Summary
Semiflexible 폴리머 생명체가 광범위 하 게 적용 되는 독특한 기계적 속성을 표시 합니다. 그러나, biopolymers에 대 한 체계적인 연구는 폴리머 강성 같은 속성은 액세스할 수 없습니다 이후 제한 됩니다. 이 원고는이 제한 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브, 강성 필 라 멘 트의 영향에 대 한 실험 연구를 활성화 하 여 우회는 어떻게 설명 합니다.
Abstract
셀 또는 biopolymer 네트워크 같은 복잡 한, 폴리머 기반 부드러운 물질의 기계적 성질도 클래식 프레임 유연한 폴리머도 엄밀한 막대의 이해할 수 있습니다. 기본 필 지 속성 길이 (lp)를 통해 계량 되는 그들의 비 사라지는 백본 강성으로 뻗은 남아 있지만 그들은 또한 강한 열 변동 될 수 있습니다. 그들의 한정 된 굽 힘 강성 대량 네트워크, 큰 메시 크기를 제공 하면서 낮은 볼륨 분수에서 안정적인 장비의 형성을 활성화의 독특한, 특수 집단 역학 이끌어 낸다. 이 기본 원리는 (예를 들어, 셀 또는 조직), 자연에 널리 높은 분자 콘텐츠 및 따라서 퍼지는 촉진 또는 능동 이동 최소화. 그들의 생물 학적 영향 및 생체 hydrogels 잠재적인 기술 응용 프로그램, semiflexible 폴리머 상당한 연구 대상이 되었습니다. 그러나 그들은 자유롭게 조정 되지 않은 걸 필 라 멘 트 같은 천연 고분자에 의존 하는 때문에,, 이해할 수 있는 조사 도전 남아 있었다. 이러한 제한에도 불구 하 고 합성, 기계적으로 가변 및 semiflexible 폴리머의 부족, 말라 필 라 멘 트 일반적인 모델 시스템으로 설립 되었다. 주요 제한은 중앙 수량 lp 자유롭게 거시적인 대량 구조에 미치는 영향을 연구 조정 될 수 없습니다입니다. 이 한계는 강성 필 라 멘 트의 제어 변경 수 있도록 구조적 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브를 채용 하 여 해결 되었습니다. 그들은 부분적으로 보완 가닥의 개별 세트 개별 둘레와 반지 구조에서 교배 타일 기반 디자인을 통해 형성 된다. 이 고리 사용 필 라 멘 트에 효과적인 중 합 길이, 여러 미크론 끈끈한 끝 있으며 자연 biopolymers로 비슷한 중 합 속도 론을 표시 합니다. 그들의 프로그래밍 가능한 역학 때문이 튜브는 단일 분자 대량 규모에 lp 의 영향을 공부 다재 다능 한, 소설 도구입니다. 말라 필 라 멘 트, 달리 그들은 주 동안에, 주목할 만한 변성 없이 안정적으로 유지 하 고 그들의 처리는 comparably 간단.
Introduction
그들의 독특한 기계적 성질으로 사용 복잡 한 동작으로 인해 semiflexible 폴리머는 생활 문제의 근본적인 빌딩 블록. 유연한 고분자, 달리 semiflexible 폴리머 여전히 강한 열 변동1에 따라 하면서 자신의 비 사라지는 백본 강성 때문 뻗은 구성 채택. 따라서, 순전히 확률적 모델은 완벽 하 게 유연 하거나 딱딱한 폴리머의 극치와 마찬가지로 그들의 행동에 적용할 수 없습니다. 소위 벌레 같은 체인 모델2,,34 p l통해이 강성 필 라 멘 트4따라 접선 탄젠트 상관 관계의 붕괴 상수는 척도를 개발 되었다. Lp 는 윤곽선 길이 (lc)는 필 라 멘 트의 비교, 폴리머 semiflexible1를 간주 됩니다. 텐트의 기둥에 유사한, 그들의 준비 네트워크 또는 번들 안정화 낮은 볼륨 분수, 특이 한 점 탄성 속성5,6,7, 선도에서 전체 집단 시스템 8,9. 이러한 구조는 높은 신축성 대형 메쉬 크기10, 아직도 퍼지는 촉진 및 활성 전송 프로세스 동안 기계적 무결성을 유지 제공 합니다. 이 속성은 특히 골격 또는 기질, 생물 학적 시스템에 적합 하지만 그것은 식품 공학1,,1112에서 또한 널리 이용 된다.
생활 문제에 그들의 의미를 넘어가 고, 포괄적으로 생체 모방 재료 또는 소설 hydrogels 개발 도구 순서 이러한 구조체의 물성을 검토 하 결정적 이다. Semiflexible 폴리머의 관점에서이 단일 필 라 멘 트 속성 lp 설명 이론적 프레임 워크의 개발 등에서 발생 하는 네트워크의 집단 속성의 체계적인 결정을 의미 합니다. 선구적인 연구에서 세포 biopolymer 말라 semiflexible 고분자를 위한 모델 시스템으로 설립 되었다와 금5,13,,1415 에 아직도 널리 것으로 간주 됩니다. , 16 , 그러나 17., 철저 한 연구는이 시스템 제한 때문에 그들은이 단백질의 고유한 속성에 바인딩됩니다. 다양 한 이론적 접근 건물 단일 필 라 멘 트 수준에서 특수 기계 동작의 설명 목적으로 그리고 특히 다른 배율 예측에 의존에 대 한 선형 탄성 고원 전단 탄성 계수, G의 지도 0 (즉, 네트워크의 "신축성"), 농도 (c) 및 lp6,7,,1314, 15,18,19,20,21,,2223. 농도 스케일링은 걸 기반으로 실험 또는 다른 모델 시스템에 쉽게 액세스할 수 있으며 이론적인 예측을 엄격 하 게 되었습니다 확인13,,1624, 25, 실험적으로 접근 하기 어려운 남아 있다 lp 에 관하여 스케일링. 그러나 Lp 은 semiflexible 고분자의 정의 수량은 독립 변수 이기도 때문이,, 주요 한계입니다.
이 중앙, 자연 제한 걸의 고정된 lp 또는 콜라겐 같은 다른 생물학으로 파생 된 중합체에 의해 부과 된 최근 타일 기반 DNA 튜브, 그들의 기계적 성질에 가변을 사용 하 여 해결 되었습니다. 9 , 26 , 27 , 28. (단위 링 내 가닥 구성 DNA의예를 들어, 서로 다른 숫자) 튜브의 아키텍처에 약간의 변화가 항복 lp, 형광 현미경 검사 법을 통해 평가 될 수 있는 고유 값 한 변동 튜브를 분석 하거나 여러 준수 튜브의 곡선된 구성을 평가 하 여,와 같이 설명한 이전9,28. 이러한 분석을 다른 튜브 인구의 lp 값 이상의 크기 순서에 따라 달라 지는 다른 평가 기술을 일관 된 결과9,28항복 공개 했다.
놀랍게도, 농도 및 lp 선형 탄성 고원 전단 계수 G0 의 전반적인 비율 보고 되었습니다 모든 이전 이론적 접근와 일치 하도록 9, 특히 훨씬 시연 시 lp예측된 의존 보다 강한. 이러한 연구 결과 semiflexible 폴리머의 중앙 속성을 공부 하는 새로운 모델 시스템의 가치를 강조 한다. N채용-헬릭스 DNA 튜브 극적으로 이러한 조사의 범위를 높 혔 습니다. 수 lp 기본 재료를 변경 하지 않고 자유롭게 변화 될 뿐만 아니라 DNA의 고유한 프로그래밍 가능한 특성 추가 요소, crosslinks 등 운동 스위칭 프로세스의 체계적인 검사를 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 튜브 물에 용 해 되며, 대부분의 단백질 달리 적절 한 pH와 이온 조건 감지 저하9없이 몇 주 동안 안정.
이러한 튜브 조립 DNA oligonucleotides의 개별 집합은 사용 되, 각각 포함 된 2 개의 이웃 물가를 보완 기본 시퀀스를 공유 하는 두 개의 도메인 (특정 시퀀스 때문에 한 가닥 형성할 수 없습니다 머리 핀 같은 구조). 상호 보완적인 시퀀스 교배 n 상호 더블 헬리컬 세그먼트의 동봉, 반 겹치는 반지를 형성, 순환 방식에서 (그림 1A 및 B). 개별 직경 (그림 1C), 및 그들의 반 중복 구성에서이 고리 형태로 축 끈끈한 끝 다른 링의 끈끈한 끝에 무료 제공합니다. 이 선택적 추가 oligonucleotides 일치의 크기 n (nHT)의 filamentous DNA 나선 관의 효과적인 중 합으로 이어지는 반지의 스태킹 트리거합니다. 그들의 윤곽선 길이 일반적으로 길이, 여러 미크론을 측정 하 고 그들의 길이 분포는 걸 필 라 멘 트9,26,,2728의 비교. 그것은 표시 되었습니다 유사한 DNA 나노튜브에 대 한 그들은 실제로 비슷한 걸 필 라 멘 트 및 microtubules의 중 합 속도 론을 전시
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Protocol
1. n HTs의 준비
참고: 여기, n 다른 단일 DNA 가닥을 특정 크기의 나선 관의 형성에 관여의 수를 나타냅니다. N = 8, 8 개의 다른 단일 DNA 가닥 단위 링 메이크업.
- 구매 DNA 시퀀스 (HPLC 순도 등급 이상) 적당 한 DNA 합성에서 서비스 또는 높은-품질 합성 및 정화 (모범적인 시퀀스를 표 1에 주어진).
- 정화 물에 따라 더 물의 resuspension resuspend 동결 건조 된 oligonucleotides 단계는 회사에서 해당 설명서에 주어진. 200 µ M의 최종 농도 얻을 수의 양을 조절. 배포자에 의해 주어진 값을 확인 하 긴
- 단일 DNA의 농도 결정 (예: 260에 대 한 UV 분광학을 통해 nm) 이기 때문에 정확한 산출할 어셈블리 프로세스에 대 한 중요 한. 특정 어 금 니 무게 및 각 단일 가닥 DNA oligonucleotide에 대 한 소멸 계수 oligonucleotides의 농도 계산.
참고: 소멸 계수 값 본질적으로 다를 다른 시퀀스에 대 한 및 상업적으로 구입한 DNA의 설명서에서 진술 된다. 그들은 또한 가까운 이웃 모델 수 자유롭게 사용할 수 있는 온라인 도구를 사용 하 여 계산할 수 있습니다. 분석기의 선형 범위를 준수 농도 결정을 위해 사용 하는 샘플을 희석 하십시오. - Micropipette를 사용 하 여 혼합 DNA 가닥-각 농도에서 동시에 원하는 n HTs를 thermocycler (예를 들어, 200 µ L PCR 튜브)에 대 한 적합 한 컨테이너 (최종 버퍼 조건: 1xTE (10 mM Tris 및 1 m m EDTA, pH 8) 및 12.5 m m MgCl 2).
참고: 최종 DNA n HT 샘플 구성 n-1 가닥, U 1 − U n − 1, 고 1 T n 가닥. 스트랜드 당 농도 사용자의 요구에 따라 하위-micromolar 이상 10 µ M에서 다를 수 있습니다 (예를 들어, < 단일 필 라 멘 트를 관찰 하는 후속 희석에 대 한 가닥 또는 높은 농도의 시험에 대 한 당 1 µ m 조밀한 네트워크 역학). - 교배 n HTs thermocycler (65 ° c 이후 빠른 드롭과 90 ° C에서 10 분 변성, 느린 온도 65 ° C에서 30 분-0.5 K의 20 온도 단계에서 보완 기본 페어링으로 55 ° C 감소에 각; 그리고 한 빠른 방울 55 ° C에서 20 ° C); 그림 2A 참조.
참고: 65 ° C에서 느린 감소 단계 평균 튜브 길이; 증가를 길게 할 수 있습니다. 그러나, 20 ° C에 이후 빠른 드롭 생산 튜브의 집계를 피하기 위해 중요 하다. - 감지 저하 없이 4 ° C에서 최대 3 주 동안 교배 n HTs 저장.
참고: 형광에 대 한 현미경 검사 법, n HTs 표시 됩니다 때 교배 (부분적으로) 수정된 U1 Cy3 (표 1)와 u 1을 대체 하 여. 더 이상 관찰 시간, 설립된 안티 표백 에이전트의 추가 것이 좋습니다. - 신중 하 게 원하는 최종 농도에 샘플을 희석 (예를 들어, 4 네트워크 또는 20 µ M 단일 필 라 멘 트 관측에 대 한 nM) 필요한 경우 샘플 버퍼를 사용 하 여. 가능한 오류 소스를 최소화 하기 위해 원하는 최종 농도에서 샘플 조립.
2. 전단 유동 학
동적 전단 고분자에 대 한- 선택 적절 한 형상 (-격판덮개 또는 콘 판). 콘 판 기하학을 사용 하는 작은 볼륨 (즉, 아래 200 µ L).
- 동적 전단 고분자에 샘플 로드.
- 잠재적인 증발 효과 방지 하기 위해 다음 단계를 사용 하 여 환경과 샘플의 공기-물 인터페이스 passivate.
- 샘플 버퍼 목욕의 2.5 mL과 샘플을 둘러싸고.
- Micelle 농도 바로 아래 계면 활성 제를 추가.
- 해밀턴 주사기를 사용 하 여 공기 샘플의 직접 접촉을 피하기 위해 지질으로 샘플을 둘러싸고.
- 젖은 스폰지를 갖춘 모자와 함께 샘플 챔버를 봉인 하 고, 만약에 가능 하다 면, 추가 (샘플) 접촉 하지 추가 물 목욕과 증발을 억제.
- 실내 온도에서 고분자 관련 소프트웨어를 사용 하 여 측정을 시작, (해당 되는 경우 생리 조건 필요) 또는 37 ° C와 같은 서로 다른 온도에서 측정을 수행.
참고: 샘플을 냉각은 종종 함께 수증기의 응축 주변 공기에서 난방 리드 향상 된 증발 하는 동안 합니다. 두 효과 미친 듯이 샘플의 농도 시리즈에서 모든 측정은 일정 한 온도에서 수행 되어야 한다 변경할 수 있습니다. - 실 온에서 2 h equilibrate을 샘플을 수 있습니다. 시간 진화 시간 청소와 모니터링할 수 있습니다 (데이터 분당 지점, 스트레인 γ = 5%; 주파수 f = 1 Hz).
- 원하는 테스트 프로토콜 기계적 특성을 측정합니다. 주파수 스위프의 시리즈와 함께 시작 (f-스윕) 그들은 샘플 그대로 두고 더 많은 측정에 대 한 허용 하기 때문에.
참고: 또한, 짧은 f-더 이상 측정 전후 청소 밖으로 실행 되어야 한다 (긴 f 등-훨씬 더 높은 해상도와 스윕) 샘플 전체 측정 프로토콜에 걸쳐 변동 확인 하. - 수행 짧은
- f-스윕 (예를 들어, γ = 5%; f = 0.01 Hz 30 hz; 10 년 당 5 데이터 포인트).
- 수행 긴 f-스윕 (예를 들어, γ = 5%; f = 0.001 Hz 30 hz; 21 데이터 요소 10 년 당); 측정 시간을 줄이기 위해 필요 하지 않은 경우 낮은 주파수 정권을 생략할 수 있습니다.
- 짧은 f를 수행-스윕.
- Γ-스위프를 실행 (예: f = 1 Hz; γ = 0.0125% ~ 100%; 10 년 당 20 데이터 포인트).
참고: 사용 짧은 f-청소 처음, 그것은 일반적으로 이전 f 일치-스윕 네트워크는 일반적으로 γ-스윕 동안 파열 또는 격판덮개에서 분리 하기 때문에. 또는, γ-램프를 사용 하 여 (예: 0.025 s -1, t = = 60 s); 그러나, 경사로 일반적으로 변경할 필요가 모터 모드, 그래서 이후 짧은 f-스윕 위조한 것.
3. 형광 기반 분석의 DNA 어 닐 링
- 12의 준비 8 aliquots µ L 1-4 µ M를 사용 하 여 각 샘플에 대 한 DNA 가닥, TE 버퍼, x 12.5 m m 1에서 MgCl 2 및 1 핵 산 젤 x 10000 x DMSO에서 얼룩 주식입니다. 없는 DNA와 부정적인 제어 하지만 핵 산 젤 얼룩을 포함.
- 실시간 PCR 플레이트에는 aliquots를 전송 하 고 접착 필름 (예를 들어, 96-잘 반응 플레이트)와 함께 인감.
참고: 프로토콜을 어 닐 링 열에 사용 된 높은 온도 샘플 증발 됩니다. 따라서, 우물은 특히 장기 실험 중 물 증발 및 농도 증가 방지 하기 위해 접착 필름으로 단단히 밀폐 된 있는지 확인 하십시오. - 가스 거품 제거를 실 온에서 1 분 x 100g에 격판덮개 원심; 가스 거품 확장, 우물 분석 될 수 없습니다.
- 실시간 정량 PCR 시스템으로 밀폐 접시 로드.
- 어 닐 링 프로그램을 실행합니다. 10 분 드롭 빨리 72 ° c.에 온도 90 ° C에서 DNA를 변성 다음, 0.5 ° C 마다 30 분으로 천천히 온도 감소. 후에 신호는 부식 가속 온도 램프.
참고: 72 ° C는 진짜 교 잡 온도; 위에 충분히 따라서, 신호는 광범위 한 온도 범위는 필요한 온도 범위를 결정 하기 위한 적합 한 기록. - 는 cycler 뚜껑 접착 필름에 증발된 샘플의 응축을 방지 하기 위해 100 ° c 이상가 열이 있는지 확인 하십시오.
- 488에서 아르곤 이온 레이저 샘플 어셈블리, 동안 자극 nm 550에서 형광을 검출 하 고 nm 핵 산 젤 얼룩을 사용 하는 경우 (또는 괴기 하 게 비슷한). 다른 염료에 대 한 적절 한 여기/방출 조합을 선택 합니다. 전체 증가를 가능한 한 자주 형광 신호를 측정 내장 카메라를 사용 하 여 신호 품질.
참고: 여기, 측정 모든 9 찍은 s. - 미리 용 해 및 어 닐 링 프로그램 적용 하는 경우 데이터를 분석 하는 제공 된 소프트웨어를 사용 합니다. 그렇지 않으면, 형광 신호의 상대적인 변화를 각 온도 단계에 대 한 평균 값에서 이전 평균 값 빼기.
4. AFM 이미징
- 쪼개 운 모 (예: 운 모 " V1 ") 상용 접착 테이프를 부착 하 고 벗; 여는 운의 최고 층을 제거 해야 합니다.
- 미리 형성 된 n HT Mg 2 + 갓 쪼개진된 운 모에 접는 버퍼를 포함 하 고 10 분에 대 한 정착 보증금 micropipette를 사용 하 여
- 남은 액체를 제거 하는 작은 테이블 원심 분리기에 2000 x g 3-s 짧은 간격에서 샘플을 회전 합니다. 여러 n HTs 여전히 운 모 표면에 붙어 있어야 한다.
- 외팔보 팁 높은 뻣 뻣 함 (예: 54 Nm -1) 사용 하 고 내부 AFM 소프트웨어와 함께 그것의 공명 주파수 결정.
- 기록 모드 손상 또는 n HTs.를 전치 하지 않으려면 낮은 스캔 속도 (예를 들어, 1 선/s)에서 도청에서 공기에 afm 높이 프로 파일
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Representative Results
온도 경사로 (그림 2)를 통해 DNA 나노튜브의 어셈블리 이러한 인공 semiflexible 폴리머를 형성 하는 매우 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이러한 고분자 걸 필 라 멘 트, 등 그들의 자연적 사건 대응에 유사한 특성을가지고 있지만 훨씬 광범위 한 실험 프레임 워크를 그들의 기계적 특성은 controllably 될 수 있으므로 변경9,27 제공 . Biopolymers, 처럼 그들은 네트워크 (그림 3)에서 배열 될 수 있다 고 특히 대량 구조 및 속성에 필 라 멘 트 경직성의 영향을 테스트 할 수 있습니다. 그림 4에서 같이, 이러한 네트워크 표시 긴장에 대 한 선형 긴장 정권 최대 10%, 밀접 하 게 말라 필 라 멘 트의 네트워크의 특성을 닮는. 이 정권 내에서 선형 전단 유동 학 적용할 수 있습니다 쉽게, 예를 들어, 서로 다른 주파수9조사 DNA 나노튜브 네트워크의 탄성 및 점성 응답을 확인 하려면. 이 테스트는 이러한 네트워크는 주로 탄력적 행동 계시 (그림 5). 단백질 측정, 달리이 튜브 샘플의 공기-물 인터페이스에서 변성 하지 않습니다 및 따라서, 패 시 베이 션 전략은 정교한 필요 (그림 6). 따라서, 샘플의 처리는 오히려 간단 하 고 낮은 샘플--예제 유사와 일관 된 결과, 매우 강력한을 입증 하고있다.
그러나, 여부 무료 "끈끈한 끝" 짝이 없는 단일 가닥 DNA 각 관의 양 끝의 질문 이벤트 남아 원치 않는, 확률적 교 잡을 유도할 수 있다. 이 문제를 해결 하려면 보완 "모자 끝" 시퀀스는 튜브의 끝을 덮고 교 잡 과정 완료 후이 샘플에 추가 되었습니다. 그러나, 그림 7 에서는 보여 줍니다 그는 필 라 멘 트의 끝 상한 영향이 없습니다 감지 튜브 끝9네트워크 모든 임시 가교 효과 유도 하지 마십시오. 이벤트를 고집만 중요 한 역할 때 샘플 너무 약 처리 하 고 튜브 가혹한 pipetting으로 휴식. 이러한 파손 포인트 실제로 스트레인 스티프닝 (그림 8)과 같이 시스템의 비선형 응답 선도 가교 효과 유도 하기 위해 나타납니다.
샘플 신중 하 게 준비 하 고, 만약 그들이 사용할 수 있는 필 라 멘 트 농도 (그림 9A) 또는 필 라 멘 트 강성 (그림 9B)9 의 구성 된 네트워크의 기계적 성질에 미치는 영향을 테스트 하 semiflexible 폴리머입니다. 처음으로 필 라 멘 트 강성 및 탄성 네트워크 사이의 양적 연결 연구 했다 실험적으로 그리고 체계적으로, 주된 이론적 예측을 모순 되는 선형 전원 법 행동, 저조한. 이러한 결과 DNA 나노튜브는 실험적으로 액세스할 수 없는 이전9,27했다 semiflexible 폴리머의 효과 공부 하는 새로운, 다양 한 도구를 보여 줍니다. 이제, 다양 한 이론은 테스트할 수 있습니다 실험적으로,는 필 라 멘 트의 지 속성 길이 lp 에 대 한 종속성에 대 한 설명을 포함. 또한, (그림 10), reptation 등 아주 근본적인 효과 다양 한 관점에서 강성에서 변화 하는 튜브를 채용 하 여 조사 수 있습니다.
| 이름 | 시퀀스 | ||
| U1: a1 *-b1 *-a2-b2 | GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U1-Cy3: a1 *-b1 *-a2-b2 | Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U2: a2 *-b2 *-a3-b3 | GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT | ||
| U3: a3 *-b3 *-a4-b4 | GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT | ||
| U4: a4 *-b4 *-a5-b5 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT | ||
| U5: a5 *-b5 *-a6-b6 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT | ||
| U6: a6 *-b6 *-a7-b7 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG | ||
| U7: a7 *-b7 *-a8-b8 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA | ||
| U8: a8 *-b8 *-a9-b9 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA | ||
| U9: a9 *-b9 *-a10-b10 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC | ||
| U10: a10 *-b10 *-a11-b11 | TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT | ||
| U11: a11 *-b11 *-a12-b12 | AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA | ||
| U12: a12 *-b12 *-a13-b13 | ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA | ||
| U13: a13 *-b13 *-a14-나사 b14 | GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC | ||
| T4: a4 *-b4 *-a1-b1 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T5: a5 *-b5 *-a1-b1 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T6: a6 *-b6 *-a1-b1 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T7: a7 *-b7 *-a1-b1 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T8: a8 *-b8 *-a1-b1 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T9: a8 *-b8 *-a1-b1 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T10: a10 *-b10 *-a1-b1 | GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T14: a14 *-나사 b14 *-a1-b1 | TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| 엔드 캡 A1 | CCTAATCGCC | ||
| 엔드 캡 A2 | CCTTTAGATCC | ||
| 엔드 캡 A3 | CCACTCTTCC | ||
| 끝 단면 A4 | CCGTGAGAACC | ||
| 엔드 캡 A5 | CCGCACGACC | ||
| 엔드 캡 A6 | CCAACGATGCC | ||
| 엔드 캡 A7 | ATGCACCTCC | ||
| 엔드 캡 A8 | AACGGTAACTA | ||
| 엔드 캡 B1 * | ACGCTAAGCCA | ||
| 엔드 캡 B2 * | ACCAGATACA | ||
| 엔드 캡 b 3 * | ACAAGATGTCA | ||
| 엔드 캡 b 4 * | ACGCATTGCA | ||
| 엔드 캡 b 5 * | ACTGTCGAACA | ||
| 엔드 캡 b 6 * | ACTTCTATCA | ||
| 엔드 캡 B7 * | CATTCAAAGCT | ||
| 엔드 캡 B8 * | TCCCAAGTCA | ||
표 1: DNA의 예 nHTs에 표시의 교 잡에 대 한 시퀀스 그림 1 c는 또한 nHTs9, 에 이전 학문에서 사용 되었다 클래스 = "외부 참조" > 26,27,28. 시퀀스의 주어진된 세트 7 다른 튜브 아키텍처 (예: a 1와 상호 보완적인 시퀀스 a1 * hybridizes)의 어셈블리에 대 한 수 있습니다. 여기 주지 다른 튜브 아키텍처 또한 더하기 또는 빼기 가닥 가닥 n U1의 일치 cyclization를 동반의 의해 형성 될 수 있습니다.
그림 1: 튜브 어셈블리 및 건축. (A) 회로도 4HT 어셈블리의 4 가지 42-mers의 형성. 인접 한 단일 가닥 DNA 물가의 10-11, 긴 검은 틱 (짧은 검은 틱 표시 unhybridized 기지)에 표시 된 연속 대체 도메인 통해 교배. 이 반 정열 모티브는 축 따라 양쪽에 끈끈한 끝 기능, 화살표 표시 축 성장 수 있도록. 경계 가닥 u 1와 t 4 무료 도메인 기능 하 고 따라서 오른쪽 화살표에 표시 된 대로 닫히는 반지를 형성 한다. 참고가이 스케치는 2D 표현; 교배 시킨된 상태에서 가닥이 이중 나선 형성 하 고 모든 기초 쌍. (B) 와 2 개의 이중 나선 4HT tetramer의 준 3D 회로도 음영된 먼 계층에 덮여. 이중 나선 무료 도메인에 대 한 고 단위 길이 요소 마다 한 번 튜브의 두 인접 한 이중 나선에 연결. 1 u 2 가닥 두꺼운 지혜로 움에 대해 그려집니다. (C) 7 다른 튜브 아키텍처의 예제는 주어진, 스트랜드 숫자 4에서와 14 HT 및 lp 26 µ m. 1.2에서 배열 하는 HT (D 와 E) 피 형광 이미지 Cy3 레이블이의 흡착 5 HT 그리고 10 HT 다르게 곡선된 윤곽을 통해 다른 stiffnesses 설명. 빨간색 오버레이 필 라 멘 트 컨투어 엔드-투-엔드 거리 R와 윤곽선 길이 lC이미지 분석을 통해 발견. 그림 Schuldt 외9에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 온도 램프 및 DNA 나노튜브의 해당 어셈블리. (A) DNA 나노튜브 조립 한 thermocycler에 여러 가지 온도 단계에 대략 11 h. (B) 실시간 정량 PCR 시스템 스테인드 가닥의 형광 신호의 상대적인 변화를 포함 하는 프로토콜을 통해 새로 형성된 된 이중 가닥 DNA에 대 한 온도 경사로 통해가 동안. DNA 나노튜브의 종류에 따라 어셈블리 속도 달라질 수 있습니다. 더 복잡 한 구조, 아마도 더 많은 가닥부터 광범위 한 어셈블리 (및 그러므로 더 고유한 시퀀스와 현지 어 닐 링 온도 세그먼트) 형성 과정에 의해 구동 되는 적절 한 위치에 교배 필요가 확률적 열 변동입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 4 µ M에 8HTs의 얽혀 네트워크의 대표 AFM 이미지. 8HTs 운 모 표면에 흡수의 미리 형성한 네트워크의 높이 프로 파일 공기에서 태핑 모드를 사용 하 여 기록 했다. AFM 이미지 시각화는 네트워크의 2D 투영 하지만 네트워크 뿐 아니라 튜브는 2D 구성에서 압축 이후 3D 사건에 대 한 데이터 (예: 메쉬 크기)의 신뢰할 수 있는 추출에 대 한 허용 하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 선형 범위. 스트레인 측정 (G' = 1 Hz)는 광범위 한 선형 탄성 고원, 가교 효과 변형 경화로 낸 비 선형 동작 등의 표시 없이 공개. 특성 스트레인 (다른 각 nHT), 위 고원 탄성 계수는 돌이킬 휴식. 오차 막대 각 모든 수행된 측정의 평균 값의 표준 편차를 나타냅니다. 그림 Schuldt 외9에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 전형적인 주파수 의존 얽혀 6HT 네트워크의. DNA 튜브의 네트워크 이상 4 개의 크기 순서, 적용된 주파수에 따라 넓은 탄성 고원을 표시합니다. 폴리머 네트워크, 탄력 있는 부분에 대 한 예상 대로 (G') 복잡 한 전단의 계수는 점성 부분 보다 훨씬 더 높은 (G'). 그림 Schuldt 외9에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 공기 액체 인터페이스 효과 없음. 주파수 스위프 (f-스윕, γ = 5%) 8HT의 샘플 8 µ M에서 공기-물 인터페이스에서 증발 및 겔 화 효과의 영향을 무시할 수 있습니다 밝혀. 단백질 (계면 활성 제, 지질), 인터페이스에 클러스터링을 획기적으로 줄일 것으로 알려져 두 가지 방법으로 다른 평형 시간 사용 되었다. 방법의 독립, 증발 또는 표면 탄성에 의해 크게 영향의 표시는 기록 되었다. 여기, G' 탄성 계수 G를 나타냅니다 ' 점성 계수 (점선)을 나타냅니다. 그림 Schuldt 외9에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 최종 수정의 아무런 영향을 미치지 않습니다. 그들의 각각 보완 시퀀스와 8HTs의 스티커 무료 끝 상한 때 고원 탄성 계수 상수 남아 있습니다. 그림 Schuldt 외9에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 미리 형성 된 DNA의 처리 절차의 영향 측정에 네트워크. 미리 형성한 네트워크는 어떻게 교 잡 후 처리에 따라 측정이 달라질 수 있습니다. 이 예제에서는 DNA 나노튜브의 pipetting 동안 전단 흐름을 획기적으로 변화 되었다, 그리고 튜브 파산 너무 약 처리 하는 경우. 노출, 부서 지거나 파열 세그먼트는 탄성에 증가 이끌어 내 고 비 선형 효과 유도, 상호 보완 단일 가닥 파손 간의 상호 작용을 원치 않는 리드 such 스트레인 (큰 종자, 녹색 곡선에 대 한 탄력의 증가)를 강화 하는으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: DNA 나노튜브 lp 종속성의 연구를 사용합니다. (A) 의 증가 농도 (농도 스윕), 연구 기반 biopolymers 걸 같은 유사 시스템의 기계적 응답 조사 수 nHTs와 semiflexible 고분자 네트워크를 공부 하 고. (B) 또한, 튜브의 다른 아키텍처 촉진 기본 필 라 멘 트의 다양 한 lp 에 관하여 기계적 응답의 결정은 자연스럽 게 발생 가능 semiflexible 폴리머입니다. 이 위해 A 에서 데이터는 lp에 관하여 고원 탄성 계수의 확장을 해결 하기 위해 합니다. 오차 막대 각 모든 수행된 측정의 평균 값의 표준 편차를 나타냅니다. 그림 Schuldt 외9에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10: Reptation 및 메쉬 크기. Reptating 필 라 멘 트 (단일 레이블 DNA 8HT 레이블 없는 네트워크;에 포함 된의 녹음 형광 이미지 c = 14 µ M) 네트워크에 필 라 멘 트의 얽혀 특성을 확인 하는 데 사용할 수 있습니다. 어떤 가교 효과 1 차원 확산이 방해 것 이다. 삽입: 걸 측정을 잘 비교 하 고 이론적인 예측30동의 농도, 스케일링 메쉬 크기를 결정 하는 Reptation 분석을 사용할 수 있습니다. 오차 막대 각 모든 수행된 측정의 평균 값의 표준 편차를 나타냅니다. 그림 Schuldt 외9에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
제대로 구성 된 네트워크를, DNA 나노튜브 조립은 중요 한 단계 이다. 합성 과정에서 오류 저하 튜브 품질; 따라서, HPLC 또는 더 엄격한 프로세스는 oligonucleotides 정화를 사용할 것이 좋습니다. 집합에서 n 구성 oligonucleotides의 아데닌 산출할 집계 DNA 나노튜브, 뿐만 아니라 그들의 길이 분포 보다 이산의 형성에 의하여 달려 있다, 이후 그것은 농도 측정 하는 데 필요한 구입한 가닥의 이후 값 주어진 수 다 실질적으로 실제 농도에서. 이 수행할 수 있습니다, 예를 들어, 260의 흡 광도 파장에서 자외선에 대 한 분광학에 의해 nm. 분자 무게와 소멸 계수; 다른 시퀀스 사이 다 참고 하 고 싶습니다. 따라서, 농도에 흡 광도 변환할 값 각 DNA oligonucleotide에 대 한 결정 되어야 합니다. 장비는 NanoDrop 같은 작은 샘플 볼륨에 대 한 최적화를 사용 하는 경우 각 측정 지점은 여러 번 촬영 한 평균 해야 합니다. 탐지는 분석기의 선형 범위를 준수 합니다. 필요한 경우 농도 결정을 위해 사용 되는 분수를 희석. 약간의 부정확 올바른 산출할 관 형성;의 품질에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 단일 가닥의 pipetting 최대한 정확 해야 합니다. 그 후, 최종 샘플 솔루션 천천히 아래로 thermocycler에 그것을 배치 하기 전에 샘플을 pipetting으로 철저 하 게 혼합 수 한다. 직접적인 빛, 그리고의 설립된 안티 표백 에이전트 (즉, 산소와 같은 시스템, 청소는 나중에 또한에서 차폐 된 환경에서 모든 단계를 수행 해야 가닥 시각화를 위한 형광 염료와 수정 되지 않았으면, 포도 당 산화 효소/catalase) 것이 좋습니다. 단일 가닥 오른쪽 버퍼 조건에 혼합 되어있다, 온도 램프 구조 (그림 2A)을 교배에 적용 됩니다. 이 온도 패턴 이전 결정된 중요 한 교 잡 온도를, 어디는 DNA 이중 나선 형태는 다음과 같습니다. DNA 교 잡 반응 (즉, 기본 DNA UV 흡 광도31, 열 량32또는 형광 염료33) 분석을 여러 가지 방법이 개발 되었습니다. 후자의 방법에서 염료 언바운드 염료 보다 밝은 높은 형광 복합물을 형성 하는 DNA 이중 나선에 intercalate. 그들은 부분적으로 단일 가닥 DNA34하지만 더블-좌초에 바인딩합니다. 따라서, 이러한 염료 시스템35 에서 자기 조립 DNA nanostructure 모니터링에 적용 된 고 이상적인 조립 상태를 식별 하는 데 수 있습니다.
처음에, 미리 정의 된, unpredicted duplexes 같은 샘플 내에서 어떤 이중 가닥 DNA는 의도 하지 않은 기본 쌍을 피하기 위해 높은 온도 (90 ° C)에서 변성. 온도 ( 그림 2A와 유사한) 후속 점진적 감소 기본 껍질 벗기기 이벤트를 사용 하는 DNA 물가의 열 동작을 줄일 수 있습니다. 자유 에너지의 최소화로 인해 DNA 물가 우선적으로 그들의 상호 보완적인 시퀀스에서 교배. DsDNA 전용 intercalating 염료를 적용 하면 밝기는 새로 형성된 된 이중 가닥 DNA34에 대 한 정량적 측정에 높은 형광 단지의 형성으로 증가 합니다. 4HTs 및 8HTs의 형성에 대 한 형광 신호의 상대적 변화는 그림 2B에서 플롯 됩니다. 이 상대적인 변화 각 온도 대 한 형광 강도 평균 하 고 그 후 이전 온도의 평균 값을 빼서 계산 합니다. 온도 감소, 높은 형광 수 있습니다 (그림 2B), 감지 하 고이 곡선의 최대 하이라이트 대규모 교 잡 이벤트가 발생 하는 온도. 곡선의 드롭 고원에 도달 강도 값을 말합니다. DNA 구조와 그 복잡성 (예를 들어, 소형 또는 대형 된 DNA 가닥)에 따라 피크 샤 프 (그림 2B, 블루 곡선) 또는 확장 (그림 2B, 녹색 곡선) 수 있습니다. 가능 하면이 교배 dsDNA 세그먼트의 형성을 통해 튜브의 형성 발생 범위 온도 램프의 점차적으로 감소 부분에 포함 되어 있는지 확인을 모든 새로 설계 된 구조에 대 한 시험 되어야 한다. 적절 한 온도 후 정권 nanostructures 성공적으로 매우 좁은 온도 범위 (그림 2B, 파란색 곡선), 또는 심지어 설치가35에서 조립 될 수 있다 결정 됩니다. 정기적인 격자에서 여러 DNA의 교 잡 긴는 협력 어 닐 링 효과35,36, 더 DNA 어 닐 링 지원 유도 합니다. 그것은 intercalating 염료 나선형 회전 구성, 따라서 튜브의 전체 형상을 변경 당 그들의 표준 10.5 자료 쌍 넘어 DNA 나선을 기지개 할 것을 고려해 야 합니다. 따라서, 900 DNA 기본적인 쌍35당 한 분자 이상의 염료 농도를 권장 하지 않습니다. 또한, 피크 어셈블리 온도 실제 최적의 어 닐 링 온도에서 이탈 될 수 있습니다. 높은 정밀도 달성 하 고 관 형성에 대 한 최상의 조건을 결정 하, DNA 교 잡 단계 많은 천천히 변화 온도, agarose 젤 전기 이동 법으로 이중 확인 해야 조사 한다. DNA 나노튜브의 경우, 우리는 3 단계 프로토콜을 설립. 첫째, 샘플으로 단일 가닥 DNA를 변성을 90 ° C에가 열 된다. 그 후, 광범위 한 온도 범위 (형광 신호의 어셈블리 피크)의 주위에 적용 됩니다. 우리의 경우에, 10 ° C의 범위까지 65 ° C에서 55 ° C,-0.5 ° C의 단계 마다 30 분 적용 됩니다. 마지막 단계에서 온도 빠르게 드롭 해야한다 또는, 우리의 경우, 20 ° C--실내 온도에 중간 온도 (그림 2A)에서 어떤 불리 한 상호 작용을 방지 하기 위해. 일반적으로, thermocyclers는 추운 온도에서 샘플을 열. 따라서, 어셈블리, 최종 샘플 농도 증가 하는 동안 샘플에 액체의 증발을 제한 하는 뚜껑의 온도 조절에 중요 하다.
경우 nHTs 적절 하 게 형성 된다, 그들은 별개 튜브 사이의 가교 효과 일으키는 상호 작용 없이 순전히 얽혀 네트워크 (그림 3)으로 정렬 합니다. Crosslinks 아마도 결함 튜브 따라 또는 이웃 관에 보완적인 단일 가닥 세그먼트와 쌍을 자유로울 것이 끈끈한 끝에서 연장 하는 짝이 없는 DNA 세그먼트에서 발생할 것 이다. 이러한 효과 스트레인 경화 같은 비선형 속성을 유도 것 ( G증가 ' 큰 종자에 대 한), 하지만 그들은 결 석에서 얽혀 네트워크 (그림 4). 표시 된 γ-스윕 또한 일반적 유 변 학적 측정에 대 한 적절 한 선형 긴장 정권 공개. 특정 임계값 이상 네트워크 파열 또는 시스템 돌이킬 수 없 손상 고분자의 접시와 접촉을 잃는다. 따라서, 적용 된 긴장은 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 선형 정권에서 이어야 한다. 일반적으로, 5%의 긴장은 잘 잡음 정권 위에 데이터를 충분 합니다. 높은 긴장은 적용 될 수 있습니다; 그러나, 그들은 쉽게 파열 임계값을 접근 하 고 결과 falsifi 수 있습니다.비-선형 정권에서 측정 때문에 드.
유 변 학적 측정 샘플의 주의 일관 된 준비가 필요 하 고 신중 하 게 측정 재현성 및 해석할 결과 얻기 위해 프로토콜을 고려. 중앙 포인트 제가 판 때문에 이러한 네트워크는 주로 재현할 수 구조 사이의 완전히 무작위, 등방성 네트워크 구축 하는 것 이다. 따라서, 다소 긴 평형 시간 (일반적으로 약 2 시간, 때로는 더 많은) 샘플의는 pipetting 동안 전단 유도 맞춤으로 인해 발생 하는 모든 주문 효과 분산 필요 합니다. 사전 테스트 실험 평형 중 필요한 시간 프레임을 결정 하기 위해 시스템의 시간 진화 (청소 시간) 녹음 권장 됩니다. 일단 신호 추가 변경 없이 고원 도달, 시스템 equilibrated입니다. 일단 평형 조건 결정 되었습니다, 원하는 테스트 부담 등 램프 또는 f 또는 γ 스윕, 실행할 수 있습니다. 종자의 광범위 한 스펙트럼을 테스트 네트워크 또는 격판덮개에 연결을 궁극적으로 파괴할 수 있다. 그러나, 테스트 긴장 파열 임계값 미만으로 제한 된, 경우 스트레인 경사로 및 스윕 반복할 수 있습니다 반복적으로 잠재적인 노화 또는 히스테리시스 효과 조사. F의 경우-스윕, 측정 시간 실질적으로 다를 수 있습니다. 한 발진은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다 이후 극적으로 낮은 주파수 테스트 실험, 연장. NHTs, f의 경우, 유의-스윕 공개는 탄성 계수 G' 점성 계수 G초과 ' 대략 1 개의 크기 순서, 여는 이러한 시스템 ( 의 주된 탄성 응답을 보여 줍니다 그림 5). 다양 한 유형의 실험 짧은 f동반 수 있습니다 일반적으로,-스윕 시스템 자체 측정 하 여 그대로 남아 확인 하는 주요 실험 전후. 그러나 일부 시스템 동적 실험에서 변경 하는 경우에 특히, 측정의 다른 유형에 대 한 기본 모터 모드를 변경 해야 하는, (예를 들어, f에 대 한 진동-스윕) 정적 스트레인 진입으로. 이 변화는 종종 자발적인 큰 긴장 네트워크를 파괴 하 고 부드럽게 하는 후속 측정 함께 합니다. 따라서, 사용 하는 고분자의 사양을 확인 하는 것이 좋습니다.
유동 학 실험 걸 기반 시스템에서 시스템의 공기-물 인터페이스에서 발생 하는 단백질 변성의 극적인 효과 공개. 변성된 단백질 unspecifically를 준수, 그로 인하여 전체 시스템의 기계적 성질을 지배 높은 수 밀도 젤을 형성. 주변 공기 샘플의 직접 접촉을 방지 하기 위해, 또한 샘플의 함량의 증발을 억제 하는 보호막 처리 기법을 사용할 수 있습니다. 세 가지 잠재적인 방법은: (i) 샘플;에서 같이 동일한 버퍼를 샘플 챔버를 둘러싼 (ii)를 사용 하 여 계면 활성 제 때문에 그들의 소수 성 및 친수성 도메인 (주의 해야 합니다, 이후 일부 계면 폴리머 conformations 방해); 인터페이스 커버 또는 (iii) 고용 더 생물학적으로 호환 지질, 계면으로 비슷한 효과. NHTs 찾지 못한 인터페이스에 변성 효과 대상이 될 및 결과 오류의 주요 잠재적인 소스를 패 시 베이 션 방법 (그림 6)의 독립적인 주목 한다. 일반적으로, 시료 챔버 항상 젖은 스폰지 증발 억제 챔버에 습도 높이기 위해 장비 될 수 있다 모자와 함께 봉인 한다.
짧게 설명한 대로 이전에 DNA 기반 시스템에 잠재적인 오류 소스 아니다 교배 등 짝이 없는 단일 가닥 DNA DNA overhangs 결함 또는 추가적인 가교 효과 발생할 수 있습니다 나노튜브의 끝에. 조사 및이 가능성을 제거, 보완 짧은 가닥 이러한 끈끈한 끝을 모자를 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리의 자신의 조사는 상한 가닥 도입된 nHTs, 그리고 얽혀 네트워크의 동작에 영향을 주지 않습니다 유지 했다 변경된 (그림 7)의 추가 보였다. 그러나, 보완 시퀀스와 끈끈한 끝 상한 원치 않는 상호 작용을 억제 하기 위해 다른 DNA 기반 (그리고 더 복잡 한) 시스템에 대 한 유용할 수 있습니다. NHTs의 샘플을 신중 하 게 pipetted 해야 합니다 또한, (예를 들어, 희석 단계 및 샘플 준비) 튜브에 속보 또는 기타 손해를 방지 하기 위해. 솔루션은 pipetted 너무 약 튜브 미친 듯이 휴식, 결함 지점, 선도에서 끈끈한 끝의 노출 많은 시스템에서 튜브와 잠재적인 가교 간 상호 작용을 바라지 않는. 이 신호와 방해 하 고 효과, 스티프닝 뿐만 아니라 γ-스윕 (그림 8)에 표시 되는 변형 경화 같은 비선형 효과 리드. 따라서, pipetting 얽혀 솔루션만 할 수 천천히 하 고 오히려 큰 직경을 가진 피 펫 팁을 사용 하 여 (피 펫 팁의 끝을 자르는 것이 좋습니다) 튜브에 힘을 기울이기를 줄이기 위해.
결론적으로, DNA nHTs는 semiflexible 고분자를 연구 하 고 대량이 필 라 멘이 트를 기계적으로 가변 hydrogels의 새로운 클래스를 나타내는에서 형성 하는 네트워크에 적합 하 고 매우 융통성 있는 모델 시스템입니다. 튜브는 신중 하 게, 준비 하는 경우 다양 한 경우에는 필 라 멘 트의 lp 의 영향을 테스트를 사용할 수 있습니다. 대량 유 변 학적 측정 얽혀 네트워크, 예를 들어, 농도 및 lp 와 탄성 계수의 이론적으로 예측 된 종속성 실험적으로 파생 된 크기와 일치 하지 않는 보여 (그림 9)9법률 있습니다. 이 연구는 네트워크의 신축성 기본 폴리머의 강성을 증가 의해 증가 될 수 있다 강조 한다. 전통적으로,는 히드로의 강성을 증가 더 많은 고분자 솔루션에 추가 하거나 이웃 폴리머37,38사이 crosslinks (물리적 또는 화학적)을 유도 하 여 달성 되었다. 그러나, 높은 분자 콘텐츠 연관-3D 세포 배양 같은 응용 프로그램을 제한할 수 있습니다 감소 메쉬 크기 이기도 합니다. Crosslinks, 다른 한편으로, 더욱 복잡 기계적 특성39의 정확한 튜닝 기본 네트워크 아키텍처 내에서 복잡 한 형태학 상 변화를 유도할 수 있다. 그러나 NHTs의 네트워크를 사용 하 여,, 스티프닝 효과 동안 메쉬 크기 그대로 기본 필 라 멘 트의 강성을 전적으로 변경 하 여 유도 될 수 있다 그것에 의하여,이 매개 변수는 완전 한 분리에 대 한 수 있습니다. 또한, 튜브 구조 변경 될 수 있습니다 특히 가교는 마찬가지로 얽혀 네트워크에서 더 만듭니다 실험적으로 테스트에 대 한 이론적 예측 가능성 등의 추가 효과 선택적으로 통합 하 와 같은 매개 변수l p 또는 crosslink 크기와 네트워크에 대 한 강도. 프로그래밍 가능한 아키텍처 lp의 연구에 대 한 허용 하는 응용 프로그램의 범위를 확장 하는 일반적으로,-대량, 뿐만 아니라 단일 분자 수준에 종속 효과. 레이블된 튜브 공부 하 고, 예를 들어, 튜브와 같은 감 금, 흔히 reptation (그림 10)9 lp 는 필 라 멘 트의 1 차원 운동에의 종속성 네트워크에 포함 될 수 있습니다. 이 방산 모션 표시 경우 또한 확인 합니다 네트워크의 얽혀 자연을 때문에 가교 효과 의해 억제 될 것 이다. 또한 네트워크의 메쉬 크기 보여 기본 역학 분석. 또한,이 튜브는 강성의 종속성과 번들40,41,,4243, 의 형성에 기본 튜브의 카이랄성 조사 하 사용할 수 있습니다. 44 , 스타 같은 꽃46,47,48,49,50, 가교 효과 또는 통해 유도 될 수 있다 같은 45 또는 더 높은 순서 구조 분자로 환경27혼잡.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
DFG (1116/17-1) 및 "BuildMoNa" (GSC 185) 자연 과학의 라이프 찌 히 학교에 의해 자금을 인정 합니다. 이 작품은 프라운호퍼 유치 프로젝트 601 683 통해 지원 되었습니다. T. H. 유럽 사회 기금 (ESF-100077106)에서 자금을 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM - NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore - Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
References
- Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
- Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
- Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
- Doi, M., Edwards, S. F. The Theory of Polymer Dynamics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1986).
- Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
- MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A.
- Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
- Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
- Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
- Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
- Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
- Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
- Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
- Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A.
- Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
- Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J.
- Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
- Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
- Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
- Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
- Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
- Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
- Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
- Hinsch, H., Frey, E. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat]. , Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009).
- Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
- Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
- Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
- de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
- Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
- Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
- You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
- Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
- Sobczak, J. -P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
- Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
- Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
- Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
- Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
- Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
- Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
- Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
- Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
- Strehle, D., et al.
- Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
- Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
- Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).
