Summary
여기에서는 MCS (Magnetic-activated Cell Sorting)를 사용하여 Perivascular Adipose Tissue (PVAT)에서 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cell, APC) 개체군을 분리하는 방법을보고합니다. 이 방법은 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)와 비교할 때 지방 조직 1g 당 APC의 증가 된 분리를 허용합니다.
Abstract
Paracrine 신호를 통한 혈관 기능의 주요 조절자인 Perivascular Adipose Tissue (PVAT)의 확장은 비만 동안 고혈압 발생과 직접적으로 관련이 있습니다. 비대 및 증식의 정도는 저장소 위치, 성별 및 존재하는 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cell, APC) 표현형의 유형에 달려 있습니다. 지난 10 년 동안 APC와 전 지방 세포 분리에 사용 된 기술은 특정 세포 표면 마커를 기반으로 개별 세포를 식별 할 수있는 정확성을 획기적으로 향상 시켰습니다. 그러나 APC와 지방 세포의 분리는 세포의 취약성으로 인해 어려움이 될 수 있습니다. 특히 손상되지 않은 세포가 세포 배양에 사용되어야하는 경우 특히 그렇습니다.
MCS (Magnetic-activated Cell Sorting )는 지방 조직의 무게 단위 당 더 많은 수의 APC를 분리하는 방법을 제공합니다. MCS에 의해 수확 된 APC 는 시험 관내 프로토콜에 사용되어 prea세포에 의해 유지되는 다작 및 지방 형성 잠재력의 분석을 허용하는 성장 인자 칵테일의 사용을 통해 지방 세포로 이들을 분화시킨다. 이 실험은 대동맥 및 장간막 PVAT 저장소에 초점을 두었습니다.이 저장소는 확장 중에 심혈관 질환 발병에서 중요한 역할을합니다. 이 프로토콜은 정의 된 APC 인구를 분리, 확장 및 차별화하는 방법을 설명합니다. 이 MCS 프로토콜을 사용하면 최소한의 장비 또는 교육으로 세포 정렬이 필요한 모든 실험에서 격리를 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 세포 표면 마커의 존재를 기반으로 특정 세포 인구의 기능을 결정하기 위해 추가 실험을 도울 수 있습니다.
Introduction
혈관과의 근접성 때문에 혈관 주위 지방 조직 (Perivascular Adipose Tissue, PVAT)은 혈관 기능 1 에서 중요한 파라 크린 신호 전달 요소입니다. 이 지방 조직의 팽창은 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cells, APC)의 표현형에 따라 다릅니다 2 , 3 . 지방 세포로부터의 분리는 주요 지방 세포가 약하고 부력이 있고 크기가 다양하기 때문에 어렵습니다. 특정 분리 기술은 또한 염증 단백질 합성을 증가시키고 지방 생성 유전자 발현을 감소시킴으로써 세포 표현형 및 형태를 변화시킬 수 있으며, 세포의 완전성을 유지하는 프로토콜의 중요성을 강조한다.
1 차 세포 및 특이적인 전 지방 세포 모집단의 배양 은 생체 내 성장 에 대한 환원 주의적 접근법을 제공하고, 동등한 세포 유전 학적 구성을 유지한다.이 세포들을 가지고있는 노화는 노화 또는 노화로 인한 악화로 인해 제한됩니다 6 . 피하 및 망막 저장소를 비롯한 다양한 지방 저장소의 전 지방 세포는 또한 특정 해부학 적 부위에서 세포를 수집하는 중요성을 강조하는 증식의 차이를 보여준다. 비 PVAT 백색 지방 저장소의 선구 세포는 이전 연구 7,8,9에서 특징 지어졌지만 PVAT APC 표현형에 대해서는 알려진 바가 적다.
여기에 설명 된 기술은 형태와 생존력, 증식 및 분화 가능성에 미치는 영향을 최소화하면서 특정 APC 집단과 정의 된 APC 집단을 분석 할 수 있습니다. MCS (Magnetic-Activated Cell Sorting)는 배양액과 같이 다운 스트림 응용 분야에 적합합니다. 구슬이 세포를 변경하지 않고 용해되기 때문입니다. MCS는 또한 경제적이며 일단 항체가 손상되면농도가 표준화 되었기 때문에 유동 세포 계측법의 필요성은 미미합니다. PVAT 선구 물질에 대한 시험 관내 연구는 또한 이러한 일차 세포가 가질 수있는 잠재력을 엿볼 수 있습니다.
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Protocol
이 문서에 설명 된 모든 절차는 Michigan State University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 제정 한 지침을 따릅니다. 모든 버퍼와 미디어는 빛으로부터 보호되어야합니다.
1. 버퍼, 미디어 및 기기 준비
- Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered 용액 (KRBB) 준비 : 135 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼륨, 1 mM 황산 마그네슘, 0.4 mM 인산이 수소 칼륨, 5.5 mM 포도당, 1 % 항생제 / 항균제 (10,000 units / mL 페니실린, 10,000 μg / mL 스트렙토 마이신, 25 μg / mL 암포 테리 신 B) 및 10 mM HEPES (pH = 7.4). 이 용액은 4 ℃에서 멸균 한 상태에서 3 주 동안 안정하다.
- Collagenase Type 1 용액을 준비하십시오 : 4 % Bovine Serum Albumin (BSA)가 함유 된 KRBB 1mg / mL. 이 용액은 37 ° C에서 보관해야하며 4 시간 동안 안정합니다.
- 적혈구 용해 용액 준비 : 154 mM ammonium chloride, 10 mM potassium bicarbonate, 및 0.1 mM EDTA. 4 ° C에서 최대 1 개월간 보관하십시오.
- MCS 차단 버퍼 : DMEM / F12 미디어베이스, 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 5 % 정상 당나라 혈청, 40 μL / ML F (ab) 단클론 항 쥐 IgG를 준비합니다. 4 ° C에서 최대 1 개월간 보관하십시오.
- MCS 완충 용액 준비 : 인산염 완충 식염수 (PBS, pH = 7.5), 0.5 % BSA 및 2mM EDTA. 4 ° C에서 최대 1 개월간 보관하십시오. 유리 용기에 넣고 37 ° C로 가열 한 후 15 초 동안 진공을 가하여 De-gas 용액을 만든다. 사용하지 않은 상태로 봉인 된 상태로 두십시오.
- FBS, FCS, 1 % 항생제 / 항균제 (10,000 units / mL 페니실린, 10,000 μg / mL 스트렙토 마이신, 25 μg / ml), Dalbecco 's Modified Eagles Medium (DMEM) / ml amphotericin B), 44.05 mM 중탄산 나트륨, 100 μM 아스코르브 산, 33 μM 비오틴, 17 μM 판토텐산, 2 mM L- 글루타민 및 20 mM HEPES. 4 ° C에서 2 주 동안 무균 상태로 유지하십시오.
- APC &표피 성장 인자 10 ng / mL, 백혈병 억제 인자 (10 ng / mL), 혈소판 유도 성장 인자 BB (10 ng / mL) 및 염기성 섬유 모세포 성장 인자 5 ng / mL). 4 ° C에서 2 주 동안 무균 상태로 유지하십시오.
- APC 유도 배지 : 10 % FBS, 2.5 μg / mL 인슐린, 0.5 mM 2-isobutyl-1-methylaxanthine (IBMX), 1 μM dexamethasone 및 200 pM T3 (triiodothyronine 갑상선 호르몬)가 포함 된 APC Media를 준비하십시오. 4 ° C에서 2 주 동안 무균 상태로 유지하십시오.
2. 지방 세포 전구 세포 분리
- 기관 지침에 따라 쥐를 마취. 쥐를 등받이에 놓습니다. 발가락 핀치를 통한 마취 깊이와이 고통스러운 자극에 대한 반사 반응의 상실을 확인하십시오.
참고 :이 프로토콜은 10 주 된 Sprague Dawley 쥐와 70 mg / kg의 pentobarbital을 복강 내 주사를 통해 전달합니다. - 수직 정중 절개를 만들어라.흉골 부위의 흉골과 회음부의 가위. 복강에 접근하여 상 장간막 동맥, 작은 장간막 저항 혈관 (mPVAT) 및 흉부 대동맥 (aPVAT)을 노출시킵니다.
- 장간막과 대동맥에 모든 연결을 단절하고 동물에서 혈관을 제거하십시오. 해부 현미경과 KRBB로 가득 찬 페트리 접시를 사용하여 PVAT를 분리하고 혈관을 관찰하고 PVAT를 분리합니다.
- 이 실험에서는 비 PVAT 지방 저장소를 나타내는 생식선 (Gonadal, GON)을 수집합니다. 10 밀리미터 HEPES (산도 = 7.4)와 KRBB에 얼음에 격리 지방 패드를 놓으십시오.
- 바이오 안전성 (biosafety) 두드림에서 조직 약 50 mg을 콜라게나 제제 I 용액 1 mL가 들어있는 1.7 mL 튜브에 옮기고 조직 가위 (1 - 3 mm 조각)로 말하다.
- 1 시간 동안 rotisserie 인큐베이터 (또는 궤도 진탕기를 가진 인큐베이터)에서 37 ° C에서 배양하여 샘플을 소화합니다. biosafety 후드에서 100과 40을 통해 소화 된 물질을 순차적으로 걸러냅니다. μm 세포 스트레이너를 50 mL 튜브에 넣었다. 생성 된 여과 액을 4 ℃에서 원심 분리하여 300 x g에서 10 분간 원심 분리한다.
참고 : 여기에서 프로토콜의 모든 단계는 세포를 살균 유지하기 위해 생물 안전성 보닛에서 수행되어야합니다. - SVX 세포가 들어있는 상등액과 resuspend 펠렛을 1X 적혈구 용적 완충 용액 1 mL에 넣고 1.7 mL 미세 튜브에 옮긴다. 빛으로부터 보호 된 RT에서 5 분간 세포를 인큐베이션하고 4 ℃에서 300 x g에서 5 분간 원심 분리한다.
- SVF Basal Media에 상청액을 붓고 남아있는 세포 펠렛을 재용 해하십시오. Trypan 블루 솔루션으로 살아있는 세포를 계산하기 위해 20 μL 하위 샘플을 수집합니다.
참고 : 격리 할 수있는 SVF 셀의 수는 사이트마다 다릅니다. 조직 1mg 당 평균 SVF 수는 다음과 같습니다. aPVAT = 5.0 ± 2.0x10 3 , mPVAT = 1.04 ± 0.62x10 4 , GON = 2.4 ± 1.2x10.
3. 자기 활성화 셀 정렬
_content "> 참고 : 4 ℃에서 모든 단계를 수행하여 CD34 및 PDGFRα 세포 표면 마커를 기반으로 SVF에서 APC를 분리합니다.- 300 x g에서 5 분간 세포를 회전시킨다. 뜨는을 붓고 1 X 10 6 세포 / ML에서 MCS 차단 버퍼에 세포 펠렛을 resuspend 20 분 동안 품어.
참고 : 1x10 6 - 2 x 10 8 세포 / mL의 세포 현탁액을 효과적으로 분리 할 수 있습니다. - 4에서 30 분 동안 FITC - 결합 마우스 안티 CD34 (1 μg / 1 X 10 6 셀) 5 μL와 세포를 품어 ° C. 300 xg 및 4 ° C에서 5 분간 세포를 스핀.
- 항 -FITC 마이크로 비드 4 μL와 4 ° C에서 5 분간 MCS 완충액 96 μL (총 부피 100 μL)와 함께 항온 배양하여 CD34 + 및 CD34 - 세포를 분리한다.
- 자성 분리기를 스탠드에 부착하고 컬럼 날개가 앞쪽에있는 MultiSort (MS) 컬럼을 분리기에 넣으십시오. 5 mL포집 관을 상부 관 홀더의 MS 칼럼 아래에 놓는다.
- MCS Buffer Solution으로 헹구어 MS Column을 준비하십시오. 컬럼 상단에 500 μL의 MCS Buffer를 넣고 완충액을 통과 시키십시오. 유출 물을 버리고 수거 튜브를 교체하십시오.
- 준비된 MS 칼럼에 항체 표식 세포 현탁액을 적재하십시오. 레이블이없는 세포가 들어있는 플로우 스루를 수집하십시오.
- 탈기 된 MCS 완충액 3x 500 μL로 MS 칼럼을 세척하십시오. 이전 단계에서 통과 흐름과 결합하여 전달 unlabeled 세포를 수집합니다.
- 마그네틱 분리기에서 MS 컬럼을 제거하고 새로운 수집 튜브에 놓습니다. MS 칼럼에 MCS 완충액 1 mL 피펫. 즉시 자석으로 표시된 세포로 분획을 즉시 플러싱하지만, 칼럼과 함께 제공된 플런저를 천천히 적용하여 과잉 가스가 칼럼에 들어 가지 않도록하십시오.
참고 : 격리 된 셀 번호는 사이트마다 다릅니다. SVF 집단으로부터 분리 된 CD34 + APC의 평균 수조직의 mg은 aPVAT = 2.6 ± 0.43x10 2 , mPVAT = 9.6 ± 1.4x10 2 , GON = 1.3 ± 0.22x10 3 이다. - 300 × g 및 4 ℃에서 5 분간 세포를 스핀. 4시 30 분 1시 200 분 솔루션 / 1 X 10 6 세포 토끼 항 PDGFRα 10 μL에 수집 된 CD34 + 분만 품어 ° C.
- 300 XG 및 4 ° C에서 5 분 동안 세포를 다시 원심 분리하십시오. 분리 된 단계 3.3 ~ 3.7을 반복하여 안티 토끼 IgG microbeads 4 μL와 MCS 버퍼 96 μL로 표시된 세포를 품어.
참고 : 격리 된 셀 번호는 사이트마다 다릅니다. 조직 1mg 당 CD34 + 개체군으로부터 분리 된 PDGFRα + APC의 평균 수는 aPVAT = 2.4 ± 0.64, mPVAT = 8.4 ± 2.4, GON = 10.4 ± 1.9이며 이는 이전에 격리 된 개체군의 0.5-10 %이다.
- 300 XG 및 4 ° C에서 5 분 동안 세포를 다시 원심 분리하십시오. 분리 된 단계 3.3 ~ 3.7을 반복하여 안티 토끼 IgG microbeads 4 μL와 MCS 버퍼 96 μL로 표시된 세포를 품어.
4. 세포 배양 및 Adipogenesis 유도
- SVF 문화및 2 일마다 교체하는 기초 배지의 6-Well 조직 배양 판에서의 APC. 3 연속 통로 후, 8 웰, 24 웰, 48 웰 및 96 웰에서 평가되는 증식 검정을위한 1 x 10 2 세포 / 웰의 검정색 96 웰 웰 배양 플레이트 및 24 웰 플레이트 또는 50,000 세포 / 웰에서의 플레이트 질적 및 정량적 인 지방 생성 분석을위한 48-Well 조직 배양 플레이트에서 10,000 세포 / 웰.
- 분화를 위해 표시된대로 뼈 형태 형성 단백질 4 (3.3 nmol / L)로 유도하기 전과 48 시간 후의 합류 후 APC 기초 배지 보충. APC 유도 미디어를 사용하여 세포를 부화시키기 위해 100 % confluency (0 일) 48 시간 후 세포를 유도하십시오.
- 48 시간 후, 미디어를 변경하여 IBMX 및 dexamethasone이없는 APC 유도 매질에서 14 시간 동안 세포를 유지하고 매 48 시간마다 배지를 교환하십시오.
- FACS에 의해 검증 된 MCS 격리.
- 자기 적으로 분리 된 50 μL (50,000 셀)의 하위 샘플을 가져옵니다.FACS 용액으로 세척 하였다.
- 원심 분리기 세포와 PDGFRα + 세포를 라벨에 당나귀 안티 - 토끼 IgG Dylight 405의 1 : 1,000 솔루션 100 μL에 resuspend. 빛과 4 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.
- Flow cytometer에서 488 nm (FITC) 및 405 nm (Dylight 405) 필터를 사용하여 분석 할 때까지 세포를 세척하고 2 % 포름 알데히드 용액 200 μL로 resuspend하십시오.
참고 : 배양 된 세포에 의한 지질 축적은 형광을 측정하는 마이크로 플레이트 판독기에서 지방 친화 지방 세포 형광 분석을 사용하여 정량적으로 평가되고 지질 축적을위한 교정자로 전 지방 세포를 사용합니다. 지질 축적은 또한 지질 염색 및 세포가 지질을 함유하지 않는 전체 세포의 비율을 관찰 할 수있는 역상 현미경에서 수행되는 영상화에 의해 정 성적으로 측정됩니다. 485 nm에서 여기와 572에서 방출로 형광을 측정 할 수있는 모든 플레이트 판독기nm는 디지털 이미지를 캡처 할 수있는 카메라가있는 모든 현미경뿐만 아니라 분석에도 적합합니다.
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Representative Results
전 지방 세포의 증식 능력과 지방 세포 전구체의 지방 형성 잠재력은 시험 관내에서 유지 되는 특성이다 11 . 정량적 DNA 분석을 사용하여 도금 후 8, 24, 48 및 96 시간에 수컷 랫트의 aPVAT, mPVAT 및 GON으로부터 분리 된 SVF 및 APC의 시험 관내 증식을 평가 하였다. 같은 장소의 SVF 세포와 비교하여 96 시간까지 증식이 적은 aPVAT의 APC를 제외하고는 모든 시점에서 SVF 팽창률의 차이가 관찰되지 않았다 ( 그림 1 ).
Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4)로 자극 한 컨 플루 언트 APC는 표준 유도 전 48 시간 동안 분화를 보였다. 이것은 형광 지질 섭취 분석 ( 그림 2) 으로 평가 된 방울에서의 더 큰 지질 축적에 의해 분명했다A ) 및 오일 레드 O 염색 ( 그림 2B ).
APC의 수율을 비교할 때, MCS 분리는 FACS에 비해 배양을 위해 준비된 세포 수가 더 많았다. 중요한 것은 APC 집단 (CD34 + 및 PDGFRα + )의 분포와 생존 가능성이 MCS와 FACS간에 유사하다는 점입니다. 포스트 분리를 계산하기위한 Trypan Blue 염색에 의해 결정된 세포 생존력은 두 단리 절차 (FACS = 71.57 % ± 11.09; MCS = 79.25 % ± 7.47)에서 유사했다. 이 데이터는 APC의 MCS 분리가 MCS에 비해 실행 가능한 APC의 수가 더 많음을 보여줍니다.
도표 1 : In Vitro Adipocyte Progenitor Cells (APC)는 해부학 적 위치의 영향을받습니다. 10 주령의 수컷 흰쥐의 대동맥 및 장간막 혈관 주위 지방 조직 (aPVAT & mPVAT)과 성선 지방으로부터 간질 혈관 분획 (SVF)과 APC를 분리 하였다. 세포의 증식은 시딩 후 8, 24, 48 및 96 시간 시점에서의 DNA 정량 분석에 의해 측정되었다. 데이터는 8 시간베이스 라인 ± SEM (N = 4)에 걸쳐 배수 증가로 표현된다. 유의성은 * (P <0.05)로 표시됩니다. Contreras et al .에서 수정 된 그림. 2016 13 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 2 : Adipocyte Progenitor 세포 (APC)는 Differentia에있는 변이를 보여준다Depot 간의 기능 차이는 있지만 SVF (Stromal Vascular Fraction)와 비교할 때 더 큰 지질 축적. 세포는 48 시간 동안의 confluency와 BMP4 노출 후 dexamethasone과 3- isobutyl-1-methylxanthine에 48 시간 노출시킨 후 유지 배지에서 14 시간마다 배지를 48 시간마다 바꾼다. ( A ) 분화되지 않은 preadipocytes의 비율로 표현 된 데이터와 차별 APC의 지질 섭취 분석 : 상대 형광 단위 (RFU) ± SEM (N = 4)에서 차별 지방 세포 (preadipocytes : 지방 세포). ( B ) APC와 SVF의 Oil Red O (ORO) 염색은 지질 (ORO 흡수) ± SEM (N = 4)을 갖는 세포의 퍼센트로 표시되는 데이터로 나타냈다. 유의성은 * (P <0.05)로 표시됩니다. Contreras et al. 에서 수정 된 그림 . 2016 13 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 생존 가능한 지방 세포 전구 세포 (APC)의 분리 수율은 MCS (Magnetic-Activated Cell Sorting)로 향상되었습니다. MCS와 FACS를 이용한 혈관 주위 지방 조직 (대동맥 = aPVAT, mesenteric = mPVAT)으로부터 분리 된 SVF에서 CD34 + ( A )와 PDGFRα + ( B )의 표면 표식 발현. 데이터는 조직 50mg ± SEM (N = 4)으로부터 분리 된 평균 세포 수로 나타낸다. 유의성은 * (P <0.05)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
현재 실험의 중심은 PVAT 저장소에서 APC를 분리, 확장 및 지방 생성 유도하는 것입니다. 여기서 우리는 표면 마커 CD34 및 PDGFRα를 발현하는 세포의 동정에 기초한 APC의 분리 프로토콜을 제시한다. 이러한 표면 단백질은 이전 APC에서 높은 증식 속도와 다양한 지방 저장소 14 , 15 에서 흰색 또는 갈색 지방 세포로 분화 할 잠재력으로 확인되었습니다. 이러한 특정 마커를 기반으로 세포를 선택함으로써 우리는 선택된 PVAT에서 관찰되는 지방 세포 표현형과 일치하는 여러 지방 저장소에서 유사한 APC 개체군을 분리 할 수있었습니다. 우리의 실험에서 우리는 성장 인자 BMP4를 보충함으로써 APC 분화를 향상시켰다. 이전에 Macotela와 동료들은 내장 지방 저장소의 특정 APC 집단이배양 배지에 지방 성장 인자 BMP2 또는 BMP4가 보충되지 않으면 분화 될 때 피하 저장소 12 , 16 , 17 , 18 .
지방 조직으로부터의 개별 세포 분리는 세포의 취약성으로 인해 어렵 기 때문에 MCS를 사용하면 소모품, 장비 및 교육 자원의 비용을 줄이면서 효율적인 세포 분리 방법을 제공 할 수 있습니다. APC 수율은 동물의 나이 또는 크기, 그리고 매개체 온도의 변화 및 살균 된 격리 환경을 유지하지 못하는 것에 의해 영향을받을 수 있다는 점에 유의해야합니다. 정상 산소 상태에서 세포를 배양하는 것은 또한 증식과 분화에 중요하며, 따라서 배양 공기 조건의 유지는 배양 관행에 필수적입니다. t 동안 충분한 세포 펠릿이 형성되지 않으면 원심 분리 속도를 800 xg로 증가시킬 수 있습니다.그는 고립 과정. conjugated FITC fluorochrome이 시간이 지남에 따라 분해 될 수 있기 때문에 항체의 만료를 확인하는 것도 필요할 수 있습니다. 콜라게나 제 유형 I의 많은 변화는 로트가 효력이 다를 수 있으므로 소화 과정을 변경해야 할 수도 있습니다. 쥐 이외의 다른 종을 사용하는 경우, 항체의 숙주 종 (host species)이 여기에 사용 된 것과 다르면 차단 완충액에서 특정 혈청과 IgG가 필요할 수도 있습니다.
FACS에 비해 MCS의 장점 중 하나는 키트가 저렴하고 쉽게 구입할 수 있으므로 FACS보다 경제적으로 실현 가능하다는 것입니다. 이것은 또한 flow cytometer의 구매, 유지 보수 및 사용 교육을 피합니다. MCS를 사용하면 선택 및 배경 형광 관여를 위해 게이트를 조정하지 않고도 특정 바인딩을 사용할 수 있습니다.
이 연구의 한계는 두 개의 전 지방 세포 표면 마커에 의존한다는 것입니다. 헌신과 차이의 다른 전 지방 세포 표면 지표Zfp423, Sca1 및 CD24와 같은 증식이 20 , 21 번 확인되었습니다. 이러한 마커는 특정 표현형의 헌신 된 지방 전구 세포를 정확하게 식별 할 수 있습니다. 그러나,이 마커를 발현하는 세포는 갈색 및 흰색 표현형 20 , 21 둘 모두를 유도 할 수 있기 때문에, 여기에서 사용 된 표면 마커를 선택 하였다. 이 연구의 또 다른 한계는 APC 배양에서 성장 인자의 선택적 사용이었다. 다른 성장 인자 칵테일은 지방 생성 유도에 효과적입니다 22 . 이 연구에서 세포 배양은 모든 배양이 2 차원 배양 판에서 이루어 졌기 때문에 제한적이었다. 이것은 문화 표준이지만, 생체 내 세포는 이런 식으로 증식하지 않습니다. 입체 환경에서 배양하면 지방 형태의 자연 형태를 복제하기 때문에 더 많은 비대 및 증식을 허용 할 수 있습니다ructure 23 .
MCS 사용의 실용성과 효율성으로 인해이 프로토콜은 PVAT의 다른 세포 유형뿐만 아니라 APC의 분리에도 이상적입니다. 이 절차는 또한 지방 전구 세포 배양에서 분화를 유도하는보다 효과적인 방법을 제공합니다. 최소한의 비용, 장비 및 필요한 교육을 통해 특정 표면 마커를 기반으로 세포를 분리하고자하는 실험실에서이 방법을 사용할 수 있습니다. 미래의 응용은 다른 세포 집단의 분리 또는 더 특정한 세포 마커의 사용을 허용 할 수있다. 줄기 세포 활성화에 세포 투입에 성장 인자 칵테일을 사용하는 것이 유용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Contreras와 Watts Laboratories와 William Raphael 박사. 이 실험은 NHLBI F31 HL128035-01 (조직 분해 프로토콜 표준화), NHLBI 5R01HL117847-02 및 2P01HL070687-11A1 (동물) 및 NHLBI 5R01HL117847-02 (세포 분리 및 배양)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC-conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48-Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
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