Analisi del promotore di ligandi di c-KIT utilizzando l'immunoprecipitazione cromatina

Summary

Le interazioni tra proteine ​​del DNA sono essenziali per processi biologici multipli. Durante la valutazione delle funzioni cellulari, l'analisi delle interazioni tra proteine ​​del DNA è indispensabile per comprendere la regolazione del gene. L'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è un potente strumento per analizzare in vivo tali interazioni .

Abstract

Molti processi cellulari, compresa la replicazione e la riparazione del DNA, la ricombinazione del DNA e l'espressione genica, richiedono interazioni tra proteine ​​e DNA. Pertanto, le interazioni proteine ​​del DNA regolano molteplici funzioni fisiologiche, patofisiologiche e biologiche, come la differenziazione cellulare, la proliferazione cellulare, il controllo del ciclo cellulare, la stabilità del cromosoma, la regolazione epigenetica dei geni e la trasformazione cellulare. Nelle cellule eucariotiche, il DNA interagisce con proteine ​​istone e non-istone e viene condensato in cromatina. Diversi strumenti tecnici possono essere utilizzati per analizzare le interazioni tra proteine ​​del DNA, come l'EMSS (Electrophoresis (Gel)) e DNase I (footprinting). Tuttavia, queste tecniche analizzano l'interazione proteina-DNA in vitro , non all'interno del contesto cellulare. L'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è una tecnica che cattura le proteine ​​nei loro siti specifici di legame del DNA, consentendo così l'identificazione dell'interazione tra proteine ​​del DNAAll'interno del loro contesto cromatico. Viene fatta con la fissazione dell'interazione tra proteine ​​del DNA, seguita da immunoprecipitazione della proteina di interesse. Successivamente, si caratterizza il sito genomico cui è legata la proteina. Qui descriviamo e discutiamo il ChIP e dimostriamo il suo valore analitico per l'identificazione del legame di trasformazione Factor-β (TGF-β) del fattore di trascrizione SMAD2 a SMAD Binding Elements (SBE) all'interno della regione promotore della tirosina- Proteina chinasi Kit (c-KIT) del recettore del fattore cellule staminali (SCF).

Introduction

Nel nucleo degli eucarioti, il DNA interagisce con proteine ​​dell'istone e proteine ​​non-istone ed è condensato in cromatina. Nel contesto fisiologico, patofisiologico e biologico delle cellule, le funzioni cellulari sono controllate spazialmente e temporaneamente dall'espressione genica coordinata con cromatina. Le interazioni tra proteine ​​del DNA hanno un ruolo essenziale nella regolazione dei processi cellulari, come la replicazione del DNA, la ricombinazione e la riparazione, così come l'espressione di proteine. Pertanto, l'analisi delle interazioni tra proteine ​​del DNA è uno strumento indispensabile nella valutazione dell'espressione ge....

Protocol

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare le seguenti soluzioni fresche per ogni esperimento.
   1. Per la soluzione di fissazione , preparare la formaldeide al 37% e conservarla a RT. Diluire in 1x salina fosfata-bufferizzata (PBS) ad una concentrazione finale di 1,42%.
      ATTENZIONE: La formaldeide è classificata come irritante, corrosiva, mutagena, teratogena e cancerogena. Non ingerire. Non respirare gas / fumo / vapore / spray. In caso di ventilazione insufficiente, indossare apparecchiature respiratori adeguate. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Tenere lontano da incompatibili, come agenti ossidant....

Results

Il legame del TGF-β1 ligando al suo complesso recettore cognato determina la fosforilazione della serina dei fattori di trascrizione SMAD2 / 3, seguita dalla loro associazione con il mediatore comune, SMAD4. Il complesso SMAD trasloca al nucleo. TGF-β può regolare la trascrizione genica, direttamente tramite SMAD, legame a SBE all'interno di regioni di regolazione dei geni bersaglio, oppure indirettamente attraverso l'espressione regolata da SMAD di attivatori o repressori trascrizionali.......

Discussion

In questo rapporto dimostriamo il legame di SMAD2 indotto da TGF-β1 a un SBE all'interno del promotore di ligandi del c-KIT e del legame di STAT3 indotto da TGF-β1 alla sua sequenza di riconoscimento all'interno del gene ligand TGF-β1. Abbiamo dimostrato la legame di entrambi i fattori di trascrizione con citocina indotta da immunoprecipitazione cromatina.

L'immunoprecipitazione di cromatina è un potente strumento per dimostrare il legame diretto di una proteina di interesse per .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellule HepG2	ATCC	HB-8065
Celle Hep3B	ATCC	HB-8064
TGF-β 1	R& Sistemi D	101-B1	Utilizzato a una concentrazione di 10 ng/mL
Anticorpi anti-SMAD2	Tecnologia di segnalazione cellulare	5339	Quantità utilizzata/IP: 3 µ g
Anticorpi anti-STAT3	Tecnologia di segnalazione cellulare	4904	Quantità utilizzata/IP: 3 µ g
ChIP-IT Proteina G Perline magnetiche	Motivo attivo	53033
Cocktail di inibitori della proteasi	Motivo attivo	37490
Tecnologia di segnalazione cellulare	della nucleasi micrococcica	10011
Primer in avanti della PCR: PAI-1			Sequenza: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'
Primer inverso PCR: PAI-1			Sequenza: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'
Primer diretto per PCR: SCF			Sequenza: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'
Primer inverso PCR: SCF			Sequenza: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
Primer diretto per PCR: TGF-β 1 (STB-1)			Sequenza: 5'-GAGAGAGGTGAGTGGCATGTT-3'
Primer inverso per PCR: TGF-β 1 (STB-1)			Sequenza: 5'-TAGCTTTCTGCCTTGGTCTCCCC-3'
Primer diretto per PCR: TGF-β 1 (STB-2)			Sequenza: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'
Primer inverso per PCR: TGF-β 1 (STB-2)			Sequenza: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3'