Summary
Her rapporterer vi en metode for isolering av Adipocyte Progenitor Cell (APC) populasjoner fra Perivascular Adipose Tissue (PVAT) ved hjelp av magnetisk aktivert cellesortering (MCS). Denne metoden tillater økt isolering av APC per gram fettvev i sammenligning med fluorescensaktivert cellesortering (FACS).
Abstract
Utvidelse av perivaskulær adiposvæv (PVAT), en stor regulator av vaskulær funksjon gjennom parakrinsignalering, er direkte relatert til utvikling av hypertensjon under fedme. Omfanget av hypertrofi og hyperplasi er avhengig av depotplassering, kjønn, og typen av adipocytprogenitorcelle (APC) fenotyper tilstede. Teknikker brukt til APC og preadipocytter isolasjon de siste 10 årene har drastisk forbedret nøyaktigheten ved hvilke enkelte celler kan identifiseres basert på spesifikke celleoverflate markører. Imidlertid kan isolering av APC og adipocytter være en utfordring på grunn av cellens skjøthet, spesielt hvis den intakte celle beholdes for cellekulturapplikasjoner.
Magnetisk aktivert cellesortering ( MCS) gir en metode for å isolere større antall levedyktig APC per vektenhet av fettvev. APC høstet av MCS kan brukes til in vitro- protokoller for å utvide preaDipocytter og differensiere dem til adipocytter ved bruk av vekstfaktor-cocktailer som muliggjør analyse av det potensielle og adipogene potensialet som beholdes av cellene. Dette eksperimentet fokuserte på aorta- og mesenteriske PVAT-depotene, som spiller sentrale roller i utviklingen av kardiovaskulær sykdom under ekspansjon. Disse protokollene beskriver metoder for å isolere, utvide og differensiere en definert befolkning av APC. Denne MCS-protokollen tillater isolasjon å brukes i ethvert eksperiment hvor celle sortering er nødvendig med minimal utstyr eller trening. Disse teknikkene kan bistå ytterligere eksperimenter for å bestemme funksjonaliteten til spesifikke cellepopulasjoner basert på tilstedeværelsen av celleoverflate markører.
Introduction
Perivaskulær Adipose Tissue (PVAT), på grunn av sin nærhet til blodkar, er en viktig parakrin signalering komponent i vaskulatur funksjon 1 . Utvidelse av dette fettvev er avhengig av fenotypen av Adipocyte Progenitor Cells (APC) tilstede 2 , 3 . Isolering av celler fra fettvev er vanskelig da primære adipocytter er skjøre, flytende og varierer i størrelse. Visse isolasjonsteknikker kan også endre cellefenotype og morfologi ved å øke inflammatorisk proteinsyntese og redusere adipogen genuttrykk 4 , understreker betydningen av en protokoll som opprettholder integriteten til cellene.
Kultur av primære celler og spesifikke preadipocyt-subpopulasjoner gir en reduktivistisk tilnærming til vekst i in vivo og opprettholder ekvivalent cellulær genetisk sminke 5 , selv om man arbeider tiMeg med disse cellene er begrenset på grunn av forverring med aldring eller senescence 6 . Preadipocytter fra forskjellige adipose depots, inkludert subkutane og omental depoter, viser også forskjeller i proliferation 7 , som understreker viktigheten av å samle celler fra bestemte anatomiske steder. Forløperceller fra ikke-PVAT hvite adipose depoter har blitt preget av tidligere studier 7 , 8 , 9 , men mindre er kjent om PVAT APC fenotyper.
Teknologiene beskrevet her tillater analyse av spesifikke og definerte APC-populasjoner med minimal innvirkning på deres morfologi, levedyktighet og potensial til å proliferere og differensiere. Magnetisk aktivert cellesortering (MCS) er egnet til nedstrømsapplikasjoner, for eksempel kultur, da perlene oppløses uten å endre cellen. MCS er også økonomisk, og når antistoffet conSentreringer har blitt standardisert, behovet for strømningscytometrianalyser er minimal. In vitro- studier med PVAT-forløpere kan også gi et glimt av potensialet som disse primære cellene kan ha.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet i dette dokumentet følger retningslinjer fastsatt av Institutt for dyrepleie og brukskomité (IACUC) fra Michigan State University. Alle buffere og medier bør beskyttes mot lys.
1. Fremstilling av buffere, medier og instrumenter
- Klargjør Krebs Ringer Bikarbonatbuffert løsning (KRBB): 135 mM natriumklorid, 5 mM kaliumklorid, 1 mM magnesiumsulfat, 0,4 mM kaliumfosfatdibasisk, 5,5 mM glukose, 1% antibiotisk / antimykotisk (10 000 enheter / ml penicillin, 10 000 μg / Ml streptomycin, 25 μg / ml amfotericin B) og 10 mM HEPES (pH = 7,4). Denne løsningen er stabil i 3 uker når den holdes steril og ved 4 ° C.
- Forbered kollagenase type 1 løsning: 1 mg / mL i KRBB med 4% bovint serumalbumin (BSA). Denne løsningen bør holdes ved 37 ° C og er stabil i 4 timer.
- Forbered Erythrocyt Lysis Buffer Solution: 154 mM ammoniumklorid, 10 mM kaliumbikarbonat, Og 0,1 mM EDTA. Oppbevares ved 4 ° C i opptil en måned.
- Klargjør MCS-blokkeringsbuffer: DMEM / F12 Media Base, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 5% normalt eselserum, 40 μL / mL F (ab) Fragment Eple Anti-Rat IgG. Oppbevares ved 4 ° C i opptil en måned.
- Klargjør MCS Buffer Solution: Fosfatbuffert saltvann (PBS, pH = 7,5), 0,5% BSA og 2 mM EDTA. Oppbevares ved 4 ° C i opptil en måned. De-gassoppløsning ved oppvarming til 37 ° C i en glassbeholder og deretter påføring av et vakuum i 15 s. La ubrukt, forseglet, forseglet.
- Forbered Stromal Vascular Fraction (SVF) Basal Media: Dulbecco's-Modified Eagles Medium (DMEM): F12, 15% Fetal Calf Serum (FCS), 1% antibiotika / antimykotisk (10.000 enheter / mL penicillin, 10.000 μg / mL streptomycin, 25 μg / Ml amfotericin B), 44,05 mM natriumbikarbonat, 100 uM ascorbinsyre, 33 pM biotin, 17 pM pantotenat, 2 mM L-glutamin og 20 mM HEPES. Hold steril og ved 4 ° C i opptil 2 uker.
- Forbered APC &# 160; Medier: Basalmedia med ytterligere vekstfaktorer inkludert epidermal vekstfaktor 10 ng / mL), leukemi-inhibitorisk faktor (10 ng / mL), blodplateavledet vekstfaktor BB (10 ng / mL) og basisk fibroblastvækstfaktor 5 ng / mL). Hold steril og ved 4 ° C i opptil 2 uker.
- Klargjør APC-induksjonsmedier: APC-medier med 10% FBS, 2,5 μg / ml insulin, 0,5 mM 2-isobutyl-1-metylakantin (IBMX), 1 μM dexametason og 200 pM T3 (triiodtyronin-skjoldbruskhormon). Hold steril og ved 4 ° C i opptil 2 uker.
2. Isolering av adipocytprogenitorer
- Bedøv råtten i henhold til institusjonelle retningslinjer. Plasser rotte i dorsal recumbency. Bekreft dybde av anestesi via en tåre og tap av refleksrespons på denne smertefulle stimulansen.
MERK: Denne protokollen bruker 10 uker gamle Sprague Dawley rotter og 70 mg / kg pentobarbital levert via en intraperitoneal injeksjon. - Lag en vertikal midtlinje snitt wMed en saks langs brystbenet i thoraxområdet og til perinealområdet. Få tilgang til bukhulen og avslør den overordnede mesenteriske arterien, de små mesenteriske motstandsbeholderne (mPVAT) og thoracic aorta (aPVAT).
- Fjern alle tilkoblinger til mesenteri og aorta og fjern kar fra dyr. Isoler PVAT ved å bruke et disseksjonsmikroskop og petriskål fylt med KRBB for å se fartøy og isolere PVAT.
- I dette forsøket samler gonadal (GON) adipose for å representere et ikke-PVAT fett depot. Plasser isolerte fettputer på is i KRBB med 10 mM HEPES (pH = 7,4).
- I en biosikkerhet hette, overfør ca. 50 mg vev til et 1,7 ml rør med 1 ml kollagenase type I løsning og hakk med vevssaks (1 - 3 mm stykker).
- Fordel prøver ved å inkubere ved 37 ° C i en rotisserie-inkubator (eller inkubator med en orbital shaker) i 1 time. I en biosikkerhet hette, sekventielt filtrert fordøyd materiale gjennom 100 og 40 Μm celle avstivere i et 50 ml rør. Sentrifuge resulterende filtrat ved 4 ° C i 10 minutter ved 300 x g.
MERK: Alle trinn i protokollen herfra skal utføres i en biosafetyhette for å holde cellene sterile. - Hell supernatanten og resuspender pellets som inneholder SVF-cellene i 1 ml 1X Erythrocyte Lysis Buffer Solution og overfør til et 1,7 ml mikrofugerør. Inkubér celler i 5 minutter ved RT beskyttet mot lys og sentrifuger ved 4 ° C i 5 minutter ved 300 x g.
- Hell supernatanten og resuspender gjenværende cellepellet i SVF Basal Media. Samle en 20 μL delprøve for å telle levende celler med Trypan Blue Solution.
MERK: Antall SVF-celler som kan isoleres, varierer fra sted til sted. Gjennomsnittlig antall SVF høstet per mg vev er: aPVAT = 5,0 ± 2,0x10 3 , mPVAT = 1,04 ± 0,62x10 4 , GON = 2,4 ± 1,2x10 5 .
3. Magnetisk aktivert cellesortering
_content "> MERK: Isoler APC fra SVF basert på CD34 og PDGFRα celleoverflate markører ved å utføre alle trinn ved 4 ° C.- Spinceller i 5 minutter ved 300 x g. Hekk supernatanten og resuspender cellepelletet i MCS-blokkeringsbufferen ved 1 x 106 celler / ml og inkuber i 20 minutter.
MERK: Cellesuspensjoner på 1 x 10 6 - 2 x 108 celler / ml kan separeres effektivt. - Inkubér celler med 5 μl FITC-konjugert Mouse anti-CD34 (1 μg / 1 x 106 celler) i 30 minutter ved 4 ° C. Spinceller i 5 minutter ved 300 xg og 4 ° C.
- Inkuber med 4 μl anti-FITC mikroperler og 96 μl MCS buffer (total volum på 100 μl) i 5 minutter ved 4 ° C i mørket for å separere CD34 + og CD34 - celler.
- Fest magnetisk separator til stativet og plasser MultiSort (MS) kolonnen, med kolonnevingene foran, i separatoren. Plasser en 5 mlOppsamlingsrør under MS-kolonnen i øvre rørholder.
- Forbered MS-kolonnen ved å skylle med MCS Buffer Solution. Påfør 500 μL MCS Buffer på toppen av kolonnen og la bufferen løpe gjennom. Kast utløp og bytt oppsamlingsrør.
- Last antistoff merket cellesuspensjon på den fremstilte MS-kolonnen. Samle gjennomstrømning som inneholder umerkede celler.
- Vask MS-kolonne med 500 μl avgasset MCS buffer 3x. Samle unlabeled celler som passerer gjennom og kombinere med strømmen gjennom fra forrige trinn.
- Fjern MS-kolonnen fra den magnetiske separatoren og plasser den på et nytt oppsamlingsrør. Pipetter 1 ml MCS buffer på MS-kolonnen. Spyl straks ut fraksjonen med de magnetisk merkede cellene ved fast, men sakte, bruk stemplet som følger med kolonnen for ikke å tillate overflødig gass inn i kolonnen.
MERK: Isolerte cellenumre varierer fra sted til sted. Gjennomsnittlig antall CD34 + APC isolert fra SVF-befolkningen perMg vev er: aPVAT = 2,6 ± 0,43x10 2 , mPVAT = 9,6 ± 1,4x10 2 , GON = 1,3 ± 0,22x10 3 . - Spinceller i 5 minutter ved 300 x g og 4 ° C. Inkubér CD34 + fraksjonen samlet i 10 μl av en 1: 200 løsning / 1 x 106 celler Kanin anti-PDGFRa i 30 minutter ved 4 ° C.
- Sentrifuger cellene igjen i 5 minutter ved 300 xg og 4 ° C. Inkuber merkede celler med 4 μl anti-kanin-IgG-mikroperler og 96 μl MCS-buffer ved å gjenta trinn 3.3 til 3.7 for å isolere.
MERK: Isolerte cellenumre varierer fra sted til sted. Gjennomsnittlig antall PDGFRα + APC isolert fra CD34 + populasjonen per mg vev er: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, som er 0,5-10% av den tidligere isolerte befolkningen.
- Sentrifuger cellene igjen i 5 minutter ved 300 xg og 4 ° C. Inkuber merkede celler med 4 μl anti-kanin-IgG-mikroperler og 96 μl MCS-buffer ved å gjenta trinn 3.3 til 3.7 for å isolere.
4. Cellekultur og adipogeneseinduksjon
- Kultur SVFOg APC i 6-brønners vevskulturplater i basale medier med erstatning hver 2. dag. Etter 3 serielle passasjer, tallerken i sorte 96-brøndvevskulturplater ved 1 x 10 2 celler / brønn for proliferasjonsanalyser, som evalueres ved 8, 24, 48 og 96 timer og ved 50 000 celler / brønn i brønner med 24 brønner eller 10.000 celler / brønn i 48-brønds vevskulturplater for adipogenese-analyser, som er kvalitative og kvantitative.
- Supplement APC basale medier i 48 timer etter konfluens og før induksjon med benmorfogen protein 4 (3,3 nmol / L) som indikert 10 for differensiering. Inducere celler etter 48 timer med 100% konfluens (dag 0) ved hjelp av APC-induksjonsmediet for å inkuberere cellene.
- Etter 48 timer, bytt media for å opprettholde celler i APC Induksjonsmedier uten IBMX og dexamethason, i 14 dager med utskifting av media hver 48 time.
- MCS-isolasjon validert av FACS.
- Ta en 50 μl (50 000 celle) delprøve av magnetisk separasjonAted celler og vask med FACS løsning.
- Sentrifuger celler og resuspender i 100 μl av en 1: 1000 løsning av esel anti-kanin-IgG Dylight 405 for å merke PDGFRα + -cellene. Inkubér i 30 minutter beskyttet mot lys og ved 4 ° C.
- Vask celler og resuspender i 200 μl 2% formaldehydoppløsning til tiden for analyse ved bruk av 488 nm (FITC) og 405 nm (Dylight 405) filtre på et strømningscytometer.
MERK: Lipidakkumulering av dyrkede celler vurderes kvantitativt ved hjelp av en lipofil adipogenese-fluorescensanalyse i en mikroplate-leser som måler fluorescens og ved bruk av preadipocytter som kalibratorer for lipidakkumulering. Lipidakkumulering måles også kvalitativt ved lipidfarging og avbildning utført på et invertert mikroskop utstyrt med et kamera, noe som gjør prosentandelen av totale celler som gjør eller ikke inneholder lipid observerbare. Enhver tallerkenleser som kan måle fluorescens med eksitasjon ved 485 nm og utslipp ved 572Nm er egnet for analyse, samt alle mikroskop med kamera som er i stand til å fange digitale bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proliferativ kapasitet av preadipocytter og adipogen potensial for adipocytprekursorer er karakteristika som opprettholdes in vitro 11 . In vitro- proliferasjon av isolert SVF og APC fra aPVAT, mPVAT og GON av hannrotter ble evaluert ved 8, 24, 48 og 96 timer etter plating ved bruk av et kvantitativt DNA-assay. Ingen stedforskjeller i SVF-ekspansjonshastigheten ble observert når som helst, unntatt APC fra aPVAT, som hadde mindre proliferasjon på 96 timer sammenlignet med SVF-celler fra samme sted ( Figur 1 ).
Konfluent APC stimulert med benmorfogen protein 4 (BMP4) i 48 timer før standardinduksjon 12 viste differensiering. Dette var tydelig ved større lipidakkumulering i dråper som evaluert ved både fluorescerende lipidopptaksanalyse ( figur 2A ) og Olje Rød O-farging ( Figur 2B ).
Ved sammenligning av utbyttet av APC ga MCS-isolasjon et større antall celler klar for kultur sammenlignet med FACS. ( Figur 3 ) Det var viktig at fordelingen og levedyktigheten av APC-populasjoner (CD34 + og PDGFRα + ) var lik mellom MCS og FACS. Cellelevbarhet bestemt ved Trypan Blue-farging for telling etter isolering var lik for begge isolasjonsprosedyrer (FACS = 71,57% ± 11,09; MCS = 79,25% ± 7,47). Disse dataene viser at MCS-isolasjonen av APC gir et høyere antall levedyktig APC sammenlignet med MCS.
Figur 1 : I Vitro Proliferation of AdIpocyte Progenitor Cells (APC) påvirkes av anatomisk plassering. Stromal vaskulær fraksjon (SVF) og APC ble isolert fra henholdsvis aorta og mesenterisk perivaskulært adiposevev (henholdsvis aPVAT og mPVAT) og gonadal adipose fra 10 uker gamle hannrotter. Spredning av celler ble målt ved hjelp av et DNA-kvantifiseringsassay ved 8, 24, 48 og 96 timer tidspunkter etter sådd. Data er uttrykt som fold økning over 8 h baseline ± SEM (N = 4). Betydningen er indikert med * (P <0,05). Figur modifisert fra Contreras et al . 2016 13 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Adipocyt Progenitor Cells (APC) Vis ingen variasjon i DifferentiaEvner mellom depots, men større lipidakkumulering sammenlignet med stromal vaskulær fraksjon (SVF). Celler ble indusert etter 48 timers konfluens og eksponering for BMP4 etterfulgt av 48 timers eksponering for dexametason og 3-isobutyl-1-metylxantin og deretter opprettholdt i vedlikeholdsmedier 14 dager med mediaendringer hvert 48 timer. ( A ) Lipidopptaksanalyse av differensiert APC med data uttrykt som forholdet mellom utifferentierte preadipocytter: differensierte adipocytter (preadipocytter: adipocytter) i relative fluorescensenheter (RFU) ± SEM (N = 4). ( B ) Olje Rød O (ORO) -farging av APC og SVF med data uttrykt som prosent av celler med lipid (ORO opptak) ± SEM (N = 4). Betydningen er indikert med * (P <0,05). Figur modifisert fra Contreras et al. 2016 13 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 : Isolasjonsutbytte av levende adipocytprogenitorceller (APC) er forbedret ved magnetisk aktivert cellesortering (MCS). Overflate markør ekspresjon av CD34 + ( A ) og PDGFRα + ( B ) i SVF isolert fra perivaskulær adipose vev (aortic = aPVAT; mesenteric = mPVAT) ved hjelp av MCS og FACS. Data uttrykkes som gjennomsnittlig antall celler isolert fra 50 mg vev ± SEM (N = 4). Betydningen er indikert med * (P <0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det sentrale fokuset i foreliggende eksperiment er isolering, ekspansjon og adipogen induksjon av APC fra PVAT-depoter. Her presenterer vi en protokoll for isolering av APC basert på identifisering av celler som uttrykker overflate markørene CD34 og PDGFRα. Disse overflateproteiner ble tidligere identifisert på APC med høye proliferasjonshastigheter og potensialet til å differensiere til hvite eller brune adipocytter i forskjellige adipose depots 14 , 15 . Ved å velge celler basert på disse spesifikke markørene, var vi i stand til å isolere lignende APC-populasjoner fra flere adipose-depoter som samsvarer med adipocytfenotypen som observeres i PVAT valgt 13 . I våre eksperimenter forbedret vi APC-differensiering ved å supplere vekstfaktor BMP4. Tidligere viste Macotela og kolleger at spesifikke APC-populasjoner fra viscerale adipose depoter hadde mindre BMP-aktivitet enn de fraSubkutane depot når differensiert med mindre kulturmedia ble supplert med adipogene vekstfaktorene BMP2 eller BMP4 12 , 16 , 17 , 18 .
Siden isolering av individuelle celler fra fettvev er vanskelig på grunn av cellens sårbarhet, bruker MCS en effektiv metode for celleisolering til en mindre kostnad for forbruksvarer, utstyr og opplæringsressurser. Det er viktig å merke seg at APC-utbyttet kan påvirkes av dyrets alder eller størrelse og ved endringer i medietemperaturen og manglende opprettholdelse av et sterilt isolasjonsmiljø. Kultiveringsceller i normoksi er også viktige for proliferasjon og differensiering 19 , og vedlikehold av inkubasjonsluftforhold er derfor integrert i kulturpraksis. Sentrifugeringshastigheten kan økes til 800 xg dersom tilstrekkelig cellepellets ikke dannes under tHan isolasjonsprosess. Kontroll av utløpet av antistoffene kan også være nødvendig da det konjugerte FITC fluorokrom kan nedbrytes over tid. Endring av mye kollagenase type I kan også kreve endringer i fordøyelsesprosedyrene, da mye kan variere i potens. Hvis du bruker en annen art enn rotter, kan spesifikt serum og IgG i blokkeringsbufferen også være nødvendig hvis vertsarter av antistoffene er forskjellige fra de som brukes her.
Blant fordelene med MCS over FACS er at det er mer økonomisk mulig enn FACS som kits er billige og kan enkelt kjøpes. Dette unngår også kjøp, vedlikehold og brukstrening av et flytcytometer. Bruk av MCS tillater også spesifikk binding uten justering av portene for valg og bakgrunnsfluorescensinvolvering.
En begrensning for denne studien er at den stole på to preadipocyt overflate markører. Andre preadipocyt overflate markører av engasjement og diffErentiering, som Zfp423, Sca1 og CD24, er blitt identifisert 20 , 21 . Disse markørene kan nøyaktig identifisere dedikerte adipocyt-progenitorceller av spesifikke fenotyper; Men overflatemarkørene som ble brukt her, ble valgt siden celler som uttrykker disse markørene har evnen til å indusere til både brune og hvite fenotyper 20 , 21 . En annen begrensning av denne studien var den selektive bruken av vekstfaktorer i APC-kulturen. Andre vekstfaktor-cocktailer har vært effektive ved induksjon av adipogenese 22 . Cellkulturen i denne studien ble også begrenset av det faktum at all kultur ble gjort i todimensjonale kulturplater. Selv om dette er kulturnormen, sprer celler ikke in vivo på denne måten. Kultivering i tredimensjonale miljøer kan muliggjøre ytterligere hypertrofi og hyperplasi ettersom den replikerer naturlig form av adipose stØdeleggelse 23 .
På grunn av praktiske og effektivitet ved bruk av MCS, er denne protokollen ideell for isolering av APC, så vel som andre celletyper i PVAT. Denne prosedyren gir også en mer effektiv måte å indusere differensiering i preadipocytkulturer. Minimale kostnader, utstyr og trening kreves, gjør at denne metoden kan brukes i alle laboratorier som ønsker å isolere celler basert på bestemte overflate markører. Fremtidige applikasjoner kan tillate isolering av andre cellepopulasjoner eller bruk av mer spesifikke cellemarkører. Bruk av vekstfaktor-cocktailer i celleforpliktelse kan være nyttig ved stamcelleaktivering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Contreras og Watts Laboratories og Dr. William Raphael. Disse forsøkene ble støttet av NHLBI F31 HL128035-01 (vevsfordøyelsesprotokoll standardisering), NHLBI 5R01HL117847-02 og 2P01HL070687-11A1 (dyr) og NHLBI 5R01HL117847-02 (celleisolasjon og kultur).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC-conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48-Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. in eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
