Summary
このプロトコルは、マウス胚からのmetanephric基盤を単離および培養するための方法を記載する。
Abstract
このプロトコールの目的は、マウスのメタネフリカの基礎の解剖、単離および培養のための方法を記述することである。
哺乳動物の腎臓発達中、2つの前駆組織、尿管芽および間葉間葉は、最終的に腎臓の収集系およびネフロンを形成するために、細胞機構を伝達し相互に誘導する。哺乳動物の胚が子宮内で増殖し、したがって観察者が接近できないので、器官培養が開発されている。この方法により、腎臓器官形成の間に上皮間葉相互作用および細胞の挙動を研究することが可能である。さらに、先天性腎臓および泌尿生殖路奇形の起源を調べることができる。慎重な解剖の後、metanephricの手先は、培地上に浮遊するフィルター上に移され、数日間細胞培養インキュベーターに保持することができます。しかし、条件が人工的であり、組織内の代謝に影響を及ぼす可能性がある。また、外植片に存在する細胞外基質および基底膜のために、試験物質の浸透が制限される可能性がある。
器官培養の1つの主な利点は、実験者が器官に直接アクセスできることである。この技術は安価で簡単であり、生物学的に活性な物質の添加、遺伝子変異の研究、高度なイメージング技術の適用など、多数の改変が可能である。
Protocol
マウスは、スウェーデンの規制およびEU法（2010/63 / EU）に従って維持された。すべての手続きはスウェーデン倫理委員会のガイドライン（C79 / 9、C248 / 11、C135 / 14の許可）に従って実施された。ハイデルベルク大学での動物被験者の手順は、ハイデルベルク大学のRegierungspräsidiumKarlsruheとAnimal Welfare Officersによって承認されています。
1.培養用試薬および材料の調製
注：汚染を最小限に抑えるために、層流フードを使用してください。
- 解剖の日に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の1：5のモル比で抗ヒトFcヤギ抗体と混合することにより、ヒトFcに融合されたヒトFcのみまたはヒトFcに融合された組換えキメラエフリンタンパク質を前もってクラスター化する。 37℃で1時間インキュベートする。5 。
- ダルベッコ改変イーグル培地：栄養素を補充して培地を調製する1％ペニシリン/ストレプトマイシン（v / v）、1％グルタミン（v / v）、1％インシュリン - トランスフェリン - セレン（v / v）、50μg/ mlのヒトホロ - トランスフェリン、および1.5μg/ mLのアンホテリシンを含む。
注：16胚には培地10 mLで十分です。 - 20μg/ mLの最終濃度のクラスター化組換えエフリン溶液を培地に添加する。クラスター化されたヒトFcを対照として使用する。
- 無菌のコーティングされていない平底のポリスチレン4ウェルプレートの各ウェルに培地500μLを加えて培養プレートを調製する。
- 滅菌鉗子を使用して、培地の上に穴あたり5μmの孔径を有するポリカーボネート膜フィルターを注意深く1つ置きます。調製したプレートをインキュベーター（37℃/ 5％CO 2 ）に移す。フィルターが上面に濡れていて浮いていることを確認してください。
注：2つの腎臓の癌細胞には1つのフィルターで十分です。 - かみそりの刃を使用して、およそ30個のピペットチップ（容量：100μL）を切断して先端から1mmの位置で、より広い開口部をもたらす。チップをピペットチップラックに戻します。
2. E11.5におけるメタネフリックルディメントの解体
- E11.5で妊娠しているマウスを頸椎脱臼により犠牲にする（または地元の倫理委員会で承認された方法を使用する）。
- ブラウンら 6 ）の記載に従って、子宮および胚を取り除く。この時点から、解剖顕微鏡下で作業する。
- 第5時計メーカーの鉗子を使用して、前脚のすぐ下に胚を切断します。各胚のために新しいペトリ皿を使用してください。胚の脚と尾を外す。これを行うには、削除する組織を1組の5番時計メーカーの鉗子でつかみ、2番目のペアの先端を使用して切断します。
- 腹側器官の塊を取り除くには、一対の鉗子の先端を使用して、胚の体壁を吻側 - 尾側方向に横に開く。
- 表面と平行、tに平行彼は背の大動脈。血液充填された、したがって目に見える背側大動脈を方向付けに使用する。閉鎖した鉗子の先端を用いて体壁の腹側部分を背側部分から注意深く分離し、胚を裏返す。体側の壁を吻側から尾側に切断し、前側と同様に背側の大動脈を使用して向きを決めます。
- 腹側の身体の壁が背側の身体から分離されたら、1対の鉗子でそれをつかんで、それを臓器塊とともに慎重に引き抜く。
注：metanephric anlagenは、通常、背の体の壁に付着したままになります。それらは、後肢のレベルに位置する長さ約200μmの楕円形の構造である。 - 腹側を上にして、1対の鉗子で背側の身体の壁を保持する。他の鉗子のペアを使用して、その吻側の端で背部の大動脈をつかんで背部の体の壁から背部の大動脈を注意深く剥がす。
注：両方のメタニュークリニック腎臓は、通常、背部大動脈に投与した。 - 1対の鉗子を用いて、大動脈を除去するために吻側に吻側に切断する。次に、慎重に鉗子の先端を使用して2つの腎臓のanlagenを分離します。
- 慎重に鉗子の先端を使用して腎臓のanlagenから不要な組織を剥がす。間葉系に損傷を与えないよう注意してください。破損は、さらなる分析から外植片の成長不良および排除を招く可能性があるためです。
- 4ウェルプレートのポリカーボネートメンブランフィルターに10μLのPBSにマイクロタイターピペットとワイドオープンピペットチップを使用して、腎臓のanlagenを別々に移す。
注：表面張力のため、外植片は薄い培地層で覆われます。 2つの腎臓のマーカーには1つのフィルターで十分です。- 2つの腎臓のそれぞれをフィルターの各半分の中央に置きます。プレートを37℃/ 5％CO 2のインキュベーターに戻します。プレートはインキュベーターの中に放置してください次の胚からのイメントは、フィルター上に置く準備ができている。
- 各胚についてステップ2.3〜2.9.1を繰り返す。
注：いくつかの練習では、解剖の手順は、胚あたり約5分かかるでしょう。 - 37℃/ 5％CO 2で3日間、腎臓の蛍光物質をインキュベートする。
3.固定化および染色のための試薬の調製
- カルシウムとマグネシウム（w / v）を含まないPBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を調製するために、PFAを60℃でPBSに溶解し、連続的に撹拌する。室温まで冷却し、紙フィルターを使用して残りの粒子を除去する。分注し、すぐに使用する場合は4℃に保ち、長期間保存する場合は凍結してください。
注意：PFAは有毒です。現地の安全基準に規定されている個人用保護具を着用し、ヒュームフードで作業してください。施設ガイドラインと指定廃棄物容器を使用して廃棄物を廃棄してください。 - 透過液を調製するために、希釈したTriton X-1000.3％（v / v）までのカルシウムおよびマグネシウムを含まないPBS中でインキュベートした。
- ブロッキング溶液を調製するために、5％（v / v）ヤギ血清および0.1％Triton X-100をカルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSに加える。アジ化ナトリウムを0.02％（w / v）の最終濃度まで添加する。 4℃で保存する。
注意：アジ化ナトリウムは有毒である。現地の安全および環境保護規制に従ってナトリウムアジドを取り扱ってください。
注：染色のために抗体を使用する場合、二次抗体が由来する種からの5％血清を用いてブロッキング溶液を作製する。 - ビオチン化Dolichorus biflorusアグルチニンをブロッキング溶液で1：200希釈する。 Alexa488結合ストレプトアビジンをブロッキング溶液で1：200希釈する。
- すぐに使用できる包埋培地（材料の表を参照）を調製するために、0.1M Tris-HCl（pH 8.5）中の25％（w / v）グリセロールに0.1gの水溶性ポリビニルアルコール系粘膜接着剤/ 。連続的に攪拌しながら50℃に1時間加熱し、冷却し、1を用いてpHを8.0-8.5に調整する。M NaOH。より高いNaOH濃度を避けてください。 100μg/ mLのN-プロピルガレートおよびチメロサールを0.02％（w / v）の最終濃度に加える。室温で30分間撹拌する。
注意：チメロサールは有毒です。現地の安全および環境保護規制に従って取り扱ってください。- 50 mLのチューブに包埋培地を満たし、ローターをバランスさせ、3,200 xgで室温で10分間遠心する。透明な溶液を15 mLチューブに移し、ペレットを捨てる。分注し、数週間-20℃で保存します。解凍後、溶液を4℃に保ちます。使用直前に約30℃まで暖めます。
- 外植片を取り付けるためのフィルターをガラススライドとして準備します。このためには、インスタント接着剤を使用してスライドガラスの両側に小さなカバースリップ（18 x 18 mm）を2つ貼り付けます。間に15 mmのスペースを残してください。
4.固定および染色
- 3の培養期間後in vitroでインキュベートし （div）、インキュベーターからプレートを取り出し、マイクロピペットを用いて各ウェルから培地を注意深く吸引する。フィルターに触れないで、先端開口部を井戸の壁の方に保つようにしてください。
- 500μLの4％PFA / PBSを各ウェルに加える。フィルターは固定液に浮かぶでしょう。マイクロピペットを使用して、注意深くPFA固定剤を滴下して、フィルターを水没させる。室温で30分間インキュベートする。
注記：以降のすべての手順では、外植片をフィルターから洗い流さないように注意しなければなりません。井戸の壁に向かってピペットチップの開口部を保つ。 - PFAを除去し、500μLのPBSで2回洗浄し、フィルターを浸します。 500μLの透過処理溶液を各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートする。
- 500μLのPBSで2回すすぎ、500μLのブロッキング溶液を各ウェルに加えます。室温で1時間インキュベートする。
- ブロッキング溶液を250μLのビオチン化Dolichorus biflorus凝集素をブロッキング溶液で1：200に希釈し、4℃で24時間インキュベートする。
- Dolichorus biflorusアグルチニン溶液を除去し、1ウェルあたり500μLのPBSで2回リンスする。
- ブロッキング溶液で1：200に希釈したAlexa488結合ストレプトアビジン250μLを添加し、4℃で24時間インキュベートする。あるいは、室温で2時間インキュベートする。
注：4℃でインキュベートすると、より良いシグナル対ノイズ比が得られます。 - 1ウェルあたり500μLのPBSで2回すすぐ。鉗子を使用して、外植片を上にして、準備したガラススライドにフィルターを移す。 〜50〜100μLの包埋培地でマウントする。長さ60mmの1.5号カバースリップで覆う。包埋媒体溶液を暗所で室温で2時間固化させる。イメージングに進むか、フォイルに包まれたスライドを4°Cで画像化するまで保存します。
- 広視野落射顕微鏡7 <（励起帯域、460〜495nm;二色性鏡、505nm、および発光バンドパス、510〜550nm）および20X Plan-Apochromatレンズ、0.75数値絞り。
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Representative Results
Metanephric kidney anlagenは、E11.5で妊娠したBlack-6近交系マウスに由来し、培養した。 3日後、尿管芽は5回まで分岐し、最初はT字型の尿管芽が分岐した。各外植片を撮影し、分節世代を決定し、分枝あたりのエンドポイントの数を計算するために、セグメントおよびエンドポイントの数を定量化した（ 図1 ）。 ImageJ（ rd世代;第4世代は、移植外植片のわずか8％で到達したが、対照外植片の35％（ 図1b ）と比較して、分岐あたりのエンドポイント数およびmm 2あたりのエンドポイント数は、さらに、外植片の3分の1が尿管芽の先端に異常な形態を有していた（ 図1 ）ことから、EphrinB2には拘束効果がある可能性が示唆されたEphA4およびEphB2の順方向シグナル伝達を活性化することにより、尿管芽分岐プロセスにおいて、
成功した実験のためには、解剖中に間葉間葉間腔が損傷しないことが重要である。間葉の損傷は誘導電位を低下させ、尿管枝の分岐が減少または欠如し、バイアスの原因となり得る。 図2Aの例は、間葉がほぼ欠損している外植片を示す。尿管芽はT期を越えて分岐しなかった。 図2Bは、間葉系間葉の損傷が不十分な成長および分岐を引き起こした例を示す。両方の外植片を分析から除外しなければならない。
図1：3つの部門で培養され、クラスター化組換えEphrinB2またはClustersで処理されたE11.5 Metanephric腎臓のAnlagen対照としてヒトFcを産生する。 （ A ）Metanephric kidney anlagenをE11.5で解剖し、3divで培養し、ビオチン化Dolichorus biflorusアグルチニンおよびAlexa488結合ストレプトアビジンで染色した。外植片は、460~495nmの励起バンドパス、505nmの二色性ミラー、510~550nmの放射バンドパス、および20Xプランアポクロマートレンズを有する広視野落射蛍光顕微鏡で撮像した。クラスター化組換え体EphrinB2（clEphrinB2）の適用は、分枝の複雑さおよび尿管芽の先端（矢頭）の異常をもたらした。 （ B ）左のグラフは、clEphrinB2処理および対照外植片における分枝世代を示す。 4 回目の分岐の発生は、処置外植片の35％と比較して、処置された外植片の僅か8％に達した。ブランチあたりのエンドポイント数（中央グラフ）および面積あたりのエンドポイント数（右グラフ）は減少した（ブランチCNTあたりのエンドポイント2.1±0.09; clEphrinB2,1.7±0.08、P = 0.007 **; 1平方ミリメートルあたりの終点：CNT、31±0.01; clEphrinB2,27±0.02; P = 0.04 *; n = 23）。データは、平均±SEMとして示され、対になっていないスチューデントのt検定が用いられた。スケールバー=100μm。この図は、Peuckert et al。 、2016 3 。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：解剖中に損傷を受け、3divのために培養され、ビオチン化Dolichorus Biflorus AgglutininおよびAlexa488結合ストレプトアビジンで染色された2つのE11.5 Metanephric腎臓のAnlagenの例。 （ AおよびB ）間葉の損傷は、成長不良および尿管枝の枝分かれを生じ、外植片をさらなる分析から不適格とする。 （ A ）尿路枝の分岐がない、3区画後のメタネフリック腎臓外植片。最初のTステージブランチのみが表示されます。 （ B ）尿路枝の分岐が不十分で、3div後のMetanephric腎臓外植片。スケールバー=60μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この写本は、発達中のメタネフリカのanlagenをマウスの胚から単離し、器官を培養する方法を記述しています。この方法は、Grobstein 8とSaxén9,10によって開発された標準的な手法であり、多くの他者11,12によって適応され、変更されています。この方法の成功は、主に、外植片の生存および誘導電位の低下が切開時間の延長に伴う切開の持続時間に依存する。腎臓基底組織を周囲の組織から浄化する場合、間葉系を損傷しないように注意しなければならない。間葉間葉の損傷は、しばしば外植片の乏しい成長の理由である。しかし、解剖速度および精巧な運動能力は、実践によって大きく改善する。
提示されたプロトコールにおける化学的に規定された培地は、一次細胞およびインビトロ器官培養物中の血清含有培地中で培養し、外植片の成長および生存を支持するためにインスリントランスフェリンセレンを補充したDMEMおよびHam's F-12の1：1（v / v）混合物を含有する。グルコースおよびアミノ酸の取り込み、脂質生成、および細胞内輸送は、インスリンによって促進される。グルタチオンペルオキシダーゼの補因子であるセレンは、抗酸化剤として機能する。トランスフェリンは鉄キャリアであり、酸素ラジカルからの保護に役立ちます。胚の腎臓培養において、培地へのトランスフェリンの添加は、用量依存的に細管分化およびチミジン取り込みを増加させ、最大効果は約50μg/ mLである13 。 したがって、ヒト - ホロ - トランスフェリンを培地に補充して最終トランスフェリン濃度を約55μg/ mLとする。シンプルであるが化学的にあまり定義されていない組成物を使用する多くのプロトコールは、Eagle's Minimal Essential Medium（MEM）またはDMEMおよび10％血清（ すなわち、ウシ胎児血清、FBS）も非常に満足のいく結果を与える12,13,14,15。しかしながら、異なるロット間の変動が起こる可能性がある。そのような変動を回避し、血清中に存在する成長因子のEphシグナル伝達の妨害を排除するために、無血清培地を選択した。無血清培地を使用するかどうかの決定は、実験のセットアップおよび科学的な質問に依存する。最終的な目的が治療的適用である場合、無血清培養条件が特に必要とされるであろう。アンフォテリシンB（このプロトコールに含まれる抗真菌剤）は省略することができる。提示された例の培養期間は3日間であったが、メタニュークリンの腎臓基礎は10日間まで培養することができる15 。 3日を超える培養では、培地は48時間ごとに交換する必要があります。幼稚園の開発試験管内では、管状凝集体、腎小胞、およびコンマおよびS字体のインビボ配列が再構成される。 インビトロで 3日後、糸球体様構造が15,16を形成した。より長い培養では、外植片は、尿管芽の分岐が継続するためにさらに増加する。培養の約5日目に、ネフロンは、遠位、中間および近位のセグメント16に分離されている 。
多彩なアプリケーションを可能にしながら、技術の比較的容易さとコスト効率にもかかわらず、実験を計画し、結果を解釈するときは、いくつかの考慮事項を念頭に置いておく必要があります。培養器官に存在する細胞外基質および基底膜のために、外因性物質および粒子の拡散は制限される17 。さらに、人工培養条件および操作は、代謝物の変化組織のism、およびインビボ状況と異なる細胞挙動15,18。最も顕著に、外植片は血液供給がなく、糸球体は無血管である。ネフロンはセグメント化されるが、ゾーネーションとヘンレの髄質とループの形成は欠落している14,19。したがって、胚性腎臓培養の適用範囲は、管状構造、それらの分枝形態、および間葉上皮相互作用に限定される。その結果、腎機能を目的とした科学的な問題に対処することはできません。
Henle 15の拡張ループによる皮質髄質ゾニズムまで、低容量化可能な器官発達でコーティングされたガラス上に腎臓の基礎を成長させる培養方法の最近の改変。また、最近では、生活を保存し、保存する方法も注目されています胚の腎臓が公開された。この方法は、E11.5で数日間、胚の腎臓基礎を輸送することを可能にし、後にそれらを培養することを可能にする。これはとりわけコラボレーションに関心がもたれています20 。全腎臓基礎文化の性質は、高度なイメージング技術を含む様々な方法論的適応を可能にする。ライブイメージング中の妨げになる動きを避けるために、フローウェルをトランスウェルインセットなどの固定フィルターで置き換えることをお勧めします。提示された技術は、泌尿生殖路全体を含む組織ブロックを培養するためにも拡張されている。この拡張された培養を使用して、尿管の膀胱への挿入を調べることができる21 。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
筆者はLeif OxburghとDerek Adamsの知識共有、Leif Oxburghの原稿への有用なコメント、StefanWölflとUlrikeMüllerのテクニカルサポート、Saskia Schmitteckert、Julia Gobbert、Sascha Weyer、Viola Mayerに感謝します。ラボこの研究は、Development、The Biology of Company （CPへ）によって支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | use for dissection |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Thimerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 conjugated Streptavidin | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF | R&D Systems | 496-EB | |
| Recombinant Human IgG1 Fc, CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc Antibody | R&D Systems | G-102-C | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | use for fixation and immunostaining |
| Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm |
agnthos.se | 0208-5-PS | 2 pairs of forceps are needed |
| Iris scissors, straight, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm |
agnthos.se | 08-032-130 | |
| Petri dishes Nunclo Delta treated | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom |
Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Fixed stage research mircoscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough Stereo Microscope | Leica | Leica S6 E |
References
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