Summary
Enda cell sekvense är ett allt populärare och tillgängliga verktyg för att ta itu med genomiska förändringar med hög upplösning. Vi tillhandahåller ett protokoll som använder en enda cell sekvensering för att identifiera kopietal förändringar i enskilda celler.
Abstract
Detektion av genomiska förändringar vid en enda cell upplösning är viktig för att karakterisera genetiska heterogenitet och utveckling i normala vävnader, cancer och mikrobiella populationer. Traditionella metoder för att bedöma genetisk heterogenitet har begränsats av låg upplösning, låg känslighet och / eller låg specificitet. Enda cell sekvense har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att upptäcka genetisk heterogenitet med hög upplösning, hög känslighet och när lämpligt analyseras hög specificitet. Här ger vi ett protokoll för isolering, hela genomet förstärkning, sekvensering och analys av enskilda celler. Vårt tillvägagångssätt möjliggör tillförlitlig identifiering av megabas skala kopietal varianter i enstaka celler. Emellertid kan aspekter av detta protokoll också tillämpas för att undersöka andra typer av genetiska förändringar i enskilda celler.
Introduction
Förändringar i DNA-kopieantal kan variera i storlek från flera baspar (kopieantal varianter) (CNVs) till hela kromosomer (aneuploidi). Kopietal förändringar som påverkar stora delar av genomet kan få betydande konsekvenser fenotypiska genom att förändra uttrycket av upp till tusentals gener 1, 2. CNVs som finns i alla celler i en population kan detekteras genom bulk-sekvensering eller microarray-baserade metoder 3, 4. Däremot kan populationer också vara genetiskt heterogena, med CNVs finns i en undergrupp av befolkningen eller ens enskilda celler. Genetisk heterogenitet är vanligt vid cancer, driving tumörutveckling, och även är närvarande i normala vävnader, med okänd konsekvens 5, 6, 7, 8, 9
Traditionellt har genetisk heterogenitet bedöms antingen genom cytologiska metoder eller bulksekvensering. Cytologiska metoder, såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH), kromosom uppslag och spektral karyotypering (SKY), har fördelen av att identifiera förändringar som förekommer i enskilda celler, men har hög felfrekvens på grund av artefakter för hybridisering och spridning 11. Dessa metoder är också begränsade i sin resolution endast avslöja antal kopior förändringar spänner flera megabaser. Sekvensering eller mikroarrayer bulk DNA, men högre noggrannhet och upplösning, är mindre känslig. För att upptäcka genetisk heterogenitet genom befolkningsbaserade strategier måste varianterna vara närvarande i en väsentlig del av cellerna i populationen. Uppkomsten av metoder för att förstärka den genom-DNA från enskilda celler har gjort det möjligt att sekvensera genomet av enskilda celler. Enda cell sequencing har fördelarna med hög upplösning, hög känslighet, och när lämpliga metoder för kvalitetskontroll tillämpas, hög noggrannhet 12.
Här beskriver vi en metod för att detektera megabas skala kopietal förändringar i enskilda celler. Vi isolera enstaka celler genom microaspiration, förstärka genomiskt DNA med hjälp av länk-adapter PCR, förbereda bibliotek för nästa generations sekvensering, och upptäcka kopietalet varianter av både dolda Markov-modellen och cirkulär binär segmentering.
Protocol
1. Isolera enstaka celler
- Förbered microaspirator
- Ta bort plast änden från aspirator rörenheten och för in den smala änden i en ände av en 1 fot lång PVC-slang med 3/16 "innerdiameter.
- Sätt i utloppet av en 0,2 | im sprutfilter in i den andra änden av en fot långa PVC-slang med 3/6 "innerdiameter.
- Sätt i inloppet av 0,2 | im sprutfilter in i en ände av en sex tum lång PVC-slang med 5/16 "innerdiameter.
- Valfritt: Skär sex tum långa PVC-slang med 5/16 "innerdiameter i halv och för in en in-line vattenfälla mellan de två halvorna.
- Bryt en 5 ml plast serologisk pipett i en ml gradering och sätter den brutna änden i den öppna änden av PVC-slang med 5/16 "innerdiameter.
- Sätt utlopp 5 ml plast serologisk pipett i den flexibla änden av ett sugrör enhet (där det genomskinliga plast ändenhade tagits bort).
- För lagring, täcker den röda språkrör för sugrör enheten med ett sterilt plaströr.
- Dra ut en glaskapillärrör med en inre diameter på 10 till 30 ^ m genom att bringa mitten av röret i närheten av en Bunsenbrännare låga och applicera spänning på endera änden av röret. Bryt dragna rör i mitten för att skapa två potentiella aspirationsnålar. Upprepa detta steg med flera rör som bara vissa rör kommer att sluta med en innerdiameter som är lämplig för att plocka enstaka celler.
- För lagring, placera två remsor av modellera i en 15 cm petriskål och säkra sugan nålar över remsorna.
- plocka celler
- Förbereda en enkelcellsuspension såsom är lämpligt för den celltyp och experiment. Till exempel, för att framställa vidhäftande celler såsom humana fibroblast-cellinjer, skörd cellerna genom trypsinisering och överföra cellerna till ett koniskt rör innehållande rätt material.
- Före, under eller ettfter förbereda enda cellsuspensionen (beroende på hur lång tid det tar att förbereda en enda cell suspension), ställa in huven för hela genomet förstärkning.
- Spraya ner ytan av huven, pipettspetsar lådor, och pipettspetsar med 10% blekmedel och torka med en pappershandduk. Upprepa detta steg med 70% etanol.
- Lägga 8 mikroliter av vatten från hela genomet amplifiering (WGA) kit till enskilda brunnar i en 96-brunnars PCR-platta, till en brunn för varje cell skall sekvenseras. Täck 96-brunnars PCR-platta med ett lock från en 96-brunnars vävnadsodlingsplatta och placera på is.
- Lägg 1000 celler till 10 ml media eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en 15 cm petriskål och placera skålen på is för att förhindra cellerna från att fastna i skålen.
- Bringa cellerna i petriskålen och den 96-brunnars PCR-platta med lock på is till ett ljusmikroskop med 10x objektiv.
- Öka öppnandet av sugan nålen genom att försiktigt trycka på utdragna änden av the aspirator nål på en hård yta så att spetsen bryts av. För in den breda änden av utsugnings nålen i den klara änden av microaspirator.
- Placera petriskål med celler på mikroskopställningen. Placera den röda munstycket av aspiratorn i munnen. Använda en hand för att flytta aspirator nålen och den andra handen för att flytta petriskål med celler. Identifiera enskilda celler som skall sekvenseras.
- Med hjälp av mun sug, dra en enda cell i utsugnings nålen tillsammans med ~ 1-2 mikroliter av media eller PBS. Överföra cellen till de 8 mikroliter av vatten inne i ett enda brunn i 96-brunnars PCR-platta. Undvika att införa bubblor när du överför cellen.
- Upprepa steg 1.2.7 tills det önskade antalet celler har isolerats. Håll PCR-plattan på is och täcktes med locket i mellan plock celler. Markera brunnarna som har fått celler.
- Samtidigt plocka enstaka celler, tina 10X enda cell lys och fragmentering buffert från hela genome amplifieringskit. Efter plocka önskat antal celler, omedelbart gå till hela genomet förstärkning.
2. hela genomet Amplifiering
- För att förhindra kontaminering under hela genomet amplifiering, tillsätt alla reagens inuti en vävnadsodling huva, använd pipettspetsar med filter, och ändra pipettspetsen mellan brunnarna.
- Förbered en fungerande lys och fragmentering buffertlösning från hela genomet förstärkning (WGA) kit. För varje uppsättning av upp till 32 celler, kombinera 32 mikroliter av 10x enda cell lysis och fragmentering buffert och 2 mikroliter av proteinas K-lösning i ett mikrocentrifugrör. Vortexa röret för att blanda lösningarna.
- Lägg 1 mikroliter av arbetslysering och fragmentering buffertlösning till varje brunn och pipettera upp och ned för att blanda.
- Täck plattan och täta alla brunnar med en plastfilm. centrifugera kort plattan i en mini platta spinner.
- Värmecykel som follows: 50 ° C, 1 h och 99 ° C, 4 min.
- Kyla plattan på is och centrifugera kort plattan i en mini platta spinner.
- Förbered en fungerande bibliotek beredning buffertlösning från hela genomet förstärkningssats. För varje cell, kombinera 2 mikroliter av 1x enda cell bibliotek förberedelse buffert och 1 mikroliter av biblioteksstabiliseringslösning i ett mikrocentrifugrör. Förbered verksamt lösningen för flera celler i samma mikrocentrifugrör.
- Ta bort plastfilmen och tillsätt 3 mikroliter av att arbeta bibliotek förberedelse buffertlösning till varje brunn. Pipettera innehållet i brunnen upp och ned för att blanda. Byt plastfilmen.
OBS: Plastfilmen kan återanvändas genom hela genomet amplifieringsprocessen tills brunnarna börjar borrhål i filmen. När detta inträffar, byta till en ny plastfilm. - centrifugera kort plattan i en mini platta spinnaren och inkubera vid 95 ° C under 2 min.
- Kyla plattan på is och en kort stundcentrifugera plattan i en mini platta spinner.
- Ta bort plastfilmen, tillsätt 1 mikroliter bibliotek förberedelse enzym till varje brunn, och pipettera innehållet i brunnen upp och ner för att blanda. Hålla biblioteket preparatet enzymet på is eller i ett kallt blocket i hela detta steg. Byt plastfilmen.
- centrifugera kort plattan i miniplatta spinnaren och värmecykel enligt följande: 16 ° C, 20 min, 24 ° C, 20 min, 37 ° C, 20 min, 75 ° C, 5 min, och håll vid 4 ° C.
- Kyla plattan på is och centrifugera kort plattan i en mini platta spinner.
- Förbered en fungerande förstärkningsblandning från hela genomet förstärkningssats. För varje cell, kombinera 48,5 mikroliter vatten, 7,5 mikroliter 10x förstärkning Master Mix, och 5 mikroliter WGA DNA-polymeras i ett mikrocentrifugrör. Förbered verksamt mix för flera celler i samma mikrocentrifugrör. Håll arbets mix på is.
- Ta bort plastfilmen, tillsätt 61 mikroliter arbetar förstärkning mixtill varje brunn och pipettera innehållet i väl upp och ner för att blanda. Håll arbetsförstärkningsblandningen på is eller i ett kallt kvarter hela det här steget. Byt plastfilmen.
- centrifugera kort plattan i en mini platta spinnaren och värmecykel enligt följande: 95 ° C, 3 min, 25 cykler vid 94 ° C, 30 sek och 65 ° C, 5 min, och håll vid 4 ° C.
- Överföring 60 mikroliter av varje prov till en separat mikrocentrifugrör och förvara vid - 20 ° C för användning i steg 3.
- Lägg DNA-laddningsfärg till den återstående volymen av varje prov (dvs. 3 mikroliter av 6x DNA laddningsfärg till 15 mikroliter av prov) och köra 5 mikroliter från varje reaktion på en 1% agarosgel.
OBS: Celler som framgångsrikt amplifierade visas som en utstryk från 250 till 1000 bp. Prover som inte visar en smutsfläck eller bara visar en svag cellprov är osannolikt att ge användbara sekvenseringsdata.
3. Sekvensering
- Rena prover med paramagnetiska pärlor.
- thaw DNA-prover på is. Virvelparamagnetiska kulor till dess att lösningen är homogen och inkubera pärlorna vid rumstemperatur under åtminstone 30 min.
- Överföra 20 | il av varje DNA-prov i ett rent mikrocentrifugrör. Återstoden av provet kan lagras vid -20 ° C.
- Tillsätt 30 mikroliter (1,5x) av paramagnetiska pärlor till varje DNA-prov och skaka för att blanda. Inkubera proverna vid rumstemperatur i 10 min. Lämnar förrådslösning av pärlor vid rumstemperatur för användning i steg 3,4.
- Placera rören på ett magnetiskt rör remsa i 2 min, eller tills pärlorna bildar en pellet och supernatanten är klar.
- Med användning av en P200 pipett, ta bort så mycket av supernatanten som möjligt utan att störa pärlorna.
- Lägg 180 mikroliter av 80% etanol till DNA-kornsblandningen. Rotera rören flera gånger i förhållande till magneten "spola" pärlorna genom etanollösningen.
- Med hjälp av en P200 pipett, ta bort så mycket av etanoltvätt som möjble utan att störa pärlorna.
- Upprepa 3.1.6 och 3.1.7.
- Lufttorka pärlorna i ca 10 min eller tills ingen mer etanol är synlig. Fortsätt till nästa steg när pärlorna visas spruckna eller falla av väggen av röret.
- Ta prover från magnetremsan. Tillsätt 40 mikroliter av 10 mM Tris, pH 8,0 för att eluera DNA från pärlorna och vortexblanda proverna för att återsuspendera pärlorna. Inkubera under 2 min vid rumstemperatur.
- centrifugera kort proverna för att samla vätskan vid botten av röret och placera rören på ett magnetiskt rör remsa för åtminstone två minuter. Överför eluenten till rena mikrocentrifugrör utan att störa pärlorna.
- prov normalisering
- Kvantifiera koncentrationen av varje prov med användning av en spektrofotometer. Koncentrationerna bör sträcka sig från 10 till 30 ng / mikroliter.
- Späd varje prov till 0,2 ng / mikroliter med användning av 10 mM Tris pH 8,0. Följande steg kommer att kräva ett minimum imatas n av 5 mikroliter från denna utspädning.
- bibliotek beredning
- Förbered sekvense bibliotek genom att följa instruktionerna i biblioteket förberedelse kit 13.
- slutlig sanering
- Rengör proverna enligt steg 3,1. För lästa längder om 50 bp, 75 bp eller 150 bp, använder ett förhållande av pärla att prova volym 1.5x, 1x, eller 0,6x respektive. Eluera med 15 mikroliter av 10 mM Tris pH 8,0.
- Köra proverna på ett fragment analysator för att kontrollera storleksfördelningen av biblioteket 14. Storleksfördelningen ska vara jämnt fördelade 150-900 bp.
- Kvantifiera prover med qPCR
- Med hjälp av ett bibliotek kvantifiering kit, skapa en qPCR reaktion enligt kit instruktioner 15. Lämna en kolumn tom att lägga till positiva standarder (DNA-standarder ur satsen) och negativa normer (vatten eller annan blindlösning).
- Värmecykel som follows: 95 ° C, 5 min (ramphastighet av 4,8 ° C / s) och 35 cykler av 95 ° C, 30 sek (ramphastighet av 4,8 ° C / sek) och 60 ° C, 45 sek (ramphastighet av 2,5 ° C / sek).
- pooling
- Bestäm hur många körfält på flödescellen behövs och dela proverna i grupper, med en grupp per bana.
- För varje grupp av prover, väljer provet med den lägsta koncentrationen baserad på qPCR data från steg 3.5.2 och normalisera alla prover i den gruppen för att denna koncentration med användning av 10 mM Tris pH 8,0.
- Pool samplen i varje grupp tillsammans.
- sekvensering
- Last pooler på nästa generations sekvense maskin följande standardförfaranden 16.
4. Dataanalys
OBS: En Unix-baserad miljö som krävs för att köra program och skript i detta avsnitt. Installera programvaran som nämns i protokollet efter deras i installationsanvis- guider. Alla skript kan hittas på https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/.
- Trimma läser till 40-nt med hjälp fastx_trimmer från FASTX-Toolkit version 0.0.13 17.
fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq - Rikta läser till lämplig referens genomet (MM9 för mus, hg19 för människa) med hjälp av BWA version 0.6.1 med standardalternativen 18.
BWA aln mm9.fa example.trim.fastq> example.sai
bwa SAMSE mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam - Ta bort justeringar till CHRM och slump kromosomer, sedan sortera och indexera resulte BAM fil med SAMTools version 0.1.19 19.
grep -v w CHRM example.sam | grep -v random> example.filtered.sam
samtools visa -uSh example.filtered.sam | samtools sort - example.filtered
index samtools example.filtered.bam - Köra HMMcopy att detektera CNVs= "Xref"> 20
- Använd gcCounter i HMMcopy att generera en GC procent referensfil för genomet. Använd alternativet "-w 500000" för att ange fönsterstorleken. Använd samma version av FASTA-referensfilen som användes i steg 4,2, men se CHRM och slumpmässiga kromosomer avlägsnas från FASTA filen.
gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig - Använd generateMap.pl i HMMcopy att generera en vicka fil för mappability. Använd alternativet "-w 40" för att ange läsa längd. Använd samma FASTA referensfilen som användes i steg 4.4.1.
generateMap.pl -b mm9.fa
generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig - Använd mapCounter i HMMcopy att generera en mappability referensfil för genomet. Använd alternativet "-w 500000" för att ange fönsterstorleken.
mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig - Använd readCounter i HMMcopy att generera en vicka fil för varje BAM fil.
readCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig Ändra sökvägar till referensfiler i R-skript (run_hmmcopy.mm9.r eller run_hmmcopy.hg19.r), använda filerna genereras ovan i 4.4.1 (t.ex. mm9_gc.wig) och 4.4.3 (t.ex. mm9_map. peruk) för variablerna gfile och mfile, som hänvisar till GC procentuella referensfilen och mappability referensfilen, respektive. Kör sedan förutsatt att R script "run_hmmcopy.mm9.r" eller "run_hmmcopy.hg19.r".
R CMD SATS run_hmmcopy.mm9.r
eller
R CMD SATS run_hmmcopy.hg19.r - För satsvis bearbetning av en uppsättning av BAM-filer, lägga Bam-filer i en mapp och kör den medföljande skriptet "HMMpipe.pl" i paketet för att ringa segment och beräkna variabilitet poäng (VS). Följ formatet:
perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles MM9
- Använd gcCounter i HMMcopy att generera en GC procent referensfil för genomet. Använd alternativet "-w 500000" för att ange fönsterstorleken. Använd samma version av FASTA-referensfilen som användes i steg 4,2, men se CHRM och slumpmässiga kromosomer avlägsnas från FASTA filen.
- Köra DNAcopy att detektera CNVs 21.
- Använda SAMtools version 0.1.19 för att extrahera unikt mappad läser från varje BAM fil.
samtools visa -h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i "^ @ | XT: A: U" | samtools visa -shū -> example.mapped.bam - Använd MarkDuplicates i Picard version 1.94 för att markera PCR dubbletter i BAM-filen 22.
java-jar MarkDuplicates.jar INPUT = example.mapped.bam OUTPUT = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true - Använd coveragebed i bedtools version 2.17.0 att räkna mappas läser i vart och ett av de fördefinierade dynamiska 500KB Mappable fönster i tillgänglig Bed filen "mm9.500k.dynamic.win.bed" eller "hg19.500k.dynamic.win.bed" 23 .
coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sortera -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts - Använd den medföljande Perl script "normalizeGC.pl" för att normalisera de avlästa räknar baserat på den medföljande GC-halt referensfil "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" eller "hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt ".
perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts - Använd den medföljande R script "dnacopy.r" kalla segmenten.
R CMD SATS dnacopy.r
- Använda SAMtools version 0.1.19 för att extrahera unikt mappad läser från varje BAM fil.
- identifiera CNVs
- Uteslut celler som VS beräknas 4.4.6 överstiger 0,26.
- Filtrera segment som kallas av HMMcopy i 4.4.6 till att omfatta endast de för vilka median log 2 förhållandet är större än 0,4 (förmodade vinst) eller mindre än -0,35 (förmodad förlust).
- Filtrera segment som kallas av DNAcopy i 4.5.5 till att omfatta endast dem för vilka segment menar är större än 1,32 eller mindre än 0,6.
- Lappar segmenten från 4.6.2 och 4.6.3, ringer CNVs endast i områden där både HMMcopy och DNAcopy identifiera en förmodad vinst eller förmodad förlust.
Representative Results
Den sammansatta aspirator bör likna den i figur 1A. Nålen bör dras så att den är tillräckligt bred för att rymma en enda cell, men inte så stort att en stor volym upprättas med en enda cell. Aspire enskilda celler är lättast när det är mellan ett och fem celler i en 10X fält (Figur 1B).
Om hela genomet förstärkning är framgångsrik, kommer provet att visas som en fläck på en agarosgel (Figur 2, spår 1, 2, 4, 5, 6, och 7). En svag eller frånvarande smeta indikerar en misslyckad amplifieringsreaktion och provet bör inte sekvenseras (Figur 2, spår 3 och 8).
Biblioteks beredning, bör bedömas fragmentstorleksfördelningen av proverna genom kapillärelektrofores på ett fragment analysator.Framgångsrikt framställda bibliotek kommer att ha en ganska jämn fördelning av fragmentstorlekar 150-900 bp (fig 3, A, B). Misslyckades bibliotek beredning kommer att resultera i en skev fragment storleksfördelning och sådana bibliotek bör inte sekvenserats (figur 3C).
Bearbetning sekvensdata genom den dolda Markov-modellen (HMMcopy) och cirkulär binär segmente (DNAcopy) kommer analysera genomet hos varje cell i segment av beräknade antal kopior. Dessa segment kan sedan filtreras för att identifiera dem med en beräknad kopietal i överensstämmelse med vinst eller förlust i en enda cell (tabell 1). Dessa filtrerade segment från HMMcopy och DNAcopy bör sedan överlappas för att identifiera hög förtroende CNVs.
Figur 1. Single cellisolering. ( A) En sammansatt microaspirator. (B) En 10X fältet visar dissocierade celler (pilar) och microaspirator nål (nedre högra hörnet). Aspire enskilda celler är lättast när det är mellan ett och fem celler i en 10X fält. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Hela genomet förstärkning. Agarosgelelektrofores av 5 | j, l av hela genomet amplifieringsprodukter. Prover som framgångsrikt amplifierar kommer att visas som ljusa utstryk från 100 bp till 1 kb (banorna 1, 2, 4, 5, 6 och 7) och kan sekvenseras. Prover som inte framgångsrikt amplifierar kommer att producera svaga utstryk eller ingen utsmetning (banorna 3 och 8) och bör inte sekvenseras.large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Bibliotek förberedelse. Representativa resultat från ett fragment analysator. Diagrammen visar fragmentstorlek (i bp) på X-axeln och relativa fluorescensenheter (RFU) på Y-axeln. Till höger om varje diagram är en simulerad gel lane. (A) Resultat för en perfekt prov, med en jämn fördelning mellan 150 och 900 bp och utan skarpa toppar eller bias mot ena sidan. Detta prov är acceptabelt för sekvensering. (B) Resultat från en okej prov, med en storleksfördelning skev mot lägre fragmentstorlekar. Även om detta inte är optimalt, kan provet ändå sekvenseras. (C) Resultat från en misslyckad prov, med övervägande små fragmentstorlekar. Detta är sannolikt orsakas av långvarig inkubation under tagmentation stegetbiblioteks preparat. Detta prov bör inte sekvenseras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| HMMcopy | |||||||
| Prov | Segmentet | Chr | Start | Slutet | stat | Median | |
| D15-4998 | 23 | chr8 | 144500001 | 146500000 | 6 | 0.5008794 | |
| D15-4998 | 29 | chr10 | 67000001 | 134500000 | 6 | 0.4031945 | |
| D15-4998 | 52 | chr19 | 1 | 20000000 | 6 | 0.4616884 | |
| D15-4998 | 57 | chrY | 1 | 59500000 | 2 | -1,506532 | |
| DNAcopy | |||||||
| Prov | Chrom | startfack | änden bin | Start | Slutet | Seg medelvärde | SEG Med |
| D15-4998 | chr10 | 88 | 197 | 62612945 | 129971511 | 1,4688 | 0,157 |
| D15-4998 | chr19 | 0 | 31 | 0 | 28416392 | 1,4141 | 0,1674 |
| D15-4998 | chrX | 77 | 126 51659160 | 95343369 | 1,3548 | 0,1874 | |
| D15-4998 | chrY | 0 | 14 | 0 | 23805358 | -2,7004 | 0,3591 |
Tabell 1. Dataanalys. Filtrerade segment som genereras av HMMcopy och DNAcopy från en enda cell. Överlappande dessa två resultat visar en vinst på kromosom 10 från 67 till 130 Mb samt en vinst på kromosom 19 från 0 till 20 Mb. Vi har funnit att vinster på den proximala delen av kromosom 19 är en artefakt av en enda cell sekvense 12.
Discussion
Traditionellt, identifiera CNVs och aneuploidi vid nivån av enskilda celler som krävs cytologiska metoder såsom fisk och SKY. Nu har enda cell sekvense dykt upp som ett alternativt tillvägagångssätt för sådana frågor. Enda cell sekvense har fördelar jämfört med FISH och SKY eftersom det är både genomet bred och hög upplösning. Dessutom, när lämpliga metoder för kvalitetskontroll tillämpas, kan en enda cell sekvense ge en mer tillförlitlig bedömning av CNVs och aneuploidi eftersom det inte är mottagliga för hybridisering och spridnings artefakter inneboende FISH och SKY. Men många av de senaste tillämpningarna av en enda cell sekvense inte har styrkts genom noggrann bedömning av känslighet och specificitet metoder och analyser. Faktum är att några av de analytiska metoder som används av andra studier är förknippade med höga frekvenser (> 50%) falska positiva CNV samtal 12. Tillvägagångssättet beskriver vi har testats grundligt med celler av knegen CNV börda för att bestämma sanna och falska upptäckt priser och optimera känsligheten och specificiteten av CNV upptäckt 12. Använda kvalitetskontroll och analytiska metoder som beskrivs i detta protokoll, ca 20% av 5 Mb vinster, 75% av 5 Mb förluster, och alla CNVs överstiger 10 Mb kan upptäckas. Även om bestämning av falska upptäckten hastigheten för en enda cell sekvense är svårt, har vi uppskattat att det är mindre än 25%. Detta protokoll kan tillämpas på celler från en rad olika källor, kan skript ändras för att justera upplösningen av CNV upptäckt, och protokollet kan anpassas för att identifiera andra typer av genomiska förändringar.
Det finns en mängd olika medel för att dissociera färska vävnader in i enskilda celler, och många publikationer beskriver förfaranden optimerade för specifika vävnader, såsom hud 24 och hjärna 25. Vi föredrar att isolera enstaka celler genom microaspiration eftersom det tillåter fo r visuell bedömning av varje cell som skall sekvenseras. Det är emellertid också möjligt att isolera enstaka celler genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) 26 och mikrofluidikanordningar 27. Om en enda cell isolering och hela genomet förstärkning sker manuellt, är det rimligt att isolera och amplifiera upp till fyrtio celler i ett enda sammanträde. För att få hög kvalitet enda cell sekvenseringsdata, är det viktigt att förstärkningen av encelliga genomen är enhetlig och fullständig. Vi finner att kvaliteten på enskilda celler isolerades liksom effektiviteten i lys och amplifiering har en betydande inverkan på kvaliteten på sekvenseringsdata. Som sådan bör cellerna skördas från sin ursprungliga miljö strax före isolering och hela genomet förstärkning bör inledas omedelbart efter det att cellerna isoleras. Dessutom bör lys och fragmentering steg följas exakt såsom beskrivits i steg 2,3-2,6.
"> Kan Algoritmerna justeras för att ändra upplösningen av CNV upptäckt, med motsatta effekter på sensitivitet och specificitet 12. Det är också möjligt att anpassa de trösklar för att upptäcka hela-kromosom aneuploidi i fastställandet av tetraploidy 11. Men finner vi att vår strategi är begränsad till att upptäcka CNVs större än 5 Mb, buller införas under hela genomet förstärkning komplicerar detektering av mindre varianter 12. Framtida förbättringar i hela genomet förstärkningsmetoder bör på sikt öka upplösningen av CNV upptäckt med hjälp enda cell sekvensering.Enda cell sekvense möjliggör undersökning av inte bara kopietal förändringar men också single nucleotide variationer 28, 29 och strukturell variation 30. Vår protokoll för enskild cell isolering kan användas för att besvara dessa andra questions. Men valet av hela genomet amplifieringsmetod beror på den specifika tillämpningen. Den metod som beskrivs i detta protokoll, som är baserad på polymerase chain reaction, är bäst lämpad för att upptäcka kopietal förändringar eftersom det är förenat med lägre förstärknings partiskhet 32. För att undersöka andra typer av genomiska förändringar, såsom single nucleotide polymorphisms är andra metoder för hela genomet förstärkning tros vara lämpligare 31, 32.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Stuart Levine för kommentarer om detta manuskript. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant GM056800 och Kathy och Curt Marble Cancer Research Fund till Angelika Amon och delvis av Koch-institutet Support Grant P30-CA14051. Angelika Amon är också en utredare av Howard Hughes Medical Institute och Glenn Stiftelsen för biomedicinsk forskning. KAK stöds av NIGMS Training Grant T32GM007753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177 | |
| PVC tubing (ID 3/16", OD 5/16", ~1 foot) | VWR | 89068-500 | |
| PVC tubing (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inches) | VWR | 89068-508 | |
| Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 µm) | VWR | 28144-040 | |
| Serological pipette (5 mL) | BioExpress | P-2837-5 | Any plastic 5 mL pipette should suffice |
| In-Line Water Trap for Oxygen Use | Amazon.com | 700220210813 | |
| Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length) | VWR | 34502-99 | |
| Modeling clay | VWR | 470156-850 | |
| Petri dish (150 mm diameter) | VWR | 25384-326 | Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells |
| Hard-Shell Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR Plates | Bio-Rad | HSS9601 | Any 96-well PCR plate should suffice |
| 96-well tissue culture plate | VWR | 62406-081 | Any 96-well tissue culture plate should suffice |
| GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit | Sigma | WGA4 | |
| Microseal 'A' Film | Bio-Rad | MSA5001 | |
| Mini plate spinner | Thomas Scientific | 1225Z37 | |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1861096 | Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate |
| Agencourt Ampure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Dynamag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Any similar magnetic tube strip should suffice |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-121-1012 | |
| Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480) | Kapa Biosystems | KK4845 | This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine. |
References
- Kahlem, P. Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome. Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).
- Torres, E. M. Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast. Science. 317 (5840), 916-924 (2007).
- Itsara, A. Population Analysis of Large Copy Number Variants and Hotspots of Human Genetic Disease. Am. J. Human Gen. 84 (2), 148-161 (2009).
- Sudmant, P. H. Global diversity, population stratification, and selection of human copy-number variation. Science. 349 (6253), aab3761 (2015).
- Navin, N. Inferring tumor progression from genomic heterogeneity. Genome Res. 20 (1), 68-80 (2010).
- Torres, L., Ribeiro, F. R., Pandis, N., Andersen, J. A., Heim, S., Teixeira, M. R. Intratumor genomic heterogeneity in breast cancer with clonal divergence between primary carcinomas and lymph node metastases. Breast cancer res and treat. 102 (2), 143-155 (2007).
- Yates, L. R. Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing. Nat. Med. 21 (7), 751-759 (2015).
- Forsberg, L. A. Age-related somatic structural changes in the nuclear genome of human blood cells. Am. J. Human Gen. 90 (2), 217-228 (2012).
- Laurie, C. C. Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer. Nat. Gen. 44 (6), 642-650 (2012).
- Jacobs, K. B. Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer. Nat. Gen. 44 (6), 651-658 (2012).
- Knouse, K. A., Wu, J., Whittaker, C. A., Amon, A. Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (37), 13409-13414 (2014).
- Knouse, K. A., Wu, J., Amon, A. Assessment of megabase-scale somatic copy number variation using single-cell sequencing. Genome Res. 26 (3), 376-384 (2016).
- Nextera XT DNA Library Preparation Kit. at. , at: http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html (2016).
- Advanced Analytical Fragment Analyzer. , at: http://aati-us.com/product/fragment-analyzer (2016).
- KAPA Library Quantification Kit. , at: https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/ (2016).
- Illumina HiSeq 2000. , at: http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_instruments/hiseq_2000.html (2016).
- FASTX-Toolkit. , at: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2016).
- Burrows-Wheeler Aligner. , at: http://bio-bwa.sourceforge.net/ (2016).
- SAMTools. , at: http://samtools.sourceforge.net/ (2016).
- HMMcopy. , at: http://compbio.bccrc.ca/software/hmmcopy/ (2016).
- DNAcopy. , at: https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html (2016).
- Picard. , at: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2016).
- bedtools. , at: http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ (2016).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat. Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Navin, N. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
- Szulwach, K. E., Chen, P. Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism. PLoS ONE. 10 (8), e0135007 (2015).
- Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
- Wang, Y. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing. Nature. 512 (7513), 155-160 (2014).
- Zhang, C. Z. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives. PLoS Genetics. 10 (1), e1004126 (2014).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nat. Rev. Gen. , 1-14 (2016).
