Summary
Polímeros semiflexible mostrar propiedades mecánicas únicas que se aplican extensivamente por los sistemas de vida. Sin embargo, estudios sistemáticos sobre biopolímeros son limitados puesto que propiedades como la rigidez del polímero son inaccesibles. Este manuscrito describe cómo esta limitación es burlada por nanotubos de ADN programables, permitiendo estudios experimentales sobre los efectos de la rigidez del filamento.
Abstract
Propiedades mecánicas de la materia suave complejo, basados en polímeros, tales como células o redes de biopolímero, pueden entenderse en ninguno de los dos el marco clásico de polímeros flexibles ni de varillas rígidas. Filamentos subyacentes permanecen extendidos debido a su rigidez de columna vertebral no desaparece, que es cuantificada a través de la longitud de persistencia (lp), pero también están sujetos a fuertes fluctuaciones térmicas. Su rigidez de flexión finita conduce a la mecánica colectiva única, no trivial de redes a granel, lo que permite la formación de andamios estables en fracciones de volumen bajo mientras que proporciona los tamaños de malla grande. Este principio subyacente es frecuente en la naturaleza (por ejemplo, en células o tejidos), minimizando el alto contenido molecular y facilitando la difusión o transporte activo. Debido a sus implicaciones biológicas y potenciales aplicaciones tecnológicas en hidrogeles biocompatibles, semiflexible polímeros han sido objeto de considerable estudio. Sin embargo, investigaciones comprensibles seguía siendo difíciles desde que los polímeros naturales, tales como filamentos de actina, que no son libremente ajustables. A pesar de estas limitaciones y debido a la falta de polímeros sintéticos, mecánicamente ajustables y semiflexible, filamentos de actina se establecieron como el sistema de modelo común. Una limitación importante es que la cantidad central lp no puede ajustarse libremente para estudiar su impacto en las estructuras macroscópicas a granel. Esta limitación fue resuelto mediante el empleo de nanotubos de ADN estructuralmente programables, permitiendo la alteración controlada de la rigidez del filamento. Se forman a través de diseños de azulejos, donde un discreto conjunto de filamentos parcialmente complementarios hibridar en una estructura de anillo con una circunferencia de discreta. Estos anillos presentan extremos pegajosos, lo que permite la polimerización efectiva en filamentos de varias micras de longitud y mostrar la cinética de polimerización similar como biopolímeros naturales. Debido a su mecánica programable, estos tubos son herramientas versátiles, novela para estudiar el impacto de lp de la solo-molécula así como la escala mayor. En contraste con los filamentos de actina, permanecen estables durante semanas, sin notable degeneración, y su manejo es sencillo comparable.
Introduction
Debido a los comportamientos complejos habilitados por sus propiedades mecánicas únicas, polímeros semiflexible son bloques de construcción fundamentales de la materia viva. En contraste con los polímeros flexibles, semiflexible polímeros adoptan una configuración extendida debido a su rigidez de la columna vertebral no desapareciendo mientras que aún permanecen sujetos a fuertes fluctuaciones térmicas1. Por lo tanto, modelos puramente estocásticos no pueden aplicarse a sus comportamientos, al igual que con los extremos de los polímeros rígidos o totalmente flexibles. El supuesto gusano-como cadena modelo2,3,4 fue desarrollado para cuantificar esta rigidez por medio del lp, que es la constante de decaimiento de la correlación de tangente-tangente a lo largo de los filamentos4. Si lp es comparable a la longitud del contorno (lc) del filamento, el polímero se considera semiflexible1. Análogo a los polos de una tienda de campaña, sus arreglos en redes o en haces se estabiliza el sistema colectivo en fracciones de bajo volumen, a viscoelástica inusuales propiedades5,6,7, 8,9. Estas estructuras proporcionan tamaños10, manteniendo la integridad mecánica sigue facilitando la difusión y procesos de transporte activo de malla de alta elasticidad en general. Esta propiedad es especialmente conveniente para los sistemas biológicos como el citoesqueleto con la matriz extracelular, pero es también ampliamente utilizado en alimentos ingeniería1,11,12.
Va más allá de su importancia a la materia viva, es crucial examinar exhaustivamente las propiedades físicas de estas estructuras para poder tener las herramientas para desarrollar materiales biomiméticos o hidrogeles novela. En términos de polímeros semiflexible, esto implica la determinación sistemática de las propiedades colectivas de las redes resultantes de propiedades solo filamento como lp y el desarrollo de un marco teórico descriptivo. En estudios pioneros, la actina celular biopolímero se estableció como un sistema modelo para polímeros semiflexible y todavía es considerada como el estándar de oro5,13,14,15 , 16 , 17. sin embargo, estudios exhaustivos se limitan con este sistema ya que están limitados a las propiedades inherentes de esta proteína. Varios enfoques teóricos han destinado a la construcción de una descripción de los comportamientos mecánicos no triviales en el nivel del solo filamento y han provocado especialmente diferentes escala las predicciones para la dependencia del módulo del esquileo meseta elástico lineal, G 0 (es decir, la "elasticidad" de la red), con respecto a la concentración (c) y lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Mientras que la escala de concentración es fácilmente accesible en experimentos con actinia-basado o en otros sistemas modelo y mientras que las predicciones teóricas han sido rigurosamente verificado13,16,24, 25, la escala con respecto a lp ha permanecido inaccesible experimentalmente. Esto, sin embargo, es una limitación importante, ya que lp es también una variable independiente que es la definición cantidad de polímeros semiflexible.
Esta limitación natural, central impuesta por fijo lp de la actina o de otros polímeros biológicamente derivados tales como colágeno ha sido recientemente resuelto mediante el empleo de tubos de ADN basada en azulejos, que son ajustables en sus propiedades mecánicas 9 , 26 , 27 , 28. ligeras variaciones en las arquitecturas de los tubos (por ejemplo, diferentes cantidades de ADN constituyen filamentos dentro del anillo de la unidad) producen distintos valores para lp, que puede evaluarse mediante microscopía de fluorescencia, analizando un tubo fluctuante o mediante la evaluación de las configuraciones de curvas de varios tubos adheridos, como se ha descrito anteriormente9,28. Estos análisis revelaron que lp valores de las poblaciones de tubo diferentes varían en más de un orden de magnitud y que técnicas de evaluación diferentes dan resultados consistentes9,28.
Sorprendentemente, la escala total de la meseta elástico lineal cortante módulo G0 con respecto a la concentración y lp se ha divulgado para ser incompatibles con los anteriores planteamientos teóricos 9, demostrando en particular mucho más fuerte que prevista dependencia lp. Estos resultados enfatizan el valor de un nuevo sistema modelo para estudiar las propiedades centrales de polímeros semiflexible. Empleando n-tubos de ADN hélice dramáticamente amplía el alcance de estas investigaciones. No sólo puede lp libremente variar sin cambiar la materia prima, sino la propia naturaleza programable del ADN permite el examen sistemático de elementos adicionales, tales como reticulaciones o procesos cinéticos de conmutación. Además, estos tubos son solubles en agua y, en contraste con la mayoría de las proteínas, estables en pH adecuado y condiciones iónicas durante varias semanas, sin degradación perceptible9.
A estos tubos, se utiliza un conjunto discreto de oligonucleótidos de ADN, que contiene dos dominios que comparten secuencias complementarias de base a los dos filamentos vecinos (debido a las secuencias específicas, un solo filamento no puede formar estructuras como horquillas para el cabello). Las secuencias complementarias hibridan de forma cíclica, formando anillos cerrados, superposición de mitad de segmentos helicoidales doble n interconectadas (figura 1A y B). Éstos forman anillos discretos de diámetro (figura 1), y su configuración de medio traslapo expone axiales extremos pegajosos complementarios a los extremos pegajosos de otro anillo. Esta adición selectiva de emparejar oligonucleótidos desencadena un apilamiento de los anillos, conduciendo a la polimerización efectiva de filamentosos tubos de hélice de ADN de tamaño n (nHT). Sus longitudes contornos miden típicamente varias micras de longitud, y su distribución de la longitud es comparable a la de actina filamentos9,26,27,28. Se ha demostrado para nanotubos de ADN similares que de hecho presentan cinética de polimerización similar a las de los microtúbulos y filamentos de actina
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Protocol
1. preparación de n HTs
Nota: aquí n denota el número de diferentes solos filamentos de ADN implicados en la formación de los tubos de la hélice de un cierto tamaño. Para n = 8, ocho diferentes cadenas simples de ADN conforman un anillo unidad.
- Secuencias de ADN de compra (grado de pureza HPLC o superior) de una adecuada síntesis de ADN del servicio o realizar síntesis de alta calidad y purificación (secuencias ejemplares dadas en la tabla 1).
- Oligonucleótidos liofilizado de resuspender en agua purificada y seguir la resuspensión más pasos dados en el manual correspondiente de la empresa. Ajustar la cantidad de agua para obtener una concentración final de 200 μm.
- Determinar las concentraciones de la sola DNA filamentos para verificar los valores indicados por el distribuidor (por ejemplo, mediante espectroscopía UV-Vis en 260 nanómetro) puesto que la estequiometría exacta es crucial para el proceso de montaje. Calcular la concentración de los oligonucleótidos, teniendo en cuenta el peso específico molar y el coeficiente de extinción para cada oligonucleótido de ADN monocatenario.
Nota: Los valores del coeficiente de extinción inherentemente varían para las diferentes secuencias y figuran en la documentación de ADN adquirido comercialmente. También puede calcularse según el modelo de vecino más cercano con un número de herramientas libremente disponibles en línea. Para cumplir con la gama linear del espectrómetro, considerar la dilución de la muestra utilizada para la determinación de la concentración. - Usando una micropipeta, mezcla de la DNA filamentos, cada uno en la misma concentración en un contenedor adecuado para el termociclador (por ejemplo, un tubo PCR de 200 μL) formar el deseado n HTs (condiciones de buffer final: 1xTE (10 mM Tris y 1 mM EDTA, pH 8) y 12.5 mM MgCl 2).
Nota: Las muestras de ADN Final n HT consisten en n - 1 filamentos, U 1 − U n − 1 y una cadena de T n. La concentración por strand puede variar desde sub-micromolar a más de 10 μm, dependiendo de las necesidades del usuario (por ejemplo, < 1 μm por filamento para la dilución subsecuente observar filamentos individuales o concentraciones más altas para el examen de mecánicos de la red). - Hibridar n HTs en un termociclador (desnaturalización durante 10 minutos a 90 ° C, con una posterior caída rápida a 65 ° C; temperatura lenta disminución de 65 ° C a 55 ° C, con base que se aparea complementarios en 20 pasos de la temperatura de-0,50 K por 30 min cada uno; y una rápida caída de 55 ° C a 20 ° C); Ver figura 2A.
Nota: Los pasos del lento descenso de 65 ° C pueden ser alargados para aumentar la longitud del tubo promedio; sin embargo, la posterior caída rápida a 20 ° C es crucial para evitar la agregación de polimerizado tubos. - Tienda la hibridizada n HTs hasta por 3 semanas a 4 ° C sin degradación perceptible.
Nota: Para fluorescencia microscopía, etiquetado n HTs son hibridadas sustituyendo (en parte) U1 con el U1-Cy3 modificada (tabla 1). Por más tiempo de observación, es recomendable la adición de agentes anti blanqueo establecidos. - Cuidadosamente diluir la muestra a la concentración final deseada (por ejemplo, 4 μm para redes o 20 nM para observaciones solo filamento) usando el tampón de muestra, si es necesario. Para minimizar las fuentes posibles de error, montar las muestras en la concentración final.
2. Reología del esquileo
- elegir una adecuada geometría (placa-placa o placa de cono) para el Reómetro de corte dinámico. Para volúmenes pequeños (es decir, por debajo de 200 μL), utilice la geometría cono-placa.
- Carga la muestra en el Reómetro de corte dinámico.
- Apaciguar la interfaz aire agua de la muestra y el medio ambiente mediante los siguientes pasos para prevenir posibles efectos de evaporación.
- Rodean la muestra con 2,5 mL del baño de tampón de muestra de.
- Añadir un surfactante justo debajo de la concentración micelar.
- Utilizar una jeringa Hamilton para rodear la muestra con un lípido para evitar el contacto directo de la muestra con aire a.
- Sellar la cámara de muestras con tapa equipada con esponjas mojadas y, si es posible, con un baño de agua (no en contacto con la muestra) a otros suprimir evaporación.
- Iniciar la medición utilizando el software específico de reómetro a temperatura ambiente, o bien, realizar la medición a diferentes temperaturas, como 37 ° C (si se necesitan condiciones fisiológicas).
Nota: Refrigeración de la muestra es acompañada a menudo por la condensación del vapor de agua del aire circundante, mientras que la calefacción conduce a mayor evaporación. Ambos efectos incontrolable pueden cambiar la concentración de la muestra, así que todas las medidas en una serie deben realizarse a una temperatura constante. - Permitir que la muestra se equilibren por 2 h a temperatura ambiente. El tiempo de evolución puede controlarse con un barrido de tiempo (datos de un punto por minuto; tensión γ = 5%; de frecuencia f = 1 Hz).
- Medir las propiedades mecánicas con los protocolos de prueba deseado. Comenzar con una serie de barridos de frecuencia (f-barre) porque deja la muestra intacta y permiten mediciones más.
Nota: Adicionalmente, corta f-barridos deben ser realizada antes y después de las mediciones más larga (como largo f-barridos con una resolución mucho mayor) para verificar que la muestra permaneció sin cambios en el protocolo de medición completo.- Realizar un corto f-barrido (por ejemplo, γ = 5%; f = 0,01 Hz a 30 Hz; 5 puntos por década).
- Realizar un largo f-barrido (por ejemplo, γ = 5%; f = 0,001 Hz a 30 Hz; 21 puntos de datos por década); el régimen de baja frecuencia puede omitirse si no es necesario para reducir el tiempo de medición.
- Realizar un corto f-barrido.
- Realizar un barrido de γ (e.g., f = 1 Hz; γ = 0.0125% a 100%; 20 puntos por década).
Nota: Use el corta f - barrido en primer lugar, como es generalmente incompatible con el anterior f - barre porque redes generalmente la ruptura durante el barrido de γ o separan de las placas. Alternativamente, use γ-rampa (por ejemplo, = 0.025 s -1, t = 60 s); sin embargo, las rampas generalmente requieren cambiar el modo de motor, tan posterior corto f-barridos falsificó.
- Bin o liso los datos en bruto con un kernel gaussiano.
3. fluorescencia asistida por análisis de ADN del recocido
- 8 preparar alícuotas de 12 μl de cada muestra utilizando 1-4 μm manchas de ADN por filamento y 12.5 mM de MgCl 2 en 1 x buffer TE 1 x gel de ácido nucleico de un DMSO 10.000 x stock. Hacer un control negativo sin ADN, pero incluyen la mancha de gel de ácido nucleico.
- Transferencia de las alícuotas a una placa PCR en tiempo real y sellar con la película adhesiva (por ejemplo, una placa de 96 pocillos de reacción).
Nota: Las temperaturas utilizadas en el térmico recocido protocolos evaporarán las muestras. Por lo tanto, asegúrese de que los pozos están sellados firmemente con la película adhesiva para evitar que el agua aumento de evaporación y concentración, especialmente en experimentos a largo plazo. - Centrifugar la placa a 100 x g durante 1 min a temperatura ambiente para eliminar las burbujas de gas; si expandan las burbujas de gas, los pozos no pueden ser analizados.
- Cargar la placa de sellado en un sistema PCR cuantitativo en tiempo real.
- Ejecutar un programa de recocido. Desnaturalizar el ADN a 90 ° C durante 10 minutos colocar la temperatura rápidamente a 72 ° C. Luego, disminuir la temperatura lentamente de 0,5 ° C cada 30 minutos. Después de que la señal ha decaído, acelerar la rampa de temperatura.
Nota: 72 ° C es lo suficientemente superior a la temperatura de hibridación real; así, la señal se registra en un rango de temperatura amplio adecuado para determinar el rango de temperatura necesario. - Asegúrese de que la tapa de la cycler calienta a menos de 100 ° C para evitar la condensación de la muestra evaporada en la película adhesiva del.
- Durante el montaje, excitar las muestras con un láser de ion argón 488 nm y detectar la fluorescencia a 550 nm cuando se utiliza una tinción del gel de ácido nucleico (o espectralmente similares). Para los otros tintes, elegir una combinación adecuada de excitación/emisión. Medir la señal de fluorescencia tan a menudo como sea posible para aumentar el total utilizando la cámara integrada de la calidad de señal.
Nota: Aquí, las mediciones se realizaron cada 9 s. - Si se aplican la fusión preestablecida y recocido programas, utilice el software suministrado para analizar los datos. Si no, resta el anterior valor medio desde el valor medio para cada paso de la temperatura obtener el cambio relativo de la señal fluorescente.
4. Imágenes de AFM
- Cleave mica (por ejemplo, mica " V1 ") colocando cinta adhesiva disponible comercialmente y estafando; se debe retirar la capa superior de la mica.
- Usando una micropipeta, depósito forma n HT en Mg 2 + que contiene tampón plegable en la mica recién descamada y déjelo reposar 10 min.
- Girar las muestras en intervalos cortos 3-s a 2.000 x g en una centrífuga de mesa para quitar el líquido restante. Varios n HTs todavía debe fijarse a la superficie de la mica.
- Utilizar la punta de un voladizo con una alta rigidez (por ejemplo, 54 Nm -1) y determinar su frecuencia de resonancia con el software interno del AFM.
- Registro del perfil de altura con la AFM en el aire en modo tasas bajo análisis (por ejemplo, 1 línea/s) para evitar dañar o desplazar n HTS.
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Representative Results
El montaje de nanotubos de ADN a través de una rampa de temperatura (figura 2) es un método muy confiable para formar estos polímeros artificiales semiflexible. Estos polímeros tienen características comparables a sus pares que ocurren naturalmente, como filamentos de actina, sino proporcionan un marco experimental mucho más amplio ya que sus propiedades mecánicas puede controllably alterado9,27 . Como biopolímeros, que pueden disponerse en redes (figura 3) y permiten específicamente para probar los efectos de la rigidez del filamento grueso estructuras y propiedades. Como se muestra en la figura 4, estas redes muestran un régimen lineal tensión para tensiones hasta un 10%, que más se asemeje a las características de las redes de filamentos de actina. Dentro de este régimen, reología de corte lineal puede fácilmente aplicarse, por ejemplo, para determinar la respuesta elástica y viscosa de DNA redes de nanotubos sondeado en diferentes frecuencias9. Estas pruebas revelan que las redes predominante se comportan elásticamente (figura 5). En contraste con las mediciones con las proteínas, estos tubos desnaturalice en la interfase aire-agua de la muestra y por lo tanto, sofisticadas estrategias de estabilización requerida (figura 6). Por lo tanto, el manejo de las muestras es bastante sencillo y ha demostrado para ser muy robusto, obtención de resultados consistentes con baja variación de muestra a muestra.
Sin embargo, la cuestión de si los "extremos pegajosos" libres de impar monocatenario a ADN en ambos extremos de cada tubo puede inducir hibridación indeseado, estocástico acontecimientos permanecieron. Para abordar esta preocupación, secuencias complementarias "end cap", que cubre los extremos del tubo se agregaron a la muestra después de completado el proceso de hibridación. Sin embargo, la figura 7 muestra que los extremos de los filamentos para envases no tienen ninguna influencia detectable y que los extremos del tubo debe inducir cualquier efecto de cura transitorio en la red9. Eventos sólo desempeñan un papel importante cuando la muestra se maneja demasiado áspero y rotura de los tubos debido a uso áspero. De hecho, estos puntos de rotura parecen inducir efectos de reticulación, conduce a respuestas no lineales del sistema, tales como tensión de refuerzo (figura 8).
Si las muestras son cuidadosamente preparadas, pueden ser utilizados para probar el impacto que la concentración de filamento (Figura 9A) o el filamento de rigidez (figura 9B)9 en las propiedades mecánicas de redes de polímeros semiflexible. Por primera vez, la conexión cuantitativa entre la rigidez del filamento y la elasticidad de la red se estudió experimentalmente y sistemáticamente, dando un comportamiento de ley de potencia lineal, que contradice las predicciones teóricas predominantes. Estos resultados muestran que los nanotubos de DNA son una nueva y versátil herramienta para estudiar los efectos de polímeros semiflexible, que eran inaccesibles antes experimentalmente9,27. Ahora, varias teorías pueden ser experimentalmente probadas, que las declaraciones sobre las dependencias a la persistencia de longitud lp de los filamentos. Además, efectos muy fundamentales, tales como reptation (figura 10), pueden ser investigados desde diferentes perspectivas mediante el empleo de tubos que varían de rigidez.
| Nombre | Secuencia de | ||
| U1: a1 *-b1 *-a2-b2 | GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U1-Cy3: a1 *-b1 *-a2-b2 | Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U2: a2 *-b2 *-a3-b3 | GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT | ||
| U3: a3 *-b3 *-a4-b4 | GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT | ||
| U4: a4 *-b4 *-a5-b5 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT | ||
| U5: a5 *-* b5-a6-b6 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT | ||
| U6: a6 *-b6 *-a7-b7 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG | ||
| U7: a7 *-b7 *-a8-b8 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA | ||
| U8: a8 *-b8 *-a9-b9 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA | ||
| U9: a9 *-b9 *-a10-b10 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC | ||
| U10: a10 *-b10 *-a11-b11 | TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT | ||
| U11: a11 *-b11 *-a12-b12 | AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA | ||
| U12: a12 *-b12 *-a13-b13 | ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA | ||
| U13: a13 *-b13 *-a14-b14 | GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC | ||
| T4: a4 *-b4 *-a1-b1 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T5: a5 *-b5 *-a1-b1 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T6: a6 *-b6 *-a1-b1 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T7: a7 *-b7 *-a1-b1 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T8: a8 *-b8 *-a1-b1 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T9: a8 *-b8 *-a1-b1 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T10: a10 *-b10 *-a1-b1 | GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T14: a14 *-b14 *-a1-b1 | TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| tapa A1 | CCTAATCGCC | ||
| tapa A2 | CCTTTAGATCC | ||
| tapa final A3 | CCACTCTTCC | ||
| tapa A4 | CCGTGAGAACC | ||
| tapa A5 | CCGCACGACC | ||
| tapa A6 | CCAACGATGCC | ||
| tapa final A7 | ATGCACCTCC | ||
| tapa A8 | AACGGTAACTA | ||
| casquillo de extremo B1 * | ACGCTAAGCCA | ||
| tapa B2 * | ACCAGATACA | ||
| casquillo de extremo B3 * | ACAAGATGTCA | ||
| tapa B4 * | ACGCATTGCA | ||
| tapa B5 * | ACTGTCGAACA | ||
| casquillo de extremo B6 * | ACTTCTATCA | ||
| tapa B7 * | CATTCAAAGCT | ||
| casquillo de extremo B8 * | TCCCAAGTCA | ||
Tabla 1: Ejemplo de la DNA las secuencias para la hibridación de la nHTs en figura 1, que también fueron utilizadas en estudios anteriores realizados sobre nHTs9, clase = "xref" > 26,27,28. El conjunto de secuencias permite el montaje de siete arquitecturas de tubo diferentes (por ejemplo, a1 cruza por hibridación con la secuencia complementaria a1 *). Otras arquitecturas de tubo no se da aquí también pueden estar formadas por la suma o resta de filamentos acompañado por la ciclización según strand n con U1.
Figura 1: montaje y arquitectura del tubo. (A) esquema de la Asamblea de un 4HT formado de cuatro distintas 42-mers. Filamentos de ADN monocatenario adyacentes hibridan a través de dominios alternancias continuados de 10-11 bases, indicados por garrapatas negras largo (las garrapatas negro corto indican bases unhybridized). Este motivo escalonado en medio cuenta con extremos pegajosos en ambos lados del eje, permitiendo crecimiento axial, indicada por la flecha. Los filamentos de límite U1 y T4 también cuentan con dominios complementarios y así forman un anillo cerrado, según lo indicado por la flecha derecha. Tenga en cuenta que este esquema es una representación 2D; en el estado hibridizado, los filamentos forman dobles hélices y todas las bases se aparean. (B) esquema cuasi-3D de un tetrámero de 4HT con dos hélices de doble cubierta en la capa lejana sombra. Dobles hélices forman dominios complementarios y están vinculadas a dos dobles hélices adyacentes del tubo una vez por el elemento de longitud unidad. Una sola hebra de U2 se dibuja más gruesa para mayor claridad. (C) se dan ejemplos de siete arquitecturas de tubo diferentes, con números de línea que van desde 4 HT HT y l14p desde 1.2 hasta 26 μm. (D y E) imágenes de Epi-fluorescente de marcado con Cy3, adsorbida 5 HT y 10 HT ilustran las diferentes rigideces mediante contornos curvas diferentemente. La superposición de rojo es el contorno de filamento encontrado por medio de análisis de imagen, con end-to-end distancia R y la longitud del contorno lC. Figura adaptada de Schuldt et al9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: rampa de temperatura y montaje correspondiente de ADN nanotubos. (A) ADN nanotubos están montados en un termociclador a través de un protocolo que contiene que varios temperatura distinto pasos sobre aproximadamente 11 h. (B) en un sistema PCR cuantitativo en tiempo real, el cambio relativo de la señal fluorescente de hilos teñidos es una medida para ADN de doble hebra recién formado yendo a través de la rampa de temperatura. Dependiendo del tipo de ADN nanotubos, puede variar el tipo de Asamblea. Cuanto más compleja la formación de la estructura, el más amplio la Asamblea, presumiblemente desde hilos más (y por lo tanto más segmentos con distintas secuencias y temperaturas de recocido locales) necesita hibridar en las posiciones adecuadas, un proceso que es impulsado por fluctuaciones térmicas estocástico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: imagen de AFM representante de una enmarañada red de 8HTs a 4 μm. El perfil de altura de una red preformado de 8HTs absorbe a una superficie de mica fue grabado usando el modo de golpear ligeramente en el aire. Imágenes AFM visualizar una proyección 2D de la red pero no permiten la extracción fiable de datos (por ejemplo, tamaño de malla) para el caso 3D ya que los tubos, así como las redes se comprimen en una configuración 2D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: gama lineal. Las mediciones de la tensión (G' = 1 Hz) revelan una amplia meseta elástico lineal, sin signos de entrecruzamiento efectos tales como el comportamiento no-lineal que manifiesta como tensión endurecimiento. Por encima de una cepa característica (diferente para cada nHT), el módulo elástico de la meseta interrumpió irreversible. Las barras de error cada representan la desviación estándar del valor promedio de las mediciones realizadas. Figura adaptada de Schuldt et al9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: dependencia de la frecuencia típica de una red enmarañada 6HT. Redes de tubos de ADN muestran una meseta amplia elasticidad en cuatro órdenes de magnitud, dependiendo de la frecuencia aplicada. Como era de esperarse para una red de polímero, el elemento elástico (G') de la cizalla complejo módulo es significativamente mayor que la parte viscosa (G''). Figura adaptada de Schuldt et al9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Sin efectos de interfaz aire-líquido. Barridos de frecuencia (f-barridos, γ = 5%) de 8HT muestras a 8 μm revelaron que la influencia de efectos de evaporación y congelación en la interfaz aire-agua son insignificantes. Se utilizaron tiempos de equilibrio diferentes, así como dos métodos conocidos para reducir drásticamente el agrupamiento en la interfaz (surfactantes y lípidos), proteínas. Independiente del método, ningún indicio de influencias drásticas por evaporación o elasticidad superficial se registró. Aquí, G' representa el módulo de elasticidad y G'' representa el módulo viscoso (líneas discontinuas). Figura adaptada de Schuldt et al9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: ninguna influencia de modificación final. El módulo elástico de la meseta se mantiene constante cuando tapado los extremos libres pegajosos de la 8HTs con sus respectivas secuencias complementarias. Figura adaptada de Schuldt et al9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: influencia de los procedimientos de manipulación de la DNA preformado de redes en la medida de. Dependiendo de cómo se manejan las redes preformadas después de la hibridación, las mediciones pueden ser diferentes. En este ejemplo, el flujo de corte durante el uso de los nanotubos de ADN ha sido variado drásticamente y tubos se rompieron Si maneja demasiado áspero. Rotura conduce a interacciones no deseadas entre los expuestos, solo hilos complementarios correlacionar a segmentos quebrados o rotos, que conduce a un aumento de la elasticidad y provoca efectos no lineales, sUCH como cepa Temple (aumento de la elasticidad para la curva de grandes tensiones, verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Nanotubos de ADN permiten el estudio de lp dependencias. (A) estudiando redes de polímeros semiflexible con nHTs permite la investigación de la respuesta mecánica del sistema con aumento de la concentración (barrido de concentración), análogo a los estudios basados en biopolímeros tales como actina. (B) además, las diferentes arquitecturas de los tubos de facilitan la determinación de la respuesta mecánica con respecto a la variable lp de los filamentos subyacentes, que no es factible con natural polímeros semiflexible. Para ello, los datos de A es volver a la escala del módulo elástico de la meseta respecto a lp. Las barras de error cada representan la desviación estándar del valor promedio de las mediciones realizadas. Figura adaptada de Schuldt et al9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Reptation y malla tamaño. Imágenes de fluorescencia de grabación de reptating filamentos (solo etiquetado ADN 8HT incrustados en una red sin etiqueta; c = 14 μm) puede utilizarse para verificar la naturaleza enredada de los filamentos de la red. Efectos de reticulación impediría esta difusión unidimensional. Recuadro: Reptation análisis pueden utilizarse para determinar el tamaño de acoplamiento escalar con concentraciones, que se compara bien con mediciones de actinia y está de acuerdo con las predicciones teóricas30. Las barras de error cada representan la desviación estándar del valor promedio de las mediciones realizadas. Figura adaptada de Schuldt et al9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Para obtener correctamente formadas redes, montaje de los nanotubos de ADN es un paso crucial. Errores durante el proceso de síntesis un impacto negativo en la calidad del tubo; por lo tanto, se recomienda usar HPLC o un proceso más riguroso para purificar los oligonucleótidos. Puesto que la formación de discretos en lugar de agregados nanotubos de ADN, así como su distribución de longitud, depende de la estequiometría equimolar de los oligonucleótidos constituyentes n dentro del conjunto, es necesario que vuelva a medir las concentraciones de hilos comprados, desde valores dados pueden variar substancialmente de la concentración real. Esto se puede realizar, por ejemplo, mediante espectroscopía UV-Vis a una longitud de onda de absorbancia de 260 nm. Nos gustaría señalar que los pesos moleculares y los coeficientes de extinción varían entre las diferentes secuencias; por lo tanto, los valores para traducir la absorbancia en concentración deben determinarse para cada oligonucleótido de ADN. Cuando utilice equipo optimizado para volúmenes de muestra pequeños, como un NanoDrop, cada punto de medición debe ser tomado varias veces y un promedio de. Cumplir con la gama linear de la detección del espectrómetro. Diluir la fracción se usa para la determinación de la concentración si es necesario. Inexactitudes leves pueden tener un gran impacto en la estequiometría correcta y la calidad de la formación de tubo; por lo tanto, debe ser lo más preciso posible pipetear de solos filamentos. Posteriormente, la solución de la muestra final se debe mezclar bien transfiriendo lentamente la muestra hacia arriba y hacia abajo antes de poner en el termociclador. Si los filamentos se han modificado con tintes fluorescentes para visualización, todas las medidas deben realizarse en un entorno protegido de la luz directa y la adición posterior de los agentes anti blanqueo establecidos (es decir, oxígeno barrido sistemas, tales como glucosa oxidasa/catalasa) se recomienda. Después de los solos filamentos se han mezclado en las condiciones de buffer correcto, una rampa de temperatura aplica para hibridar las estructuras (figura 2A). Este patrón de temperatura sigue la temperatura de hibridación críticas previamente determinado, donde el ADN doble forma de hélices. Varios métodos se han desarrollado para analizar la cinética de hibridación de ADN (es decir, nativos UV ADN absorbancia31, calorimetría32o tintes fluorescentes33). En este último método, tintes intercalar en dobles hélices de ADN, formando complejos altamente fluorescentes más brillante que los tintes no consolidados. Se unen parcialmente bicatenario pero no de DNA monocatenario34. Por lo tanto, estos tintes se han aplicado para controlar la nanoestructura de la DNA uno mismo-montaje en el sistema35 y pueden utilizarse para identificar condiciones de montaje ideal.
Inicialmente, cualquier ADN de doble cadena dentro de la muestra, tales como duplex predefinida y sin precedentes, son desnaturalizados a alta temperatura (90 ° C) para evitar la involuntaria base que se aparea. Una posterior disminución gradual en la temperatura (similar a la figura 2A) reduce el movimiento termal de los filamentos de la DNA, que permite eventos de base pelado. Debido a la minimización de la energía libre, los filamentos de la DNA preferencial hibridan en sus secuencias complementarias. Cuando se aplica un colorante intercalante dsDNA-específicas, el brillo aumenta con la formación de complejos altamente fluorescentes, que a su vez es una medida cuantitativa de ADN doble hebra recién formado34. El cambio relativo de la señal de fluorescencia para la formación de 4HTs y 8HTs se grafica en la figura 2B. Este cambio relativo se calcula por el promedio de la intensidad de fluorescencia para cada temperatura y posteriormente restar el valor promedio de la temperatura anterior. Con la disminución de temperatura, una elevada fluorescencia puede ser detectada (figura 2B), y el pico de la curva destaca la temperatura donde ocurren eventos de hibridación masiva. La caída de las curvas se refiere a los valores de intensidad, llegando a una meseta. Dependiendo de la estructura del ADN y su complejidad (por ejemplo, un conjunto pequeño o grande de ADN en hebras), el pico puede ser agudo (figura 2B, curva azul) o amplia (figura 2B, curva verde). Cuando sea posible, esto debe analizarse para que cada estructura recién diseñada asegurar que la porción gradualmente decreciente de la rampa de temperatura contiene el rango donde está ocurriendo la formación de tubos a través de la formación de segmentos de dsDNA hibridizada. La temperatura adecuada se determina régimen, nanoestructuras pueden ser montado con éxito en las gamas de temperaturas muy estrecha (figura 2B, curva azul), o incluso isothermally35. Tenga en cuenta que la hibridación de ADN de múltiples filamentos en enrejados periódicos induce cooperativa recocido efectos35,36, que apoyan más ADN recocido. Debe considerarse que tintes intercalante estiramiento hélices de ADN más allá de sus estándar 10,5 pares de bases por vuelta helicoidal configuración, alterando así la geometría general de los tubos. Por lo tanto, no es recomendable aumentar la concentración de colorante sobre una molécula por 900 pares de bases de ADN35. Además, la temperatura máxima de Asamblea puede desviarse de la temperatura de recocido óptimos. Para lograr alta precisión y determinar las mejores condiciones para la formación del tubo, hibridación de la DNA debe ser investigado durante muchos pasos lentamente cambiantes de temperatura, que deben ser doble comprobación con electroforesis en gel de agarosa. Para el caso de los nanotubos de ADN, hemos establecido un protocolo de tres pasos. En primer lugar, la muestra se calienta a 90 ° C para desnaturalizar el ADN en solos filamentos. Posteriormente, se cubre una gama de temperaturas ancha (alrededor de la Cumbre de la Asamblea de la señal de fluorescencia). En nuestro caso, se cubre un rango de 10 ° C, entre 65 ° C a 55 ° C, con un paso de-0,50 ° C cada 30 minutos. En el paso final, la temperatura debe bajar rápidamente a temperatura ambiente - o, como en nuestro caso, 20 ° C - para evitar que las interacciones desfavorables en temperaturas intermedias (figura 2A). Generalmente, termocicladores calientan las muestras de temperaturas más frías. Por lo tanto, es importante ajustar la temperatura de la tapa por lo tanto para limitar la evaporación del líquido en la muestra durante el montaje, que aumenta la concentración de la muestra final.
Si nHTs se forma adecuadamente, organizar en redes puramente enredadas (figura 3), sin interacciones que causan efectos de entrecruzamiento entre los distintos tubos. Vínculos cruzados probablemente resultaría de segmentos de DNA que se extiende desde defectos a lo largo de un tubo o en extremos pegajosos, que se libre a la par con segmentos de monocatenario complementarios en tubos vecinos. Estos efectos induciría a propiedades no lineales, como el endurecer de tensión (aumento G' para las tensiones más grandes), pero están ausentes en enredados redes (figura 4). Las γ-barridos mostradas revelan también los regímenes de tensión lineal apropiado para mediciones reológicas en general. Por encima de cierto umbral, la red rompe o pierde el contacto con las placas de reómetro, que daña irreversiblemente el sistema. Por lo tanto, las tensiones aplicadas deben estar en el régimen lineal para obtener datos fiables. Por lo general, una tensión de 5% es suficiente para obtener datos muy por encima del régimen de ruido. Cepas de mayor podrán aplicarse; sin embargo, fácilmente se acercan al umbral de ruptura, y los resultados pueden ser realizasenEd por medición en el régimen no lineal.
Mediciones reológicas requieren una preparación cuidadosa y consistente de la muestra y examinó cuidadosamente los protocolos de medición para obtener resultados reproducibles e interpretables. El punto central es establecer una red completamente al azar, isotrópica entre las placas del reómetro puesto que estas redes son en su mayoría la estructura sólo reproducible. Así, se necesitan tiempos de equilibrado bastante largo (típicamente alrededor 2 horas, a veces incluso más) para dispersar cualquier pedidos efectos que se producen debido a la alineación por cizalla durante el pipeteado de la muestra. Experimentos de pre-test se recomiendan para que grabar el tiempo de evolución (barrido de tiempo) del sistema en equilibrio con el fin de determinar el tiempo necesario. Una vez que las señales alcanzan mesetas sin otros cambios, el sistema es equilibrado. Una vez equilibrado se han determinado las condiciones, las pruebas de la deseada, como una cepa f - o γ-barridos, o una rampa puede ser ejecutado. Un amplio espectro de cepas de la prueba puede destruir la red o la conexión a las placas. Sin embargo, si las pruebas son limitadas a tensiones por debajo del umbral de ruptura, tensión rampas y barridos pueden iterativamente repetir para investigar efectos de envejecimiento o histéresis. En el caso de f-barridos, tiempos de medida pueden variar sustancialmente. Bajas frecuencias de prueba dramáticamente prolonga los experimentos, ya que una oscilación puede tardar varios minutos. Tenga en cuenta que, en el caso de nHTs, f-barridos revelan que el módulo elástico G' excede el módulo viscoso G'' por aproximadamente un orden de magnitud, que ilustra la respuesta elástica predominante de estos sistemas ( Figura 5). En general, los diferentes tipos de experimentos pueden ir acompañados de corto f-barridos antes y después del experimento principal para verificar que el sistema seguía siendo imperturbado por la medida sí mismo. Sin embargo, algunas máquinas tienen que cambiar el modo de motor subyacente para los diferentes tipos de mediciones, especialmente al cambiar de experimentos dinámicos (por ejemplo, las oscilaciones de f-barre) a una rampa de tensión estática. Este cambio es acompañado a menudo por espontáneas cepas grandes destruyendo la red y templado medidas posteriores. Así, se recomienda verificar las especificaciones del reómetro utilizado.
Experimentos de reología en sistemas actina revelan un efecto dramático de la desnaturalización de la proteína que ocurre en la interfase aire-agua del sistema. Desnaturalizado las proteínas se adhieren inespecífica entre sí, formando un gel denso que muy puede dominar las propiedades mecánicas de todo el sistema. Para evitar el contacto directo de la muestra con el aire, pueden utilizarse técnicas de estabilización que también inhiben la evaporación de la humedad de la muestra. Tres métodos posibles son: (i) que rodea la cámara de la muestra con el mismo buffer en la muestra; (ii) uso de surfactantes para cubrir la interfaz debido a sus dominios hidrofóbicos e hidrofílicos (hay que tener cuidado, ya que algunos surfactantes interfieren con conformaciones de polímero); o (iii) emplear lípidos biológicamente más compatibles, con efectos similares como tensioactivos. Cabe señalar que nHTs no fueron encontrados para ser sujeto a efectos de la desnaturalización en el interfaz, y los resultados son independientes del método de estabilización (figura 6), que elimina una importante fuente potencial de error. Generalmente, la cámara de muestras siempre debe sellarse con una tapa, que puede ser equipada con esponjas húmedas para aumentar la humedad en la cámara de supresión de la evaporación.
Brevemente descrito anteriormente, una fuente potencial de error en sistemas basados en el ADN es unhybridized ADN como el ADN sobresale en defectos o en los extremos de los nanotubos, que podrían causar efectos adicionales de la reticulación. Para investigar y eliminar esta posibilidad, filamentos cortos complementarios pueden utilizarse para tapar estos extremos pegajosos. Sin embargo, nuestras propias investigaciones demostraron que la adición de capsular filamentos ningún efecto en la introducida nHTs y el comportamiento de las redes enmarañadas permaneció sin cambios (figura 7). Sin embargo, puede ser útil para otros sistemas basados en ADN (y más complejas) suprimir las interacciones no deseadas que capsula extremos pegajosos con secuencias complementarias. Además, muestras de HTs ndeben pipetearse con cuidado (por ejemplo, para pasos de dilución y preparación de la muestra) para evitar cualquier rotura u otros daños a los tubos. Si la solución se pipetea demasiado áspero, rotura de los tubos incontrolablemente, expone gran número de extremos pegajosos en defecto puntos, llevando a no deseados las interacciones entre los tubos y reticulación potenciales en el sistema. Esto interfiere con la señal y conduce a efectos de refuerzo, así como a efectos no lineales como el endurecer de tensión, que se hace visible en γ-barridos (figura 8). Así, pipetear la solución enredada sólo debe realizarse lentamente y utilizando pipetas de diámetro bastante grande (es recomendable cortar el extremo de una punta de pipeta) reducir el esquileo las fuerzas en los tubos.
En conclusión, nHTs de ADN son un sistema modelo muy adaptable y conveniente estudiar los polímeros semiflexible y a granel redes formadas a partir de estos filamentos, que representa una nueva clase de hidrogeles mecánicamente ajustables. Si los tubos son preparados cuidadosamente, pueden ser utilizados para probar el impacto del lp de los filamentos en varios casos. La medición reológica a granel de enredados redes, por ejemplo, revela que las dependencias teóricamente predichas del módulo de elasticidad con la concentración y lp son incompatibles con la escala experimental derivada leyes (figura 9)9. Este estudio enfatiza que la elasticidad de una red puede incrementarse mediante el aumento de la rigidez de los polímeros subyacentes. Tradicionalmente, aumentando la rigidez de un hidrogel se logró mediante la adición de polímeros más a la solución o induciendo reticulaciones (físicas o química) entre vecinos polímeros37,38. Sin embargo, un mayor contenido molecular también se asocia con un tamaño de malla reducida, que puede limitar aplicaciones como cultivo celular 3D. Por otro lado, vínculos cruzados, pueden inducir cambios morfológicos complejos dentro de la arquitectura subyacente de la red, que complica aún más la afinación exacta de propiedades mecánicas39. Sin embargo, utilizando redes de nHTs, permite una disociación completa de estos parámetros, por el que los efectos de endurecimiento pueden ser inducidos por únicamente cambiando la rigidez de los filamentos subyacentes dejando la malla inalteradas. Además, las arquitecturas de tubo pueden ser alteradas específicamente para integrar selectivamente los efectos adicionales como entrecruzamiento, que, del mismo modo en redes enredadas, crea más posibilidades para probar experimentalmente las predicciones teóricas para parámetros tales comol p o reticulación de tamaño y fuerza para las redes. En general, la arquitectura programable amplía el alcance de las aplicaciones, lo que permite el estudio de lp-efectos dependientes no sólo a granel sino también en el nivel de una sola molécula. Tubos etiquetados pueden ser incrustados en la red a estudiar, por ejemplo, la dependencia de lp en el movimiento unidimensional de un filamento en forma de tubo de aislamiento, comúnmente reptation (figura 10)9. Si este movimiento difusivo es visible, también verifica la naturaleza enredada de la red, puesto que se suprimió por efectos de reticulación. Análisis de la dinámica subyacente también revelan el tamaño de la malla de la red. Por otra parte, estos tubos pueden ser utilizados para investigar la dependencia de la rigidez y la quiralidad de los tubos subyacentes en la formación de paquetes40,41,42,43, 44 , estructuras 45 o de orden superior, tales como áster estrella46,47,48,49,50, que puede ser inducida por efectos de reticulación o a través de molecularmente concurridos ambientes27.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos financiación por DFG (1116/17-1) y la Facultad de Ciencias naturales de Leipzig "BuildMoNa" (SGC 185). Este trabajo ha sido apoyado a través del proyecto de Fraunhofer atraer 601 683. T. H. reconoce la financiación del Fondo Social Europeo (FSE-100077106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM - NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore - Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
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