Summary
Qui presentiamo un bilingue lipidico supportato nel contesto di una piattaforma microfluidica per studiare le interazioni proteine-fosfoinositide usando un metodo senza etichetta basato sulla modulazione del pH.
Abstract
Numerose proteine cellulari interagiscono con superfici di membrana per influenzare processi cellulari essenziali. Queste interazioni possono essere indirizzate verso una componente lipidica specifica all'interno di una membrana, come nel caso di fosfoinositide (PIP), per garantire una localizzazione e / o un'attivazione subcellulare specifica. PIPs e domini cellulari PIP-binding sono stati studiati in modo estensivo per comprendere meglio il loro ruolo nella fisiologia cellulare. Abbiamo applicato un saggio di modulazione del pH sui bilayers lipidici supportati (SLBs) come uno strumento per studiare le interazioni proteine-PIP. In questi studi è stata utilizzata la fosfatidiletiletilammina coniugata con orto- Solforodina B sensibile al pH per rilevare interazioni proteine-PIP. Dopo il legame di una proteina a una superficie di membrana contenente PIP, il potenziale di interfaccia è modulato ( cioè il cambiamento nel pH locale), spostando lo stato di protonazione della sonda. Un caso di studio sull'uso efficace del saggio di modulazione del pH è presentato utilizzando fosfolipasi C delta1 PleckstrIn omologia (PLC-δ1 PH) e fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PI (4,5) P 2 ) come esempio. L'apparente costante di dissociazione ( K d, app ) per questa interazione era 0,39 ± 0,05 μM, simile a K d, valori app ottenuti da altri. Come osservato in precedenza, il dominio del PLC-δ1 è PI (4,5) P 2 specifico, mostra un legame più debole verso fosfatidilinositolo 4-fosfato, e nessun legame con SLB di fosfatidilcolina pura. Il test PIP-on-a-chip è vantaggioso rispetto ai test tradizionali PIP-binding, tra cui, ma non limitati, il basso numero di campioni e nessun requisito di etichettatura del ligando / del recettore, la capacità di testare interazioni a membrane di alta e bassa affinità con piccole e Grandi molecole e un miglior rapporto segnale / rumore. Di conseguenza, l'utilizzo del metodo PIP-on-a-chip faciliterà la chiarificazione dei meccanismi di una vasta gamma di interazioni di membrana. Inoltre, questo metodo poteva essere uNel identificare le terapie che modulano la capacità della proteina di interagire con le membrane.
Introduction
Interazioni di microrganismi e processi biochimici avvengono su superfici a membrana bidimensionale fluida. Gli organelli racchiusi in membrana in cellule eucariotiche sono uniche non solo nei processi biochimici e nel loro proteome associato, ma anche nella loro composizione lipidica. Una classe eccezionale di fosfolipidi è fosfoinositide (PIP). Anche se comprendono solo l'1% del lipidome cellulare, essi svolgono un ruolo cruciale nella trasduzione del segnale, nell'autofagia e nel traffico di membrana tra gli altri 1 , 2 , 3 , 4 . La fosforilazione dinamica del gruppo testa inositolo per le cellule PIP chinasi dà origine a sette gruppi di capi PIP che sono mono-, bis-, o tris-fosforilati 5 . Inoltre, i PIP definiscono l'identità subcellulare delle membrane e servono come siti di ancoraggio a membrana specializzati per proteine / enzimi che contengono uno o più fosfoidiDomini leganti, ad esempio Homology Pleckstrin (PH), Phox Homology (PX) e Epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . Uno dei domini PIP-legame più studiati è fosfolipasi C (PLC) dominio PH -δ1 che interagisce specificamente con fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) all'interno di un alto nanomolari-gamma bassa affinità micromolare 8 , 9 , 10 , 11 .
Sono stati sviluppati diversi metodi qualitativi e quantitativi in vitro e utilizzati per studiare il meccanismo, la termodinamica e la specificità di queste interazioni. Tra i più comuni metodi di rilascio PIP sono la risonanza plasmonica superficiale (SPR), la calorimetria isotermica (ITC), la spettroscopia magnetica nucleare (NMR), il test di flottazione / sedimentazione dei liposomi e le macchie lipidiche (grasso-blots / PIP-strips)12 , 13 . Anche se questi sono ampiamente utilizzati, tutti hanno molti svantaggi. Ad esempio, SPR, ITC e NMR richiedono grandi quantità di campioni, strumentazione costosa e / o personale addestrato 12 , 13 . Alcuni formati di analisi come i blot di lipidi a base di anticorpi utilizzano forme solubili in acqua di PIP e li presentano in modo non fisiologico 12 , 14 , 15 , 16 . Inoltre, le macchie lipidiche non possono essere quantificate in modo affidabile e spesso hanno portato a osservazioni false positivo / negativo 12 , 17 , 18 . Per superare queste sfide e migliorare l'attuale set di strumenti, è stato stabilito un nuovo metodo senza etichetta basato su un duplicato lipidico supportato (SLB) nel contesto di Piattaforma microfluidica, che è stata applicata con successo allo studio delle interazioni proteine-PIP ( Figura 1 ) 19 .
La strategia utilizzata per rilevare le interazioni proteine-PIP è basata sulla sensazione di modulazione del pH. Ciò comporta una tintura sensibile al pH che ha orto- solforodamina B ( o SRB) direttamente coniugata al gruppo tossico lipidico della fosfatidiletanolammina 20 . La sonda o SRB-PAPA (Figura 2A) è altamente fluorescente a pH basso e spenta a pH elevato con un pKa circa 6,7 entro 7,5 moli% PI (4,5) P 2 SLB -aventi (Figura 5B). Il dominio PH del PLC-δ1 è stato ampiamente utilizzato per la convalida delle metodologie di legame di proteine-PIP a causa della sua elevata specificità nei confronti di PI (4,5) P 2 ( Figura 5A ) 21 , 22 ,"> 23 , 24 , 25. Quindi, abbiamo ragionato che il dominio PL PLC-δ1 possa essere utilizzato per testare il suo legame a PI (4,5) P 2 attraverso il test PIP-on-a-chip. Utilizzata in questo studio ha una carica netta positiva (pI 8.4) e attrae quindi gli OH - ioni ( Figura 5C ). Quando si lega a SLB che contengono PI (4,5) P 2 , il dominio PH porta gli OH - ioni al La superficie della membrana, che a sua volta modula il potenziale di interfaccia e sposta lo stato di protonazione di o SRB-POPE ( Figura 5C ) 26. In funzione della concentrazione del dominio di PH, la fluorescenza viene fatta abbrutire ( Figura 6A ). Adatta ad un'isoterma legante per determinare l'affinità dell'interazione di PH-dominio-PI (4,5) P 2 ( Figura 6B , 6C ). </ P>
In questo studio viene fornito un protocollo dettagliato per eseguire la legame delle proteine a SLB contenenti PIP all'interno di una piattaforma microfluidica. Questo protocollo prende il lettore dall'assemblaggio del dispositivo microfluidico e della preparazione della vescicola alla formazione di SLB e alla legatura delle proteine. Inoltre sono fornite indicazioni per l'analisi dei dati per estrarre le informazioni di affinità per l'interazione PLC-δ1 PH-dominio-PI (4,5) P 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Pulizia dei vetri di copertura
- Diluire la soluzione di pulizia 7x (vedi tabella dei materiali ) 7 volte con acqua deionizzata in un piatto di vetro borosilicato profondo da 100 mm con fondo piano e riscaldare fino a 95 ° C su una piastra calda a livello per 20 minuti o fino a che la soluzione nuvolosa diventa chiara .
NOTA: la soluzione sarà calda, usa cautela per evitare lesioni corporali. La soluzione di pulizia 7x è una miscela proprietaria di esasodio [ossido- [ossido (fosfonatoossil) fosforil] ossifosforil] fosfato, 2- (2-butossietossi) etanolo, sodio 1,4-bis (2-etilhexossi) -1,4-diossobutano -2-solfonati e aggiunte non pericolose. - Usando le pinzette, disporre le copertine (40 mm di lunghezza x 22 mm di larghezza x 0,16-0,19 mm di altezza) su una cremagliera di alluminio in alternanza. Mantenere un punto vuoto tra ciascuna copertina per evitare che si tocchino.
- Immergere completamente la cremagliera con le copertine nella soluzione di pulizia. Tieni le copertineLa soluzione per 1 h.
NOTA: quando l'acqua evapora, continuare ad aggiungere acqua fresca deionizzata per mantenere invariata la concentrazione della soluzione. - Prendete le cremagliere dalla soluzione di pulizia e lavate le copertine con abbondanti quantità di acqua deionizzata per rimuovere il detersivo.
- Asciugare le copertine con gas azoto (circa 5 min per cremagliera) e quindi posizionare le copertine in un forno per 6 ore a 550 ° C per l'annealing.
NOTA: questo è un passo fondamentale che liscia le caratteristiche ruvide sulla superficie del vetro. - Posizionare le copertine in un contenitore di plastica e tenerli lontani dalla polvere.
2. Fabbricare blocchi PDMS Micropatternati
- Mescolare il prepolimero di polidimetilsilossano (PDMS) e l'agente di tamponamento in rapporto 10: 1 (w / w) in una grande barca di pesata in plastica e degassarlo in vuoto per 1 h con resistenza al vuoto a 500 Torr o inferiore.
NOTA: PDMS è un polimero in silicone trasparente e inerte. Per ottenere il blocco PDMS desiderato(0,5 cm), mescolare 55 g del prepolimero con 5,5 g dell'agente di tintura. - Posizionare il master di silicio che contiene più repliche dello stesso SU-8 micropattern in una grossa barra di pesatura in plastica di diametro di 10 cm e versare il PDMS degasato. Quindi, curare in un forno a secco a 60 ° C per tutta la notte.
NOTA: I micropatteri sono abbastanza grandi da essere visti con l'occhio nudo. Ogni modello contiene 8 micro canali (100 μm di larghezza x 40 μm di altezza x 1 cm di lunghezza) con 40 μm di spaziatura tra ( Figura 1A , 1B ). Lo stampo in silicone, costituito da fotoresist SU-8, è stato fabbricato in un impianto di nanofabbricazione 27 . Altri approcci per la preparazione del master includono l'etching dell'acido fluoridrico (HF), l'etching dell'acqua ad alta temperatura, la xurography e la stampa 3D 28 , 29 , 30 , 31 . commercPossono essere utilizzate anche sorgenti per la preparazione del silicio. I modelli per il dispositivo microfluidico sono stati progettati con un software di progettazione (vedi tabella dei materiali). Il file originale che contiene il disegno del modello è fornito come un file aggiuntivo "Pattern Design.dwg", che può essere fornito direttamente al produttore. - Delicatamente, sfilare il PDMS dal master silicio con le mani. Segna i confini di ogni micropattern in rettangoli utilizzando un bisturi chirurgico e un righello. Quindi, tagliate il PDMS in blocchi.
- Punzonatura 16 fori (8 entrate e 8 uscite per blocco) su entrambe le estremità di ciascuna microcanale con un punzone di biopsia (diametro del foro da 1,0 mm) come indicato nella figura 3B .
- Applicare nastro su ogni blocco PDMS per proteggere i micropattern da danni e polvere. Conservarli in un contenitore di plastica.
3. Preparazione di piccole vescicole unilamellari (SUV)
NOTA: Composizione negativa di due strati di controlloè 99,5 mol% 1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (POPC) e 0,5 moli% orto- solforodamina B-1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfoetanolamina (o SRB- PAPA). Composizione di prova bistrato è 92,0 mol% POPC, 0,5 moli% o SRB-PAPA, e 7,5% in moli di una L-α-fosfatidilinositolo-4-fosfato (PI4P) o L-α-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato (PI ( 4,5) P 2 ). Sotto è la procedura per la preparazione 92,0 mol% POPC, 0,5 moli% o SRB-PAPA, e 7,5% molare di PI (4,5) P 2 SUV -contenenti. La sintesi di o SRB-POPE utilizzata in questo studio è stata precedentemente descritta 20 .
- Calcola il volume di POPC, PI (4,5) P 2 e o SRB-POPE che deve essere miscelato, che conta i seguenti totali totali: 2,22 mg di POPC, 0,26 mg di PI (4,5) P 2 , E 2,1 x 10 -5 mg di o SRB-POPE.
- Pipette il volume calcolato di POPC, PI (4,5) P 2 , <Em> o SRB-POPE in una singola fiala di scintillazione di vetro da 20 ml.
NOTA: Le soluzioni di riserva POPC e o SRB-POPE vengono fornite in una soluzione cloroformica, mentre il titolo PI (4,5) P 2 (e altri fosfoinositidi) arriva in una miscela di cloroformio: metanolo: acqua (20: 9: 1). Per precisione, bagnare la punta della pipetta con cloroformio prima di utilizzarla. Per la sicurezza, questo passaggio dovrebbe avvenire all'interno di una cappa chimica. - Asciugare la miscela in un flusso di gas di azoto all'interno di una cappa chimica per 10 minuti o fino a quando il solvente si elimina e si forma una sottile pellicola lipidica in fondo alla fiala.
- Desiccare la miscela sotto vuoto per ≥3 h ad una forza di vuoto di 10 mTorr per rimuovere qualsiasi residuo organico residuo.
NOTA: Il tempo di essiccazione di 3 ore è sufficiente per la scala di preparazione SUV descritta in questo protocollo, che è sufficiente per 50 esperimenti. Se è richiesta una più ampia scala di preparazione SUV, si può eseguire la desquamazione durante la notte. - Ridorre il dott(20 mM HEPES, 100 mM NaCl, a pH 7,0) e collocarlo in un bagno ad ultrasuoni con una frequenza di funzionamento di 35 kHz per 30 minuti a RT.
NOTA: La miscelazione delle quantità di lipidi specificata al punto 3.1 e l'aggiunta di 5 mL di tampone in esecuzione al punto 3.5 rende una sospensione di vescicola a 0,5 mg / mL. In questa fase, la sospensione della vescicola è un mix di vescicole unilamellari e multilamellari ( Figura 2B ). La soluzione apparirà rosa / porpora a colori e relativamente torbida. - Freeze-scongelare la sospensione della vescicola con l'azoto liquido e il bagno d'acqua a 40 ° C per ottenere vesicles unilamellar. Ripetere la freccia-scongelamento 10 volte.
NOTA: (Facoltativo) Per garantire l'assenza di vescicole non unilamellare nella sospensione, può essere applicata la fase di centrifugazione 32 , 33 . - Estrudere la sospensione della vescolina attraverso una membrana in policarbonato incisa da traccia 0,10 μm usando un estrusore lipidico (vediTavola di materiali) per arricchire i SUV. Ripetere l'estrusione 10 volte.
NOTA: Un tubo conico da 15 ml può essere utilizzato per raccogliere le vescicole estruse. In questa fase la soluzione dovrebbe essere invalida di torbidità. Il diametro del SUV può essere confermato mediante dispersione luminosa dinamica (DLS) ( Figura 2C ). I SUV sono più adatti per la formazione di SLB 34 . - Coprire il tubo conico con foglio di alluminio e conservare a 4 ° C fino a quando non sarà pronto per l'uso.
4. Montaggio del dispositivo Microfluidico
- Testare le entrate e le uscite del blocco PDMS per bloccare schizziando l'acqua deionizzata attraverso i fori usando una bottiglia di lavaggio dell'acqua. Quindi, asciugare il blocco PDMS con gas di azoto.
NOTA: Questo passaggio rimuoverà anche le particelle di polvere che potrebbero essere intrappolate all'interno e / o tra i canali. Se necessario, copre le coperture pre-pulite con gas nitrogeno per rimuovere eventuali particelle di polvere. - Posizionare il blocco PDMS e il pre-pulito(Vedi sezione 1) all'interno del sistema di plasma dell'ossigeno (vedi tabella dei materiali) camera di campione per esporre con plasma ad ossigeno per 45 s con impostazione di potenza a 75 Watt, velocità di flusso di ossigeno a 10 cm 3 / min e resistenza al vuoto a 200 mTorr .
- Posizionare la superficie modellata del blocco PDMS a contatto con la copertura immediatamente dopo il trattamento con plasma ad ossigeno. Premere delicatamente per rimuovere le bolle d'aria nei siti di contatto.
- Mettere il dispositivo su una piastra riscaldata a 100 ° C per 3 min per migliorare l'incollaggio.
- Utilizzare un panno umido senza pelo ( es. Kimwipe) con etanolo al 100% per rimuovere eventuali particelle di polvere dall'alto (PDMS) e dal fondo (vetro) del dispositivo. Quindi, avvitare il dispositivo in cima ad una vetrina del microscopio in vetro.
NOTA: Non utilizzare una quantità eccessiva di etanolo e evitare che l'etanolo entri nei canali di ingresso e uscita. L'esecuzione di questo passaggio mentre il dispositivo è ancora caldo è consigliato per garantire che l'etanolo evapori immediatamente. MicrLe scivolature di oscopia possono essere immagazzinate in soluzione al 100% di etanolo per rimuovere polvere e altri contaminanti.
5. Formazione di Bilayers Lipidi Supportati (SLBs)
- Trasferire 100 μL di SUV contenenti PI (4,5) P 2 dal punto 3.8 in un tubo di microcentrifuga da 0,65 ml. Regolare il pH della soluzione a ~ 3,2 aggiungendo 6,4 μL di acido cloridrico 0,2 N.
NOTA: Verificare il pH della soluzione con un misuratore pH dotato di sonda microfilo (vedere tabella dei materiali). - Pipettare 10 μL della soluzione SUV regolata in pH in ogni canale attraverso l'ingresso e applicare la pressione attraverso la pipetta fino a raggiungere la soluzione. Staccare la punta dalla pipetta e lasciarla fissata al dispositivo.
- Ripetere il passo precedente per ogni canale e quindi incubare il dispositivo per 10 minuti a RT.
NOTA: L'iniezione di vescicole nei microchannel dovrebbe essere eseguita immediatamente dopo l'assemblaggio del dispositivo. - Tagliare i set di tubo di entrata e uscita eaCh 60 cm (tubo di entrata) e 8 cm (tubo di uscita) lungo, rispettivamente.
NOTA: Tagliare diagonalmente il tubo e creare un bordo tagliente, rende più facile inserire il tubo nelle entrate e nelle prese. Il tubo di uscita dovrebbe avere una forma d'arco. La lunghezza del tubo di ingresso può variare in base alla configurazione del microscopio. Il diametro interno del tubo è di 0,05 cm. - Utilizzando le pinzette, collegare il tubo di scarico impostato sul dispositivo e quindi nastro il dispositivo su uno stadio microscopico.
- Immergere un'estremità del tubo di entrata impostata in 25 ml di tampone di corsa contenuta in un tubo conico e fissarla per assicurarsi che il tubo sia fissato.
- Posizionare il tubo conico su un terreno superiore (~ 20 cm) rispetto al dispositivo per spingere la soluzione attraverso i microchannel via il flusso di gravità; Un jack di laboratorio può essere utilizzato per ottenere questo risultato.
- Per ogni tubo di ingresso, utilizzare una siringa per disegnare 1 mL di tampone di esercizio dall'estremità libera del tubo. Rimuovere la punta della pipetta dall'apertura e inserire ilEstremità libera del tubo di entrata nel dispositivo.
NOTA: Introdurre una goccia di buffer di esecuzione sull'ingresso per ridurre la probabilità che una bolla d'aria venga introdotta nel canale durante questo passaggio. Dopo che il tubo di ingresso è collegato al dispositivo, utilizzare una panno senza peli per rimuovere il buffer in eccesso. - Ripetere il passaggio sopra riportato per collegare tutti i pezzi del tubo di ingresso al dispositivo.
NOTA: Il flusso di corrente di flusso attraverso i canali aiuta a rimuovere le vescicole in eccesso e a equilibrare il doppio strato in condizioni sperimentali. - Aprire il software di controllo del microscopio (vedere tabella dei materiali). Sul pannello sinistro, fai clic sulla scheda "Microscopio" e scegli l'obiettivo "10X".
- Fai clic su icone di immagine "Live" e poi "Alexa 568" sulla barra degli strumenti. Utilizzando le manopole di regolazione del fine e del corso, concentrarsi sui microchannel.
- Scansiona attraverso il dispositivo per controllare la qualità degli SLB ei canali ( Figura 8 ). Poi,Fare clic sull'icona di immagine "FL Shutter Closed" sulla barra degli strumenti.
- Fai clic sulla scheda "Acquisizione" e in "Regolazioni di base" seleziona "Tempo di esposizione". Impostare il tempo di esposizione su "200 ms".
- Nel pannello sinistro, fai clic su "Acquisizione multidimensionale" e nel menu filtri seleziona il canale rosso (contrassegnato come "Alexa 568"). Quindi fare clic sul menu "time lapse", impostare l'intervallo di tempo su 5 minuti, durata fino a 30 minuti e fare clic su "Start".
NOTA: Sulla base della durata (30 min) e della portata (~ 1,0 μL / min), 30 μL di tampone di funzionamento viene utilizzato per equilibrare il SLB all'interno di un canale, vale a dire 240 μL di tampone di esecuzione per tutti e 8 i canali. - Selezionare lo strumento "Circle" nella scheda "Misura" e disegnare un cerchio in qualsiasi canale. Fare clic destro con il cerchio selezionato e scegliere "Proprietà". Nella scheda "Profilo", seleziona "tutto T" per visualizzare il fileIntensità di fluorescenza in funzione del tempo.
- Assicurarsi che questa curva raggiunga un plateau, che indica l'equilibrio, prima di passare alla fase successiva.
- Abbassare la soluzione di tampone a un terreno uguale come il dispositivo per fermare il flusso.
- Salvare il file di scadenza del tempo.
6. Verifica dell'interazione del dominio di PL con PL (4,5) P 2 contenenti SLB
- Preparare le diluizioni del dominio PH utilizzando il buffer di esecuzione come diluente.
NOTA: poiché esistono otto canali all'interno del dispositivo, utilizzare almeno due di essi per i controlli vuoti. Scegli le estremità finali da ogni lato e usa i canali rimanenti per le diluizioni proteiche. Sono state testate le seguenti concentrazioni di domini PH: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 e 2,50 μM. Circa 200 μL di ciascuna diluizione era sufficiente per raggiungere l'equilibrio entro 30 minuti. - Uno alla volta, staccare ogni tubo di uscita e applicare 200 μL di ciascuna diluizione proteicaIl canale di uscita usando una pipetta. Non applicare alcuna pressione, lasciare che la gravità faccia il lavoro. Staccare la punta dalla pipetta e lasciarla fissata al dispositivo microfluidico.
- Ripetere il passo precedente per ogni canale e assicurarsi che le bolle d'aria non siano introdotte nei canali durante questo processo.
- Abbassare il tubo di entrata ad un terreno sotto il dispositivo microfluidico per iniziare a fluire la proteina attraverso i microchannel. Nastro l'estremità libera del tubo in un contenitore di rifiuti. Portare le diluizioni proteiche per 30 min.
NOTA: Ciò invertire il flusso e consentire che la proteina venga introdotta nei canali. Il tempo per equilibrare e il volume delle diluizioni proteiche necessarie dipenderà dall'affinità dell'interazione. - Sul pannello sinistro del software, nella scheda "Time Lapse", fare clic su "Start" per riprendere l'imaging.
- Ripetere la fase 5.15 per assicurarsi che l'equilibrio sia raggiunto. Quando l'esperimento è completo, salva l'intervallo di tempofile.
7. Valutazione della fluidità delle membrane
NOTA: Recupero di fluorescenza Dopo che gli esperimenti di Photobleaching (FRAP) dovrebbero essere eseguiti con ogni nuovo gruppo di SUV e coperture di vetro pulite per garantire che i SLB siano fluidi.
- Seguire la procedura per la pulizia delle coperture in vetro (1.1-1.6), fabbricare blocchi PMMS micropaternati (2.1-2.5), preparare SUV (3.1-3.8), assemblare il dispositivo microfluidico (4.1-4.5) e formare SLB (5.1-5.17) come precedentemente descritto.
- Mettete a fuoco il microscopio sul doppio strato, impostate il tempo di esposizione a 200 ms e il binning a 1.
- Effettuare la foto-candeggina di un punto circolare usando un raggio laser di 532 nm, 2 mW (raggio di 13 μM). Subito dopo la fotopolimerizzazione, iniziare a catturare una serie di immagini ogni 3 s per i primi 45 s, seguita da un intervallo di 30 secondi per il resto del tempo (durata totale di 15 minuti). Una volta che l'acquisizione dei dati è completa, salva il file di scadenza.
- Selezionare la sbiancata aRea utilizzando lo strumento di disegno del cerchio per estrarre i valori di intensità di fluorescenza in funzione del tempo. Inoltre, selezionare altre due aree vicine, una corrispondente a una regione non maculata e quella corrispondente a una regione senza SLB.
- Calcolare il recupero di fluorescenza ( y ) utilizzando la seguente equazione:
NOTA: Qui F t rappresenta l'intensità della regione sbiancata in funzione del tempo, F i rappresenta l'intensità di fluorescenza prima dello sbiancamento (usa "1" come valore normalizzato in questo caso); F 0 è l'intensità di sfondo. - Recupero di fluorescenza trama (asse y) in funzione del tempo (asse x) per generare una curva FRAP. Quindi, inserire i dati in una singola funzione esponenziale come segue,
NOTA: Qui A rappresenta la frazione mobile e
- Utilizzare il t 1/2 per calcolare la costante di diffusione ( D ):
NOTA: Qui R rappresenta il raggio del raggio laser (13 μm). La costante di diffusione per un doppio strato di fluido deve essere di ≥1,0 μm 2 / s.
8. Dati di elaborazione
NOTA: La routine dell'analisi dei dati dipenderà dal microscopio, dal software di elaborazione dell'immagine e dal software di montaggio curva che viene utilizzato.
- Apri i file di scadenza del tempo prima (dal passaggio 5.17) e dopo (dal punto 6.6) titolando il dominio PH. Vai all'ultimo fotogramma di ogni file di scadenza del tempo e fai una scansione di linea in tutti i microchannel per ottenere il fluorescenteIn funzione della distanza in pixel ( Figura 6A ). Trasferire i dati in un software di foglio elettronico.
- Per ogni microchannel (prima e dopo l'aggiunta di dominio PH), esaminare alcuni dati all'interno del canale e entrambi i lati del canale che rappresentano la linea di base ( Figura 7A ).
NOTA: L'intensità di fluorescenza del canale vuoto dovrebbe essere rimasta invariata. Tutti gli altri canali sono normalizzati al canale in bianco, quindi è fondamentale avere due canali vuoti e assicurarsi che le loro intensità di fluorescenza rimangano coerenti tra loro. - Applica la seguente formula per normalizzare i dati sul canale in bianco; Un calcolo del campione è fornito in Figura 7B .
NOTA: qui la proteina ΔF rappresenta l'intensità di fluorescenza sottrattata di sfondo del canale proteico, Δ; F vuoto rappresenta l'intensità di fluorescenza sottrattata di sfondo del canale in bianco, pre e post si riferiscono a passaggi di titolazione prima e dopo la proteina e α rappresenta il fattore di correzione che è il rapporto delle intensità di fluorescenza del canale proteico e del canale in bianco ([ F protein / F blank ] pre ) con un passaggio di titolazione pre-proteina. Poiché l'intensità della fluorescenza diminuisce in funzione della concentrazione di dominio PH, i dati normalizzati saranno negativi in valore. - Utilizzando un software di montaggio a curva (vedi tabella dei materiali ), tracciare la fluorescenza normalizzata in funzione della concentrazione di dominio PH e adattarsi ad un'isotherm di Langmuir ( Figura 6C ):
NOTA: Qui ΔF rappresenta la variazione dell'intensità di fluorescenza rispetto alla variazione massima del fluorescence intensità quando una concentrazione di saturazione di proteine è presente (Af max), mentre il K d, app rappresenta la dissociazione apparente costante, che è uguale alla concentrazione proteica di massa ([PLC-δ1 PH]) alla quale copertura del 50% ( Complesso legato alla membrana). Si tratta di una misurazione basata sull'equilibrio in modo che i dati normalizzati siano adatti a una semplice istamermica Langmuir per estrarre un apparente parametro sperimentale K d, app . Sulla base del software di montaggio K d, l'app per interazione PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 è 0,39 ± 0,05 μM ( Figura 6B ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbiamo utilizzato il saggio di modulazione del pH per studiare l'interazione di PL-δ1 domino-PI (4,5) P 2 all'interno di un microprocessore PIP-on-a-chip ( Figura 1 ). Attraverso un protocollo dettagliato, abbiamo dimostrato come preparare e assemblare componenti microfluidici del dispositivo, realizzare piccole vescicole unilamellare ( Figura 2 ), formare SLB all'interno di un dispositivo ( Figura 3 ) e testare la proteina legata a SLB contenenti PIP. Un diagramma di flusso di un tipico esperimento di legame SLB è rappresentato in Figura 4 . Il principio del saggio di modulazione del pH è illustrato in figura 5 usando il legame PH domino-PI (4,5) P 2 come esempio. I risultati ottenuti da questo studio hanno suggerito che il dominio PH si lega a SL (SL) contenenti PI (4,5) P 2 . Più specificamente, abbiamo osservato che, dopo il legame, il pH locale è diventato più elementare. Questo Il cambiamento locale del pH è stato rilevato dalla sonda fluorescente o SRB-POPE presente all'interno di SLB, che è stata quindi fatta in modo appropriato ( Figura 6A , 6C ). Lo spegnimento era dipendente dalla concentrazione e saturabile, per cui i dati di un isomero Langmuir hanno prodotto un K d, app di 0,39 ± 0,05 μM ( Figura 6B , 6D ). Il dominio PH mostrato selettività verso PI (4,5) P 2 poiché nessun legame è stato osservato verso POPC (lipidi zwitterionici), e più debole legame verso PI4P contenenti SLB (K d, app = 1.02 ± 0.20 pM) (Figura 6B). Un calcolo del campione è incluso per mostrare come vengono elaborati i dati di fluorescenza ( Figura 7 ). Nella figura 8 vengono presentate serie di immagini microchannel per fornire indizi visivi per determinare la qualità dei SLB e dei microchannel.
_content "per: keep-together.within-page =" 1 ">
Figura 1: Dispositivo microfluidico PIP-on-a-chip per studiare interazioni proteine-PIP. ( A ) Il dispositivo microfluidico dispone di 8 micro canali con 8 prese e 8 prese. Soluzioni colorate sono state attraversate per rendere visibili i canali in questa immagine. Il dispositivo è di 2,0 cm di larghezza (x), di 0,5 cm di altezza (y) e di 3,0 cm di lunghezza (z). ( B ) Il pavimento dei micro canali è vetro, mentre le pareti e i soffitti sono costituiti da polidimetilsilossano (PDMS). Ogni microcanale è di 100 μm di larghezza, di 40 μm di altezza e di 1 cm di lunghezza. La distanza fra due microchannelli adiacenti è di 40 μm. Sulla base della superficie di vetro si formano due strati di lipidi supportati (SLB). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Preparazione di piccole vescicole unilamellari (SUV) e studi di controllo di qualità. ( A ) Componenti lipidiche utilizzate per la produzione di vescicole: orto- solforodina B-POPE ( o SRB-POPE), L-α-fosfatidilinositolo-4-fosfato (PI4P), L-α-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato PI (4,5) P 2 ) e 1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-foscololina (POPC). ( B ) Tipologie di vescicole lipidiche: SUV, grande vescica unilamellare (LUV), vescica unilamellare gigante (GUV) e vescicola multilamellare (MLV). I SUV sono più adatti per la preparazione di SLB 34 . ( C ) Conferma basata sulla diffusione luminosa dinamica (DLS) sulla dimensione dell'estrusione post-lipidica delle vescicole (tramite filtro da 0,1 μm). Il raggio idrodinamico (Rh) di 53,9 nm conferma che il m Ean della distribuzione della dimensione vescicale è ~ 100 nm. I risultati rappresentano la misurazione da SUV ( 16) contenenti PI (4,5) P 2 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: formazione SLB su un supporto in vetro. ( A ) Le vescicole della composizione lipidica desiderata vengono preparate e poi scorrono attraverso micro canali. Le vescicole vengono adsorbite alla superficie di vetro e deformate. Una volta raggiunta una copertura critica della superficie, le vescicole si rompono spontaneamente per formare SLB. Adattato dai riferimenti 35 , 36 . ( B ) sono visualizzati SLB all'interno di un dispositivo sotto un obiettivo 10X. Viene utilizzato un set di filtri Alexa 568 (eccitazione / emissione a 576/603 nm).Ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Diagramma di flusso di un tipico esperimento di legame SLB. I componenti microfluidici del dispositivo, vale a dire il blocco PDMS modellato e le copertine pulite, vengono trattate con un plasma di ossigeno per rendere entrambe le superfici idrofili e poi assemblate. I SUV sono scorruti attraverso i microchannel per formare SLBs. Le vesciche in eccesso vengono rimosse e gli SLB vengono equilibrati a condizioni sperimentali scorrendo una soluzione di tampone in esecuzione. Poi, le diluizioni di proteine sono scorrenti attraverso microchannel. Infine, i dati di intensità della fluorescenza sono analizzati, normalizzati e tracciati in funzione della concentrazione proteica. I dati normalizzati sono adatti a una funzione per estrarre una costante apparente di dissociazione ( K d, app ) value. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Principi del rilevamento basato sulla modulazione del pH. ( A ) Struttura a cristalli a raggi X del dominio di PLC-δ1 nel complesso con PI (4,5) P 2 gruppo di testa inositolo 1,4,5-trisfosfato (Ins (1,4,5) P 3 ) (PDB ID: 1MAI) 37 . (B) L'o sonda SRB-PAPA è altamente fluorescente a pH basso e spenta a pH elevato con un pKa di 6,7 entro 7,5 moli% PI (4,5) P 2 -contenente SLB come indicato nella curva di titolazione pH. ( C ) Il dominio PH utilizzato in questo studio ha un punto isoelettrico (pI) di 8.4, quindi a pH sperimentale (7.0) la proteina è caricata positivamente. Con un positivo netto cLa proteina attrae OH - ioni. Quando il dominio PH si lega a SLB contenenti PI (4,5) P 2 , porta gli OH - ioni alla superficie della membrana, viene modulato il potenziale di interfaccia che a sua volta sposta lo stato di protonazione di o SRB-POPE e la sua fluorescenza Viene interrotta in maniera dipendente dalla concentrazione di dominio PH. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: PLC-δ1 legame di membrana PH monitorata tramite modulazione del pH. ( A ) La visione dei microchannelli prima e dopo l'aggiunta del dominio PH a concentrazioni indicate. (B) confronto delle affinità verso POPC, PI4P e PI (4,5) P 2 SLB -contenenti. Domain binding PH al 7,5% in moli PI (4,5) P 2 SLB -contenenti ha prodotto un Kd, app di 0,39 ± 0,05 pM. Un legame più debole è stato osservato nei confronti di SLB contenenti PI4P contenenti 7,5 mol% ( K d, app di 1,02 ± 0,20 μM) e non è stata osservata alcuna connessione per POPC SLB puro. Le barre di errore indicano SEM (n = 3). T test a due teli è stato utilizzato per confrontare le affinità tra PI4P e PI (4,5) P 2 binding (* p = 0,0396). ( C ) Le intensità di fluorescenza dalla scansione di linea attraverso i microchannel sono tracciate in funzione della distanza in pixel per i POPC, PI4P e PI (4,5) P 2 . (D) normalizzato e mediati POPC, PI4P e PI (4,5) P2 associazione dati è tracciata in funzione della concentrazione dominio PH PLC-δ1 e quindi adatta ad un Langmuir per estrarre K d, app. Vedere l'equazione nel punto 8.4 per i dettagli."Target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: calcolo del campione per l'elaborazione dei dati. ( A ) Prima che la linea di titolazione della proteina (nero) e dopo (rosso) filtri i dati per il vuoto (no proteina) e il canale proteico, dove vengono presentati dati di intensità di fluorescenza in funzione della distanza in pixel. Le aree ombreggiate rappresentano le regioni utilizzate per estrarre i dati per i calcoli. I dati di intensità della fluorescenza di base vengono estratti prima e dopo ogni canale. ( B ) I dati vengono estratti per canali vuoti e proteici, sia prima che dopo la titolazione della proteina. Le medie sono prese per la linea di base e all'interno di un dato di fluorescenza dei canali. Dopo la sottrazione di base, i dati di fluorescenza vengono normalizzati al canale in bianco. Vedere l'equazione nel punto 8.3 per i dettagli.
Figura 8: Valutare l'integrità di SLB e microchannel. ( A ) un'immagine che illustra SLB e microchannel di alta qualità. ( B ) fusione incompleta. ( C ) Microchannelli fusi. ( D ) Particelle di polvere intrappolate all'interno di un microchannel. ( E ) Bolle d'aria intrappolate all'interno di microchannel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplemento File 1: Pattern_Design.dwgBlank "> Clicca qui per scaricare il file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ogni variante PIP, seppure a basse concentrazioni, è presente sulla superficie citosolica di organismi specifici in cui contribuiscono alla creazione di una composizione fisica e specificità funzionale della membrana organellare 1 . Uno degli usi più importanti di PIPs è come una piattaforma specifica di docking per la moltitudine di proteine che richiedono localizzazione e / o attivazione subcellulare specifica 6 , 7 . A causa del loro ruolo nella fisiologia cellulare e nelle malattie, è importante la capacità di studiare le interazioni proteine-PIP in vitro , in un contesto fisiologicamente rilevante. Il formato di analisi descritto in questo documento consente di considerare le interazioni proteine-PIP nel contesto di un bilayer lipidico fluido, in presenza di una miscela di fosfolipidi, con la normale presentazione del gruppo di testa polare e di catene grasse acriliche di lunghezza naturale.
Questo dosaggio, in combinatiOn con la modulazione del pH come sistema di rilevazione e SLB come sistema di membrana modello impostato in una piattaforma microfluidica, offre vantaggi unici rispetto ad altre tecniche di legame delle membrane. Prima di tutto, la piattaforma microfluidica risparmiare sui materiali a causa dei requisiti di basso volume, sia per le proteine e lipidi utilizzato (40 nL volume del canale globale; 1,0 millimetri 2 SLB superficie). Inoltre, possono essere utilizzate composizioni lipidiche fisiologicamente rilevanti, mantenendo comunque la fluidità bidimensionale della membrana (≥ 1,0 μm 2 / s) 28 , 38 . Il sistema di rilevamento fornisce un migliore rapporto segnale / rumore rispetto a ITC, SPR e microbalancio a cristallo di quarzo con controllo di dissipazione (QCM-D), che consente di testare non solo le interazioni tra proteine e membrane, ma le ioni, la piccola molecola, le interazioni delle membrane peptide Ben 19 , 20 , 39 , 40 . Inoltre, la sonda fluorescente sensibile al pH è altamente stabile e non fotopolimerizza nelle condizioni sperimentali testate 19 , 20 e 41 . Un altro vantaggio di questa piattaforma è la capacità di osservare visivamente le superfici delle membrane. Alcune interazioni possono indurre la formazione di microdominio lipidico e / o influenzare la fluidità della membrana, che possono essere visualizzati direttamente e / o testati tramite recupero di fluorescenza dopo la fotopolimerizzazione (FRAP) rispettivamente 42 . Il saggio qui descritto non richiede alcuna strumentazione costosa oltre un microscopio a fluorescenza. Infine, e soprattutto, la valutazione delle interazioni di membrana in assenza di etichettatura del ligando / del recettore rende il metodo PIP-on-a-chip il metodo preferito rispetto a quelli tradizionali.
Anche se il test PIP-on-a-chip è una tecnica potente, le proteine della membrana periferica possono diffNella composizione complessiva dei residui cationici e anionici e della loro distribuzione all'interno / intorno al sito di legame, che creano certe sfide. Alcune proteine hanno siti di legame PIP composti da molti residui di base, mentre altri hanno solo pochi. Pertanto, il rapporto H + / OH - sul sito di legame sarà diverso, e così è anche la grandezza della variazione del pH locale dopo il legame. La stechiometria dell'interazione e se il legame di PIP è stabilizzato dalle interazioni con altri lipidi complicano ulteriormente il caso. Di conseguenza, il pI di una proteina, specialmente per una grande proteina, non può essere l'unico indicatore del cambiamento di fluorescenza atteso. Mentre alcune interazioni proteine-PIP provocheranno grandi variazioni di fluorescenza, il resto può determinare piccole variazioni di fluorescenza. In quest'ultimo caso, è possibile adottare almeno due azioni per aumentare il rapporto segnale / rumore: 1) utilizzando livelli di PIP più elevati sul doppio strato per aumentare il numero di proteine recruited alla superficie, cioè aumentando il numero di reclutati ioni OH - e il numero di molecole o SRB-PAPA temprati; 2) aumentando i livelli o SRB-POPE per migliorare il rapporto segnale / rumore.
Anche se la piattaforma attuale offre molti vantaggi per lo studio delle proteine delle membrane periferiche, ha alcune sfide per lo studio delle proteine transmembranali. A causa della vicinanza di supporto SLB-vetro (lo strato d'acqua è di circa 1-2 nm a seconda della composizione lipidica), l'interazione di supporto di proteine vetro transmembrana può promuovere la denaturazione delle proteine, portare alla perdita di funzione e immobilizzare 34 , 43 , 44 , 45 . Anche se più coinvolti, sono stati sviluppati diversi approcci per superare queste sfide, come la modifica della superficie del supporto in vetro per fornire ammortizzatori di polimero o incluso il lipopolyme(Per esempio lipidi PEGilati) all'interno del doppio strato per aumentare la distanza di supporto SLB vetro 34 , 46 , 47 , 48 .
La formazione di SLB di alta qualità è l'aspetto più critico del test PIP-on-a-chip ( Figura 8A ). È consigliabile utilizzare coperchi puliti e nuovi SUV per garantire la riproducibilità. A causa della presenza di lipidi anionici, come il PI (4,5) P 2 , i SUV sono caricati negativamente, il che riduce l'efficienza di rottura del SUV e influenza la fluidità della membrana ( Figura 8B ). Pertanto, la regolazione del pH della soluzione SUV è fondamentale per protonare i fosfati della testa del gruppo PI (4,5) P 2 e diminuire la repulsione elettrostatica con il vetro per aumentare l'efficienza di rottura 49 , 50 . SUV che non contengono l anionicoIpids, non richiedono alcuna regolazione del pH. Inoltre, i SUV dovrebbero essere iniettati nei canali subito dopo il trattamento e l'incollaggio del plasma a ossigeno, mentre la superficie di copertura in vetro è ancora idrofilo, che è necessaria per la formazione di SLB. Oltre alla qualità SLB, le particelle di polvere rappresentano un altro problema. Durante il processo di fabbricazione del dispositivo, una particella di polvere intrappolata tra i canali può causare la fusione di canali, mentre una particella di polvere intrappolata all'interno di un canale può danneggiare la SLB e / o ridurre la velocità di flusso della soluzione ( Figura 8C, 8D ). L'area di lavoro va pulita periodicamente per rimuovere la polvere. Allo stesso modo, l'esposizione di una bolla d'aria in un canale dovrebbe essere evitata in qualsiasi fase, altrimenti danneggerà SLB irreversibilmente ( Figura 8E ).
Un altro parametro da considerare quando si pianifica un test PIP-on-a-chip è il buffer di memorizzazione delle proteine. Se utilizzati ad alte concentrazioni, i singoli componenti (Agenti stabilizzanti, agenti riducenti, sali, agenti antimicrobici, reagenti chelanti, ecc. ) Possono influenzare l'integrità della fluorescenza e / o SLB. Pertanto, il buffer di memorizzazione dovrebbe essere titolato per verificarne l'effetto. Se si osserva un effetto, gli SLB dovrebbero anche essere equilibrati alle condizioni del buffer di memorizzazione prima di titolare la proteina per evitare una deriva nella fluorescenza. Considerando che questo è un test basato sulla modulazione del pH, se possibile, la proteina purificata dovrebbe contenere anche la stessa componente di buffering del buffer di esecuzione (in questo caso 20 mM HEPES a pH 7,0) per ridurre al minimo la deriva nella fluorescenza causata dalla mancata corrispondenza del tampone.
In conclusione, abbiamo dimostrato che il test di modulazione del pH può essere utilizzato con successo per studiare le interazioni proteine-PIP. Anche se l'enfasi è stata posta sui PIP, questa piattaforma può essere usata per testare le interazioni con sistemi membrana più complessi che includono altri lipidi fisiologicamente rilevanti come i fosfatidilieriNe, fosfatidiletanolammina, acido fosfatidico e colesterolo, tra gli altri 28 , 39 , 42 , 51 . Al di là delle proteine cellulari, questa piattaforma di analisi può anche essere utile per coloro che studiano patogeni umani. Ad esempio, le proteine codificate da virus e batteri hanno dimostrato di interagire con le membrane cellulari e alcune specificamente con PIPs 52 , 53 , 54 , 55 , 56 . Di conseguenza, il dosaggio PIP-on-a-chip può fornire un mezzo per scoprire e caratterizzare gli inibitori di piccole molecole di interazioni proteine-PIP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
DS e CEC sono stati sostenuti, in parte, dalla sovvenzione AI053531 (NIAID, NIH); SS e PSC sono stati sostenuti dalla sovvenzione N00014-14-1-0792 (ONR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip | |||
| Glass Coverslips: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544B | 22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass |
| 7X Cleaning Solution | MP Biomedicals | 976670 | Detergent |
| PYREX Crystallizing Dish | Corning | 3140-190 | Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700) |
| Sentry Xpress 2.0 | Paragon Industries | SC-2 | Kiln |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | |||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives |
| PYREX Desiccator | VWR | 89134-402 | Vacuum Rated |
| Biopsy punch | Harris | 15110-10 | Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device | |||
| Plasma Cleaning System | PlasmaEtch | PE25-JW | 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged) |
| Digital Hot Plate | Benchmark | H3760-H | Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640) |
| Frosted Micro Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mold | |||
| AutoCAD | Autodesk | v.2016 | Drafting software for the photomask design |
| Photomask | CAD/Art Services | N/A | Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services |
| Silicone Wafers | University Wafer | 1575 | Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness |
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | N/A | Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property |
| SU-8 Developer | MicroChem Corp. | N/A | Penn State Nanofabrication Facility Property |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SUV | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate | Avanti Polar Lipids | 840045X | PI4P |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046X | PI(4,5)P2 |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757C | POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE |
| Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) | ThermoFisher Scientific | L-20 | Required for the synthesis of oSRB-POPE |
| pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) | In-house | N/A | In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013) |
| Glass Scintillation Vial | VWR | 66022-065 | 20 mL volume capacity |
| Aquasonic 250D | VWR | N/A | Ultrasonic Water Bath |
| Nuclepore Track-Etched Membranes | Whatman | 110605 | Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich |
| Chloroform | VWR | CX1054-6 | HPLC grade |
| LIPEX Extruder | Transferra Nanosciences | T.001 | LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder |
| Viscotek 802 DLS | Malvern Instruments | N/A | Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data Analysis | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v.6 | Curve-fitting software for data analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Axiovert 200M Epifluorescence Microscope | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Microscope |
| AxioCam MRm Camera | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Camera |
| X-Cite 120 | Excelitas Technologies | N/A | Light Source |
| Alexa 568 Filter Set | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Ex/Em 576/603 nm |
| AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Image Processing Software |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other | |||
| Tips | VWR | 10034-132 | 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel |
| Tips | VWR | 53509-070 | 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel |
| Orion Star A321 pH meter | Thermo Scientific | STARA3210 | pH meter |
| Orion micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | micro pH probe |
| N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) | VWR | VWRB30487 | HEPES, Free Acid |
| Sodium Chloride | VWR | BDH8014-2.5KGR | NaCl |
| Tubing | Allied Wire & Cable | TFT-200-24 N | Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color |
| Nitrogen Gas - Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
| Oxygen Gas - Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
| Liquid Nitrogen | Praxair | N/A | Local Provider |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K.
- Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
- Lystad, A. H., Simonsen, A.
- Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
- Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
- Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
- Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
- Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34 (49), 16228-16234 (1995).
- Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
- Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
- Narayan, K., Lemmon, M. A.
- Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
- Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
- He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
- Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
- Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
- Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
- Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
- Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
- Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
- Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
- Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
- Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
- Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
- Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
- Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
- Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
- Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
- Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
- Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
- Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
- Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (12), 2806-2810 (1977).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
- Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
- Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
- Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
- Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
- Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
- Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
- Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1 (2013).
- Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
- Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
- Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
- Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
- Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
- Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
- Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
- Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
- Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
- Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
- Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
- Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
- Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
- Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
- Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).
