Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل وزراعة أساسيات ميتانيفريك من الأجنة الماوس.
Abstract
الهدف من هذا البروتوكول هو لوصف طريقة لتشريح، العزلة، والثقافة من أساسيات ميتانيفريك الماوس.
خلال تطور الكلى الثدييات، واثنين من الأنسجة الاصلية، وبرعم الحالب والميزينشيم ميتانيفريك، والتواصل وتحفيز بالمثل آليات الخلوية لتشكيل في نهاية المطاف نظام جمع و نيفرونس الكلى. كما تنمو الأجنة الثدييات داخل الرحم وبالتالي لا يمكن الوصول إليها للمراقب، وقد وضعت ثقافة الجهاز. مع هذا الأسلوب، فمن الممكن لدراسة التفاعلات الظهارية اللحمة المتوسطة والسلوك الخلوي خلال أورغانوجينيسيس الكلى. وعلاوة على ذلك، يمكن التحقق من أصل الكلى الخلقية والتشوهات الجهاز البولي التناسلي. بعد تشريح دقيق، يتم نقل أساسيات ميتانيفريك على مرشح الذي يطفو على وسط الاستزراع ويمكن أن تبقى في حاضنة ثقافة الخلية لعدة أيام. ومع ذلك، يجب أن يكون على بينة من أن الشروط هيالاصطناعي ويمكن أن تؤثر على عملية التمثيل الغذائي في الأنسجة. أيضا، اختراق المواد اختبار يمكن أن تكون محدودة بسبب المصفوفة خارج الخلية والغشاء القاعدي موجودة في إكسلانت.
ميزة رئيسية واحدة من ثقافة الجهاز هو أن المجرب يمكن الحصول على إمكانية الوصول المباشر إلى الجهاز. هذه التكنولوجيا هي رخيصة وبسيطة، ويسمح لعدد كبير من التعديلات، مثل إضافة المواد النشطة بيولوجيا، ودراسة المتغيرات الجينية، وتطبيق تقنيات التصوير المتقدمة.
Protocol
وتم الحفاظ على الفئران وفقا للوائح السويدية وتشريعات الاتحاد الأوروبي (2010/63 / يو). وتم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات السويدية (التصاريح C79 / 9 و C248 / 11 و C135 / 14). وقد تمت الموافقة على الإجراءات في جامعة هايدلبرغ التي تتعلق بالمواضيع الحيوانية من قبل ريجيرونسبراسيديوم كارلسروه وضباط رعاية الحيوان في جامعة هايدلبرغ.
1. إعداد الكواشف والمواد للثقافة
ملاحظة: استخدام غطاء تدفق رقائقي للحد من التلوث.
- في يوم تشريح، قبل الكتلة البشرية فك وحدها أو المؤتلف البروتين إفرين خيالي تنصهر إلى فك البشري عن طريق مزجها مع الأجسام المضادة الماعز فك الإنسان بنسبة مولارية من 1: 5 في المالحة الفوسفات معقمة المالحة (بس). احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية 5 .
- إعداد وسط الثقافة عن طريق استكمال دولبيكو في النسر المعدل المتوسطة: المغذياتالخليط F-12 (دمم / F12) مع 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (v / v)، 1٪ الجلوتامين (الخامس / الخامس)، 1٪ الأنسولين ترانسفرين-السيلينيوم (v / v)، 50 ميكروغرام / مل الإنسان holo- ترانسفيرين، و 1.5 ميكروغرام / مل أمفوتيريسين.
ملاحظة: 10 مل من المتوسط يكفي ل 16 الأجنة. - إضافة محلول إفرين متجمد المؤتلف في تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل إلى وسط الاستزراع. استخدام فك الإنسان المتجمعة كسيطرة.
- إعداد لوحات الثقافة عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الوسط الثقافي إلى كل بئر من العقيمة، غير المطلية، مسطحة القاع البوليسترين لوحة 4 جيدا.
- باستخدام ملقط معقم، مكان بعناية واحد مرشح غشاء البولي مع حجم المسام من 5 ميكرون لكل بئر على أعلى المتوسطة. نقل لوحة أعدت إلى حاضنة (37 درجة مئوية / 5٪ كو 2 ). تأكد من أن المرشح يبقى جافة على السطح العلوي ويطفو.
ملاحظة: مرشح واحد يكفي لاثنين من أنلاجين الكلى. - باستخدام شفرة حلاقة، وقطع ما يقرب من 30 نصائح ماصة (حجم: 100 ميكرولتر) أبروسيماتلy 1 ملم من طرف ليؤدي إلى افتتاح أوسع. ضع النصائح مرة أخرى في رف ماصة طرف.
2. تشريح رذاذ ميتانيفريك في E11.5
- التضحية الماوس في فترة الحوامل في E11.5 عن طريق خلع عنق الرحم (أو باستخدام طريقة وافقت عليها لجنة الأخلاق المحلية).
- إزالة الرحم والأجنة، كما وصفها براون وآخرون 6 . من هذه النقطة إلى الأمام، والعمل تحت المجهر تشريح.
- باستخدام رقم 5 ملقط الساعاتي، وقطع الجنين مباشرة تحت أركان. استخدام طبق بتري جديدة لكل الجنين. إزالة الساقين والذيل من الجنين. للقيام بذلك، والاستيلاء على الأنسجة المراد إزالتها مع زوج واحد من رقم 5 ملقط الساعاتي واستخدام نصائح الزوج الثاني لخفض.
- لإزالة كتلة الجهاز البطني، واستخدام نصائح من زوج من ملقط لفتح أفقيا جدار الجسم من الجنين في اتجاه منقاري إلى الذيلية.
- قطع سطحيا، موازية ل tالأبهر الظهري. استخدام الدم المملوءة وبالتالي مرئية الظهري الأبهر للتوجه. بعناية فصل الجزء البطني من جدار الجسم من الجزء الظهري باستخدام نصائح ملقط مغلقة والوجه الجنين أكثر. قطع جدار الجسم أفقيا في اتجاه منقاري إلى الذيلية واستخدام الشريان الأورطي الظهري للتوجه، كما في الجانب السابق.
- مرة واحدة وقد تم فصل جدار الجسم البطني من الجسم الظهري، والاستيلاء عليها مع زوج واحد من ملقط وسحب بعناية لإزالته، جنبا إلى جنب مع كتلة الجهاز.
ملاحظة: أنلاجين ميتانيفريك عادة ما تبقى تعلق على جدار الجسم الظهري. فهي بيضاوية، ~ 200 ميكرون هياكل طويلة تقع على مستوى أطرافه الخلفية. - عقد جدار الجسم الظهري مع زوج واحد من ملقط، مع الجانب البطني مواجهة. باستخدام زوج آخر من ملقط، والاستيلاء على الشريان الأورطي الظهري في نهاية منقاري وقشر بعناية الشريان الأورطي الظهري من جدار الجسم الظهري.
ملاحظة: كلا الكلى ميتانيفريك البقاء عادة إرفاقإد، حتى، ال التعريف، ظهري، أورتي. - باستخدام زوج واحد من ملقط، وقطع روسترالي إلى أنلاجين الكلى لإزالة الشريان الأبهر. ثم، فصل بعناية اثنين من أنلاجين الكلى باستخدام نصائح ملقط.
- تقشر بعناية الأنسجة غير المرغوب فيها من أنلاجين الكلى باستخدام نصائح ملقط. الحرص على عدم إلحاق الضرر اللحمة المتوسطة، كما يمكن أن يؤدي الضرر في ضعف النمو وإقصاء إكسلانت من مزيد من التحليل.
- نقل أنلاجين الكلى بشكل منفصل باستخدام ماصة ميكروليتر وفتح ماصة واسعة مفتوحة في 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لتصفية غشاء البولي في لوحة 4 جيدا.
ملاحظة: بسبب التوتر السطحي، وسوف تكون مغطاة إكسلانت مع طبقة رقيقة من المتوسطة. مرشح واحد يكفي لاثنين من أنلاجين الكلى.- وضع كل من أنلاجين الكلى في وسط كل نصف منها من المرشح. نقل لوحة العودة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية / 5٪ كو 2 . ترك لوحة في الحاضنة حتى رود ميتانيفريكمن الجنين المقبل على استعداد لوضعها على التصفية.
- كرر الخطوات من 2.3-2.9.1 لكل جنين.
ملاحظة: مع بعض الممارسة، فإن إجراء تشريح يستغرق حوالي 5 دقائق لكل جنين. - احتضان أنلاجين الكلى لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية / 5٪ كو 2 .
3. إعداد الكواشف للتثبيت وتلطيخ
- لإعداد بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) في برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم (ث / ت)، حل بفا في 60 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني، واثارة باستمرار. بارد إلى درجة حرارة الغرفة واستخدام فلتر الورق لإزالة الجسيمات المتبقية. قسامة والحفاظ على 4 درجات مئوية للاستخدام الفوري أو تجميد للتخزين على المدى الطويل.
تنبيه: بفا سامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المحددة في معايير السلامة المحلية والعمل في غطاء الدخان. التخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية واستخدام حاويات النفايات المعينة. - لإعداد حل بيرمابيليزاتيون، تمييع تريتون X-100في برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم إلى 0.3٪ (الخامس / الخامس).
- لإعداد حجب الحل، إضافة 5٪ (الخامس / الخامس) الماعز المصل و 0.1٪ تريتون X-100 إلى برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم. إضافة أزيد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 0.02٪ (ث / ت). تخزين في 4 درجات مئوية.
تنبيه: أزيد الصوديوم سامة. التعامل مع أزيد الصوديوم وفقا للسلامة المحلية وحماية البيئة اللوائح.
ملاحظة: عند استخدام الأجسام المضادة للتلطيخ، واستخدام مصل 5٪ من الأنواع تم اشتقاق الأجسام المضادة الثانوية من لجعل حجب الحل. - تمييع البيروكسيديز دوليتشور بيفلوروس راصة 1: 200 في حجب الحل. تمييع Alexa488 مترافق ستريبتافيدين 1: 200 في حجب الحل.
- (انظر جدول المواد)، إضافة 0.1 غرام من الكحول القابلة للذوبان في الماء بولي فينيل موكودزيف / مل إلى 25٪ (ث / ت) الجلسرين في 0.1 M تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.5) . الحرارة إلى 50 درجة مئوية تحت التحريض المستمر لمدة 1 ساعة، يبرد، وضبط درجة الحموضة إلى 8.0-8.5 باستخدام 1M هيدروكسيد الصوديوم. تجنب تركيزات أعلى هيدروكسيد الصوديوم. إضافة 100 ميكروغرام / مل N- بروبيلغالات والثيميروسال إلى تركيز النهائي من 0.02٪ (ث / ت). يحرك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: ثيميروسال سامة. التعامل معها وفقا للسلامة المحلية وحماية البيئة اللوائح.- ملء المتوسطة التضمين في أنابيب 50 مل، وتوازن الدوار، وأجهزة الطرد المركزي في 3،200 x ج ودرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. صب حل واضح في أنابيب 15 مل وتجاهل بيليه. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع. مرة واحدة إذابة، والحفاظ على الحل في 4 درجات مئوية. الدافئة إلى ~ 30 درجة مئوية مباشرة قبل الاستخدام.
- إعداد العديد من الشرائح الزجاجية كما المرشحات مع إكسلانتس هي التي شنت. لهذا، الغراء اثنين كوفرسليبس الصغيرة، 18 × 18 ملم، على جانبي الشريحة الزجاجية باستخدام لاصقة فورية، وترك مساحة 15 ملم ~ للمرشح بينهما.
4. التثبيت وتلطيخ
- بعد فترة زراعة من 3أيام في المختبر (ديف)، وإزالة لوحات من الحاضنة ونضح بعناية وسط الثقافة من كل بئر باستخدام ميكروبيبيت. تأكد من عدم لمس فلتر والحفاظ على فتح طرف نحو جدار البئر.
- إضافة 500 ميكرولتر من 4٪ بفا / برنامج تلفزيوني لكل بئر. المرشحات سوف تطفو على تثبيتي. باستخدام ميكروبيبيت، إضافة بعناية بفا تثبيتي قطرة للغمر المرشحات. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: بالنسبة لجميع الخطوات التالية، يجب الحرص على عدم غسل إإكسبلنتس من التصفية. الحفاظ على فتح طرف ماصة نحو جدار البئر. - إزالة بفا وشطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، غمر مرشح. إضافة 500 ميكرولتر من حل بيرمابيليزاتيون إلى كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- شطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولتر من حجب الحل لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- استبدال الحل حظر مع250 ميكرولتر من البيروكسيديز دوليكوروس بيفلوروس راصة المخفف 1: 200 في حجب الحل واحتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
- إزالة الحل بلاتلوروس دوليتشوروس الجلوتين وشطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر.
- إضافة 250 ميكرولتر من Alexa488 مترافق ستريبتافيدين المخفف 1: 200 في حجب الحل واحتضان في 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. بدلا من ذلك، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
ملاحظة: ويتحقق أفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء عند حضانة عند 4 درجات مئوية. - شطف مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر. باستخدام ملقط، ونقل المرشحات إلى الشرائح الزجاجية المعدة، مع إإكسبلانتس مواجهة. جبل مع ~ 50-100 ميكرولتر من تضمين المتوسطة. تغطية مع 60 ملم طول رقم 1.5 كوفرسليبس. السماح حل المتوسطة التضمين لتصلب لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. انتقل إلى التصوير أو تخزين الشرائح، ملفوفة في احباط، في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للصورة.
- صورة مع المجهر إبيفلورزنس إبيفلورزنس 7 </ سوب> مقترنة بمصباح زئبق واستخدام وحدة مرآة للإثارة الزرقاء (ممر علوي للإثارة، 460 - 495 نانو متر، ومرآة ثنائية اللون، و 505 نانو متر، وممر اجتياز للانبعاثات، و 510 - 550 نانومتر)، و 20X من العدسات، فتحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استمدت أنلاجين الكلى ميتانيفريك من الحوامل الأسود -6 الفئران إنبريد في E11.5 وتم تربيتها. بعد 3 أيام، برعم الحالب قد تشعبت تصل إلى 5 مرات، مما أدى إلى تشعب من برعم الحالب على شكل حرف T في البداية. تم تصوير كل مستكشف، وتم تحديد أعداد القطاعات ونقاط النهاية لتحديد الأجيال المتفرعة وحساب عدد نقاط النهاية لكل فرع ( الشكل 1 ). وقد تم التوصل إلى الجيل الرابع في 8٪ فقط من المستكشفات المعالجة مقارنة مع 35٪ من إإكسبلنتس السيطرة ( الشكل 1 ب )، وبالتالي تم تخفيض عدد نقاط النهاية لكل فرع ونقاط النهاية لكل مم 2 في إكلانتس تعامل مع EFrinB2 متجمعة.وبالإضافة إلى ذلك، كان ثلث من إكسلانتس مورفولوجيا غير عادية في نصائح برعم الحالب ( الشكل 1 ) وتشير هذه النتائج إلى أن EphrinB2 قد يكون لها تأثير مقيدعلى عملية برعم الحالب المتفرعة، على الأرجح من خلال تفعيل EphA4 و EphB2 إشارات إلى الأمام.
لتجربة ناجحة، فمن الأهمية بمكان أن لا تتضرر اللحمة المتوسطة ميتانيفريك خلال تشريح. أي إصابة من اللحمة المتوسطة يقلل من إمكانات الاستقرائي، يؤدي إلى انخفاض أو غياب برعم الحالب المتفرعة، ويمكن أن يكون مصدرا للتحيز. المثال في الشكل 2A يظهر إكسلانت حيث ميسينشيم مفقود تقريبا. لم برعم الحالب لم يتفرع خارج مرحلة T-. ويبين الشكل 2B مثال حيث أدى الضرر من اللحمة المتوسطة ميتانيفريك إلى ضعف النمو والتفرع. يجب استبعاد كلا المستكشفين من التحليل.
الشكل 1: E11.5 ميتانيفريك الكلى أنلاجين مثقف لمدة 3 ديف ومعالجتها مع متجمد متجمد EphrinB2 أو كلوستإريد الإنسان فك كسيطرة. ( A ) تم تشريح أنلاجين ميتانيفريك الكلى في E11.5، مثقف لمدة 3 ديف، وملطخة البيروكسيديز بيوتيلوروس بفلوروس أغلوتينين و Alexa488 مترافق ستريبتافيدين. تم تصوير إإكسبلنتس مع المجهر إبيفلورزنس واسعة النطاق مع ممر ممر الإثارة من 460-495 نانومتر، ومرآة ثنائي اللون من 505 نانومتر، ممر اندفاع انبعاث 510-550 نانومتر، و 20 X العدسات خطة أبوكرومات. أدى تطبيق متجمد EphrinB2 المؤتلف (clEphrinB2) في تقليل التعقيد المتفرعة وتشوه من نصائح برعم الحالب (رأس السهم). ( B ) يظهر الرسم البياني الأيسر الأجيال المتفرعة في clEphrinB2 المعالجة والتحكم إإكسبلنتس. تم التوصل إلى الجيل الرابع من المتفرعة في 8٪ فقط من إإكسبلنتس المعالجة، مقارنة مع 35٪ من إإكسبلنتس السيطرة. تم تخفيض عدد نقاط النهاية لكل فرع (الرسم البياني المتوسط) ونقاط النهاية لكل منطقة (الرسم البياني الأيمن) (نقاط النهاية لكل فرع نت، 2.1 ± 0.09؛ clEphrinB2، 1.7± 0.08، P = 0.007 **؛ نقاط النهاية لكل مليمتر مربع: نت، 31 ± 0.01؛ clEphrinB2، 27 ± 0.02؛ P = 0.04 *؛ ن = 23). يتم عرض البيانات على أنها متوسط ± سيم واستخدمت اختبار تي طالب غير مقيد. شريط مقياس = 100 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من بيوكيرت وآخرون. ، 2016 3 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أمثلة على اثنين من E11.5 ميتانيفريك الكلى أنلاجين التي تضررت خلال تشريح، مثقف لمدة 3 ديف، والملون مع بيوتينيلاتد دوليكوروس بيفلوروس أغلوتينين واليكسا 488 مترافق ستريبتافيدين. ( A و B ) أدى الضرر من اللحمة المتوسطة في ضعف أو غياب النمو والحالب برعم المتفرعة،عدم تأهيل المستكشفين من مزيد من التحليل. ( A ) ميتانيفريك الكلى إكسلانت بعد 3 ديف، مع غياب برعم الحالب المتفرعة. فقط أول فرع T- مرحلة مرئية. ( B ) ميتانيفريك الكلى إكسلانت بعد 3 ديف، مع الفقراء برعم الحالب المتفرعة. شريط مقياس = 60 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتصف هذه المخطوطة طريقة لعزل أنلاجين ميتانيفريك النامية من جنين الماوس وثقافة أساسيات الجهاز. هذا الأسلوب هو تقنية قياسية، كما وضعتها غروبستين 8 و ساكسن 9 ، 10 ، وتم تكييفها وتعديلها من قبل العديد من الآخرين 11 ، 12 . نجاح طريقة يعتمد أساسا على مدة تشريح، كما بقاء إكسلانت و المحتملة الاستقرائية تنخفض مع وقت تشريح لفترات طويلة. يجب أيضا أن تؤخذ الرعاية لا تتلف ميسينشيم عند تنظيف الكلى رديم من الأنسجة المحيطة بها. الضرر من اللحمة المتوسطة ميتانيفريك غالبا ما يكون السبب في ضعف النمو من إإكسبلنتس. ومع ذلك، سرعة تشريح والمهارات الحركية الدقيقة تحسن كثيرا مع الممارسة.
وعادة ما يستخدم الوسط المعرف كيميائيا في البروتوكول المقدم ليحل محليحتوي على خليط من دمم و هام F-12، مع تكملة مع الأنسولين-ترانسفيرين-السيلينيوم لدعم نمو وبقاء إإكسبلنتس. يتم تسهيل الجلوكوز وامتصاص الأحماض الأمينية، الشحوم، والنقل داخل الخلايا عن طريق الأنسولين. السيلينيوم، عامل مساعد لالبروكسيديز الجلوتاثيون، وظائف كمضاد للأكسدة. ترانسفيرين هو الناقل الحديدي ويساعد على حماية ضد الجذور الأكسجين. في ثقافة الكلى الجنينية، إضافة ترانسفيرين إلى المتوسطة يزيد من التمايز نبيب وإدماج ثيميدين بطريقة تعتمد على الجرعة، مع أقصى تأثير حوالي 50 ميكروغرام / مل 13 . لذلك، يتم إضافة الإنسان-هولو-ترانسفيرين بالإضافة إلى ذلك في المتوسطة، مما أدى إلى تركيز ترانسفيرين النهائي من حوالي 55 ميكروغرام / مل. العديد من البروتوكولات، التي تستخدم تكوين أقل بساطة ولكن كيميائيا أقل، مع الحد الأدنى النسر المتوسطة الأساسية النسر(ميم) أو دمم و 10٪ مصل ( أي مصل بقري جنيني، فبس) أيضا تعطي نتائج مرضية جدا 12 ، 13 ، 14 ، 15 . ومع ذلك، قد تحدث اختلافات بين الكثير من فبس. لتجنب مثل هذه الاختلافات واستبعاد احتمال تداخل عوامل النمو الموجودة في مصل الدم مع الإشارات إيف، تم اختيار المتوسطة خالية من المصل. قرار ما إذا كان استخدام المتوسطة خالية من مصل يعتمد على الإعداد التجريبي والسؤال العلمي. وستكون ظروف الثقافة خالية من المصل مطلوبة بشكل خاص عندما يكون الهدف النهائي هو التطبيق العلاجي. أمفوتريسين B، وكيل المضادة للفطريات المدرجة في هذا البروتوكول، يمكن حذفها. فترة زراعة في المثال المقدم كان 3 أيام، ولكن يمكن استزراع أساسيات الكلى ميتانيفريك لمدة تصل إلى 10 يوما 15 . في الثقافات التي تتجاوز 3 أيام، يجب تغيير الوسيط كل 48 ساعة. تطوير كيدنتلخص أساسيات العين في المختبر تسلسل الجسم الحي من المجاميع قبل أنبوبي، الحويصلات الكلوية، والهيئات كوما و S على شكل. بعد 3 أيام في المختبر ، وشكلت الهياكل مثل الكبيبي 15 ، 16 . في الثقافات الأطول، تزيد المساحة المستكشفة بسبب استمرار تشعب برعم الحالب. في حوالي 5 أيام من الثقافة، و نيفرونس فصلت إلى قطاعات البعيدة والمتوسطة، والدانية 16 .
على الرغم من السهولة النسبية وكفاءة التكلفة لهذه التقنية، والسماح لتطبيقات متعددة الاستخدامات، وينبغي أن تؤخذ بعض الاعتبارات في الاعتبار عند التخطيط للتجارب وتفسير النتائج. بسبب المصفوفة خارج الخلية والغشاء القاعدي موجودة في الأجهزة المستزرعة، وانتشار العوامل الخارجية والجسيمات محدودة 17 . وعلاوة على ذلك، فإن ظروف الثقافة الاصطناعية والتلاعب قد يسبب تغييرات في ميتابولإيسم من الأنسجة، والسلوك الخلية التي تختلف عن الوضع في الجسم الحي 15 ، 18 . والأكثر وضوحا، أن إإكسبلنتس تفتقر إلى إمدادات الدم، والكبيبات هي عديمة الأوعية الدموية. على الرغم من أن النيفرون تصبح مجزأة، وتقسيم وتشكيل النخاع وحلقات هنلي مفقودة 14 ، 19 . وبالتالي، فإن الطيف تطبيق ثقافة الكلى الجنينية يقتصر على الهياكل الأنبوبية، التشكل المتفرعة لها، والتفاعلات الوسيطة-الظهارية. وبالتالي، لا يمكن معالجة الأسئلة العلمية التي تستهدف وظائف الكلى.
التعديلات الأخيرة من طريقة الثقافة التي تزرع فيها أساسيات الكلى على الزجاج المطلي في انخفاض حجم عضوي تمكين التنمية عضوي النمط حتى تصل إلى كورتيكو النخاعي التقسيم مع حلقات ممتدة من هينلي 15 . ومن الجدير بالذكر أيضا أنه في الآونة الأخيرة، وسيلة لتخزين والحفاظ على المعيشةتم نشر الكلى الجنينية. هذه الطريقة تمكن من نقل أساسيات الكلى الجنينية في E11.5 لعدة أيام، ويسمح لهم أن تكون مثقف في وقت لاحق. ويهتم هذا بوجه خاص بالتعاون 20 . طبيعة ثقافة الكلى كله رديم يسمح لمجموعة متنوعة من التكيف المنهجي، بما في ذلك تقنيات التصوير المتقدمة. لتجنب تحركات مقلقة أثناء التصوير الحي، فمن المستحسن استبدال العائمة مع فلتر ثابت، مثل أقحم ترانسويل. وقد تم توسيع التكنولوجيا المعروضة لكتل الأنسجة الثقافة التي تحتوي على الجهاز البولي التناسلي كله. باستخدام هذه الثقافة الموسعة، الإدراج الحالب في المثانة يمكن التحقيق 21 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ويشكر المؤلفان ليف أوكسبرغ وديريك آدمز على مشاركتهما بسخاء في معرفتهما، ليف أوكسبرغ على تعليقاتهما المفيدة على المخطوطة، وستيفان وولفل وأولريكي مولر على دعمهما التقني وساسكيا شميتكرت وجوليا غوبرت وساشا وير وفيولا ماير للمساعدة في مختبر. وأيد هذا العمل من قبل التنمية، شركة علماء الأحياء (ل كب).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | use for dissection |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Thimerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 conjugated Streptavidin | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF | R&D Systems | 496-EB | |
| Recombinant Human IgG1 Fc, CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc Antibody | R&D Systems | G-102-C | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | use for fixation and immunostaining |
| Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm |
agnthos.se | 0208-5-PS | 2 pairs of forceps are needed |
| Iris scissors, straight, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm |
agnthos.se | 08-032-130 | |
| Petri dishes Nunclo Delta treated | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom |
Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Fixed stage research mircoscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough Stereo Microscope | Leica | Leica S6 E |
References
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000 (2015).
- Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
- Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
- Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
- Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555 (2011).
- Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
- Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
- Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
- Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
- Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
- Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
- Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550 (2010).
- Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
- Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
- Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
- Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
- Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
- Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).
