Summary
运动员每年吸收数百次轻度创伤性脑损伤（mTBI）/脑震荡;然而，这些对大脑的后果不甚了解。因此，单次和重复性mTBI的动物模型始终如一地复制临床相关症状，为进一步研究mTBI和脑震荡提供了手段。
Abstract
轻度创伤性脑损伤（mTBI）可导致脑功能急性丧失，包括混乱期，意识丧失（LOC），局部神经功能缺损甚至健忘症。参加联系运动的运动员面临着大量mTBI的高风险。在体育运动员的伤害程度方面，mTBI被定义为不会引起严重病理改变的轻度损伤，但是会导致自发解决的短期神经功能缺损。尽管以前曾尝试在小鼠和老鼠中建模mTBI，但许多人报告了总体不良反应，包括颅骨骨折，脑内出血，轴突损伤和神经元细胞死亡。在这里，我们描述了我们高度重复性的mTBI动物模型，其复制临床相关症状。该型号使用定制的气动冲击器装置来传递闭合头部的创伤。这种影响是在精确的速度和变形参数下进行的，创建一个可靠和可重复的模型来检查有助于单个或重复的震荡mTBI的影响的机制。
Introduction
创伤性脑损伤（TBI）被定义为由外部物理力量持续的头部损伤，导致正常脑功能的破坏。它代表了重大的社会经济和公共卫生负担，“国际疾病预防控制中心2015年报告”向国会估计，每年有250万美国人维持TBI。这不仅影响了患者的生活质量，而且对社会造成极高的经济成本，目前估计每年为765亿美元。传达的实际脑损伤的数量和急性期症状是定义轻度，中度和重度TBI。
轻度创伤性脑损伤（mTBI）也被称为脑震荡，占每年报告的TBI的70％以上1 。参加拳击和足球2高风险接触运动的运动员最常见。不像中度或严重形式的TBI，与mTBI相关的直接损害和症状有时不明显3 。相比之下，mTBI的长期影响可能与中度和重度形式的长期影响一样虚弱。患有重复mTBI的患者已被证明会发展为慢性创伤性脑病（CTE），以及其他认知和退行性疾病。因此，重要的是要进一步了解有助于mTBI之后产生的短期症状和总体长期损害的机制。
在人类中，第四届国际体育冲击大会（苏黎世2012）定义的脑震荡定义5指出，体育震荡的伤害程度轻微，不会造成严重的病理变化，但确实造成短期神经功能缺损这是自发解决的。事实上，研究调查了使用头撞式遥测系统，mTBI对高中足球运动员认知障碍的影响。这项研究显示，在一个赛季，玩家持续头盔影响> 20g的次数从226人（平均每场4.7次）的高点到1855年（平均每场38.6次） 6次 。大多数这些影响并不导致脑震荡的临床诊断;但是使用fMRI 6可以观察到脑功能的功能变化的证据。导致这些功能变化的大脑变化是未知的，因此迫切需要有一个可靠和可重复的模型，以便于研究震荡和次冲击性mTBI的影响。
尽管以前尝试在小鼠和老鼠中建模mTBI 7 ，但许多报告不良反应。特别是，大多数啮齿动物模型的重复性质受到限制5 mTBIs的影响，以及不良的病理事件，包括脑内出血，颅骨骨折，严重的轴突损伤，神经元细胞死亡和增加的死亡率8,9,10,11,12。在这里，我们描述了更接近人类脑震荡真正定义的mTBI的小鼠模型。该模型概括了人类mTBI中观察到的许多症状，例如导致意识暂时丧失的机械力，没有明显的大脑病理学。此外，有利的是，它可以用于长时间段的单次冲击和重复冲击范例，如前所述13 。
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Protocol
这些研究严格按照“国家卫生研究院实验动物护理和使用指南”中的建议进行。该协议经乔治敦大学机构动物保护和使用委员会批准。将小鼠饲养在温度控制的动物设施中，并保持在12小时光/ 12小时黑暗循环。食物和水随意提供 。
1.制备mTBI仪器
注意：mTBI设备包括一个控制冲击参数的数据采集（DAQ）箱，一个执行冲击的高速气动冲击器，以及一个模制的凝胶填充底座，使冲击后头部减速。
- 打开压缩空气，并将高速气动冲击器初始化为861.85 kPa的压力。
- 将DAQ控制系统校准到以下参数 - 活塞速度为2.35 m / s，表面停留时间e为31.5 ms。
- 将模制的凝胶填充底座（可压缩性64 kPa / mm）放置成中线与冲击器尖端的轨迹垂直。
mTBI冲击
- 记录所有使用的小鼠的体重。
- 在诱导室中麻醉3％异氟烷在氧气中120s的小鼠。
- 将小鼠转移到mTBI装置，通过柔韧的非固定鼻锥继续麻醉。
- 在鼻锥中，将鼠标头放在凝胶垫上，使得颅骨的平坦表面垂直于冲击器尖端呈现。
- 将胶带放在鼠标头上，以创建一个平坦的表面，并将耳朵远离冲击部位。
- 降低聚四氟乙烯冲击器尖端以与头部中心的矢状中线对齐。使用的冲击器尖端直径为10mm，将覆盖从眼睛后面到耳朵中线的头皮区域。调整冲击器，这样就可以了st触摸鼠标头的表面。
- 收回冲击头，并手动拨下所需的偏转深度（7.5 mm）。
- 控制DAQ控制系统，并按下触发按钮来影响鼠标头，或者是单一或重复的影响。重复的影响在每次影响之间不间断地交付。
- 在最终冲击后立即将麻醉和mTBI装置的鼠标移开，并置于仰卧位。
- 使用秒表测量正确反射（仰卧俯仰）返回的延迟，以确定意识时间的消失以及行走时间（无阻碍的行走）。
- 监视鼠标并恢复正常行为，返回到其家中的笼子。
- 假小鼠接受相同的处理和麻醉，但不受影响。
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Representative Results
使用这种新颖的mTBI装置允许单次和重复的轻度头部损伤，没有颅骨骨折或结构性脑损伤的风险。该型号采用定制的气动特氟龙冲击器装置，可提供封闭的头部机械能量冲击。在精确的速度和变形参数下产生影响，创建可靠和可重复的模型来检查有助于单个或重复的震荡mTBI的影响的机制（ 图1 ）。
LOC的存在或不存在是在动物模型中评分脑震荡严重性的有用工具。正确反射时间的返回是对单次和重复mTBI（7.5 mm深度， 图2 ）之后我们用于量化LOC的损伤严重程度的急性神经学评估。在该过程中，小鼠接受总共3分钟的异氟烷在氧气中，因此包括假手术的所有小鼠在麻醉撤除后具有LOC周期。与假手术小鼠相比，单个mTBI导致LOC显着增加（36.4±1.6 sv 64.2±7.7 s，n = 5，** p <0.01， 图2A ）。这也与单次mTBI后增加的行走时间相关（52.0±4.5 sv 140.0±21.1 s，n = 5，** p <0.01， 图2B ）。在重复伤害范式（共30次影响，每天5次影响6天）中，所有测试日均LOC和行走时间显着升高（重复测量双向分析方差损伤效应F 1,14 = 22.92， p <0.0003）。在整个研究期间，6天内的平均LOC为Sham：35.5±1.4 sv mTBI：64.9±1.7 s，n = 8，p <0.01， 图2C和平均行走时间Sham：64.3±3.3 sv mTBI：160.8 ±5.3 s，n = 8，p <0.01，lass =“xfig”>图2D。小胶质细胞/巨噬细胞的Iba1染色显示假手术和单个mTBI小鼠之间无变化，但在重复mTBI小鼠中视神经中广泛的Iba1免疫反应性（ 图3 ）。重复mTBI小鼠在皮层（ 图3 ）或其他脑区没有显示灰质炎症的迹象。
图1 ：mTBI鼠标模型的说明性表示。 （ A ）设置执行mTBI所需的所有材料。 （ B ）将小鼠放置在异氟烷诱导室中2分钟。 （ C ）在mTBI装置上，将小鼠放置在非固定鼻锥体中以继续麻醉。 （ D ）轻轻的磁带鼠标头，创建一个平坦的表面，并保持耳朵。 IMPACTOr尖端降低以仅接触头部的表面。 （ E ）使用拨盘（插图）降低冲击器尖端并要求偏转深度。通过按下触发按钮执行mTBI。 （ F ）由正反射返回所需的时间（仰卧位）测量的意识丧失。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2 ：单次和重复的mTBIs增加了瞬间的意识丧失并返回到行动时间。接受单个mTBI的小鼠与假手术对照小鼠相比显着增加（ A ）意识丧失（LOC）和（ B ）移动时间（每组n = 5，** p <0.01）。 （ C - D ）与假手术小鼠相比，重复mTBI（每天5次/ 6天）显着增加每日LOC和行走时间（n = 8 /组* p <0.05，** p <0.01，*** p < 0.001）。数据表示为平均值±SEM，通过双因重复测量方差分析进行Bonferroni事后检验。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3 ：重复mTBI诱导光学细胞中的小胶质细胞/巨噬细胞激活。 （ A ）假小鼠Iba1染色显示皮层（a1-a3）中静止的小神经胶质细胞/巨噬细胞和视神经中有限的染色（a4-a6）。 （ B ）接收单个mTBI的小鼠（7.5mm）在皮质（b1-b3）和视神经（b4-b6），冲击后24小时具有与假手术小鼠相似的Iba1染色曲线。 （ C ）重复mTBI小鼠（连续6天每天5次）在视力（c4-c6）中显示强烈的炎症反应，但在最后一次冲击后24小时（c1-c3）不显示（第7天） ）。扩大的图像分别显示了假皮，单次和重复mTBI小鼠的皮层（a3，b3，c3）和视神经纤维（a6，b6，c6）中Iba-1阳性小胶质细胞/巨噬细胞的形态。刻度棒=200μm（A，B，C）; 50μm（a1-a5，b1-b5，c1-c5）; 20μm（a3，a6，b3，b6，c3，c6，放大图）。每组n = 6的图像。皮质（cx），视神经（opt），轻度创伤性脑损伤（mTBI）。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在人类中，mTBI的特征在于没有结构性损伤的功能障碍。这可能与意识丧失有关，或没有意识丧失1 。目前认为接触重复脑震荡是神经变性疾病如CTE 4发展和/或发展的基础。据了解，CTE通常在拳击手和足球运动员中被发现，尽管暴露于重复脑震荡（包括不导致意识丧失的人）被认为是开发CTE的基本要素，但我们还不知道为什么重复脑震荡引起大脑中发生明显变化的机制。
了解这些机制的主要障碍是难以发展模型，准确地概述在维持mTBI影响的个人中观察到的关键症状。这意味着急性和慢性生物拍摄震荡影响的基础设施难以进行调查，不能开发新的治疗手段。特别是，现有的重复脑震荡的动物模型非常严重，仅使用2-3次重复影响，导致大量神经元细胞丢失，颅骨骨折和脑组织损失8,10,11,12。在人类重复脑震荡之后，这种损伤程度不会发生，这表明需要一种单一和重复的轻度头部影响的新模型。
在这里，我们描述了一种新型的mTBI模型，使用了一种专门设计用于通过颅骨和大脑传输能量并远离鼠标的定制弥漫性损伤装置。通过单一影响和重复的影响范式，该模型允许一种手段开始调查脑震荡在生命后期如何造成神经损伤。单身h它的范例概括了人类观察到的轻度创伤性脑损伤的特征，而重复范式允许检查这些看似轻微的损伤如何有助于慢性和持续性变性。该装置允许重复的mTBI头部影响，没有颅骨骨折或结构性脑损伤的风险。
与许多技术一样，该协议的某些方面对于产生准确，可靠的结果非常重要。在腔室诱导和mTBI损伤期间，必须保持每只小鼠一致的麻醉水平。由于权力和行走时间是这种mTBI程序的关键结果测量的事实，研究人员应确保mTBI损伤和假动物都暴露于相当水平的麻醉剂。具体来说，在整个手术期间，小鼠只能在麻醉下总共3分钟（2分钟内）用mTBI鼻锥装置1分钟）。这种低水平和麻醉持续时间是超过许多其他mTBI模型的主要优点，并产生一致的反射反应时间（假小鼠20-40秒，mTBI小鼠50-100秒）。另外，当使用重复的mTBI范例时，重要的是在研究期间每天保持小鼠体重记录。这是为了确保在mTBI程序的整个时间过程中对压力和一般动物福利的持续监测。该过程不会导致小鼠被撤回或分离。在手术后的第一个小时内应观察正常的梳理，饮食。
损伤后1个星期的时间过程中单次或多次冲击导致的脑组织没有严重的形态学病理学。在单个mTBI之后，观察到的唯一的细胞反应是兴奋性突触的瞬时减少;日没有炎症，灰色或白质的损失，轴突损伤或细胞死亡。有30例重复mTBI（每天5次，6天以上），有与以前定量相似的水平的视神经的慢性炎症1 。在单次mTBI 14后多年观察到慢性白质炎症，并且可以在具有重复mTBI 15病史的生活运动员中检测到慢性炎症。该模型的局限性在于，它不能用于研究视神经以外的轴突损伤或细胞死亡机制，因为我们的模型中不存在。同样基于我们以前发表的数据，该模型在阿尔茨海默病13小鼠模型中，在mTBI后1个月时不诱导淀粉样蛋白或tau病理变化。我们认为，缺乏淀粉样蛋白和tau病理学与我们模型中轴突病理学的缺失有关。我们的模型确实提供了一个调查平台神经元网络的离散变化，突触完整性和组成以及重复脑震荡后的行为变化。基于这些结果，这种新型模型以受控，严格和有效的方式产生临床相关症状。进一步使用该模型将允许调查基础的机制，支持mTBI的急性和慢性病理生理学和脑震荡。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家神经病学和中风研究所（MPB）的R01 NS067417的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powerlab 8SP data acquisition (DAQ) control box | (AD instruments) | ||
| VIP 3000 calibrated vaporizer | Matrx | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Oxygen | Commercially available | ||
| Compressed Air | Commercially available | ||
| Masking Tape | Commercially available | ||
| Stop Watch | Fisher Scientific | 02-261-840 | |
| C57 Bl/6 Mice | Jackson Laboratories | ||
| Digital Scale and weigh container | Fisher Scientific | 20031 | |
| anti-Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| HRP labelled secondary | Jackson Immunoresearch | 111-035-003 |
References
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