Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von metanephrischen Rudimente aus Mäuseembryonen.
Abstract
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode für die Sektion, Isolierung und Kultur der Maus metanephrischen Rudimente zu beschreiben.
Während der Säugetier-Nieren-Entwicklung, die beiden Vorläufer-Gewebe, die ureterische Knospe und das metanephrische Mesenchym, kommunizieren und wechselseitig zelluläre Mechanismen induzieren, um schließlich das Sammelsystem und die Nephrone der Niere zu bilden. Da Säugetier-Embryonen intrauterin wachsen und daher für den Beobachter unzugänglich sind, wurde eine Orgelkultur entwickelt. Mit dieser Methode ist es möglich, epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen und zelluläres Verhalten während der Nierenorganogenese zu untersuchen. Darüber hinaus kann der Ursprung von angeborenen Nieren- und Urogenitaltrakt-Fehlbildungen untersucht werden. Nach sorgfältiger Dissektion werden die metanephrischen Rudimente auf einen Filter übertragen, der auf Kulturmedium schwimmt und in einem Zellkulturinkubator für mehrere Tage gehalten werden kann. Allerdings muss man sich bewusst sein, dass die Bedingungen sindKünstlich und könnte den Stoffwechsel im Gewebe beeinflussen. Auch konnte das Eindringen von Testsubstanzen aufgrund der extrazellulären Matrix und der im Explantat vorhandenen Basalmembran begrenzt werden.
Ein wesentlicher Vorteil der Orgelkultur ist, dass der Experimentator direkten Zugang zum Orgel haben kann. Diese Technologie ist billig, einfach und erlaubt eine Vielzahl von Modifikationen, wie die Zugabe von biologisch aktiven Substanzen, die Untersuchung von genetischen Varianten und die Anwendung fortschrittlicher bildgebender Verfahren.
Protocol
Die Mäuse wurden nach den schwedischen Vorschriften und den Rechtsvorschriften der Europäischen Union (2010/63 / EU) aufrechterhalten. Alle Verfahren wurden nach den Richtlinien des schwedischen Ethikausschusses durchgeführt (Genehmigungen C79 / 9, C248 / 11 und C135 / 14). Die Verfahren an der Universität Heidelberg mit Tierfächern wurden vom Regierungspräsidium Karlsruhe und den Tierschutzbeauftragten an der Universität Heidelberg genehmigt.
1. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien für Kultur
HINWEIS: Verwenden Sie eine laminare Strömungshaube, um die Kontamination zu minimieren.
- Am Tag der Sezierung wurde das menschliche Fc allein oder rekombinantes chimäres Ephrinprotein, das mit menschlichem Fc fusioniert ist, durch Mischen mit anti-humanen Fc-Ziegen-Antikörpern in einem Molverhältnis von 1: 5 in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt. 1 Stunde bei 37 ° C inkubieren 5 .
- Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient ergänzenMischung F-12 (DMEM / F12) mit 1% Penicillin / Streptomycin (v / v), 1% Glutamin (v / v), 1% Insulin-Transferrin-Selen (v / v), 50 μg / ml menschliches Holo- Transferrin und 1,5 μg / ml Amphotericin.
HINWEIS: 10 ml Medium reicht für 16 Embryonen aus. - Fügen Sie gruppierte rekombinante Ephrinlösung in einer Endkonzentration von 20 μg / ml zum Kulturmedium hinzu. Verwenden Sie Clustered Human Fc als Kontrolle.
- Bereiten Sie Kulturplatten vor, indem Sie 500 & mgr; l Kulturmedium zu jeder Vertiefung einer sterilen, unbeschichteten, flachen Boden-Polystyrol-4-Well-Platte hinzufügen.
- Mit sterilen Pinzetten sorgfältig einen Polycarbonat-Membranfilter mit einer Porengröße von 5 μm pro Well auf das Medium legen. Übertragen Sie die vorbereitete Platte in den Inkubator (37 ° C / 5% CO 2 ). Stellen Sie sicher, dass der Filter auf der Oberseite trocken bleibt und schwimmt.
HINWEIS: Ein Filter reicht für zwei Nierenanlagen aus. - Mit einer Rasierklinge schneiden Sie ca. 30 Pipettenspitzen (Volumen: 100 μl) approximatelY 1 mm von der Spitze, um zu einer breiteren Öffnung zu führen. Legen Sie die Spitzen wieder in ein Pipetten-Tip-Rack.
2. Dissektion von metanephrischen Rudimente bei E11.5
- Opfer eine zeitlich-schwangere Maus bei E11.5 durch zervikale Versetzung (oder mit einer Methode, die von der lokalen Ethik-Ausschuss genehmigt).
- Entfernen Sie den Uterus und die Embryonen, wie von Brown et al. 6 beschrieben. Von diesem Punkt aus, arbeiten Sie unter einem Sektionsmikroskop.
- Mit der Nr. 5 Uhrmacherzange, schneide den Embryo direkt unter die Vorderbeine. Verwenden Sie für jeden Embryo eine frische Petrischale. Entfernen Sie die Beine und den Schwanz des Embryos. Um dies zu tun, greifen Sie das Gewebe mit einem Paar von Nr. 5 Uhrmacher Pinzette entfernt werden und verwenden Sie die Spitzen eines zweiten Paares zu schneiden.
- Um die ventrale Organmasse zu entfernen, benutze die Spitzen einer Pinzette, um die Körperwand des Embryos in einer rostral-to-caudalen Richtung zu öffnen.
- Schnitt oberflächlich, parallel zu tEr dorsale aorta Verwenden Sie die Blut-gefüllte und daher sichtbare dorsale Aorta zur Orientierung. Sorgfältig trennen Sie den ventralen Teil der Körperwand von der dorsalen Teil mit den Spitzen der geschlossenen Pinzette und drehen Sie den Embryo über. Schneiden Sie die Körperwand seitlich in einer rostralen bis kaudalen Richtung und verwenden Sie die dorsale Aorta zur Orientierung, wie für die vorherige Seite.
- Sobald die ventrale Körperwand vom dorsalen Körper getrennt ist, packt sie mit einer Pinzette und zieht sie sorgfältig zusammen, um sie zusammen mit der Orgelmasse zu entfernen.
HINWEIS: Die metanephrischen Anlagen bleiben gewöhnlich an der dorsalen Körperwand befestigt. Sie sind ovale, 200 μm lange Strukturen, die sich auf der Höhe der Hinterbeine befinden. - Halten Sie die dorsale Körperwand mit einer Pinzette, mit der ventralen Seite nach oben. Mit dem anderen Paar Pinzette, greifen die dorsale Aorta an seinem rostralen Ende und sorgfältig schälen die dorsale Aorta aus der dorsalen Körperwand.
ANMERKUNG: Beide metanephrischen Nieren bleiben in der Regel angebrachtAuf die dorsale aorta - Mit einem Paar Pinzette, schneiden rostral auf die Niere anlagen, um die Aorta zu entfernen. Dann trennen Sie sorgfältig die beiden Niere anlagen mit den Spitzen der Pinzette.
- Vorsichtig vor unerwünschtes Gewebe aus der Niere anlagen mit den Spitzen der Pinzette abziehen. Achten Sie darauf, das Mesenchym nicht zu beschädigen, da Schäden zu einem schlechten Wachstum und Ausschluss des Explantats aus einer weiteren Analyse führen können.
- Übertragen Sie die Niere anlagen separat mit einer Mikroliterpipette und einer weit geöffneten Pipettenspitze in 10 μl PBS zum Polycarbonat-Membranfilter in einer 4-Well-Platte.
HINWEIS: Durch die Oberflächenspannung wird das Explantat mit einer dünnen Schicht von Medium bedeckt. Ein Filter reicht für zwei Nierenanlagen aus.- Legen Sie jedes der beiden Nieren-Anlagen in die Mitte jeder jeweiligen Hälfte des Filters. Übertragen Sie die Platte wieder auf den Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2 . Verlasse den Teller im Inkubator bis zum metanephrischen RudIments aus dem nächsten Embryo sind bereit, auf den Filter gelegt zu werden.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.9.1 für jeden Embryo.
ANMERKUNG: Bei einigen Übungen dauert das Dissektionsverfahren etwa 5 min pro Embryo. - Inkubation der Niere anlagen für 3 Tage bei 37 ° C / 5% CO 2 .
3. Vorbereitung der Reagenzien zur Fixierung und Färbung
- Zur Herstellung von 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS ohne Calcium und Magnesium (w / v), löst man die PFA bei 60 ° C in PBS, kontinuierlich rühren. Auf Raumtemperatur abkühlen und mit einem Papierfilter die restlichen Partikel entfernen. Aliquot und bei 4 ° C zur sofortigen Anwendung aufbewahren oder zur Langzeitlagerung einfrieren.
ACHTUNG: PFA ist giftig. Tragen Sie die persönliche Schutzausrüstung, die in den örtlichen Sicherheitsnormen angegeben ist, und arbeiten Sie in einer Abzugshaube. Verwerfung von Abfällen nach institutionellen Richtlinien und Verwendung von Abfallbehältern. - Zur Vorbereitung der Permeabilisierungslösung verdünnen Sie Triton X-100In PBS ohne Kalzium und Magnesium bis 0,3% (v / v).
- Zur Herstellung der Blockierungslösung 5% (v / v) Ziegenserum und 0,1% Triton X-100 zu PBS ohne Calcium und Magnesium zugeben. Füge Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% (w / v) hinzu. Bei 4 ° C aufbewahren.
ACHTUNG: Natriumazid ist giftig. Behandeln Sie Natriumazid gemäß den örtlichen Sicherheits- und Umweltschutzbestimmungen.
HINWEIS: Bei der Verwendung von Antikörpern für die Färbung, verwenden Sie 5% Serum aus der Spezies der sekundäre Antikörper wurde abgeleitet, um Sperrlösung zu machen. - Verdünnen Sie biotinyliertes Dolichorus biflorus Agglutinin 1: 200 in Blockierungslösung. Verdünnen Sie Alexa488-konjugiertes Streptavidin 1: 200 in Blockierungslösung.
- Zur Herstellung von gebrauchsfertigem Einbettungsmedium (siehe Tabelle der Materialien) werden 0,1 g wasserlösliches Polyvinylalkohol-basiertes Mukoadhäsiv / ml bis 25% (w / v) Glycerin in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) . Unter ständigem Rühren für 1 h auf 50 ° C erhitzen, abkühlen lassen und den pH-Wert auf 8,0-8,5 einstellenM NaOH. Vermeiden Sie höhere NaOH-Konzentrationen. Füge 100 μg / ml N-Propylgallat und Thimerosal zu einer Endkonzentration von 0,02% (w / v) hinzu. 30 min bei Raumtemperatur umrühren.
ACHTUNG: Thimerosal ist giftig. Behandeln Sie es gemäß den örtlichen Sicherheits- und Umweltschutzbestimmungen.- Füllen Sie das Einbettungsmedium in 50 ml Röhrchen, balancieren Sie den Rotor und zentrifugieren Sie bei 3.200 xg und Raumtemperatur für 10 min. Die klare Lösung in 15 ml Röhrchen dekantieren und das Pellet entsorgen. Aliquot und bei -20 ° C für mehrere Wochen aufbewahren. Einmal aufgetaut, halten Sie die Lösung bei 4 ° C. Warm bis ~ 30 ° C sofort vor Gebrauch.
- Bereiten Sie so viele Glasrutschen vor, wie Filter mit Explantaten montiert werden sollen. Dazu kleben Sie zwei kleine Deckgläser, 18 x 18 mm, auf beiden Seiten des Glasschiebers mit Instant-Klebstoff, lassen Sie einen Durchmesser von 15 mm für den Filter dazwischen.
4. Fixierung und Färbung
- Nach einer Kultivierungszeit von 3Tage in vitro (div), entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und sorgfältig aspirieren das Kulturmedium aus jeder Vertiefung mit einer Mikropipette. Achten Sie darauf, den Filter nicht zu berühren und halten Sie die Spitze in Richtung der Wand des Brunnens.
- Fügen Sie 500 μl 4% PFA / PBS zu jeder Vertiefung hinzu. Die Filter schweben auf dem Fixiermittel. Verwenden Sie eine Mikropipette, fügen Sie vorsichtig das PFA-Fixiermittel hinzu, um die Filter zu tauchen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min.
HINWEIS: Für alle folgenden Schritte ist darauf zu achten, dass die Explantate nicht aus dem Filter abgewaschen werden. Halten Sie das Öffnen der Pipettenspitze zur Wand des Brunnens. - Entfernen Sie die PFA und spülen Sie zweimal mit 500 μl PBS, tauchen Sie den Filter ein. Füge 500 μl Permeabilisierungslösung zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere bei Raumtemperatur für 1 h.
- Spülen Sie zweimal mit 500 & mgr; l PBS und fügen Sie 500 & mgr; l Blockierungslösung zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 h.
- Ersetzen Sie die Sperrlösung durch250 μl biotinyliertes Dolichorus biflorus Agglutinin verdünnt 1: 200 in Blockierungslösung und inkubieren bei 4 ° C für 24 h.
- Die Dolichorus biflorus Agglutininlösung entfernen und zweimal mit 500 μl PBS pro Vertiefung ausspülen.
- Füge 250 μl Alexa488-konjugiertes Streptavidin hinzu, verdünnt 1: 200 in Blockierungslösung und inkubiere bei 4 ° C für 24 h. Alternativ bei Raumtemperatur für 2 h inkubieren.
HINWEIS: Ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis wird erreicht, wenn es bei 4 ° C inkubiert wird. - Spülen Sie zweimal mit 500 μl PBS pro Vertiefung. Mit Pinzette, die Filter auf die vorbereiteten Glasrutschen übertragen, mit den Explantaten nach oben. Montage mit ~ 50-100 μl Einbettmedium. Deckel mit 60 mm langen Nr. 1,5 Deckgläschen. Man läßt die Einbettmediumlösung 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln erstarren. Gehen Sie zum Abbilden oder lagern Sie die Folien, in Folie verpackt, bei 4 ° C bis zum Bild.
- Bild mit einem Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop 7 </ Sup> gekoppelt an eine Hg-Lampe und verwenden eine Spiegeleinheit für die blaue Anregung (Anregungsbandpass, 460 - 495 nm, dichromatischer Spiegel, 505 nm und Emissionsbandpass, 510 - 550 nm) und 20X Plan-Apochromat-Linsen, 0,75 numerisch Öffnung.
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Representative Results
Metanephrische Nierenanlagen wurden von schwangeren Black-6-Inzuchtmäusen bei E11.5 abgeleitet und wurden kultiviert. Nach 3 Tagen hatte sich die Harnröhre bis zu 5 Mal verzweigt, was zu einer Verzweigung der anfänglich T-förmigen Harnröhre führte. Jedes Explantat wurde fotografiert, und die Anzahl der Segmente und Endpunkte wurde quantifiziert, um die Verzweigungsgenerationen zu bestimmen und die Anzahl der Endpunkte pro Zweig zu berechnen (Abbildung 1 ). Die Erzeugung der 4. Generation wurde in nur 8% der behandelten Explantate erreicht, verglichen mit 35% der Kontroll-Explantate (Abbildung 1b ). Entsprechend wurde die Anzahl der Endpunkte pro Verzweigung und Endpunkte pro mm 2 reduziert Explantate, die mit Clustered EphrinB2 behandelt wurden, und ein Drittel der Explantate hatte in den Harnröhrenspitzen eine ungewöhnliche Morphologie (Abbildung 1 ). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass EphrinB2 eine einschränkende Wirkung haben könnteAuf dem Harnröhrenknotenverzweigungsprozess, höchstwahrscheinlich durch Aktivierung von EphA4- und EphB2-Vorwärtssignalisierung.
Für ein erfolgreiches Experiment ist es entscheidend, dass das metanephrische Mesenchym während der Sektion nicht beschädigt wird. Jede Verletzung des Mesenchyms verringert das induktive Potential, führt zu einer verminderten oder fehlenden Harnröhrenknospenverzweigung und könnte eine Quelle von Bias sein. Das Beispiel in Fig. 2A zeigt ein Explantat, bei dem das Mesenchym fast fehlt. Die ureterische Knospe verzweigte sich nicht über die T-Bühne hinaus. Abbildung 2B zeigt ein Beispiel, bei dem die Schädigung des metanephrischen Mesenchyms zu einem schlechten Wachstum und einer Verzweigung führte. Beide Explantate müssen von der Analyse ausgeschlossen werden.
Abbildung 1: E11.5 Metanephrische Kidneyanlagen kultiviert für 3 div und behandelt mit Clustered Rekombinante EphrinB2 oder ClustErlangen menschlichen Fc als Kontrolle. ( A ) Metanephrische Nierenanlagen wurden bei E11.5 seziert, für 3 div kultiviert und mit biotinyliertem Dolichorus biflorus agglutinin und Alexa488-konjugiertem Streptavidin gefärbt. Die Explantate wurden mit einem Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop mit einem Anregungsbandpass von 460-495 nm, einem dichromatischen Spiegel von 505 nm, einem Emissionsbandpass von 510-550 nm und 20X Plan-Apochromat-Linsen abgebildet. Die Anwendung von gruppiertem rekombinantem EphrinB2 (clEphrinB2) führte zu einer verminderten Verzweigungskomplexität und Fehlbildung der Harnleiterknospenspitzen (Pfeilspitze). ( B ) Die linke Grafik zeigt Verzweigungsgenerationen in clEphrinB2-behandelten und Kontroll-Explantaten. Die 4. Generation der Verzweigung wurde in nur 8% der behandelten Explantate erreicht, verglichen mit 35% der Kontroll-Explantate. Die Anzahl der Endpunkte pro Zweig (mittlerer Graph) und Endpunkte pro Fläche (rechter Graph) wurde reduziert (Endpunkte pro Zweig CNT, 2,1 ± 0,09, ClEphrinB2, 1.7± 0,08, P = 0,007 **; Endpunkte pro Quadratmillimeter: CNT, 31 ± 0,01; ClEphrinB2, 27 ± 0,02; P = 0,04 *; N = 23). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt und ein ungepaartes Student's t-Test wurde verwendet. Maßstab = 100 μm. Diese Figur wurde von Peuckert et al. , 2016 3 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Beispiele für zwei E11.5 metanephrische Nierenanlagen, die während der Dissektion beschädigt wurden, für 3 div kultiviert und mit biotinyliertem Dolichor Biflorus Agglutinin und Alexa488-konjugiertem Streptavidin gefärbt. ( A und B ) Die Schädigung des Mesenchyms führte zu einem schlechten oder fehlenden Wachstum und einer ureterischen Knospenverzweigung,Disqualifizierung der Explantate aus der weiteren Analyse. ( A ) Metanephrisches Nieren-Explantat nach 3 div, mit abwesendem ureterischen Knospenverzweigung. Nur der erste T-Stufen-Zweig ist sichtbar. ( B ) Metanephrisches Nieren-Explantat nach 3 div, mit schlechter Harnleiter-Knospenverzweigung. Maßstab = 60 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Manuskript beschreibt eine Methode, um das sich entwickelnde metanephrische Anlagen aus dem Maus-Embryo zu isolieren und die Orgel-Rudimente zu kultivieren. Diese Methode ist eine Standardtechnik, wie sie von Grobstein 8 und Saxén 9 , 10 entwickelt wurde und von vielen anderen 11 , 12 angepasst und modifiziert wurde. Der Erfolg der Methode hängt hauptsächlich von der Dauer der Dissektion ab, da das Explantatüberleben und das induktive Potenzial mit längerer Sektionszeit abnehmen. Es muss auch darauf geachtet werden, das Mesenchym nicht zu beschädigen, wenn man das Nierenrudiment aus dem umgebenden Gewebe reinigt. Die Schädigung des metanephrischen Mesenchyms ist oft der Grund für ein schlechtes Wachstum der Explantate. Allerdings verbessern die Sektionsgeschwindigkeit und die feinen motorischen Fähigkeiten mit der Praxis erheblich.
Das chemisch definierte Medium in dem dargestellten Protokoll wird üblicherweise verwendet, um das zu ersetzenSerum-haltiges Medium in der primären Zelle und in vitro Orgelkultur und enthält eine 1: 1 (v / v) Mischung von DMEM und Ham's F-12, ergänzt mit Insulin-Transferrin-Selen, um das Wachstum und das Überleben der Explantate zu unterstützen. Glukose- und Aminosäureaufnahme, Lipogenese und intrazellulärer Transport werden durch Insulin erleichtert. Selen, ein Kofaktor für Glutathionperoxidase, fungiert als Antioxidans. Transferrin ist ein eiserner Träger und hilft, gegen Sauerstoffradikale zu schützen. In der embryonalen Nierenkultur erhöht die Zugabe von Transferrin zu dem Medium die Tubulendifferenzierung und den Thymidineinbau in einer dosisabhängigen Weise mit einer maximalen Wirkung um 50 μg / ml 13 . Daher wird human-holo-transferrin zusätzlich in das Medium ergänzt, was zu einer endgültigen Transferrinkonzentration von etwa 55 μg / ml führt. Viele Protokolle, die eine einfachere, aber chemisch weniger definierte Komposition verwenden, mit Eagles Minimal Essential Medium(MEM) oder DMEM und 10% Serum ( dh fötales Rinderserum, FBS) ergeben ebenfalls sehr befriedigende Ergebnisse 12 , 13 , 14 , 15 . Es können jedoch Unterschiede zwischen verschiedenen Lose von FBS auftreten. Um solche Variationen zu vermeiden und eine mögliche Interferenz von Wachstumsfaktoren, die im Serum mit Eph-Signalisierung vorhanden sind, auszuschließen, wurde serumfreies Medium gewählt. Die Entscheidung, ob serumfreies Medium zu verwenden ist, hängt vom experimentellen Aufbau und der wissenschaftlichen Frage ab. Serumfreie Kulturbedingungen wären besonders erforderlich, wenn das Ziel der therapeutischen Anwendung ist. Amphotericin B, das in diesem Protokoll enthaltene Antipilzmittel, kann weggelassen werden. Die Kultivierungszeit im vorgestellten Beispiel betrug 3 Tage, aber metanephrische Nierenrudimente können bis zu 10 Tage kultiviert werden 15 . In Kulturen, die 3 Tage überschreiten, sollte das Medium alle 48 Stunden gewechselt werden. Die Entwicklung der KidnEy rudiments in vitro rekapituliert die in vivo- Sequenz von vorröhrenförmigen Aggregaten, Nierenbläschen und Komma- und S-förmigen Körpern. Nach 3 Tagen in vitro haben glomeruläre Strukturen 15 , 16 gebildet. In längeren Kulturen steigt der Explantatbereich aufgrund der fortgesetzten Verzweigung der Harnleiterknospe weiter an. Bei etwa 5 Tagen Kultur haben sich die Nephrone in distale, mittlere und proximale Segmente 16 getrennt.
Trotz der relativen Leichtigkeit und Kosteneffizienz der Technik, die vielseitige Anwendungen ermöglicht, sollten einige Überlegungen bei der Planung von Experimenten und Interpretationsergebnissen berücksichtigt werden. Aufgrund der in den kultivierten Organen vorhandenen extrazellulären Matrix und Basalmembran ist die Diffusion von exogenen Mitteln und Partikeln begrenzt. Darüber hinaus können die künstlichen Kulturbedingungen und Manipulationen Veränderungen im Metabol verursachenIsm des Gewebes und Zellverhalten , das sich von der in vivo Situation 15 , 18 unterscheidet. Am deutlichsten fehlen die Explantate der Blutversorgung, und die Glomeruli sind avaskulär; Obwohl die Nephrone segmentiert werden, Zonierung und die Bildung einer Medulla und Schleifen von Henle fehlen 14 , 19 . So ist das Anwendungsspektrum der embryonalen Nierenkultur auf die röhrenförmigen Strukturen, ihre Verzweigungsmorphologie und mesenchymal-epitheliale Wechselwirkungen beschränkt. Folglich können wissenschaftliche Fragen zur Nierenfunktion nicht angegangen werden.
Jüngste Modifikationen der Kulturmethode, bei der Nieren-Rudimente auf beschichtetem Glas in einer geringen Volumen-fähigen organotypischen Entwicklung bis hin zur kortiko-medullären Zonierung mit ausgedehnten Schleifen von Henle 15 angebaut werden. Es ist auch erwähnenswert, dass vor kurzem eine Methode zu speichern und zu bewahren LebenEmbryonale nieren wurde veröffentlicht. Diese Methode ermöglicht den Transport von embryonalen Nieren-Rudimente bei E11.5 für mehrere Tage und ermöglicht es ihnen, später kultiviert zu werden. Dies ist besonders interessant für Kooperationen 20 . Die Natur der Vollniere-Rudimentkultur ermöglicht eine Vielzahl von methodischen Anpassungen, einschließlich fortgeschrittener bildgebender Verfahren. Um störende Bewegungen während der Live-Bildgebung zu vermeiden, empfiehlt es sich, das Floating mit einem festen Filter, wie z. B. einem Transwell-Einsatz, zu ersetzen. Die präsentierte Technologie wurde sogar auf Kulturgewebeblöcke mit dem ganzen Urogenitaltrakt erweitert. Mit dieser erweiterten Kultur kann die Harnleitereinführung in die Blase untersucht werden 21 .
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken Leif Oxburgh und Derek Adams für ihre Kenntnisse, Leif Oxburgh für die hilfreichen Kommentare zum Manuskript und Stefan Wölfl und Ulrike Müller für ihre technische Unterstützung und Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer und Viola Mayer für die Hilfe in der Labor. Diese Arbeit wurde von der Entwicklung, der Gesellschaft der Biologen (nach CP) unterstützt .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | use for dissection |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Thimerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 conjugated Streptavidin | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF | R&D Systems | 496-EB | |
| Recombinant Human IgG1 Fc, CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc Antibody | R&D Systems | G-102-C | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | use for fixation and immunostaining |
| Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm |
agnthos.se | 0208-5-PS | 2 pairs of forceps are needed |
| Iris scissors, straight, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm |
agnthos.se | 08-032-130 | |
| Petri dishes Nunclo Delta treated | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom |
Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Fixed stage research mircoscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough Stereo Microscope | Leica | Leica S6 E |
References
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000 (2015).
- Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
- Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
- Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
- Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555 (2011).
- Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
- Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
- Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
- Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
- Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
- Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
- Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550 (2010).
- Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
- Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
- Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
- Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
- Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
- Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).
