Summary
Burada Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MCS) kullanarak Perivasküler Adipoz Doku (PVAT) Adiposit Progenitör Hücre (APC) popülasyonlarının izolasyonu için bir yöntem rapor. Bu yöntem, floresan-Aktive Hücre Ayırma (FACS) ile karşılaştırıldığında, yağ dokusunun gramı başına APC'nin artan bir izolasyonuna izin verir.
Abstract
Parakrin sinyal vasıtasıyla vasküler fonksiyonların büyük düzenleyicisi olan perivasküler yağ dokusunun (PVAT) genişlemesi, obezite sırasında hipertansiyonun gelişimi ile doğrudan ilişkilidir. Hipertrofi ve hiperplazinin derecesi, depo yer, cinsiyet ve mevcut Adiposit Progenitör Hücre (APC) fenotiplerinin türüne bağlıdır. Son 10 yılda APC ve preadipositler izolasyonu için kullanılan teknikler, spesifik hücre yüzeyi belirteçlerine dayalı olarak tek tek hücrelerin tanımlanabileceği doğruluğunu büyük ölçüde geliştirmiştir. Bununla birlikte, APC ve adipositlerin izolasyonu, özellikle hücrelerin hücre kültürü uygulamaları için muhafaza edilmesi gerekiyorsa, hücrenin kırılganlığından dolayı bir meydan okuma olabilir.
Manyetik olarak aktive olan Hücre Ayırma ( MCS), yağ dokusunun ağırlık birimi başına daha fazla canlı APC'yi izole etmek için bir yöntem sağlar. MCS tarafından hasat edilen APC, preapeni genişletmek için in vitro protokoller için kullanılabilirDipositleri ve büyüme faktörü kokteyllerini kullanarak hücreler tarafından tutulan üretken ve adipojenik potansiyelin analizine izin vererek adipositlere ayırdık. Bu deney genişleme sırasında kardiyovasküler hastalığın gelişiminde kilit rol oynayan aortik ve mezenterik PVAT depoları üzerine odaklanmıştır. Bu protokoller, APC'nin tanımlanmış bir popülasyonunu izole etmek, genişletmek ve ayırmak için kullanılan yöntemleri tanımlamaktadır. Bu MCS protokolü, hücrenin sınıflandırılmasına minimum ekipman veya eğitimle ihtiyaç duyulan herhangi bir deneyde izolasyonun kullanılmasını sağlar. Bu teknikler, hücre yüzeyi markörlerinin varlığına dayanan spesifik hücre popülasyonlarının işlevselliğini belirlemek için ileri deneylere yardımcı olabilir.
Introduction
Perivasküler Adipoz Doku (PVAT), kan damarlarına yakın olması nedeniyle damar sistemi fonksiyonu 1'de önemli parakrin sinyal bileşenidir. Bu yağ dokusunun genleşmesi, 2 , 3 mevcut Adiposit Progenitör Hücrelerinin (APC) fenotipine bağlıdır. Primer adipositler kırılgan, yüzen ve aralıklı olduğundan, yağ dokularından hücrelerin izolasyonu zordur. Bazı izolasyon teknikleri aynı zamanda hücrelerin bütünlüğünü koruyan bir protokolün önemini vurgulayan, inflamatuvar protein sentezini arttırarak ve adipogenik gen ekspresyonunu azaltarak hücre fenotipini ve morfolojisini değiştirebilir.
Birincil hücrelerin kültürü ve spesifik preadiposit alt popülasyonları, in vivo büyümeye indirgemeci bir yaklaşım sağlar ve eşdeğer hücresel genetik yapıyı korur 5 , ancak tiYaşlanma, ya da yaşlanma 6 ile bozulma nedeniyle bu hücrelerle beni sınırlıdır. Deri altı ve omental depolar da dahil olmak üzere çeşitli yağ depolardan preadipositler, spesifik anatomik bölgelerden hücrelerin toplanmasının önemini vurgulayan proliferasyon 7'deki farklılıkları da gösterir. PVAT dışı beyaz yağ depolarından öncül hücreler önceki çalışmalar 7 , 8 , 9'da karakterize edilmiştir, ancak PVAT APC fenotipleri hakkında daha az bilgi bilinmektedir.
Burada açıklanan teknikler, morfolojileri, yaşayabilirlikleri ve çoğalması ve farklılaşması potansiyeli üzerinde asgari düzeyde etkisi olan spesifik ve tanımlanmış APC popülasyonlarının analiz edilmesine izin verir. Manyetik olarak aktive olan Hücre Ayırma (MCS), hücrenin değiştirilmeden boncukların çözünmesi nedeniyle kültür gibi müteakip uygulamalara uygundur. MCS de ekonomiktir ve bir kez antikor koniSantitler standart hale getirildiğinden, akış sitometrisi deneylerine olan ihtiyaç azdır. PVAT öncülleri ile yapılan in vitro çalışmalar, bu primer hücrelerin sahip olabileceği potansiyelin bir görüntüsünü de verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu yazıda açıklanan tüm prosedürler, Michigan Devlet Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından oluşturulan yönergeleri izlemektedir. Tüm tamponlar ve medyalar ışığa karşı korunmalıdır.
1. Tamponların, Ortamların ve Aletlerin Hazırlanması
- 135 mM sodyum klorür, 5 mM potasyum klorür, 1 mM magnezyum sülfat, 0.4 mM potasyum fosfat dibazik, 5.5 mM glukoz,% 1 antibiyotik / antimikotik (10,000 ünite / mL penisilin, 10,000 μg) Krebs Ringer Bikarbonat Tamponlanmış çözeltiyi (KRBB) hazırlayın. / ML streptomisin, 25 ug / mL amfoterisin B) ve 10 mM HEPES (pH = 7.4). Bu solüsyon steril tutulduğunda ve 4 ° C'de 3 hafta boyunca stabildir.
- Kollajenaz Tip 1 Solüsyonu hazırlayın: KRBB'de% 1 sığır Serum Albümini (BSA) içeren 1 mg / mL. Bu solüsyon 37 ° C'de tutulmalı ve 4 saat boyunca stabildir.
- Eritrosit Lizis Tamponu Çözeltisi Hazırlayın: 154 mM amonyum klorür, 10 mM potasyum bikarbonat, Ve 0.1 mM EDTA. Bir aya kadar 4 ° C'de tutun.
- MCS Engelleme Tamponu Hazırlayın: DMEM / F12 Ortam tabanı,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 5 normal eşek serum, 40 uL / mL F (ab) Parç편 Eşek Anti-Rat IgG. Bir aya kadar 4 ° C'de tutun.
- MCS Tampon Çözeltisi Hazırlayın: Fosfat Tamponlu Tuz (PBS, pH = 7.5),% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA. Bir aya kadar 4 ° C'de tutun. De-gaz çözeltisi, bir cam kap içerisinde 37 ° C'ye ısıtılarak ve daha sonra 15 saniye süreyle vakum uygulanarak hazırlanır. Kullanılmayan tamponlu mühürlü bırakın.
- Dulbecco's-Modifiye Kartal Ortamı (DMEM): F12,% 15 Fetal Buzağı Serumu (FCS),% 1 antibiyotik / antimikotik (10,000 ünite / mL penisilin, 10,000 μg / mL streptomisin, 25 ug / ML amfoterisin B), 44.05 mM sodyum bikarbonat, 100 uM askorbik asit, 33 uM biyotin, 17 uM pantotenat, 2 mM L-glutamin ve 20 mM HEPES. Steril olun ve 4 ° C'de 2 hafta kadar tutun.
- APC &Lösemi inhibe edici faktör (10 ng / mL), trombosit türevli büyüme faktörü BB (10 ng / mL) ve bazik fibroblast büyüme faktörü (10 ng / mL) dahil olmak üzere ilave büyüme faktörleri olan Basal Medya 5 ng / mL). Steril olun ve 4 ° C'de 2 hafta kadar tutun.
- APC İndüksiyon Ortamı hazırlayın:% 10 FBS, 2.5 μg / mL insülin, 0.5 mM 2-izobütil-1-metilaksantin (IBMX), 1 uM deksametazon ve 200 pM T3 (triiodotironin tiroid hormonu) ile APC Ortamı. Steril olun ve 4 ° C'de 2 hafta kadar tutun.
2. Adiposit Progenitörlerin İzolasyonu
- Sıçan, kurumsal kurallara göre anestezi altına alınız. Sıçanı sırt üstü yatma durumuna getirin. Anestezi derinliğini bir ayak parmak ucu ve bu acı uyarıya refleks tepkisi kaybı ile teyit edin.
NOT: Bu protokol, intraperitoneal bir enjeksiyon yoluyla 10 haftalık Sprague Dawley sıçanları ve 70 mg / kg pentobarbital kullanmaktadır. - Dikey orta hat kesi wGöğüs bölgesinde sternum boyunca makas ve perineal alana. Karın boşluğuna erişin ve üst mezenterik arteri, küçük mezenterik dirençli damarları (mPVAT) ve torasik aortayı (aPVAT) ortaya çıkarın.
- Mezenterya ve aortaya olan tüm bağlantıları kesip hayvanlardan damarları çıkarın. Bir disseksiyon mikroskopu ve PVDF'yi izole etmek için KRBB ile dolu Petri kabı kullanarak PVAT'yi ayırın.
- Bu deneyde, bir PVAT olmayan yağ deposunu temsil etmek için gonadal (GON) adipozu toplayın. İzole edilmiş yağ pedlerini KRBB'de buz üzerinde 10 mM HEPES (pH = 7.4) ile yerleştirin.
- Biyogüvenlikli bir kaputta yaklaşık 50 mg doku, 1 mL kollajenaz tip I solüsyonu ile 1.7 mL'lik bir tüpe aktarılır ve doku makası ile kıyılır (1-3 mm'lik parçalar).
- 1 saat rotisserie inkübatör (veya bir orbital çalkalayıcı ile inkübatör) 37 ° C'de inkübe ederek numuneleri sindirin. Biyogüvenlikli bir davlumbazda sindirilmiş malzemeyi 100 ve 40 Μm hücre süzücüleri 50 mL'lik bir tüp içine yerleştirin. Elde edilen süzüntü, 4 ° C'de 10 dakika, 300 x g'de santrifüjleyin.
NOT: Buradan itibaren protokoldeki tüm basamaklar, hücreleri steril tutmak için biyogüvenlikli bir başlıkta gerçekleştirilmelidir. - Süpernatantı boşaltın ve 1 mL Eritrosit Lizis Tampon Çözeltisi içindeki SVF hücrelerini içeren topakları tekrar süspansiyon haline getirin ve 1.7 mL mikrofüj tüpüne aktarın. Işıktan korunan oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve 300 x g'de 5 ° C'de 4 ° C'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı boşaltın ve kalan hücre peletini SVF Basal Media'da tekrar süspanse edin. Trypan Blue Solution ile canlı hücreleri saymak için 20 μL alt numune toplayın.
NOT: İzole edilebilen SVF hücrelerinin sayısı siteye göre değişir. Mg doku başına hasat edilen ortalama SVF sayısı: aPVAT = 5.0 ± 2.0x103, mPVAT = 1.04 ± 0.62x104, GON = 2.4 ± 1.2x105.
3. Manyetik olarak aktive olan Hücre Ayırma
Not: APC'yi, tüm adımları 4 ° C'de gerçekleştirerek CD34 ve PDGFRα hücre yüzey markerlerine dayanan SVF'den ayırın.- Hücreleri 300 x g'de 5 dakika döndürün. Süpernatantı boşaltın ve hücre peletini 1 x 10 6 hücre / mL'de MCS Engelleme Tamponuna tekrar süspanse edin ve 20 dakika inkübe edin.
NOT: 1 x 10 6 - 2 x 10 8 hücre / mL hücre süspansiyonları etkili bir şekilde ayrılabilir. - 5 uL FITC konjuge Fare anti-CD34 (1 μg / 1 x 10 6 hücre) ile 30 dakika süreyle inkübe hücreler ° C. Hücreleri 300 xg ve 4 ° C'de 5 dakika döndürün.
- CD34 + ve CD34 - hücrelerini ayırmak için karanlıkta 4 ° C'de 5 dakika süreyle 4 μL anti-FITC mikro-boncukları ve 96 uL MCS tamponu (toplam hacim 100 μL) ile inkübe edin.
- Manyetik ayırıcıyı standa takın ve MultiSort (MS) Kolonunu, kolon kanatları öne gelecek şekilde ayırıcıya yerleştirin. 5 mL yerleştirinToplama tüpünü üst boru tutucudaki MS sütununun altına yerleştirin.
- MS Sütununu, MCS Tampon Çözeltisi ile durulayarak hazırlayın. Sütun üstüne 500 μL MCS Tamponu uygulayın ve arabellek geçmesine izin verin. Atık suyu atın ve toplama tüpünü değiştirin.
- Hazırlanan MS sütununa antikor etiketli hücre süspansiyonu yükleyin. Etiketsiz hücreler içeren akışı toplayın.
- MS sütununu 500 μL gazı alınmış MCS Tamponu 3x ile yıkayın. Etiketsiz hücreleri toplayın ve bir önceki aşamadaki akışla birleşin.
- MS Sütununu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. MS sütununa 1 mL MCS Tamponu pipetleyin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücrelerle fraksiyonu hemen sık sık, fakat yavaşça sütun içerisine fazla gaz girmemesi için kolonla birlikte verilen pistonu uygulayarak boşaltın.
NOT: Yalıtılmış hücre sayıları bölgeye göre değişir. SVF popülasyonundan izole edilmiş ortalama CD34 + APC sayısıMg doku: aPVAT = 2.6 ± 0.43x102, mPVAT = 9.6 ± 1.4x102, GON = 1.3 ± 0.22x103. - Hücreleri 5 dakika 300 × g ve 4 ° C'de döndürün. 10 μL 1: 200 çözelti / 1 x 10 6 hücre tavşan anti-PDGFRα toplanan CD34 + fraksiyonu 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- 300 xg ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca hücreleri tekrar santrifüjleyin. Etiketli hücreleri, izole etmek için 3.3-3.7 adımlarını tekrarlayarak 4 uL anti-tavşan IgG mikro-boncukları ve 96 uL MCS tamponu ile inkübe edin.
NOT: Yalıtılmış hücre sayıları bölgeye göre değişir. Mg doku başına CD34 + popülasyondan izole edilen PDGFRα + APC'nin ortalama sayıları: aPVAT = 2.4 ± 0.64, mPVAT = 8.4 ± 2.4, GON = 10.4 ± 1.9, ki bu daha önce izole edilen popülasyonun% 0.5-10'udur.
- 300 xg ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca hücreleri tekrar santrifüjleyin. Etiketli hücreleri, izole etmek için 3.3-3.7 adımlarını tekrarlayarak 4 uL anti-tavşan IgG mikro-boncukları ve 96 uL MCS tamponu ile inkübe edin.
4. Hücre Kültürü ve Adipogenez İndüksiyonu
- SVF'yi kültür edinVe APC'yi 6-Well doku kültürü plakalarında bazal medyumda değiştirerek her 2 günde bir değiştirin. 3 seri pasajdan sonra, 8, 24, 48 ve 96 saatte ve 24 oyuklu plakalarda 50,000 hücre / çukurda değerlendirilen çoğalma tahlilleri için siyah 96-oyuklu doku kültürü plakalarını 1x102 hücre / oyuk ile veya Nitel ve nicel adipogenez analizleri için 48-Well doku kültürü plakalarında 10,000 hücre / çukur.
- Konfüzyon sonrası 48 saat ve kemik morfojenik protein 4 (3.3 nmol / L) ile endüksiyon öncesi APC bazal medyasını, farklılaşma için 10 olarak belirtildiği gibi ilave edin. Hücreleri inkübe etmek için APC İndüksiyon Ortamını kullanarak 48 saatlik% 100 konfluans (gün 0) sonrasında hücreleri indükleyin.
- 48 saat sonra, IBMX ve deksametazon içermeyen APC İndüksiyon ortamında hücreleri muhafaza etmek için medyayı değiştirin; medyanın her 48 saatte bir değiştirilmesi ile 14 gün boyunca.
- FACS tarafından onaylanan MCS izolasyonu.
- 50 μL (50.000 hücre) alt örnek manyetik olarak ayırınAted hücreler ve FACS çözeltisi ile yıkayın.
- Hücreleri santrifüjleyin ve PDGFRα + hücrelerini etiketlemek için, eşek anti-tavşan IgG Dylight 405'in 1: 1000 çözeltisinden 100 uL'ye tekrar süspanse edin. Işıktan ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresinde 488 nm (FITC) ve 405 nm (Dylight 405) filtreler kullanarak analiz için zaman kadar 200 uL% 2 formaldehid solüsyonuna tekrar süspanse edin.
NOT: Kültürlenmiş hücrelerin lipid birikimi, lipofilik bir adipogenezis flüoresans tahlilini kullanarak, flüoresanı ölçen bir mikroplate okuyucu kullanılarak ve lipid birikimi için kalibratörler olarak preadipositleri kullanarak niceliksel olarak değerlendirilir. Lipid birikimi ayrıca nitel olarak lipid boyası lekelenmesi ve bir kamera ile donatılmış ters mikroskop üzerinde gerçekleştirilen görüntüleme ile ölçülür ve lipid gözlemlenebilen veya içermeyen toplam hücrelerin yüzdesini oluşturur. 485 nm'de uyarılma ve 572'de emisyon ile flüoresanı ölçebilen herhangi bir plaka okuyucuNm, analiz için olduğu kadar dijital görüntüleri yakalayabilen bir kameraya sahip herhangi bir mikroskop için de uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Preadipositlerin proliferatif kapasitesi ve adiposit öncüllerinin adipojenik potansiyeli, in vitro 11'de muhafaza edilen özelliklerdir. İzole SVF'nin ve APC'nin, erkek sıçanlardan aPVAT, mPVAT ve GON'dan in vitro proliferasyonu, kantitatif bir DNA testi kullanılarak kaplamadan 8, 24, 48 ve 96 saat sonra değerlendirildi. Aynı bölgedeki SVF hücrelerine kıyasla 96 saat daha az proliferasyona sahip olan bir PVA'dan alınan APC hariç herhangi bir zaman noktasında SVF genişleme hızında herhangi bir saha farklılığı gözlenmemiştir ( Şekil 1 ).
Standart indüksiyon öncesinde 48 saat süreyle Kemik Morfojenik Protein 4 (BMP4) ile uyarılan konfluent APC 12 farklılaşmayı sergiledi. Bu, her iki floresan lipid alım analizi ( Şekil 2) tarafından değerlendirildiğinde, damlacıklarda daha büyük lipid birikimi ile belirgindiA ) ve Yağ Kırmızı O boyama ( Şekil 2 B ).
APC verimi karşılaştırıldığında, MCS izolasyonu, FACS'ye kıyasla kültür için hazır birçok hücre üretti. ( Şekil 3 ) Önemli olan, APC popülasyonlarının (CD34 + ve PDGFRα + ) dağılımı ve canlılığı, MCS ve FACS arasında benzerdi. İzolasyon sonrası sayım için Trypan Mavi lekelemesi ile saptanan hücre canlılığı her iki izolasyon işlemi için de benzerdi (FACS =% 71.57 ± 11.09; MCS =% 79.25 ± 7.47). Bu veriler, APC'nin MCS izolasyonunun, MCS'ye kıyasla daha fazla canlı APC ürettiğini göstermektedir.
Şekil 1 : Reklamın İn Vitro ÇoğalmasıIposit Progenitör Hücreleri (APC) Anatomik Konumu Etkiler. Stromal Vasküler Fraksiyon (SVF) ve APC, aortik ve mezenterik perivasküler adipoz dokudan (sırasıyla aPVAT ve mPVAT) ve gonadal adipozdan 10 haftalık erkek sıçandan izole edildi. Hücrelerin çoğalması, tohumlamadan sonra 8, 24, 48 ve 96 saatlik zaman noktalarında bir DNA kantifikasyon deneyi ile ölçüldü. Veriler, 8 saatlik bazda ± SEM (N = 4) üzerinde kat artışı olarak ifade edilmiştir. Anlamlılık * ile gösterilir (P <0.05). Şekil Contreras ve ark . 2016 13 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Adiposit Progenitör Hücreleri (APC) Farklılıkta Bir Değişikliği GöstermezDepolar arasındaki yeteneği, ancak Stromal Vasküler Fraksiyon (SVF) ile Mukayese Edilerek Büyük Lipid Birikimi. Hücreler 48 saatlik konfluans ve BMP4'e maruz bırakıldıktan sonra 48 saat boyunca deksametazon ve 3-izobütil-1-metilksantin ile maruz bırakıldıktan sonra indüklendi ve sonra her 48 saatte bir medya değişiklikleri ile 14 gün bakım ortamında tutuldu. ( A ) Farklılaşmış APC'nin, farklılaşmamış preadipositlerin oranı olarak ifade edilen lipid alım testi: relatif fluoresans ünitelerinde (RFU) farklılaşmış adipositler (preadipositler: adipositler) ± SEM (N = 4). ( B ) APC ve SVF'nin Yağlı Kırmızı O (ORO) boyaması, lipidli hücrelerin yüzdesi olarak ifade edildi (ORO Alımı) ± SEM (N = 4). Anlamlılık * ile gösterilir (P <0.05). Şekil Contreras ve ark. 2016 13 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Canlı Adiposit İzolasyon Hücrelerinin (APC) İzolasyon Verimi, Manyetik-Aktive Hücre Ayırma (MCS) ile Geliştirilmiştir. MCS ve FACS kullanılarak perivasküler adipoz dokulardan (aortik = aPVAT; mezenterik = mPVAT) izole edilen SVF'de CD34 + ( A ) ve PDGFRα + ( B ) yüzey markörü ekspresyonu. Veriler, 50 mg dokudan izole edilen ortalama hücre sayısı ± SEM (N = 4) olarak ifade edilmiştir. Anlamlılık * ile gösterilir (P <0.05). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu deneyin odak noktası PVAT depolarından APC'nin izolasyonu, genleşmesi ve adipogenik indüksiyonudur. Burada yüzey işaretleri CD34 ve PDGFRα ifade hücrelerin tanımlanması dayalı APC izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yüzey proteinleri daha önce APC üzerinde yüksek proliferasyon oranları ve çeşitli yağ depoları 14,15'te beyaz veya kahverengi adipositleri ayırma potansiyeli ile tanımlandı. Bu belirteçlere dayalı hücreleri seçerek, seçilen PVAT'de gözlemlenen adiposit fenotipiyle eşleşen çoklu yağ depolamalardan benzer APC popülasyonlarını izole edebildik. Denemelerimizde BMP4 büyüme faktörünü takviye ederek APC farklılaşmasını geliştirdik. Macotela ve meslektaşları, daha önce, viseral yağ depolarından özgül APC popülasyonlarının, BMP'den daha az aktiviteye sahip olduğunu göstermiştiSubkutanöz depolar, kültür ortamı adipogenik büyüme faktörleri BMP2 veya BMP4 12 , 16 , 17 , 18 ile desteklenmedikçe ayırdıklarında.
Hücrelerin kırılganlığından dolayı tek tek hücrelerin yağ dokusundan izolasyonu zor olduğundan, MCS'yi kullanmak, daha düşük bir sarf malzemesi, ekipman ve eğitim kaynakları maliyetiyle hücre izolasyonu için etkili bir yöntem sağlar. APC verimi, hayvanın yaşına veya boyutuna ve ortam sıcaklığındaki değişikliklerden ve steril bir izolasyon ortamının sağlanamamasından etkilenebileceğini belirtmek önemlidir. Normoksideki hücrelerin kültürlenmesi çoğalma ve farklılaşma için de önemlidir 19 , bu nedenle kuluçka hava koşullarının bakımı kültür uygulamasının ayrılmaz bir parçasıdır. Santrifüj hızları, yeterli hücre pelletleri t sırasında oluşmazsa, 800 x g'ye kadar yükseltilebilirIzolasyon işlemi. Eşlenik FITC florokromu zamanla bozunabildiğinden, antikorların ekspirasyonunu kontrol etmek de gerekebilir. Birçok Kollajenaz Tip I'in değiştirilmesi de, potens farklılık gösterebileceğinden sindirim prosedürlerinde değişiklikler gerektirebilir. Sıçan dışındaki farklı bir tür kullanıyorsa, antikorların konakçı türleri burada kullanılanlardan farklıysa, bloke edici tamponda spesifik serum ve IgG de gerekli olabilir.
MCS'nin FACS üzerindeki avantajları arasında, kitler ucuz olduğu ve kolayca satın alınabildiği için, FACS'den daha ekonomik olarak uygulanabilir olmasıdır. Bu aynı zamanda bir akış sitometrenin satın alınması, bakımı ve kullanım eğitiminden kaçınır. MCS'yi kullanmak, seçime ve arka plan flüoresan tutulumu için kapıların ayarlanmasına gerek kalmadan spesifik bağlanmaya izin verir.
Bu çalışmanın bir sınırlaması, iki preadiposit yüzey belirteçine dayandığıdır. Taahhüt ve farklılığın diğer preadiposit yüzey belirteçleriZfp423, Sca1 ve CD24 gibi ayırma işlemi 20 , 21 olarak tanımlanmıştır. Bu belirteçler spesifik fenotiplerin adiposit progenitör hücrelerini doğru olarak tespit edebilir; Bununla birlikte, burada kullanılan yüzey markörleri seçilmiştir çünkü bu belirteçleri ifade eden hücreler hem kahverengi hem de beyaz fenotip 20 , 21 indükleme yeteneğine sahiptir. Bu çalışmanın bir başka kısıtlılığı, APC kültüründe büyüme faktörlerinin seçici olarak kullanılmasıydı. Diğer büyüme faktörü kokteylleri, adipogenezin indüksiyonu için etkili olmuştur22. Bu çalışmadaki hücre kültürü, tüm kültürlerin iki boyutlu kültür plakalarında yapılması ile de sınırlıydı. Bu kültür normuna rağmen, in vivo hücreler bu şekilde çoğalmazlar. Üç boyutlu ortamlarda kültür, adipoz st'in doğal şeklini çoğaldığı için daha fazla hipertrofi ve hiperplaziye izin verebilirRıhtım 23 .
MCS'yi kullanmanın pratikliği ve verimliliği nedeniyle bu protokol APC'nin yanı sıra PVAT'daki diğer hücre tiplerinin izolasyonu için idealdir. Bu prosedür aynı zamanda preadiposit kültürlerinde farklılaşmayı başlatmanın daha etkili bir yolunu sağlar. Gerekli asgari maliyet, ekipman ve eğitim bu yöntemin belirli yüzey işaretlerine dayalı hücreleri izole etmek isteyen herhangi bir laboratuarda kullanılmasına izin verir. Gelecekteki uygulamalar, diğer hücre popülasyonlarının izolasyonuna veya daha spesifik hücre işaretleyicilerinin kullanılmasına izin verebilir. Hücreye bağlılıkta büyüme faktörü kokteyllerinin kullanılması kök hücre aktivasyonunda faydalı olabilir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Contreras and Watts Laboratuvarları ve Dr. William Raphael. Bu deneyler NHLBI F31 HL128035-01 (doku sindirim protokol standardizasyonu), NHLBI 5R01HL117847-02 ve 2P01HL070687-11A1 (hayvanlar) ve NHLBI 5R01HL117847-02 (hücre izolasyonu ve kültür) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC-conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48-Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. in eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
