Summary
Här redovisar vi en metod för isolering av Adipocyte Progenitor Cell (APC) populationer från perivaskulär adiposa vävnad (PVAT) med magnetisk aktiverad cellsortering (MCS). Denna metod möjliggör en ökad isolering av APC per gram fettvävnad jämfört med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).
Abstract
Expansion av perivaskulär fettvävnad (PVAT), en viktig regulator av vaskulär funktion genom parakrin signalering, är direkt relaterad till utvecklingen av hypertoni under fetma. Graden av hypertrofi och hyperplasi beror på depåplats, kön och typen av adipocytprogenitorcell (APC) fenotyper närvarande. Tekniker som används för APC och preadipocytisolering under de senaste 10 åren har drastiskt förbättrat noggrannheten vid vilken enskilda celler kan identifieras baserat på specifika cellyta markörer. Isolering av APC och adipocyter kan dock vara en utmaning på grund av cellens bräcklighet, speciellt om den intakta cellen måste behållas för cellodlingsapplikationer.
Magnetiskt aktiverad cellsortering ( MCS) tillhandahåller ett sätt att isolera större antal livskraftiga APC per vikt enhet av fettvävnad. APC skördad av MCS kan användas för in vitro- protokoll för att expandera preaDipocyter och differentiera dem till adipocyter genom användning av tillväxtfaktor-cocktails som möjliggör analys av den produktiva och adipogena potentialen som behålls av cellerna. Detta experiment fokuserade på aorta och mesenteriska PVAT-depåer, vilka spelar nyckelroller vid utvecklingen av hjärt-kärlsjukdom under expansion. Dessa protokoll beskriver metoder för att isolera, expandera och differentiera en definierad APC-population. Detta MCS-protokoll tillåter isolering att användas i alla experiment där cellsortering behövs med minimal utrustning eller träning. Dessa tekniker kan hjälpa ytterligare experiment för att bestämma funktionaliteten hos specifika cellpopulationer baserat på närvaron av cellytmarkörer.
Introduction
Perivaskulär Adiposa Tissue (PVAT), på grund av dess närhet till blodkärl, är en viktig parakrin signaleringskomponent i vaskulärfunktion 1 . Expansion av denna fettvävnad är beroende av fenotypen hos adipocytprogenitorcellerna (APC) närvarande 2 , 3 . Isolering av celler från fettvävnad är svår eftersom primära adipocyter är bräckliga, flytande och varierar i storlek. Vissa isoleringstekniker kan också förändra cellfenotypen och morfologin genom att öka inflammatorisk proteinsyntes och reducera adipogen genuttryck 4 , vilket betonar vikten av ett protokoll som upprätthåller cellernas integritet.
Kulturen av primära celler och specifika preadipocyt-subpopuleringar ger en reduktivistisk inställning till in vivo tillväxt och upprätthåller ekvivalent cellulär genetisk smink 5 , även om man arbetar tiMig med dessa celler är begränsad på grund av försämring med åldrande eller senescence 6 . Preadipocyter från olika fett depåer, inklusive subkutana och omentala depåer, visar också skillnader i proliferation 7 , vilket betonar vikten av att samla celler från specifika anatomiska platser. Precursorceller från icke-PVAT vita adipos depot har karakteriserats i tidigare studier 7 , 8 , 9 , men mindre är känt om PVAT APC fenotyper.
De tekniker som beskrivs här möjliggör analysen av specifika och definierade APC-populationer med minimal inverkan på deras morfologi, livskraft och potential att proliferera och differentiera. Magnetiskt aktiverad cellsortering (MCS) är mottaglig för applikationer nedströms, såsom kultur, då pärlorna löser sig utan att förändra cellen. MCS är också ekonomiskt, och när antikroppen conCentrationer har standardiserats, behovet av flödescytometrianalyser är minimalt. In vitro- studier med PVAT-prekursorer kan också ge en glimt av den potential som dessa primära celler kan ha.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs i detta dokument följer riktlinjer som fastställts av Institutionen för Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Michigan State University. Alla buffertar och medier bör skyddas mot ljus.
1. Framställning av buffertar, media och instrument
- Bered Krebs Ringer Bikarbonatbuffert lösning (KRBB): 135 mM natriumklorid, 5 mM kaliumklorid, 1 mM magnesiumsulfat, 0,4 mM kaliumfosfatdibasisk, 5,5 mM glukos, 1% antibiotikum / antimykotisk (10 000 enheter / ml penicillin, 10 000 μg / Ml streptomycin, 25 | ig / ml amfotericin B) och 10 mM HEPES (pH = 7,4). Denna lösning är stabil i 3 veckor när den hålls steril och vid 4 ° C.
- Förbered kollagenas typ 1 lösning: 1 mg / ml i KRBB med 4% bovint serumalbumin (BSA). Denna lösning bör hållas vid 37 ° C och är stabil i 4 timmar.
- Beredning av erytrocytlysisbuffertlösning: 154 mM ammoniumklorid, 10 mM kaliumvätekarbonat, Och 0,1 mM EDTA. Förvara vid 4 ° C i upp till en månad.
- Förbered MCS Blocking Buffer: DMEM / F12 Media Base, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 5% normalt åsnor serum, 40 μL / mL F (ab) Fragment Åsna Anti-Rat IgG. Förvara vid 4 ° C i upp till en månad.
- Förbered MCS buffertlösning: Fosfatbuffert saltlösning (PBS, pH = 7,5), 0,5% BSA och 2 mM EDTA. Förvara vid 4 ° C i upp till en månad. De-gaslösning genom upphettning till 37 ° C i en glasbehållare och applicering av ett vakuum under 15 s. Lämna oanvänd buffert förseglad.
- Preparat för stromal vaskulär fraktion (SVF) Basalmedia: Dulbecco's-Modified Eagles Medium (DMEM): F12, 15% Fetal Kalv Serum (FCS), 1% antibiotikum / antimykotisk (10.000 enheter / ml penicillin, 10.000 μg / ml streptomycin, 25 μg / Ml amfotericin B), 44,05 mM natriumbikarbonat, 100 | iM askorbinsyra, 33 | iM biotin, 17 | iM pantotenat, 2 mM L-glutamin och 20 mM HEPES. Håll steril och vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
- Förbered APC &# 160; Media: Basalmedia med ytterligare tillväxtfaktorer inklusive epidermal tillväxtfaktor 10 ng / ml), leukemiinhiberande faktor (10 ng / ml), blodplätt-härledd tillväxtfaktor BB (10 ng / ml) och basisk fibroblasttillväxtfaktor 5 ng / ml). Håll steril och vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
- Förbered APC-induktionsmedia: APC-medium med 10% FBS, 2,5 | ig / ml insulin, 0,5 mM 2-isobutyl-1-metylaxantin (IBMX), 1 uM dexametason och 200 pM T3 (triiodtyronin-sköldkörtelhormon). Håll steril och vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
2. Isolering av adipocytprogenitorer
- Bedöva råtta enligt institutionella riktlinjer. Placera råttan i dorsal recumbency. Bekräfta bedövningsdjupet via en tånklämma och förlusten av reflexrespons på denna smärtsamma stimulans.
OBS! Detta protokoll använder 10 veckor gamla Sprague Dawley-råttor och 70 mg / kg pentobarbital levererad via en intraperitoneal injektion. - Gör en vertikal mittlinje snitt wMed en sax längs bröstbenet i bröstområdet och perinealområdet. Gå in i bukhålan och exponera den överlägsna mesenteriska artären, de små mesenteriska motståndskärlen (mPVAT) och thorax aorta (aPVAT).
- Avbryt alla anslutningar till mesenteri och aorta och avlägsna kärl från djur. Isolera PVAT genom att använda ett dissekeringsmikroskop och petriskål fylld med KRBB för att se fartyg och isolera PVAT.
- I detta försök samla gonadal (GON) adiposa för att representera ett icke-PVAT-fett depot. Placera isolerade fettkuddar på is i KRBB med 10 mM HEPES (pH = 7,4).
- Överför ca 50 mg vävnad i en biosäkerhetskåpa till ett 1,7 ml rör med 1 ml kollagenas typ I-lösning och hakade med vävnadssax (1-3 mm).
- Digestprover genom inkubering vid 37 ° C i en rotisserie-inkubator (eller inkubator med en orbitalskakare) i 1 timme. I en biosäkerhetskåpa, filtrera digererat material i följd genom 100 och 40 Μm cellstimulatorer i ett 50 ml rör. Centrifug resulterande filtrat vid 4 ° C under 10 min vid 300 x g.
OBS: Alla steg i protokollet härifrån framåt ska utföras i en biosäkerhetskåpa för att hålla cellerna sterila. - Häll supernatanten och resuspendera pellets innehållande SVF-cellerna i 1 ml 1X Erythrocyte Lysis Buffer Solution och överföra till ett 1,7 ml mikrofuge-rör. Inkubera celler i 5 minuter vid RT skyddad från ljus och centrifugera vid 4 ° C i 5 minuter vid 300 x g.
- Häll supernatanten och resuspendera kvarstående cellpellets i SVF Basal Media. Samla ett 20 μL delprov för att räkna levande celler med Trypan Blue Solution.
OBS: Antalet SVF-celler som kan isoleras varierar beroende på plats. Genomsnittligt antal SVF skördade per mg vävnad är: aPVAT = 5,0 ± 2,0x10 3 , mPVAT = 1,04 ± 0,62x10 4 , GON = 2,4 ± 1,2x10 5 .
3. Magnetiskt aktiverad cellsortering
_content "> OBS: Isolera APC från SVF baserat på CD34- och PDGFRα-cellytmarkörer genom att utföra alla steg vid 4 ° C.- Spinceller i 5 min vid 300 x g. Häll supernatanten och resuspendera cellpelleten i MCS Blocking Buffer vid 1 x 106 celler / ml och inkubera i 20 minuter.
OBS: Cellsuspensioner av 1 x 10 6-2 x 10 8 celler / ml kan separeras effektivt. - Inkubera celler med 5 μl FITC-konjugerad mus anti-CD34 (1 μg / 1 x 106 celler) i 30 minuter vid 4 ° C. Spinceller i 5 min vid 300 xg och 4 ° C.
- Inkubera med 4 μl anti-FITC-mikrokulor och 96 μl MCS-buffert (total volym 100 μL) i 5 min vid 4 ° C i mörkret för att separera CD34 + och CD34-celler.
- Fäst magnetisk separator i stativet och placera MultiSort (MS) -kolonnen med kolumnvingarna framåt i separatorn. Placera en 5 mlUppsamlingsrör under MS-kolonnen i den övre rörhållaren.
- Förbered MS-kolonnen genom att skölja med MCS Buffer Solution. Applicera 500 μL MCS-buffert ovanpå kolonnen och låt bufferten gå igenom. Kassera utflödet och byt uppsamlingsrör.
- Ladda antikroppsmärkt cellsuspension på den beredda MS-kolonnen. Samla genomflöde innehållande omärkta celler.
- Tvätta MS-kolonn med 500 | il avgasad MCS-buffert 3x. Samla in märkta celler som passerar och kombinera med flödet igenom från föregående steg.
- Ta bort MS-kolonnen från den magnetiska separatorn och placera den på ett nytt uppsamlingsrör. Pipettera 1 ml MCS-buffert på MS-kolonnen. Spola genast spridningen med de magnetiskt märkta cellerna fast, men långsamt, applicera kolven som förses med kolonnen för att inte tillåta överskott av gas i kolonnen.
OBS: Isolerade cellnummer varierar beroende på plats. Genomsnittligt antal CD34 + APC isolerade från SVF-populationen perMg vävnad är: aPVAT = 2,6 ± 0,43x10 2 , mPVAT = 9,6 ± 1,4x10 2 , GON = 1,3 ± 0,22x10 3 . - Spinceller i 5 min vid 300 x g och 4 ° C. Inkubera CD34 + fraktionen uppsamlad i 10 | il av en 1: 200 lösning / 1 x 106 celler Rabbit anti-PDGFRa i 30 min vid 4 ° C.
- Centrifugera cellerna igen under 5 minuter vid 300 xg och 4 ° C. Inkubera märkta celler med 4 | il anti-kanin-IgG-mikrokulor och 96 | il MCS-buffert genom att upprepa steg 3.3 till 3.7 för att isolera.
OBS: Isolerade cellnummer varierar beroende på plats. Genomsnittligt antal PDGFRα + APC isolerade från CD34 + populationen per mg vävnad är: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, vilket är 0,5-10% av den tidigare isolerade populationen.
- Centrifugera cellerna igen under 5 minuter vid 300 xg och 4 ° C. Inkubera märkta celler med 4 | il anti-kanin-IgG-mikrokulor och 96 | il MCS-buffert genom att upprepa steg 3.3 till 3.7 för att isolera.
4. Cellkultur och adipogenesinduktion
- Kultur SVFOch APC i 6-Well-vävnadskulturplattor i basala medier med ersättning varannan dag. Efter 3 seriella passager, plattan i svarta 96-Brunnar vävnadskulturplattor vid 1x10 ^ celler / brunn för proliferationsanalyser, som utvärderas vid 8, 24, 48 och 96 timmar och vid 50 000 celler / brunn i plattor med 24 brunnar eller 10 000 celler / brunn i 48-brunnar vävnadsodlingsplattor för adipogenes-analyser, vilka är kvalitativa och kvantitativa.
- Tillsätt APC basala medier i 48 h efter konfluens och före induktion med benmorfogen protein 4 (3,3 nmol / L) som indikeras 10 för differentiering. Inducera celler efter 48 h 100% konfluens (dag O) med användning av APC-induktionsmediet för att inkubera cellerna.
- Efter 48 h byt media för att behålla celler i APC-induktionsmedia utan IBMX och dexametason, i 14 dagar med mediaändringar var 48: e timme.
- MCS-isolering validerad av FACS.
- Ta ett 50 μl (50 000 cell) delprov av magnetiskt separerandeAted celler och tvätta med FACS lösning.
- Centrifugera cellerna och resuspendera i 100 | il av en 1: 1000 lösning av åsna anti-kanin-IgG Dylight 405 för att märka PDGFRa + -cellerna. Inkubera i 30 min skyddad från ljus och vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna och resuspendera i 200 pl av 2% formaldehydlösning tills tiden för analys med användning av 488 nm (FITC) och 405 nm (Dylight 405) filter på en flödescytometer.
OBS: Lipidackumulering av odlade celler bedöms kvantitativt med hjälp av en lipofil adipogenesfluorescensanalys i en mikroplattläsare som mäter fluorescens och använder preadipocyter som kalibratorer för lipidackumulering. Lipidackumulering mäts också kvalitativt genom lipidfärgfärgning och avbildning utförd på ett inverterat mikroskop utrustat med en kamera, vilket gör procentandelen av totala celler som gör eller inte innehåller lipid observerbar. Eventuell plattläsare som kan mäta fluorescens med excitation vid 485 nm och utsläpp vid 572Nm är lämplig för analys samt alla mikroskop med en kamera som kan ta digitala bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proliferativ förmåga hos preadipocyter och adipogen potential för adipocytprekursorer är egenskaper som upprätthålls in vitro 11 . In vitro- proliferation av isolerad SVF och APC från aPVAT, mPVAT och GON hos hanrotter utvärderades vid 8, 24, 48 och 96 timmar efter plätering med användning av en kvantitativ DNA-analys. Inga sidoförskjutningar i SVF-expansionshastigheten observerades vid någon tidpunkt, förutom APC från aPVAT, som hade mindre proliferation vid 96 h jämfört med SVF-celler från samma plats ( Figur 1 ).
Konfluent APC stimulerad med benmorfogent protein 4 (BMP4) under 48 timmar före standardinduktion 12 uppvisade differentiering. Detta framgick av ökad lipidackumulering i droppar som utvärderades av både fluorescerande lipidupptagningsanalys ( Figur 2A ) och Oljera Red O-färgning ( Figur 2 B ).
Vid jämförelse av utbytet av APC producerade MCS-isolering ett större antal celler redo för odling jämfört med FACS. ( Figur 3 ) Det var viktigt att fördelningen och lönsamheten hos APC-populationer (CD34 + och PDGFRα + ) liknade mellan MCS och FACS. Cellleabilitet bestämd genom Trypan Blue-färgning för att räkna efter isolering var liknande för båda isoleringsförfarandena (FACS = 71,57% ± 11,09; MCS = 79,25% ± 7,47). Dessa data visar att MCS-isoleringen av APC ger ett högre antal levande APC jämfört med MCS.
Figur 1 : In vitro- spridning av adIpocytprogenitorceller (APC) påverkas av anatomisk plats. Stromal vaskulär fraktion (SVF) och APC isolerades från aorta- och mesenterisk perivaskulär adiposvävnad (aPVAT respektive mPVAT) och gonadal adiposa från 10 veckor gamla hanrotter. Proliferation av celler mättes genom en DNA-kvantifieringsanalys vid 8, 24, 48 och 96 h tidpunkter efter sådd. Data uttrycks som vikningsökning över 8 h baslinje ± SEM (N = 4). Betydelsen indikeras med * (P <0,05). Figur modifierad från Contreras et al . 2016 13 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Adipocytprogenitorceller (APC) Visa ingen variation i DifferentiaFörmåga mellan depot men större lipid ackumulering jämfört med stromal vaskulär fraktion (SVF). Celler inducerades efter 48 timmars konfluens och exponering för BMP4 följt av 48 timmars exponering för dexametason och 3-isobutyl-1-metylxantin och därefter upprepades i underhållsmedier 14 dagar med mediaändringar var 48: e timme. ( A ) Lipidupptagningsanalys av differentierad APC med data uttryckt som förhållande av odifferentierade preadipocyter: differentierade adipocyter (preadipocyter: adipocyter) i relativa fluorescensenheter (RFU) ± SEM (N = 4). ( B ) Oljera Red O (ORO) färgning av APC och SVF med data uttryckt som procent av celler med lipid (ORO upptag) ± SEM (N = 4). Betydelsen indikeras med * (P <0,05). Figur modifierad från Contreras et al. 2016 13 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 : Isolationsutbyte av livskraftiga adipocytprogenitorceller (APC) förbättras genom magnetisk aktiverad cellsortering (MCS). Ytmarkmarkeringsuttryck av CD34 + ( A ) och PDGFRa + ( B ) i SVF isolerad från perivaskulär adiposvävnad (aorta = aPVAT; mesenterisk = mPVAT) med användning av MCS och FACS. Data uttrycks som medelantal celler isolerade från 50 mg vävnad ± SEM (N = 4). Betydelsen indikeras med * (P <0,05). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det centrala fokuset för föreliggande experiment är isoleringen, expansionen och adipogen induktion av APC från PVAT-depåer. Här presenterar vi ett protokoll för isoleringen av APC baserat på identifieringen av celler som uttrycker ytmarkörerna CD34 och PDGFRa. Dessa ytproteiner identifierades tidigare på APC med höga proliferationshastigheter och potentialen att differentiera i vita eller bruna adipocyter i olika adipos depots 14 , 15 . Genom att välja celler baserade på dessa specifika markörer kunde vi isolera liknande APC-populationer från flera fettdepoter som matchar adipocytfenotypen som observeras i PVAT valda 13 . I våra experiment förbättrade vi APC-differentiering genom att komplettera tillväxtfaktorn BMP4. Tidigare visade Macotela och kollegor att specifika APC-populationer från viscerala fettdepoter hade mindre BMP-aktivitet än de frånSubkutana depåer när de differentierades om inte odlingsmedia kompletterades med adipogena tillväxtfaktorerna BMP2 eller BMP4 12 , 16 , 17 , 18 .
Eftersom isolering av enskilda celler från fettvävnad är svårt på grund av cellernas skörhet, använder MCS en effektiv metod för cellisolering till en lägre kostnad för förbrukningsvaror, utrustning och träningsresurser. Det är viktigt att notera att APC-utbytet kan påverkas av djurets ålder eller storlek och genom förändringar i medietemperaturen och underlåtenhet att upprätthålla en steril isoleringsmiljö. Odlingsceller i normoxi är också viktiga för proliferation och differentiering 19 , varför underhåll av inkubationsluftförhållanden är integrerat i odlingspraxis. Centrifugeringshastigheten kan ökas till 800 xg om tillräckliga cellpellets inte bildas under tHan isoleringsprocessen. Kontroll av antikropparnas utgång kan också vara nödvändigt eftersom det konjugerade FITC-fluorokromet kan försämras över tiden. Byte av mycket kollagenas typ I kan också kräva förändringar i matsmältningsförfarandena, eftersom mycket kan variera i styrka. Om man använder en annan art än råtta kan specifikt serum och IgG i blockeringsbufferten också vara nödvändigt om antikropparnas värdart skiljer sig från de som används här.
Bland fördelarna med MCS över FACS är att det är mer ekonomiskt genomförbart än FACS som kit är billigt och kan enkelt köpas. Detta undviker också köp, underhåll och användarutbildning av en flödescytometer. Användning av MCS möjliggör också specifik bindning utan justering av grindar för selektion och bakgrundsfluorescensinblandning.
En begränsning till denna studie är att den åberopade två preadipocyt ytmarkörer. Andra preadipocyt ytmarkörer av engagemang och diffErentiering, såsom Zfp423, Sca1 och CD24, har identifierats 20 , 21 . Dessa markörer kan korrekt identifiera engagerade adipocytprogenitorceller av specifika fenotyper; De ytmarkörer som användes här valdes emellertid eftersom celler som uttrycker dessa markörer har förmågan att framkalla till både bruna och vita fenotyper 20 , 21 . En annan begränsning av denna studie var den selektiva användningen av tillväxtfaktorer i APC-kulturen. Andra tillväxtfaktor-cocktails har varit effektiva vid induktionen av adipogenes 22 . Cellkulturen i denna studie var också begränsad av det faktum att all kultur gjordes i tvådimensionella odlingsplattor. Även om detta är kulturnormen, prolifererar cellerna inte in vivo på detta sätt. Odling i tredimensionella miljöer kan möjliggöra ytterligare hypertrofi och hyperplasi, eftersom den replikerar den naturliga formen av adipose stRukture 23 .
På grund av praktiken och effektiviteten att använda MCS är detta protokoll idealiskt för isolering av APC liksom andra celltyper i PVAT. Denna procedur tillhandahåller också ett mer effektivt sätt att inducera differentiering i preadipocytkulturer. Den minimala kostnaden, utrustningen och träningen som krävs krävs att denna metod används i alla laboratorier som vill isolera celler baserat på specifika ytmarkörer. Framtida tillämpningar kan möjliggöra isolering av andra cellpopulationer eller användning av mer specifika cellmarkörer. Användning av tillväxtfaktor-cocktails i cellåtagande kan vara användbar vid stamcellaktivering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Contreras och Watts Laboratories och Dr. William Raphael. Dessa experiment stöddes av NHLBI F31 HL128035-01 (vävnadsdigestionsprotokoll standardisering), NHLBI 5R01HL117847-02 och 2P01HL070687-11A1 (djur) och NHLBI 5R01HL117847-02 (cellisolering och odling).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC-conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48-Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. in eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
