Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Published: February 17, 2017 doi: 10.3791/55143
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5
1Koch Institute for Integrative Cancer Research, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Howard Hughes Medical Institute, 3Division of Health Sciences and Technology, Harvard Medical School, 4The Barbara K. Ostrom (1978) Bioinformatics and Computing Facility in the Swanson Biotechnology Center, Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 5BioMicro Center, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology

Summary

Enkelt celle sekvensering er et stadig mer populært og tilgjengelig verktøy for adressering genomisk endringer i høy oppløsning. Vi tilbyr en protokoll som bruker enkelt celle sekvensering for å identifisere kopitall endringer i enkeltceller.

Abstract

Deteksjon av genomiske forandringer på enkel celle oppløsning er viktig for karakterisering av genetisk heterogen og evolusjon i normale vev, kreft, og mikrobielle populasjoner. Tradisjonelle metoder for å vurdere genetisk heterogeniteten har vært begrenset av lav oppløsning, lav følsomhet, og / eller lav spesifisitet. Enkelt celle sekvensering har dukket opp som et kraftig verktøy for å avdekke genetisk heterogenitet med høy oppløsning, høy følsomhet og når riktig analysert, høy spesifisitet. Her gir vi en protokoll for isolasjon, hele genomet forsterkning, sekvensering, og analyse av enkeltceller. Vår tilnærming åpner for sikker identifikasjon av megabase stilt eksemplar nummer varianter i enkeltceller. Imidlertid kan aspekter ved denne protokollen også anvendes for å undersøke andre typer av genetiske endringer i enkeltceller.

Introduction

Endringer i DNA kopiantall kan variere i størrelse fra flere basepar (kopi antall varianter) (CNVs) til hele kromosomer (Aneuploidy). Kopi antall endringer som påvirker store regioner av genomet kan ha betydelige fenotypiske konsekvenser ved å forandre ekspresjon av opp til flere tusen gener 1, 2. CNVs som er til stede i alle celler i en populasjon kan påvises ved bulk-sekvensering eller mikromatrisebasert metode for 3, 4. Imidlertid kan populasjoner også være genetisk heterogene, med CNVs eksisterende i en undergruppe av befolkningen eller enkeltceller. Genetisk heterogenitet er vanlig i kreft, kjøring tumorutvikling, og også til stede i normalt vev, med ukjent konsekvens 5, 6, 7, 8, 9 10.

Tradisjonelt ble genetisk heterogenitet vurdert enten av cytologiske tilnærminger eller bulk sekvensering. Cytologiske metoder, som fluorescens in situ hybridisering (FISH), kromosom sprer seg, og spektral karyotypering (SKY), har fordelen av å identifisere endringer stede i enkeltceller, men har høye feilrater på grunn av gjenstander av hybridisering og spre 11. Disse metodene er også begrenset i sin kopi nummer oppløsning-bare å avsløre endringer spenner over flere megabases. Sekvense eller mikromatriser av bulk DNA, men høyere i nøyaktighet og oppløsning, er mindre følsom. For å påvise genetiske heterogenitet av populasjonsbaserte tilnærminger, må variantene være til stede i en vesentlig fraksjon av celler i populasjonen. Utviklingen av fremgangsmåter for å forsterke det genomiske DNA fra enkle celler har gjort det mulig å sekvensere genomet av enkeltceller. Enkelt celle Sequencing har fordelene av høy oppløsning og høy følsomhet, og, når passende kvalitetskontroll metoder anvendes, høy nøyaktighet 12.

Her beskriver vi en fremgangsmåte for å detektere megabase stilt kopi antall endringer i enkeltceller. Vi isolere enkeltceller ved microaspiration, forsterke genomisk DNA ved hjelp av linker-adapter PCR, forberede bibliotekene for neste generasjons sekvensering, og oppdage kopiantall varianter av både skjulte Markov modell og sirkulære binære segmentering.

Protocol

1. isolere enkeltceller

  1. Klargjør microaspirator
    1. Fjern den gjennomsiktige plastenden fra aspiratoren rørenheten og sette inn den smale enden til den ene ende av en en fot lange PVC-slanger med 3/16 "innvendig diameter.
    2. Sett utløpet av en 0,2 pm filter sprøyte inn i den andre enden av en fot lange PVC-slanger med 3/6 "innvendig diameter.
    3. Sett innløpet til 0,2 um sprøytefilter inn i en ende av en 6 tommer lang PVC-slanger med 5/16 "innvendig diameter.
    4. Valgfritt: Skjær 6 tommers-lange PVC slange med 5/16 "indre diameter i to og sette inn et in-line vannlås mellom de to halvdelene.
    5. Bryt en 5 ml plast serologisk pipette på 1 ml gradering og sette den brukne enden i den åpne enden av PVC-slanger med 5/16 "indre diameter.
    6. Sett utløpet av 5 ml plast serologisk pipette inn i den bøyelige ende av en aspirator slange (hvor den gjennomsiktige plastendehadde blitt fjernet).
    7. For lagring, dekker den røde munnstykket aspiratoren rørenheten med et sterilt plastrør.
    8. Trekke ut et glass kapillarrør til en indre diameter på 10-30 um ved å bringe i midten av røret i nærheten av en Bunsen-brenner-flammen og påføre strekk på hver ende av røret. Bryt trukne rør i midten for å lage to potensielle aspiratoranordninger nåler. Gjenta dette trinnet med flere rør som bare noen rør vil ende opp med en indre diameter som er passende for å plukke enkeltceller.
    9. For lagring, plassere to strimler av modelleire i en 15 cm petriskål og sikre aspirator nåler tvers av strimler.
  2. Plukk celler
    1. Forbered en enkelt celle suspensjon som passer for celletype og eksperiment. For eksempel, for å fremstille adherente celler så som humane fibroblast-cellelinjer, høste celler ved trypsinering og overføre cellene til et konisk rør inneholdende passende media.
    2. Før, under eller enfter forberede enkeltcellesuspensjon (avhengig av hvor lang tid det tar å forberede enkelt celle suspensjon), oppsett panseret for hele genomet forsterkning.
      1. Spray ned overflaten av hetten, pipette tips bokser, og pipetter med 10% blekemiddel og tørk med et papirhåndkle. Gjenta dette trinnet med 70% etanol.
      2. Tilsett 8 mL av vann fra hele genomet forsterkning (WGA) sett til individuelle brønner i en 96-brønners PCR-plate, en brønn for hver celle for å bli sekvensert. Dekk til 96-brønners PCR-plate med et lokk fra en 96-brønners vevkulturplate og sted på is.
    3. Legg 1.000 celler til 10 ml media eller fosfat saltvann (PBS) i en 15 cm petriskål og sett formen på is for å hindre at cellene fester seg til parabolen.
    4. Bringe cellene i petriskålen, og den 96-brønners PCR-plate med lokk på is til et lysmikroskop med 10X objektiv.
    5. Øk åpningen av aspirator nålen ved å banke lett på trukket ut slutten av the aspirator nål på et hardt underlag slik at spissen brekker av. Sett den brede enden av den aspirator nålen inn i den klare enden av microaspirator.
    6. Sett petriskål inneholdende celler på mikroskopet scenen. Den røde munnstykket på aspirator i munnen. Bruke en hånd til å bevege aspirator nål og den annen side for å bevege petriskål inneholdende celler. Identifisere enkeltceller til å bli sekvensert.
    7. Ved hjelp av munn sug, tegne en enkelt celle inn i aspirator nål sammen med ~ 1-2 mL av media eller PBS. Overfør cellen inn i 8 mL vann inne i en enkelt brønn av 96-brønners PCR-plate. Unngå å innføre bobler når du overfører cellen.
    8. Gjenta trinn 1.2.7 inntil det ønskede antall celler er blitt isolert. Hold PCR-platen på is og dekket med lokk i mellom lokasjonene celler. Marker brønnene som har mottatt celler.
      1. Mens plukke enkeltceller, tine 10X enkelt celle lysering og fragmentering buffer fra hele genome forsterkning kit. Etter plukke ønsket antall celler, fortsette umiddelbart til hele genomet forsterkning.

2. Hele Genome Amplification

  1. For å hindre forurensning under hele genomet forsterkning, legge alle reagenser inne i en vev kultur hette, bruke pipettespisser med filtre, og endre pipettespissen i mellom brønnene.
  2. Forbered en arbeider lyse og fragmentering bufferløsning fra hele genomet forsterkning (WGA) kit. For hvert sett med opp til 32 celler, kombinere 32 ul av 10 x enkeltcellelysering og fragmentering buffer og 2 ul av proteinase K-oppløsning i et mikrosentrifugerør. Vortex røret for å blande løsningene.
  3. Tilsett 1 mL av arbeidslyse og fragmentering bufferoppløsning til hver brønn og pipettere opp og ned for å blande.
  4. Dekk platen og forsegle alle brønner med en plastfilm. I korthet Sentrifuger plate i en mini plate spinner.
  5. Termisk syklus som Føllstrømmer: 50 ° C, 1 time og 99 ° C, 4 min.
  6. Avkjøl plate på is og kort sentrifuge platen i en mini plate spinner.
  7. Forbered en arbeider bibliotek forberedelse bufferløsning fra hele genomet forsterkning kit. For hver celle, kombiner 2 ul av 1 x enkelt celle bibliotek prepareringsbuffer og 1 mL av biblioteket stabilisering oppløsning i et mikrosentrifugerør. Klargjør arbeidsoppløsningen i flere celler i samme mikrosentrifugerør.
  8. Fjern plastfilmen og tilsett 3 mL av arbeids bibliotek fremstilling bufferløsning til hver brønn. Pipette innholdet av brønnen opp og ned for å blande. Sett på plastfilm.
    MERK: Plastfilmen kan brukes om igjen gjennom hele genomet forsterkning prosessen til brønnene begynner å bore hull i filmen. Når dette skjer, bytte til en ny plastfilm.
  9. I korthet Sentrifuger plate i en mini plate spinner og inkuber ved 95 ° C i 2 min.
  10. Avkjøl plate på is og rasktSentrifuger plate i en mini plate spinner.
  11. Fjern plastfilmen, tilsett 1 pl bibliotek fremstilling enzym til hver brønn, og pipette innholdet av brønnen opp og ned for å blande. Hold biblioteket fremstilling enzymet på is eller i et kaldt blokk gjennom dette trinnet. Sett på plastfilm.
  12. I korthet Sentrifuger plate i mini plate spinner og termiske syklus som følger: 16 ° C, 20 min, 24 ° C, 20 min, 37 ° C, 20 min, 75 ° C, 5 min, og holder ved 4 ° C.
  13. Avkjøl plate på is og kort sentrifuge platen i en mini plate spinner.
  14. Forbered en arbeider forsterkning blanding fra hele genomet forsterkning kit. For hver celle, kombinere 48,5 ul vann, 7,5 ul 10 x forsterkning konsentrat-blanding, og 5 ul WGA-DNA-polymerase i et mikrosentrifugerør. Forbered arbeids blanding av flere celler i samme mikrosentrifugerør. Hold arbeids mix på is.
  15. Fjern plastfilmen, legger 61 mL arbeider forsterkning mixtil hver brønn, og pipette innholdet godt opp og ned for å blande. Hold arbeids forsterkning mix på is eller i en kald blokk gjennom dette trinnet. Sett på plastfilm.
  16. I korthet Sentrifuger plate i en mini plate spinner og termiske syklus som følger: 95 ° C, 3 minutter, 25 sykluser ved 94 ° C, 30 sekunder og 65 ° C, 5 min, og holder ved 4 ° C.
  17. Overføre 60 ul av hver prøve til en separat mikrosentrifugerør og oppbevares ved - 20 ° C for anvendelse i trinn 3.
  18. Legg DNA lasting fargestoff til det gjenværende volum av hver prøve (dvs. 3 mL av 6x DNA lasting fargestoff til 15 ul av prøven) og kjøre 5 pl fra hver reaksjon på en 1% agarosegel.
    MERK: Celler som vellykket forsterket vises som en sverte fra 250 til 1000 bp. Prøver som ikke viser en sverte eller bare viser en svak smøre er usannsynlig å gi nyttige sekvense data.

3. Sekvense

  1. Rens prøver med paramagnetiske kuler.
    1. Thaw DNA-prøver på is. Vortex paramagnetiske kuler inntil oppløsningen er homogen og inkuber perlene ved romtemperatur i minst 30 min.
    2. Overfør 20 ul av hver DNA-prøve inn i en ren mikrosentrifugerør. Resten av prøven kan oppbevares ved -20 ° C.
    3. Tilsett 30 ul (1,5x) med paramagnetiske kuler til hver DNA-prøve og vortex å blande. Inkuber prøvene ved romtemperatur i 10 min. La stamløsning av perler ved romtemperatur for anvendelse i trinn 3,4.
    4. Plasser røret på en magnetisk strimmel rør i 2 minutter, eller inntil perlene danne en pellet, og supernatanten er klar.
    5. Ved hjelp av en pipette P200, fjerne så mye av supernatanten som mulig uten å forstyrre perlene.
    6. Legg 180 ul av 80% ethanol til DNA-perle-blandingen. Rotere rørene flere ganger i forhold til magneten for å "skylle" kulene gjennom etanolløsning.
    7. Ved hjelp av en pipette P200, fjerne så mye av etanolen vask som imidlegjengelig uten å forstyrre perlene.
    8. Gjenta 3.1.6 og 3.1.7.
    9. Lufttørke perlene i ca. 10 minutter eller inntil ikke mer etanol er synlig. Gå videre til det neste trinnet når Kulene forekommer sprekker eller faller av rørveggen.
    10. Ta prøvene fra magnetstripen. Legg 40 ul av 10 mM Tris pH 8,0 for å eluere DNA fra kulene og vortex prøvene for å resuspendere kulene. Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur.
    11. I korthet Sentrifuger prøvene for å samle opp væsken ved bunnen av røret og plassere rørene på en magnetisk strimmel rør i minst to minutter. Overfør elueringsmiddel i rene mikrosentrifugerør uten å forstyrre perlene.
  2. Eksempel normalisering
    1. Kvantifisere konsentrasjonen av hver prøve ved anvendelse av et spektrofotometer. Konsentrasjonene bør ligge fra 10 til 30 ng / mL.
    2. Fortynn hver prøve til 0,2 ng / pl under anvendelse av 10 mM Tris pH 8,0. Følgende trinn vil kreve et minimum input av 5 mL fra denne fortynning.
  3. bibliotek forberedelse
    1. Forbered sekvense bibliotekene ved å følge instruksjonene på biblioteket forberedelse kit 13.
  4. endelig opprydding
    1. Rengjør prøvene i henhold til trinn 3.1. For lese lengder på 50 bp, 75 bp, eller 150 bp, kan du bruke et forhold mellom perle å prøve volum på 1,5x, 1x eller 0,6x, henholdsvis. Eluer med 15 ul av 10 mM Tris pH 8,0.
    2. Kjøre prøvene på et fragment analysator for å kontrollere størrelsesfordelingen av biblioteket 14. Størrelsesfordelingen bør være jevnt fordelt 150-900 bp.
  5. Kvantifisere prøver ved hjelp av qPCR
    1. Ved hjelp av et bibliotek kvantifisering kit, satt opp en qPCR reaksjon i henhold til instruksjonene i settet 15. Legg igjen en kolonne tomt for å legge positive standarder (DNA standarder fra settet) og negative standarder (vann eller annen blank løsning).
    2. Termisk syklus som folger: 95 ° C, 5 min (rampehastighet på 4,8 ° C / sek) og 35 sykluser av 95 ° C, 30 sekunder (rampe hastighet på 4,8 ° C / sek) og 60 ° C, 45 sekunder (rampe hastighet på 2,5 ° C / sek).
  6. Bading
    1. Bestem hvor mange baner på Flowcell er nødvendig og dele prøvene inn i grupper, med en gruppe per kjørefelt.
    2. For hver gruppe av prøver, velger prøven med den laveste konsentrasjonen, basert på qPCR data fra trinn 3.5.2 og normalisere alle prøvene i den gruppen til den konsentrasjon ved anvendelse av 10 mM Tris pH 8,0.
    3. Pool prøvene i hver gruppe sammen.
  7. sekvense~~POS=TRUNC
    1. Laste bassengene på neste generasjons sekvensering maskin følgende standard prosedyrer 16.

4. Data Analysis

MERK: En Unix-basert miljø kreves for å kjøre programmer og skript i denne delen. Installer programvaren som er nevnt i protokollen etter deres i lasjon guider. Alle skript kan bli funnet på https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/.

  1. Trim leser 40-nt hjelp fastx_trimmer fra FASTX-Toolkit versjon 0.0.13 17.
    fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq
  2. Juster leser til den aktuelle referansen genomet (MM9 for mus, hg19 for human) bruker BWA versjon 0.6.1 med standardvalgene 18.
    BWA aln mm9.fa example.trim.fastq> example.sai
    BWA samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam
  3. Fjern justeringer til chrM og tilfeldige kromosomer, deretter sortere og indeksere den resulterende BAM-filen ved hjelp SAMTools versjon 0.1.19 19.
    grep -v -w chrM example.sam | grep -v tilfeldig> example.filtered.sam
    samtools vise -uSh example.filtered.sam | samtools sort - example.filtered
    samtools indeksen example.filtered.bam
  4. Kjør HMMcopy å oppdage CNVs= "Xref"> 20
    1. Bruk gcCounter i HMMcopy å generere en GC prosentvare for genomet. Bruk alternativet "-w 500000" for å angi størrelsen på vinduet. Bruk samme versjon av fasta referansefilen som brukes i trinn 4.2, men sørg for at chrM og tilfeldige kromosomer fjernes fra fasta fil.
      gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig
    2. Bruk generateMap.pl i HMMcopy å generere en vrikke fil for mappability. Bruk alternativet "-w 40" for å spesifisere lese lengde. Bruk samme fasta referansefilen som brukes i trinn 4.4.1.
      generateMap.pl -b mm9.fa
      generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig
    3. Bruk mapCounter i HMMcopy å generere en mappability vare for genomet. Bruk alternativet "-w 500000" for å angi størrelsen på vinduet.
      mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig
    4. Bruk readCounter i HMMcopy å generere en vrikke fil for hver BAM-fil.
      readCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig Endre banene til referansefiler i de R skript (run_hmmcopy.mm9.r eller run_hmmcopy.hg19.r), bruke filene generert ovenfor i 4.4.1 (f.eks mm9_gc.wig) og 4.4.3 (f.eks mm9_map. parykk) for variablene gfile og mfile, som refererer til GC prosentreferansefilen og mappability referansefilen, henholdsvis. Deretter kjører tilgjengelig R script "run_hmmcopy.mm9.r" eller "run_hmmcopy.hg19.r".
      R CMD PRODUKSJONS run_hmmcopy.mm9.r
      eller
      R CMD PRODUKSJONS run_hmmcopy.hg19.r
    5. For gruppebehandling av et sett av BAM-filer, sette BAM-filer i en enkelt mappe og kjør gitt script "HMMpipe.pl" i pakken for å ringe segmenter og beregne variasjoner score (VS). Følg format:
      perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9
  5. Kjør DNAcopy å oppdage CNVs 21.
    1. Bruk SAMtools versjon 0.1.19 for å trekke entydig kartlagt leser fra hver BAM-fil.
      samtools vise -h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i "^ @ | XT: A: U" | samtools vise -Shu -> example.mapped.bam
    2. Bruk MarkDuplicates i Picard versjon 1.94 for å markere PCR duplikater i BAM-filen 22.
      java-jar MarkDuplicates.jar INPUT = example.mapped.bam OUTPUT = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = sant
    3. Bruk coveragebed i bedtools versjon 2.17.0 å telle kartlagt leser i hver av de forhåndsdefinerte dynamisk 500kb kartlegg vinduer i den medfølgende BED filen "mm9.500k.dynamic.win.bed" eller "hg19.500k.dynamic.win.bed" 23 .
      coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sort -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts
    4. Bruk den medfølgende Perl script "normalizeGC.pl" for å normalisere lese teller basert på den medfølgende GC innhold referansefilen "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" eller "hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt ".
      perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts
    5. Bruk den medfølgende R script "dnacopy.r" å ringe segmentene.
      R CMD PRODUKSJONS dnacopy.r
  6. Identifiser CNVs
    1. Ekskluder celler hvor VS regnes i 4.4.6 stiger 0,26.
    2. Filter segmenter kalt av HMMcopy i 4.4.6 for å inkludere bare de som median log 2 forholdet er større enn 0,4 (antatt gevinst) eller mindre enn -0,35 (antatt tap).
    3. Filter segmenter kalt av DNAcopy i 4.5.5 for å inkludere bare de som segmentet mener er større enn 1,32 eller mindre enn 0,6.
    4. Overlapping segmentene fra 4.6.2 og 4.6.3, ringer CNVs bare i regioner der både HMMcopy og DNAcopy identifisere en antatt gevinst eller antatt tap.

Representative Results

Den monterte aspirator skal ligne på den i figur 1A. Nålen bør utformes slik at det er tilstrekkelig stort til å romme en enkelt celle, men ikke så stort at et stort volum er trukket opp med enkelt celle. Aspirere enkeltceller er enklest når det er mellom en og fem celler i en 10X felt (figur 1B).

Hvis hele genomet forsterkning er vellykket, vil prøven vises som et smøre på en agarosegel (figur 2, sporene 1, 2, 4, 5, 6, og 7). En svak eller fraværende smøre indikerer en mislykket amplifikasjonsreaksjon, og prøven bør ikke bli sekvensert (figur 2, sporene 3 og 8).

Etter bibliotek preparatet må fragmentet størrelsesfordelingen av prøvene vurderes ved kapillær elektroforese på et fragment analysator.Med hell fremstilt bibliotekene vil ha en ganske jevn fordeling av fragmentstørrelser 150-900 bp (figur 3, A, B). Harde bibliotek preparat vil resultere i en skjev fragment størrelsesfordeling og slike bibliotek bør ikke bli sekvensert (figur 3C).

Behandler sekvensdata gjennom skjulte Markov modell (HMMcopy) og sirkulær binære segmentering (DNAcopy) vil analysere genomet til hver celle i segmenter av anslått kopiantall. Disse segmentene kan deretter filtreres for å identifisere dem med et anslått kopitall i overensstemmelse med gevinst eller tap i en enkelt celle (tabell 1). Disse filtrerte segmenter fra HMMcopy og DNAcopy skal deretter overlappes for å identifisere høy tillit CNVs.

Figur 1
Figur 1. Enkelt celle isolasjon. ( A) En montert microaspirator. (B) En 10X feltet viser dissosiert celler (piler) og microaspirator nål (nederst til høyre). Aspirere enkeltceller er enklest når det er mellom en og fem celler i en 10X felt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Antall genom forsterkning. Agarosegelelektroforese av 5 ul av hele genomet amplifiseringsprodukter. Prøvene som vellykket forsterker vil fremstå som lyse utstryk fra 100 bp til 1 kb (spor 1, 2, 4, 5, 6 og 7) og kan bli sekvensert. Prøver som ikke klarer å forsterke vil produsere svake flyter ut eller ikke smøre (spor 3 og 8), og bør ikke bli sekvensert.large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Bibliotek forberedelse. Representative resultater fra et fragment analysator. Grafene viser fragment størrelse (i bp) på X-aksen og relative fluorescens enheter (RFU) på Y-aksen. Til høyre for hver graf er en simulert gel kjørefelt. (A) Resultater for en ideell prøven, med en jevn fordeling mellom 150 og 900 bp og uten skarpe topper eller skjevhet mot den ene siden. Denne prøven er akseptabel for sekvensering. (B) Resultater fra et ok utvalg, med en størrelsesfordeling skjev mot lavere fragmentstørrelser. Selv om dette ikke er optimale, kan prøven fortsatt bli sekvensert. (C) Resultater fra en mislykket prøve, med hovedsakelig små fragmentstørrelser. Dette er sannsynligvis forårsaket av langvarig inkubasjon under tagmentation trinnetav biblioteket forberedelse. Denne prøven bør ikke bli sekvensert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

HMMcopy
Prøve Segmentet Chr Start Slutt Stat median
D15-4998 23 chr8 144500001 146500000 6 0.5008794
D15-4998 29 chr10 67000001 134500000 6 0.4031945
D15-4998 52 chr19 1 20000000 6 0.4616884
D15-4998 57 chrY 1 59500000 2 -1,506532
DNAcopy
Prøve krom start-bin slutt bin Start Slutt Seg middel Seg Med
D15-4998 chr10 88 197 62612945 129971511 1,4688 0.157
D15-4998 chr19 0 31 0 28416392 1,4141 0,1674
D15-4998 chrX 77 126 51659160 95343369 1,3548 0,1874
D15-4998 chrY 0 14 0 23805358 -2,7004 0,3591

Tabell 1. Analyse av data. Filtrerte segmenter som genereres av HMMcopy og DNAcopy fra en enkelt celle. Overlappende disse to resultatene viser en gevinst på kromosom 10 fra 67 til 130 Mb samt en gevinst på kromosom 19 fra 0 til 20 Mb. Vi har funnet ut at gevinster på den proksimale del av kromosom 19 er et produkt av enkelt celle sekvense 12.

Discussion

Tradisjonelt identifisere CNVs og Aneuploidy på nivå med enkeltceller som kreves cytologiske metoder som fisk og SKY. Nå har enkelt celle sekvense dukket opp som en alternativ tilnærming til slike spørsmål. Enkelt celle sekvense har fordeler fremfor fisk og SKY som det er både genom-wide og høy oppløsning. Dessuten, når egnede kvalitetskontroll metoder brukes, kan enkelt celle sekvensering gir et mer pålitelig vurdering av CNVs og Aneuploidy som det ikke er utsatt for hybridisering og sprer seg gjenstander som ligger til FISH og SKY. Men mange av de siste programmene av enkelt celle sekvensering har ikke blitt underbygget av grundig vurdering av sensitivitet og spesifisitet av metodene og analyser. Faktisk er noen av de analytiske metoder som ble benyttet ved andre undersøkelser forbundet med høye frekvenser (> 50%) av falsk positiv CNV ringer 12. Tilnærmingen vi beskriver har blitt grundig testet ved hjelp av celler av knegen CNV byrde for å fastslå ekte og falske funnrate og optimalisere sensitivitet og spesifisitet av CNV gjenkjenning 12. Bruke kvalitetskontroll og analytiske tilnærminger beskrevet i denne protokoll, ca 20% av 5 Mb gevinster, 75% av 5 Mb tap, og alle CNVs over 10 Mb kan oppdages. Selv bestemme den falske funnrate på enkelt celle sekvensering er vanskelig, har vi anslått at det skal være mindre enn 25%. Denne protokollen kan anvendes på celler fra en rekke kilder, kan skript modifiseres for å justere oppløsningen av CNV deteksjon, og protokollen kan tilpasses for å identifisere andre typer av genomiske forandringer.

Det finnes en rekke måter for å dissosiere friske vev inn i enkeltceller, og mange publikasjoner beskriver fremgangsmåter som er optimalisert for spesifikke vev, slik som hud 24 og hjerne 25. Vi foretrekker å isolere enkeltceller ved microaspiration som det tillater fo r visuell vurdering av hver celle for å bli sekvensert. Det er imidlertid også mulig å isolere enkeltceller ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) 26 og microfluidic enheter 27. Hvis enkelt celle isolasjon og hele genomet forsterkning utføres manuelt, er det rimelig å isolere og forsterke opptil førti celler i én sitting. For å oppnå høy kvalitet på enkeltcelle-sekvenseringsdata, er det viktig at forsterkningen av enkeltcelle genomer er ensartet og fullstendig. Vi finner at kvaliteten av enkeltceller isolert, så vel som effektiviteten av lysering og forsterkning har en betydelig innvirkning på kvaliteten av sekvenseringsdata. Som sådan bør cellene høstes fra sitt opprinnelige miljø like før isolering og hele genomet forsterkning skal begynne umiddelbart etter at cellene er isolert. Videre bør lysis og fragmentering trinn bli fulgt nøyaktig som beskrevet i trinn 2.3 til 2.6.

"> Algoritmene kan justeres for å endre oppløsningen av CNV deteksjon, med motstridende effekter på sensitivitet og spesifisitet 12. Det er også mulig å justere terskler for å oppdage hel-kromosom Aneuploidy i innstillingen av tetraploidy 11. Imidlertid finner vi at vår tilnærming er begrenset til å påvise CNVs større enn 5 MB, som støy introdusert i løpet av hele genomet forsterkning kompliserer påvisning av mindre varianter 12. Fremtidige forbedringer i hele genomet forsterkning tilnærminger bør til slutt forbedre oppløsningen av CNV deteksjon ved hjelp av enkelt celle sekvensering.

Enkelt celle sekvense åpner for gransking av ikke bare kopi nummer endringer, men også single nucleotide varianter 28, 29 og strukturell variasjon 30. Vår protokoll for enkeltcelleisolasjon kan brukes til å svare disse andre questions. Imidlertid er valget av hele genomet forsterkning metoden avhenger av den spesifikke anvendelsen. Metoden som beskrives i denne protokollen, som er basert på polymerase kjedereaksjon, er best egnet for å detektere kopi antall forandringer, fordi det er forbundet med lavere nivåer av amplifisering skjevhet 32. For å undersøke andre typer av genomiske modifikasjoner, slik som enkeltnukleotidpolymorfi, er andre metoder for hele genomet forsterkning antatt å være mer egnet 31, 32.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Stuart Levine for kommentarer til dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant GM056800 og Kathy og Curt Marble Cancer Research Fund til Angelika Amon og delvis av den Koch Institute Support Grant P30-CA14051. Angelika Amon er også en etterforsker av Howard Hughes Medical Institute og Glenn Foundation for Biomedical Research. KAK støttes av NIGMS Training Grant T32GM007753.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177
PVC tubing (ID 3/16", OD 5/16", ~1 foot) VWR 89068-500
PVC tubing (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inches) VWR 89068-508
Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 µm) VWR 28144-040
Serological pipette (5 mL) BioExpress P-2837-5 Any plastic 5 mL pipette should suffice
In-Line Water Trap for Oxygen Use Amazon.com 700220210813
Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length) VWR 34502-99
Modeling clay VWR 470156-850
Petri dish (150 mm diameter) VWR 25384-326 Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells
Hard-Shell Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR Plates Bio-Rad HSS9601 Any 96-well PCR plate should suffice
96-well tissue culture plate VWR 62406-081 Any 96-well tissue culture plate should suffice
GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit Sigma WGA4
Microseal 'A' Film Bio-Rad MSA5001
Mini plate spinner Thomas Scientific 1225Z37
Thermal cycler Bio-Rad 1861096  Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate
Agencourt Ampure Beads Beckman Coulter A63880
Dynamag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Any similar magnetic tube strip should suffice
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-121-1012
Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480) Kapa Biosystems KK4845  This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kahlem, P. Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome. Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).
  2. Torres, E. M. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317 (5840), 916-924 (2007).
  3. Itsara, A. Population Analysis of Large Copy Number Variants and Hotspots of Human Genetic Disease. Am. J. Human Gen. 84 (2), 148-161 (2009).
  4. Sudmant, P. H. Global diversity, population stratification, and selection of human copy-number variation. Science. 349 (6253), aab3761 (2015).
  5. Navin, N. Inferring tumor progression from genomic heterogeneity. Genome Res. 20 (1), 68-80 (2010).
  6. Torres, L., Ribeiro, F. R., Pandis, N., Andersen, J. A., Heim, S., Teixeira, M. R. Intratumor genomic heterogeneity in breast cancer with clonal divergence between primary carcinomas and lymph node metastases. Breast cancer res and treat. 102 (2), 143-155 (2007).
  7. Yates, L. R. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nat. Med. 21 (7), 751-759 (2015).
  8. Forsberg, L. A. Age-related somatic structural changes in the nuclear genome of human blood cells. Am. J. Human Gen. 90 (2), 217-228 (2012).
  9. Laurie, C. C. Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer. Nat. Gen. 44 (6), 642-650 (2012).
  10. Jacobs, K. B. Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer. Nat. Gen. 44 (6), 651-658 (2012).
  11. Knouse, K. A., Wu, J., Whittaker, C. A., Amon, A. Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (37), 13409-13414 (2014).
  12. Knouse, K. A., Wu, J., Amon, A. Assessment of megabase-scale somatic copy number variation using single-cell sequencing. Genome Res. 26 (3), 376-384 (2016).
  13. Nextera XT DNA Library Preparation Kit. at. , at: http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html (2016).
  14. Advanced Analytical Fragment Analyzer. , at: http://aati-us.com/product/fragment-analyzer (2016).
  15. KAPA Library Quantification Kit. , at: https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/ (2016).
  16. Illumina HiSeq 2000. , at: http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_instruments/hiseq_2000.html (2016).
  17. FASTX-Toolkit. , at: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2016).
  18. Burrows-Wheeler Aligner. , at: http://bio-bwa.sourceforge.net/ (2016).
  19. SAMTools. , at: http://samtools.sourceforge.net/ (2016).
  20. HMMcopy. , at: http://compbio.bccrc.ca/software/hmmcopy/ (2016).
  21. DNAcopy. , at: https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html (2016).
  22. Picard. , at: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2016).
  23. bedtools. , at: http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ (2016).
  24. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat. Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
  25. Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
  26. Navin, N. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
  27. Szulwach, K. E., Chen, P. Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism. PLoS ONE. 10 (8), e0135007 (2015).
  28. Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
  29. Wang, Y. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing. Nature. 512 (7513), 155-160 (2014).
  30. Zhang, C. Z. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
  31. Macaulay, I. C., Voet, T. Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives. PLoS Genetics. 10 (1), e1004126 (2014).
  32. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nat. Rev. Gen. , 1-14 (2016).

Tags

Genetikk kopiantall endring fremkalle aneuploidi genomisk heterogenitet encellede hele genomet forsterkning hele genomsekvense
Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knouse, K. A., Wu, J., Hendricks, A. … More

Knouse, K. A., Wu, J., Hendricks, A. Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (120), e55143, doi:10.3791/55143 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter