000001 | 134500000 | 6 | 0.4031945 | |
| D15-4998 | (52) | 기음hr19 | 1 | 20000000 | 6 | 0.4616884 | |
| D15-4998 | 57 | chrY | 1 | 59500000 | 이 | -1.506532 | |
| DNAcopy | |||||||
| 견본 | 크롬 | 시작 함 | 종료 함 | 스타트 | 종료 | 원세그 평균 | 원세그 의대 |
| D15-4998 | chr10 | (88) | 197 | 62612945 | 129971511 | 1.4688 | 0.157 |
| D15-4998 | chr19 | 0 | (31) | 0 | 28416392 | 1.4141 | 0.1674 |
| D15-4998 | CHRX | 77 | (126) 51659160 | 95343369 | 1.3548 | 0.1874 | |
| D15-4998 | chrY | 0 | (14) | 0 | 23805358 | -2.7004 | 0.3591 |
표 1. 데이터 분석. 단일 셀에서 HMMcopy 및 DNAcopy에 의해 생성 된 필터링 세그먼트. 이 두 결과를 겹치는 것은 67 ~ 130 메가에서 염색체 10에 이득뿐만 아니라 0 ~ 20 메가에서 염색체 19에 이득을 보여준다. 우리는 염색체 19의 근위 부분 이익이 단일 셀 시퀀싱 (12)의 유물 것을 발견했다.
Discussion
전통적으로 생선과 SKY 등의 세포 학적 방법을 필요 단일 세포 수준에서 CNVs와 이수성를 식별. 이제, 단일 셀 시퀀싱는 질문에 대한 대체 방법으로 떠오르고있다. 이 게놈 전체와 높은 해상도 모두 같이 단일 세포 순서는 생선과 하늘 이점이있다. 적절한 품질 관리 방법이 적용되는 때 물고기와 SKY 고유의 하이브리드 및 확산 이슈에 민감하지 더욱이, 단일 셀 시퀀싱은보다 안정적인 CNVs의 평가와 이수성를 제공 할 수 있습니다. 그러나, 단일 셀 시퀀싱의 최근 응용 프로그램의 많은 방법의 철저한 감도의 평가와 특이도에 의해 입증 및 분석되지 않았다. 실제로, 다른 연구에서 사용 된 분석 방법 중 일부 가양 CNV 12 호출의 고주파 (> 50 %)와 관련이있다. 우리가 설명하는 방식은 엄격히 KN의 세포를 사용하여 시험 한CNV 검출 (12)의 민감도와 특이도를 true와 false 검색 속도를 결정하고 최적화하기 위해 자신의 CNV 부담. 10 메가 비트를 초과하는 품질 관리 및이 프로토콜에 설명 된 분석 방법, 5MB의 이득의 약 20 %, 5 메가 손실의 75 %, 모든 CNVs을 사용하는 것이 검출 될 수있다. 단일 세포 서열의 잘못된 탐색 비율을 결정하는 것은 곤란하지만, 우리는 25 % 미만인 것으로 추정하고있다. 이 프로토콜은 다양한 소스로부터 세포에 적용 할 수 있고, 스크립트 CNV 검출의 해상도를 조정하도록 변경 될 수 있으며, 프로토콜은 유전자 변형의 다른 유형을 식별하도록 구성 될 수있다.
가 단일 세포에 신선한 조직 해리 다양한 수단이 있으며, 많은 서적 피부 (24) 및 뇌 (25)과 같은 특정 조직에 대해 최적화 절차를 설명한다. 이 fo를 허용하는 우리는 microaspiration에 의해 단일 세포를 분리하는 것을 선호 각 셀의 R 시각적 평가는 서열화한다. 그러나, 형광 - 활성화 된 세포 소팅 (FACS) (26) 및 마이크로 유체 장치 (27)에 의해 단일 세포를 분리하는 것도 가능하다. 단일 세포 단리 전체 게놈 증폭 수동으로 수행되는 경우, 분리 및 단번에 마흔 셀을 증폭하는 것이 합리적이다. 고품질 단세포 시퀀싱 데이터를 획득하기 위해서는, 단일 세포 게놈의 증폭이 균일하고 완전한 것이 중요하다. 우리는 용해 및 증폭의 효율뿐만 아니라 고립 된 단일 셀의 품질이 시퀀스 데이터의 품질에 큰 영향을 미치는 것을 발견. 이와 같이, 세포는 세포가 분리 후 즉시 시작해야 직전 단리 전체 게놈 증폭 그 나라의 환경에서 수확한다. 단계의 2.3-2.6에 설명 된대로 또한, 용해 및 분열 단계를 정확히 따라야한다.
">은 알고리즘 민감도와 특이도 12의 효과에 반대하여, CNV 검출의 해상도를 변경하도록 조절 될 수있다. tetraploidy (11)의 설정에서 전체 염색체 이수성를 검출하는 임계 값을 조정하는 것도 가능하다. 그러나 발견 전체 게놈 증폭 동안 도입 된 노이즈가 작은 변형 (12)의 검출을 복잡 우리의 접근은 CNVs 이상 5MB의 검출로 제한된다. 전체 게놈 증폭 방식의 미래 개선 궁극적 단세포 시퀀싱을 이용하여 CNV 검출의 분해능을 향상시키는 것이다.단일 셀 시퀀싱뿐만 아니라 복사 번호 변경의 조사뿐만 아니라 단일 염기 변이 (28), (29) 및 구조 변화 30 수 있습니다. 단일 세포 분리를위한 우리의 프로토콜은 이러한 다른 가야 답변을 적용 할 수 있습니다stions. 그러나, 전체 게놈 증폭 방법의 선택은 특정 애플리케이션에 의존한다. 중합 효소 연쇄 반응에 기초이 프로토콜에 설명 된 방법은이 증폭 바이어스 (32)의 하부 수준과 연관되어 있기 때문에 카피 수의 변경을 검출하기 적합하다. 이러한 단일 염기 다형성 게놈 변화의 다른 유형을 조사하는 전체 게놈 증폭하는 다른 방법은 31, 32보다 적합한 것으로 믿어진다.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는이 원고에 대한 의견 스튜어트 레빈 감사합니다. 이 작품은 건강 보조금 GM056800 국립 연구소와 안젤리카 아몬의 캐시 및 커트 대리석 암 연구 기금과 코흐 연구소 지원 보조금 P30-CA14051에 의해 부분적으로 지원되었다. 안젤리카 아몬은 또한 하워드 휴즈 의학 연구소 및 생물 의학 연구를위한 글렌 재단의 연구원입니다. KAK는 NIGMS 교육 그랜트 T32GM007753에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177 | |
| PVC tubing (ID 3/16", OD 5/16", ~1 foot) | VWR | 89068-500 | |
| PVC tubing (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inches) | VWR | 89068-508 | |
| Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 µm) | VWR | 28144-040 | |
| Serological pipette (5 mL) | BioExpress | P-2837-5 | Any plastic 5 mL pipette should suffice |
| In-Line Water Trap for Oxygen Use | Amazon.com | 700220210813 | |
| Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length) | VWR | 34502-99 | |
| Modeling clay | VWR | 470156-850 | |
| Petri dish (150 mm diameter) | VWR | 25384-326 | Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells |
| Hard-Shell Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR Plates | Bio-Rad | HSS9601 | Any 96-well PCR plate should suffice |
| 96-well tissue culture plate | VWR | 62406-081 | Any 96-well tissue culture plate should suffice |
| GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit | Sigma | WGA4 | |
| Microseal 'A' Film | Bio-Rad | MSA5001 | |
| Mini plate spinner | Thomas Scientific | 1225Z37 | |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1861096 | Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate |
| Agencourt Ampure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Dynamag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Any similar magnetic tube strip should suffice |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-121-1012 | |
| Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480) | Kapa Biosystems | KK4845 | This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine. |
References
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