Summary
Semiflexible polymerer visar unika mekaniska egenskaper som tillämpas i stor utsträckning av living systems. Systematiska studier av biopolymerer är dock begränsad eftersom egenskaper såsom polymer styvhet är oåtkomliga. Detta manuskript beskriver hur denna begränsning är kringgås av programmerbara DNA nanorör, aktivera experimentella studier om effekterna av glödtrådens styvhet.
Abstract
Mekaniska egenskaper hos komplexa, polymerbaserade mjuka material, till exempel celler eller biopolymer nätverk, kan förstås i varken klassisk ram av flexibla polymerer nor av styva spön. Underliggande filament förblir utsträckta på grund av deras icke-vanishing ryggraden stelhet, som kvantifieras via persistens längden (lp), men de är också föremål för stark termiska variationer. Deras ändliga böjstyvheten leder till unika, icke-trivial kollektiva mekanik av bulk nätverk, gör det möjligt för bildandet av stabila ställningar på låg volymfraktioner samtidigt som den ger stor maskstorlek. Denna underliggande princip är förhärskande i naturen (t.ex. i celler eller vävnader), minimera hög molekylära innehåll och därigenom underlätta diffus eller aktiv transport. På grund av deras biologiska konsekvenser och möjliga tekniska tillämpningar i biokompatibla hydrogels, har semiflexible polymerer varit föremål för betydande studie. Men förblev begriplig utredningar utmanande eftersom de förlitade sig på naturliga polymerer, såsom aktin filament, som inte är fritt avstämbara. Trots dessa begränsningar och på grund av syntetiska, mekaniskt avstämbara och semiflexible polymerer fastställdes aktin filament som det gemensamma modell-systemet. En stor begränsning är att den centrala kvantitet lp fritt inte kan stämmas för att studera dess inverkan på makroskopiska bulk strukturer. Denna begränsning har lösts genom att anställa strukturellt programmerbara DNA nanorör, aktivera kontrollerade ändring av glödtrådens styvheten. De bildas genom kakel-baserade mönster, där en diskret mängd av delvis kompletterande programområden hybridisera i en ringstruktur med en diskret omkrets. Dessa ringar har klibbiga ändar, möjliggör effektiv polymerisation i filament flera mikrometer i längd, och Visa liknande polymerisation kinetik som naturliga biopolymerer. På grund av deras programmerbara mekanik är dessa rör mångsidig, roman verktyg att studera effekterna av lp på singel-molekylen som bulk skalan. I motsats till aktin filament, de förbli stabila under veckorna, utan anmärkningsvärda degeneration, och deras hantering är comparably okomplicerat.
Introduction
På grund av de komplexa beteenden aktiveras med deras unika mekaniska egenskaper, är semiflexible polymerer de grundläggande byggstenarna i levande materia. I motsats till flexibla polymerer anta semiflexible polymerer en utsträckta konfigurationen på grund av deras icke-vanishing ryggraden stelhet medan fortfarande är föremål för starka termisk växlingar1. Således inte kan rent stokastiska modeller tillämpas på deras beteenden, som med ytterligheterna av fullt flexibel eller styv polymerer. Så kallade maskliknande kedja modell2,3,4 utvecklades för att kvantifiera denna stelhet via lp, vilket är konstanten förfall av tangens-tangens korrelationen längs den glödtråd4. Om lp är jämförbar med contour längden (lc) glödtrådens, betraktas polymeren semiflexible1. Analogt med polerna av ett tält, sina arrangemang i nätverk eller buntar stabiliserar hela kollektiva systemet på låg volymfraktioner, leder till ovanliga viskoelastiska egenskaper5,6,7, 8,9. Dessa strukturer ger hög elasticiteter på stora mesh storlekar10, att upprätthålla mekanisk integritet samtidigt underlätta diffus och aktiv transportprocesser. Detta boende är speciellt lämplig för biologiska system såsom cytoskelettet eller extracellulärmatrix, men det är också allmänt används i livsmedel engineering1,11,12.
Utöver deras betydelse till levande materia, är det viktigt att utförligt undersöka de fysikaliska egenskaperna hos dessa strukturer för att ha verktyg för att utveckla biomimetiska material eller romanen hydrogels. När det gäller semiflexible polymerer innebär detta systematiska bestämningen av kollektiva egenskaper för nätverk som härrör från singel-glödtråden egenskaper såsom lp och utvecklingen av en beskrivande teoretiska ram. I pionjärstudier, cellulära biopolymer actin etablerades som ett modellsystem för semiflexible polymerer och anses fortfarande allmänt vara den gyllene standard5,13,14,15 , 16 , 17. dock uttömmande studier är begränsade med detta system eftersom de är bundna till de inneboende egenskaperna hos detta protein. Olika teoretiska ansatser har som syftar till att bygga en beskrivning av de icke-triviala mekaniska beteenden på singel-glödtråden nivå och har lett till bland annat olika skalning förutsägelser för beroendet av linjära elastiska platå skjuvning modulus, G 0 (dvs. nätverket ”elasticitet”), med avseende på koncentrationen (c) och lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Medan den koncentration skalning är åtkomlig i experiment med aktin-baserade eller andra modellsystem och teoretiska förutsägelser har varit strikt verifierade13,16,24, 25, skalningen med avseende på lp har förblivit experimentellt otillgängliga. Detta är dock en stor begränsning eftersom lp är också en oberoende variabel som är utmärkande för antalet semiflexible polymerer.
Detta centrala, naturlig begränsning som följer av den fasta lp av aktin eller andra biologiskt framställda polymerer, såsom kollagen har nyligen lösts genom att anställa kakel-baserade DNA-rör, som är reglerbart i deras mekaniska egenskaper 9 , 26 , 27 , 28. små variationer i arkitekturer av rören (t.ex. olika antal konstituerande DNA strandar inom enheten ring) ge distinkta värden för lp, som kan utvärderas via fluorescensmikroskopi, antingen genom att analysera en fluktuerande tub eller genom att utvärdera de böjda konfigurationerna av flera klibbade rör, som beskrivs tidigare9,28. Dessa analyser visade att lp värden av de olika tube populationerna varierar över mer än en storleksordning och att olika utvärderingstekniker ger konsekventa resultat9,28.
Överraskande, har den övergripande skalning av linjära elastiska platå skjuvning modulus G0 med avseende på koncentrationen och lp rapporterats vara inkonsekvent med alla tidigare teoretiska infallsvinklar 9, i synnerhet visar en mycket starkare än förutsedd beroende av lp. Dessa fynd betona värdet av nya modellsystem studera de centrala egenskaperna hos semiflexible polymerer. Anställa n-helix DNA rör dramatiskt breddar räckvidden för dessa undersökningar. Inte bara kan varieras fritt lp utan att ändra det grundläggande materiellt, men den inneboende programmerbara naturen av DNA kan aktivera att systematiskt granska ytterligare element som antipyridinantikropp eller kinetiska funktions processer. Dessutom dessa rör är lösligt i vatten och, i motsats till de flesta proteiner, stabila i adekvat pH och Joniska villkor för flera veckor, utan detekterbar nedbrytning9.
Att montera dessa rör, en diskret uppsättning DNA oligonukleotider används, som innehåller två domäner som delar kompletterande bassekvensbestämning till två närliggande strängar (på grund av den specifika sekvenser, inte en enda strand bildar strukturer såsom hårnålar). De kompletterande sekvenserna hybridisera på ett cykliskt sätt, bildar slutna, halv-överlappande ringar av n sammankopplade dubbel-spiralformade segment (figur 1A och B). Dessa ringar form på en diskret diameter (figur 1 c), och deras halv-överlappande konfiguration exponerar axiella klibbiga ändarna komplement till klibbiga ändarna av en annan ring. Denna selektiva tillägg av matchande oligonukleotider utlöser en stapling av ringen, vilket leder till effektiv polymerisation av trådlika DNA helix rör av storleksanpassa n (nHT). Sin kontur längder normalt mäta flera mikrometer i längden, och deras längd fördelning är jämförbar med aktin filament9,26,27,28. Det har visat för liknande DNA nanorör att de faktiskt uppvisar polymerisation kinetik liknar dem av aktin filament och mikrotubuli
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av n HTs
Obs: här, n betecknar antalet olika enda DNA-strängar inblandade i bildandet av helix rören av en viss storlek. För n = 8, åtta olika enda DNA-strängar utgör en enhet ring.
- Köp DNA sekvenser (HPLC renhet grad eller högre) från en lämplig DNA-syntes tjänst eller utföra högkvalitativa syntes och rening (exemplariskt sekvenser anges i tabell 1).
- Omsuspendera frystorkade oligonukleotider i renat vatten och följ ytterligare resuspension stegen i motsvarande manual från företaget. Justera mängden vatten för att få en slutlig koncentration på 200 µM.
- Bestämma koncentrationer av enda DNA strandar för att kontrollera de värden som anges av återförsäljaren (t.ex. via UV-Vis spektroskopi på 260 nm) eftersom den exakta stökiometri är avgörande för monteringsprocessen. Beräkna koncentrationen av de oligonukleotider, med hänsyn till den särskilda molära vikten och utrotning koefficienten för varje enkelsträngat DNA oligonukleotiden.
Obs: Utrotning koefficient värdena inneboende varierar för olika sekvenser och anges i dokumentationen av kommersiellt tillgängliga DNA. De kan också beräknas enligt den närmaste-granne modellen med hjälp av ett antal fritt tillgängliga online-verktyg. För att uppfylla det linjära området av spektrometern, överväga att späda provet används vid bestämning av koncentration. - Med hjälp av en mikropipett, blanda DNA strands-varje på samma koncentration-i en behållare som är lämplig för termocyklern (t.ex. en 200 µL PCR-röret) att bilda den önska n HTs (slutligt buffertvärde villkor: 1xTE (10 mM Tris och 1 mM EDTA, pH 8) och 12,5 mM MgCl 2).
Obs: Sista DNA n HT-prov består av n - 1 strandar, U 1 − U n − 1 och en T n strand. Koncentrationen per strand kan variera från sub-mikromolära till mer än 10 µM, beroende på användarens behov (t.ex. < 1 µm per strand för efterföljande utspädning att iaktta enda filament eller högre koncentrationer för undersökning av finmaskigt nät mekanik). - Hybridisera n HTs i en termocykler (denaturering för 10 min vid 90 ° C, med en efterföljande snabb drop till 65 ° C, långsam temperatur minskning från 65 ° C till 55 ° C, med kompletterande bas ihopparning i 20 temperaturen steg -0,5 k för 30 min varje; (och en snabb minskning från 55 ° C till 20 ° C); Se figur 2A.
Obs: Långsam minskning stegen från 65 ° C kan förlängas för att öka den genomsnittliga rörlängd; den efterföljande snabb drop till 20 ° C är dock mycket viktigt att undvika sammanläggning av polymeriserat rör. - Lagra hybridiserade n HTs för upp till 3 veckor vid 4 ° C utan detekterbar nedbrytning.
Obs: För fluorescens är mikroskopi, märkt n HTs hybridiseras genom att (delvis) ersätta U1 med den modifierade U1-Cy3 (tabell 1). För längre observation tider, tillägg av etablerade anti-blekning agenter är tillrådligt. - Noggrant späd provet till önskad slutliga koncentration (t.ex. 4 µM för nätverk eller 20 nM för singel-glödtråden observationer) med prov bufferten, om det behövs. För att minimera möjliga felkällor, montera prover på önskad slutlig koncentration.
2. Skeva reologi
- Välj en lämplig geometri (plattan-platta eller kon-platta) för den dynamiska skjuvning reometer. För små volymer (dvs nedanför 200 µL), använda kon-plattan geometrin.
- Ladda provet på den dynamiska skjuvning reometer.
- Passiverande luft-vatten gränssnittet för provet och miljön använda följande steg för att förhindra potentiella avdunstningen effekter.
- Omger provet med 2,5 mL av provet buffert badet.
- Lägga till ett ytaktivt ämne precis nedanför micelle koncentrationen.
- Använd en spruta för Hamilton för att omge provet med en lipid att undvika direktkontakt av provet med luft.
- Tätning provkammaren med badmössa utrustad med våt tvättsvamp och, om möjligt, med en ytterligare vattenbad (inte i kontakt med provet) att ytterligare undertrycka avdunstning.
- Starta mätningen med programvaran reometer-specifika i rumstemperatur, alternativt utföra mätning vid olika temperaturer, såsom 37 ° C (om fysiologiska villkor krävs).
Obs: Kylning provet åtföljs ofta av kondensation av vattenånga från omgivande luft, medan värme leder till ökad avdunstning. Både effekter okontrollerat kan ändra koncentrationen av provet, så att alla mätningar i en serie bör utföras vid en konstant temperatur. - Tillåt provet temperera för 2 h i rumstemperatur. Tidsutvecklingen kan övervakas med ett tid-svep (en data pekar per minut; Sila γ = 5%; frekvens f = 1 Hz).
- Mäter de mekaniska egenskaperna med de önskade testprotokoll. Börja med en serie av frekvens svep (f-sveper) eftersom de lämna provet intakt och möjliggöra fler mätningar.
Obs: Dessutom korta f-svep bör utföras före och efter längre mätningar (såsom långa f-sveper med en mycket högre upplösning) att verifiera att provet var oförändrad under hela full measurement protocol.- Utför en kort f-svep (t.ex. γ = 5%; f = 0,01 Hz till 30 Hz; 5 datapunkter per årtionde).
- Utföra en lång f-svep (t.ex. γ = 5%; f = 0,001 Hz till 30 Hz; 21 datapunkter per årtionde); låg frekvens regimen kan utelämnas om inte nödvändiga för att minska mättiden.
- Utför en kort f-sopa.
- Utföra en γ-sopa (t.ex. f = 1 Hz; γ = 0.0125 100%. 20 datapunkter per årtionde).
Obs: Använd kort f - sopa först, eftersom det är vanligtvis oförenligt med tidigare f - sveper eftersom nätverk brukar brista under γ-sopa eller lossna från plattorna. Alternativt använda γ-ramp (t.ex. = 0,025 s -1, t = 60 s); ramperna kräver dock vanligtvis ändra motor-läge, så efterföljande korta f-sveper skulle falsifieras.
- Bin eller slät rådata med k├ñrna Gaussisk.
3. fluorescens-assisted analys av glödgning DNA
- förbereda 8 portioner av 12 µL för varje prov med 1-4 µM DNA per strand, 12,5 mM MgCl 2 i 1 x TE buffert och 1 x nukleinsyra gel fläcken från en 10.000 x DMSO lager. Gör en negativ kontroll med ingen DNA, men inkluderar nukleinsyra gel fläcken.
- Överföra alikvoter till en realtids PCR-plattan och försegla med självhäftande film (t.ex. en platta med 96 brunnar reaktion).
Obs: De höga temperaturer som används i den termiska glödgning protokoll avdunstar prover. Alltså, se till att brunnarna förseglas tätt med självhäftande film att förhindra vatten avdunstning och koncentrationen ökar, särskilt under långsiktiga experiment. - Centrifugera plattan på 100 x g för 1 min i rumstemperatur ta bort gasbubblorna; om gasbubblorna expanderar, brunnarna kan inte analyseras.
- Ladda förseglade plattan i ett realtidssystem med kvantitativ PCR.
- Kör en glödgning programmet. Denaturera DNA vid 90 ° C i 10 min. droppa temperaturen snabbt till 72 ° C. Sedan sänka temperaturen långsamt av 0,5 ° C varje 30 min. Efter signalen har skämda, påskynda temperatur rampen.
Obs: 72 ° C är tillräckligt för över den verkliga hybridiseringstemperatur; Således, signalen är inspelad över ett brett temperaturområde som är lämpliga för att fastställa nödvändiga temperaturintervallet. - Kontrollera att locket på apparat som värmer till minst 100 ° C att förhindra kondensering av avdunstat prov på den självhäftande filmen.
- Under monteringen, excitera proverna med en argon-Jon laser på 488 nm och upptäcka fluorescensen vid 550 nm när du använder en nukleinsyra gel fläck (eller spektralt liknande). För andra färgämnen, välja en lämplig excitation/utsläpp kombination. Mäta fluorescens signalen så ofta som möjligt för att öka totalt signalkvalitet med den inbyggda kameran.
Obs: Här, mätningar togs varje 9 s. - Om förinställda smältning och glödgning program tillämpas, använda den medföljande programvaran för att analysera data. Om inte, subtrahera tidigare medelvärdet från medelvärdet för varje temperatur steg att erhålla den relativa förändringen av fluorescerande signalen.
4. AFM Imaging
- klyva glimmer (t.ex. mica " V1 ") genom att bifoga kommersiellt tillgängliga tejp och slet det bort, det översta lagret av glimmer bör tas bort.
- Med hjälp av en mikropipett, insättning redan bildade n HT i Mg 2 + som innehåller fällbara buffert på den nybakade klyvs glimmer och låt den nöja sig med 10 min.
- Snurra proverna i kort 3-s intervaller på 2 000 x g på en liten tabell centrifug att avlägsna den återstående vätskan. Flera n HTs bör fortfarande kopplas till ytan glimmer.
- Använder en fribärande spets med en hög styvhet (t.ex. 54 Nm -1) och avgöra dess resonansfrekvens med den interna AFM programvaran.
- Record höjd profilen med AFM i luften att knacka läge vid låg scan skattesatser (t.ex. 1 rad/s) för att undvika skada eller undantränger n HTs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Montering av DNA nanorör via en temperatur ramp (figur 2) är en mycket tillförlitlig metod att bilda dessa konstgjorda semiflexible polymerer. Dessa polymerer har jämförbara egenskaper till sina naturligt förekommande motsvarigheter, till exempel aktin filament, men ger en mycket bredare experimentella ram eftersom deras mekaniska egenskaper kan controllably ändras9,27 . Som biopolymerer, de kan ordnas i nätverk (figur 3) och tillåter uttryckligen en att testa effekterna av glödtrådens styvheten på bulk strukturer och egenskaper. I figur 4visas dessa nätverk visas en linjär stam regim för stammar upp till 10%, vilket liknar egenskaperna hos nätverk av aktin filament. Inom denna regim, kan linjär skjuvning reologi lätt tillämpas, till exempel för att bestämma DNA nanotube nätverk sonderade på olika frekvenser9elastiska och viskösa svar. Dessa provningar visar att dessa nätverk huvudsakligen beter sig elastiskt (figur 5). Till skillnad från mätningar med proteiner, dessa rör inte denaturera på gränssnittet luft-vatten av provet och därför sofistikerade passivering strategier är krävs (figur 6). Därför, hantering av proverna är ganska enkelt och har visat sig vara mycket robust, ger konsekventa resultat med låga prov till prov variationer.
Men kan frågan om huruvida gratis ”klistriga ändar” oparade enkelsträngat DNA i båda ändar av varje tub framkalla oönskade, stokastiska hybridisering händelser återstod. För att lösa detta problem, har kompletterande ”slut cap” sekvenser som täcker ändarna av röret lagts till provet efter hybridisering processen var komplett. Figur 7 illustrerar dock att tak ändarna på trådarna har ingen påvisbar påverkan och att röret ändarna inte framkalla någon övergående crosslinking effekt i nätverket9. Sticka händelser endast spela en betydande roll när provet hanteras också ungefär och rören bryta på grund av hård pipettering. Dessa brott punkter verkar faktiskt orsaka crosslinking verkningar, leder till icke-linjära Svaren av systemet, såsom stam stelhet (figur 8).
Om proverna är noggrant förberedda, kan de användas för att testa den inverkan som antingen glödtråden koncentrationen (figur 9A) eller glödtråden stelhet (figur 9B)9 har på de mekaniska egenskaperna hos nätverk bestående av Semiflexible polymerer. För första gången studerades kvantitativa anslutningen mellan glödtråden stelhet och nätverk elasticitet experimentellt och systematiskt, vilket ger en linjär kraft rätt beteende, vilket motsäger dominerande teoretiska förutsägelser. Dessa resultat visar att DNA nanorör är ett nytt, mångsidiga verktyg för att studera effekterna av semiflexible polymerer, som var tidigare experimentellt otillgängliga9,27. Nu, olika teorier kan försöksvis testas, som inbegriper uttalanden om beroenden på persistens längd lp av glödtrådarna. Mycket grundläggande effekter, såsom reptation (figur 10), kan dessutom undersökas från olika perspektiv genom att anställa rören som varierar i styvhet.
| Namn | Sekvens | ||
| U1: a1 *-b1 *-a2-b2 | GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U1-Cy3: a1 *-b1 *-a2-b2 | Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U2: a2 *-b2 *-a3-b3 | GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT | ||
| U3: a3 *-b3 *-a4-b4 | GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT | ||
| U4: a4 *-b4 *-a5-b5 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT | ||
| U5: a5 *-b5 *-a6-b6 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT | ||
| U6: a6 *-b6 *-a7-b7 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG | ||
| U7: a7 *-b7 *-a8-b8 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA | ||
| U8: a8 *-b8 *-a9-b9 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA | ||
| U9: a9 *-b9 *-a10-b10 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC | ||
| U10: a10 *-b10 *-a11-b11 | TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT | ||
| U11: a11 *-b11 *-a12-b12 | AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA | ||
| U12: a12 *-b12 *-a13-b13 | ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA | ||
| U13: a13 *-b13 *-a14-b14 | GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC | ||
| T4: a4 *-b4 *-a1-b1 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T5: a5 *-b5 *-a1-b1 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T6: a6 *-b6 *-a1-b1 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T7: a7 *-b7 *-a1-b1 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T8: a8 *-b8 *-a1-b1 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T9: a8 *-b8 *-a1-b1 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T10: a10 *-b10 *-a1-b1 | GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T14: a14 *-b14 *-a1-b1 | TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| ändlock A1 | CCTAATCGCC | ||
| ändlock A2 | CCTTTAGATCC | ||
| ändlock A3 | CCACTCTTCC | ||
| ändlock A4 | CCGTGAGAACC | ||
| ändlock A5 | CCGCACGACC | ||
| ändlock A6 | CCAACGATGCC | ||
| ändlock A7 | ATGCACCTCC | ||
| ändlock A8 | AACGGTAACTA | ||
| ändlock B1 * | ACGCTAAGCCA | ||
| ändlock B2 * | ACCAGATACA | ||
| ändlock B3 * | ACAAGATGTCA | ||
| ändlock B4 * | ACGCATTGCA | ||
| ändlock B5 * | ACTGTCGAACA | ||
| ändlock B6 * | ACTTCTATCA | ||
| ändlock B7 * | CATTCAAAGCT | ||
| ändlock B8 * | TCCCAAGTCA | ||
Tabell 1: Exempel på DNA sekvenser för hybridisering av nHTs visas i figur 1 c, som användes också i tidigare studier på nHTs9, Class = ”xref” > 26,27,28. Givna sekvenser möjliggör montering av sju olika tube arkitekturer (t.ex. a1 hybridizes med den kompletterande sekvens a1 *). Andra tube arkitekturer inte ges här kan också bildas av addition eller subtraktion av strängar som åtföljs av den enligt ringbildning strand n med U1.
Figur 1: Tube församling och arkitektur. (A) Schematisk av en 4HT församling bildades av fyra distinkta 42-mers. Intilliggande enkelsträngat DNA-strängar hybridisera genom kontinuerlig alternerande domäner av 10-11 baser, indikeras av långa svarta fästingar (kort svart fästingar ange unhybridized baser). Detta halv-vacklade motiv har klibbiga ändarna på båda sidor längs axeln, anges möjliggör axiella tillväxt, av pilen. Den gräns delarna U1 och T4 har även kompletterande domäner och således bildar en sluten ring, som indikeras av pilen till höger. Observera att denna skiss är en 2D representation; hybridiserade skick, delarna bildar dubbla spiraler och alla baser är parade. (B) Quasi-3D Schematisk bild av en 4HT tetramer med två dubbla spiraler omfattas i skuggade avlägsna lager. Dubbla spiraler bildar för kompletterande domäner och är kopplade till båda angränsande dubbla spiraler av röret en gång per enhet längd element. En U2 strand dras tjockare för tydlighet. (C) ges exempel på sju olika tube arkitekturer, med strand nummer från 4 HT 14 HT och lp allt från 1,2 till 26 µm. (D och E) Epi-fluorescerande bilder av Cy3-märkt, adsorberat 5 HT och 10 HT illustrera de olika stiffnesses via annorlunda svängda konturer. Överlägget röd är glödtråden konturen hittade via bildanalys, med end-to-end avstånd R och kontur längd lC. Figur anpassad från Schuldt et al9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: temperatur ramp och motsvarande montering av DNA nanorör. (A) det DNA nanorör är monterade i en termocykler via ett protokoll som innehåller flera distinkta temperaturen steg över ungefär 11 h. (B) i ett realtid kvantitativa PCR-system, den relativa förändringen av fluorescerande signalen av färgade trådar är ett mått för nybildade dubbelsträngat DNA samtidigt gå igenom temperatur rampen. Beroende på vilken typ av DNA nanorör, kan andelen sammansättningen variera. Desto mer komplexa bilda struktur, bredare församlingen, förmodligen sedan fler kardeler (och därför mer segment med olika sekvenser och lokala glödgning temperaturer) behöver hybridisera på rätt befattningar, en process som drivs av Stokastiska termiska variationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representant AFM bilden av en intrasslad nätverk av 8HTs vid 4 µM. Höjd profilen av ett förformade nätverk av 8HTs absorberas till en yta med glimmer spelades använder knacka läge i luften. AFM bilder visualisera en 2D projektion av nätverket men möjliggör inte tillförlitlig extraktion av data (t.ex. maskstorlek) för 3D fallet eftersom rören samt nätverken är komprimerade i en 2D-konfiguration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: linjära området. Sila mätningar (G' = 1 Hz) avslöja en bred linjära elastiska platå, utan tecken på crosslinking effekter såsom den icke-linjära beteende manifesteras som stam härdning. Ovan en karakteristisk stam (olika för varje nHT) bryter elastisk platå modulus av irreversibelt. Felstaplar varje representerar standardavvikelsen för medelvärdet av alla utförda mätningar. Figur anpassad från Schuldt et al9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: typisk frekvens beroende av en intrasslad 6HT nätverk. Nätverk av DNA rör visar en bred elasticitet platå över fyra storleksordningar, beroende på tillämpad frekvensen. Som förväntat för en polymer nätverk, den elastiska delen (G') av den komplexa skjuvning modulus är betydligt högre än den trögflytande del (G''). Figur anpassad från Schuldt et al9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Inga luft-vätska gränssnitt effekter. Frekvens svep (f-sveper; γ = 5%) av 8HT visade prov på 8 µM att påverkan av avdunstning och gelation effekter vid gränssnittet luft-vatten är försumbar. Olika Jämviktstiden gånger, liksom två metoder kända för att drastiskt minska protein kluster på gränssnittet (tensider och lipider), användes. Oberoende av metoden, utan angivande av drastiska påverkan genom avdunstning eller surface elasticitet registrerades. Här, G' representerar elasticitetsmodul och G'' representerar viskösa modulus (streckade linjer). Figur anpassad från Schuldt et al9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: ingen påverkan av slutet modifiering. Elastisk platå modulus konstant när tak de klibbiga lediga ändarna av 8HTs med sina respektive kompletterande sekvenser. Figur anpassad från Schuldt et al9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: påverkan av hantering av förformade DNA nätverk på mätning. Beroende på hur de förformade nätverk hanteras efter hybridisering, skilja mätningarna. I det här exemplet skjuvning flödet under pipettering av DNA nanorör har varierats drastiskt, och rör bröt om hanteras alltför grovt. Brott leder till oönskade interaktioner mellan utsatta, kompletterande singel-strands korrelera till trasiga eller brusten segment, som leder till en ökning i elasticitet och inducerar icke-linjära effekter, sUCH som anstränga härdning (ökning av elasticitet för stora stammar, grön kurva). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: DNA nanorör aktivera studiet av lp beroenden. (A) studerar nätverk av semiflexible polymerer med nHTs gör utredningen av den mekaniska Svaren av systemet med ökande koncentration (koncentration Svep), analogt med studier baserade på biopolymerer såsom aktin. (B) dessutom de olika arkitekturerna av rören underlätta bestämning av den mekaniska svaren med avseende på den varierande lp av den underliggande filament, vilket är omöjligt med naturligt förekommande Semiflexible polymerer. För detta ändamål, är data från A ombyggt till adress skalningen av elastisk platå modulus avseende lp. Felstaplar varje representerar standardavvikelsen för medelvärdet av alla utförda mätningar. Figur anpassad från Schuldt et al9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Reptation och mesh storlek. Inspelning fluorescens bilder av reptating filament (singel-märkt DNA 8HT inbäddade i ett omärkt nätverk; c = 14 µM) kan användas för att kontrollera intrasslad arten av glödtrådarna i nätverket. Några crosslinking effekter skulle hindra detta endimensionell diffusion. Infällt: Reptation analys kan användas för att bestämma maskstorlek skalning med koncentrationer, som väl kan jämföras med aktin mätningar och instämmer med teoretiska förutsägelser30. Felstaplar varje representerar standardavvikelsen för medelvärdet av alla utförda mätningar. Figur anpassad från Schuldt et al9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att erhålla korrekt bildade nätverk, är montering DNA nanorör ett avgörande steg. Fel under syntesprocessen negativt tube kvaliteten; Det rekommenderas därför att HPLC eller en strängare process används för att rena oligonukleotider. Eftersom bildandet av diskreta snarare än aggregerade DNA nanorör, liksom deras längd distribution, beror på den equimolar stökiometri av de n konstituerande oligonukleotider inom den, är det nödvändigt att omvärdera koncentrationerna av köpta slingor, sedan givna värden kan variera avsevärt från den faktiska koncentrationen. Detta kan utföras, exempelvis av UV-Vis spektroskopi på en absorbans våglängd av 260 nm. Vi vill påpeka att molekylvikten och utplåningkoefficienter varierar mellan de olika sekvenserna; värdena att översätta absorbansen i koncentration bör därför fastställas för varje DNA oligonukleotiden. När du använder utrustning optimerad för små provmängder, såsom en NanoDrop, bör varje mätpunkt tagit flera gånger och i genomsnitt. Uppfylla det linjära området av upptäckt av spektrometern. Späd det bråk som används vid bestämning av koncentration om det behövs. Mindre felaktigheter kan ha en stor inverkan på rätt stökiometri och kvaliteten av röret bildas; Därför måste att pipettering av de singeln strandar vara så exakt som möjligt. Därefter ska slutligt provlösningen blandas grundligt av långsamt pipettering provet upp och ner innan du placerar den i termocyklern. Om strands har ändrats med fluorescerande färgämnen för visualisering, ska alla åtgärder utföras i en miljö som är skyddad från direkt ljus, och senare tillägg av etablerade anti-blekning ombud (dvs syre rensning system, såsom glukos oxidas/katalas) rekommenderas. Efter de singeln strandar har blandats i rätt buffert villkoren, tillämpas en temperatur ramp för att hybridisera strukturer (figur 2A). Denna temperatur mönster följer tidigare fastställd kritisk hybridisering temperaturen, där DNA dubbla spiraler form. Flera metoder har utvecklats för att analysera DNA hybridisering kinetik (dvs infödda DNA UV absorbansen31, kalorimetri32eller fluorescerande färgämnen33). I den senare metoden intercalate färgämnen i DNA dubbla spiraler, bildar mycket fluorescent komplexen ljusare än de obundna färgämnena. De binder delvis till dubbelsträngat men inte till enkelsträngat DNA34. Därför sådana färgämnen har tillämpats för att övervaka DNA nanostruktur självmontering i systemet35 och kan användas för att identifiera idealisk monteringsförhållanden.
Inledningsvis några dubbelsträngat DNA i provet, såsom fördefinierade och oförutsedda duplex, är denaturerad vid hög temperatur (90 ° C) att undvika oavsiktliga bas ihopkoppling. En efterföljande gradvis minskning av temperatur (liknande figur 2A) minskar thermalen vinkar av de DNA-strängar, aktivera bas paring händelser. På grund av minimering av den fria energin hybridisera DNA-strängar företrädesvis på deras kompletterande sekvenser. När en dsDNA-specifika intercalating dye används, ökar ljusstyrkan med bildandet av starkt fluorescerande komplex, vilket i sin tur är ett kvantitativt mått för nybildade dubbelsträngat DNA34. Den relativa förändringen av fluorescens signalen för bildandet av 4HTs och 8HTs är inritade i figur 2B. Denna relativa förändring beräknas genom genomsnitt fluorescensintensiteten för varje temperatur och sedan subtrahera det genomsnittliga värdet av tidigare temperaturen. Med minskande temperatur, en förhöjd fluorescens kan vara upptäckt (figur 2B), och toppen av denna kurva belyser den temperatur där massiva hybridisering händelser inträffar. Släpp av kurvorna avser intensitetsvärdena når en platå. Beroende på den DNA konstruktionen och dess komplexitet (t.ex. en liten eller stor uppsättning DNA strandar), kan toppen vara skarpa (figur 2B, blå kurvan) eller bred (figur 2B, grön kurva). När det är möjligt ska detta testas för varje nydesignade struktur för att säkerställa att den successivt minskande del av rampen med temperatur innehåller intervallet där bildandet av rören via bildandet av hybridiserade dsDNA segment förekommer. Efter lämplig temperatur bestäms regim, nanostrukturer framgångsrikt kan monteras i trånga temperaturområden (figur 2B, blå kurvan), eller ens isothermally35. Observera att hybridisering av flera DNA strandar i periodiska galler inducerar kooperativa glödgning effekter35,36, som stöder ytterligare DNA glödgning. Det bör övervägas att infoga färgämnen sträcka DNA spiraler bortom deras standard 10,5 baspar per spiralformade tur konfiguration, således att ändra den övergripande geometrin av rören. Det är därför inte lämpligt att höja koncentrationen färgämne över en molekyl per 900 DNA baspar35. Dessutom kan topp församlingen temperaturen avvika från den faktiska optimal glödgning temperaturen. Att uppnå hög precision och att bestämma den bästa förutsättningen för tube bildandet, bör DNA hybridisering utredas under många långsamt föränderliga temperaturen steg, som bör dubbelkontrolleras med agaros gelelektrofores. För fallet av DNA nanorör etablerade vi ett tre-stegs-protokoll. Det första upphettas provet till 90 ° C att denaturera DNA in singeln strandar. Därefter är ett brett temperaturområde (runt församlingen toppen av fluorescens signalen) täckt. I vårt fall täcks en rad 10 ° C, alltifrån 65 ° C till 55 ° C, med en steg -0,5 ° c varje 30 min. I det sista steget, bör temperaturen snabbt sjunka till rumstemperatur - eller, som i vårt fall, 20 ° C - för att förhindra eventuella ogynnsamma interaktioner vid mellanliggande temperaturer (figur 2A). Vanligtvis hetta thermocyclers proverna från kallare temperaturer. Därför är det viktigt att justera temperaturen på locket för att begränsa avdunstning av vätskan i provet under monteringen, vilket ökar den slutliga prov koncentrationen.
Om nHTs bildas på lämpligt sätt, ordna de i rent intrasslad nätverk (figur 3), utan interaktioner orsaka crosslinking effekter mellan olika rör. Antipyridinantikropp skulle förmodligen resultera från oparade DNA-segment som sträcker sig från defekter längs en tub eller på klibbigt avslutar, som skulle vara fri att para ihop med kompletterande enkelsträngat segment på närliggande rör. Dessa effekter skulle framkalla icke-linjära egenskaper, såsom stam härdning (öka G' för större stammar), men de är frånvarande i intrasslad nätverk (figur 4). De visas γ-sveper också avslöja de lämpliga linjära stam regimerna för reologiska mätningar i allmänhet. Över ett visst tröskelvärde, nätverket spricker eller förlorar kontakten med pläterar av den reometer, som irreversibelt skadar systemet. Tillämpad stammar bör därför i den linjära regimen att erhålla tillförlitliga uppgifter. En stam av 5% är vanligtvis tillräckligt för att ge data väl över buller regimen. Högre stammar kan tillämpas; dock de närma enkelt sig tröskeln för bristning, och resultaten kan vara förfalskEd på grund av mätning i den icke-linjära regimen.
Reologiska mätningar kräver en noggrann och konsekvent beredning av provet och noga övervägt mätning protokoll att erhålla reproducerbara och tolkningsbara resultat. Den centrala punkten är att upprätta ett helt slumpmässigt, isotrop nätverk mellan reometer plattorna eftersom dessa nätverk är mestadels endast reproducerbara struktur. Därför behövs ganska lång Jämviktstiden gånger (vanligtvis runt 2 h, ibland ännu mer) att skingra några beställning effekter som uppstår på grund av skjuvning-inducerad anpassning under den pipettering av provet. Förtest experiment rekommenderas för inspelning tidsutvecklingen (tid Svep) av systemet under Jämviktstiden för att fastställa den nödvändiga tidsramen. När signalerna når platåer utan ytterligare ändringar, är systemet utjämnad. En gång Jämviktstiden villkor har fastställts, de önskade testerna, såsom en stam ramp eller f - eller γ-svep, kan utföras. Testa ett brett spektrum av stammar kan slutligen förstöra nätverket eller anslutningen till plattorna. Dock om tester är begränsade till stammar under tröskeln bristning, kan stam ramper och sveper iterativt upprepas för att undersöka potentiella effekter av åldrande eller hysteres. När det gäller f-sveper, mättider kan variera avsevärt. Testning låga frekvenser dramatiskt förlänger experiment, eftersom en svängning kan ta flera minuter. Observera att, när det gäller nHTs, f-sveper avslöja att elasticitetsmodulen G' överskrider trögflytande modulus G'' av ungefär en storleksordning, som illustrerar den dominerande elastisk Svaren av dessa system ( Figur 5). I allmänhet olika typer av experiment kan åtföljas av kort f-sveper före och efter det viktigaste experimentet att verifiera att systemet förblev opåverkade av mätningen själv. Vissa maskiner måste dock ändra underliggande motor läge för olika typer av mätningar, särskilt när du byter från dynamiska experiment (t.ex. svängningar för f-sveper) till en statisk belastning ramp. Denna förändring åtföljs ofta av spontana stora stammar förstöra nätverket och anlöpning efterföljande mätningar. Således, det rekommenderas att kontrollera specifikationerna i den reometer används.
Reologi experiment på aktin-baserade system visar en dramatisk effekt av protein denaturering uppstår på gränssnittet luft-vatten systemet. Denaturerade proteiner fäster ospecifikt vid varandra, så att de bildar en tät gel som starkt kan dominera de mekaniska egenskaperna av hela systemet. Undvik direkt kontakt av provet med den omgivande luften, kan passivering tekniker som också hämmar avdunstning av vattnet innehållet i provet användas. Tre möjliga metoder är: (i) omger provkammaren med samma bufferten som i provet, (ii) med tensider för att täcka gränssnittet på grund av sina hydrofoba och hydrofil domäner (man måste vara försiktig, eftersom vissa tensider störa polymer konformationer); eller (iii) anställa mer biologiskt kompatibel lipider, med liknande effekter som tensider. Det bör noteras att nHTs befanns inte vara föremål för denaturering effekter på gränssnittet, och resultaten är oberoende av passivering metoden (figur 6), vilket eliminerar en stor potentiell felkälla. I allmänhet bör provkammaren alltid tätas med en mössa, som kan utrustas med fuktig tvättsvamp för att öka luftfuktigheten i kammaren, undertrycka avdunstning.
Som kortfattat beskrivs tidigare, en potentiell felkälla i DNA-baserade system är unhybridized DNA, såsom oparade enkelsträngat DNA överhäng på defekter eller i ändarna av nanorör, vilket kan orsaka ytterligare crosslinking effekter. För att undersöka och/eller eliminera denna möjlighet, kan kompletterande korta slingor användas till cap dessa klibbiga ändar. Men visade våra egna undersökningar att tillägg av tak trådar hade ingen effekt på den introducerade nHTs och beteendet hos de intrasslade nätverk förblev oförändrade (figur 7). Dock kan det vara användbart för andra DNA-baserade (och mer komplexa) system att undertrycka oönskade interaktioner tak klibbiga slutar med kompletterande sekvenser. Dessutom prover av nHTs bör vara pipetteras noggrant (t.ex. för utspädning steg och provberedning) att förhindra eventuella brytande eller andra skador på rören. Om lösningen är pipetteras alltför ungefär, rören bryta okontrollerat, exponera stort antal klibbiga slutar vid defekt punkter, vilket leder till oönskade interaktioner bland rören och potentiella crosslinking i systemet. Detta stör signalen och leder till stelhet effekter, liksom till icke-linjära effekter såsom stam härdning, vilket blir synligt i γ-svep (figur 8). Således, pipettering intrasslad lösningen bör endast göras långsamt och använder pipettspetsar med ganska stor diameter (skära i slutet av en pipettspetsen är tillrådligt) att minska skeva styrkor på rören.
Sammanfattningsvis är DNA nHTs lämplig och mycket anpassningsbara modellsystem studera semiflexible polymerer och bulk nätverk bildas från dessa filament, som representerar en ny klass av mekaniskt avstämbara hydrogels. Om rören tillreds med omsorg, kan de användas för att testa effekterna av lp av glödtrådarna i olika fall. Bulk Reologisk mätning av intrasslad nätverk, till exempel, avslöjar att de teoretiskt förväntade beroendena av elasticitetsmodulen med koncentration och lp är oförenliga med den experimentellt härledda skalning lagar (figur 9)9. Denna studie betonar att elasticiteten i ett nätverk kan ökas genom att öka styvheten i de underliggande polymererna. Traditionellt, uppnåddes öka styvheten i en hydrogel genom att lägga till mer polymerer i lösningen eller inducera antipyridinantikropp (fysisk eller kemisk) mellan angränsande polymerer37,38. Dock är en högre molekylär innehåll också förknippat med en reducerad maskstorlek, vilket kan begränsa program såsom 3D cellodling. Antipyridinantikropp, däremot, kan inducera komplexa morfologiska förändringar inom den underliggande nätverksarkitektur, vilket ytterligare komplicerar exakt trimning av mekaniska egenskaper39. Med hjälp av nätverk av nHTs, dock möjliggör en fullständig frikoppling av dessa parametrar, whereby stelna effekterna kan induceras genom att enbart ändra styvheten i underliggande glödtrådarna medan maskstorlek oförändrade. Dessutom kan de tube arkitekturerna specifikt ändras för att selektivt integrera ytterligare effekter såsom crosslinking, som likaså i trassliga nät, skapar ytterligare möjligheter för att experimentellt testa teoretiska förutsägelser för parametrar såsoml p eller crosslink storlek och styrka för nätverk. I allmänhet, programmerbara arkitekturen breddar räckvidden för program, vilket möjliggör studier av lp-beroende effekter inte bara i bulk, men också på nivån singel-molekyl. Märkt rören kan bäddas i nätverket för att studera, till exempel beroende av lp på den endimensionella rörelsen av en glödtråd i rörliknande instängdhet, vanligen kallat reptation (figur 10)9. Om denna diffus rörelse syns verifierar den också intrasslad beskaffenhet i nätverket, eftersom det skulle undertryckas av crosslinking effekter. Analysera den underliggande dynamiken avslöjar också maskstorleken på nätverket. Dessutom kan dessa rör användas för att undersöka beroendet av styvheten och kiralitet av underliggande rören på bildandet av buntar40,41,42,43, 44 , 45 eller högre ordningens strukturer, såsom stjärnliknande astrar46,47,48,49,50, som kan induceras av crosslinking effekter eller via molekylärt trånga miljöer27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner att finansiering av DFG (1116/17-1) och Leipzig skola av naturvetenskap ”BuildMoNa” (GSC 185). Detta arbete har stötts genom Fraunhofer Attract projektet 601 683. T. H. erkänner finansiering från Europeiskasocialfonden (ESF-100077106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM - NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore - Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
References
- Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
- Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
- Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
- Doi, M., Edwards, S. F. The Theory of Polymer Dynamics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1986).
- Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
- MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A.
- Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
- Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
- Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
- Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
- Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
- Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
- Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
- Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A.
- Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
- Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J.
- Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
- Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
- Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
- Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
- Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
- Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
- Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
- Hinsch, H., Frey, E. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat]. , Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009).
- Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
- Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
- Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
- de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
- Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
- Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
- You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
- Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
- Sobczak, J. -P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
- Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
- Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
- Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
- Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
- Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
- Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
- Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
- Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
- Strehle, D., et al.
- Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
- Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
- Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).
