Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

DNA nanotüpler Semiflexible polimerler eğitim için çok yönlü bir araç olarak

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56056
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1, 1,2, 1, 1, 1,2, 2, 1
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig
* These authors contributed equally

Summary

Semiflexible polimerler canlı sistemler tarafından yaygın olarak uygulanan benzersiz mekanik özellikler görüntüler. Ancak, polimer sertlik gibi özellikleri erişilemez olduğundan biyopolimer sistematik çalışmalar sınırlıdır. Bu müsvedde filaman sertlik etkisi üzerinde deneysel çalışmalar etkinleştirme programlanabilir DNA nanotüpler tarafından bu sınırlama nasıl hile açıklar.

Abstract

Mekanik özellikleri maddenin karmaşık, polimer esaslı yumuşak hücreleri veya biyopolimer ağlar, gibi ben de klasik çerçevede esnek polimerlerin ne de katı çubuklar anlaşılabilir. Temel filamentler hangi sebat uzunluğu (lp) sayısal, onların sigara ufuk omurga sertlik nedeniyle, uzanmış kalır ama onlar da güçlü termal dalgalanmalara tabidir. Onların sonlu bükme sertlik büyük kafes boyutları sağlarken, düşük hacimli kesirler istikrarlı iskele oluşumunu sağlayan toplu ağlarını, benzersiz, önemsiz olmayan toplu mekaniği yol açar. Bu temel prensip yüksek moleküler içeriği ve böylece diffusive kolaylaştırmak veya aktif taşıma en aza indirme (Örneğin, hücreleri veya doku), doğada yaygındır. Onların biyolojik etkileri ve Biyouyumlu hydrogels potansiyel teknolojik uygulamalar nedeniyle, semiflexible polimerler tabi önemli çalışma olmuştur. Ancak, ondan beri onlar gibi serbestçe ayarlanabilir değildir aktin filamentleri doğal polimerler dayanıyordu anlaşılır araştırmalar zorlu kaldı. Bu sınırlamalar rağmen ve sentetik, mekanik olarak ayarlanabilir ve semiflexible polimerler eksikliği nedeniyle aktin filamentleri ortak modeli sistem olarak kurulmuştur. Merkezi miktar lp serbestçe makroskopik toplu yapıları üzerindeki etkisini incelemek için ayarlı değil bir büyük kısıtlamadır. Bu sınırlama ile kontrollü filaman sertlik İLETİMLERİNİZE etkinleştirme yapısal olarak programlanabilir DNA nanotüpler istihdam ederek giderilmiştir. Onlar nerede kısmen tamamlayıcı iplikçikleri ayrı bir dizi melezlemek ayrı bir çevresi ile bir yüzük yapıda kiremit tabanlı tasarımlar meydana gelir. Bu halkalar yapışkan biter, etkili polimerizasyon filamentler içine birkaç mikron uzunluğunda, etkinleştirme özelliği ve benzer polimerizasyon Kinetik doğal biyopolimer görüntüler. Onların programlanabilir mekaniği nedeniyle bu tüpler lp tek molekül yanı sıra toplu ölçek etkisini incelemek için çok yönlü, yeni araçlardır. Aktin filamentleri, aksine onlar olmadan önemli dejenerasyon, hafta boyunca istikrarlı kalır ve kullandıklarında daha nispeten kolaydır.

Introduction

Kendi benzersiz mekanik özellikleri tarafından etkin karmaşık davranışları nedeniyle semiflexible polimerler yaşam maddenin temel yapı taşları vardır. Esnek polimerler aksine semiflexible polimerler hala güçlü termal dalgalanmaları1tabi kalarak uzanmış bir yapılandırma onların sigara ufuk omurga sertlik nedeniyle evlat. Böylece, tamamen Stokastik Modeller ile tam esnek veya rijit polimerler gibi aşırı davranışları için uygulanamaz. Sözde solucan benzeri zinciri modeli2,3,4 lp, üzerinden bu sertlik çürümesine sabit boyunca filaman4tanjant-teğet korelasyon olduğu ölçmek için geliştirilmiştir. Lp filaman kontur uzunluğu (lc) karşılaştırılabilir ise, polimer semiflexible1kabul edilir. Benzer bir çadır direkleri, kendi düzenlemeleri ağlar veya demetleri tüm toplu sistem düşük hacimli kesirler, sıradışı visko elastik özellikleri5,6,7' yelider, stabilize, 8,9. Bu yapıların yüksek elasticities geniş boyutları10hala diffusive kolaylaştırılması ve aktif taşıma işlemleri sırasında mekanik bütünlüğünü korumak, kafes sağlamak. Bu özellik özellikle sitoiskeleti veya hücre dışı matriks gibi biyolojik sistemleri için uygundur, ancak Gıda Mühendisliği1,11,12' de yaygın olarak kullanılır.

Bunların önemini yaşayan konuya gidiyor, kapsamlı bir şekilde biomimetic malzeme veya roman hydrogels geliştirmek için araçlar için bu yapıların fiziksel özelliklerini incelemek önemlidir. Semiflexible polimerler açısından bu lp ve açıklayıcı bir Kuramsal çerçeve geliştirilmesi gibi tek-filament özelliklerinden kaynaklanan ağlarının toplu özelliklerini sistematik olarak belirlenmesi anlamına gelir. Öncü çalışmalar, hücresel biyopolimer aktin semiflexible polimerler için bir model sistem olarak kurulmuş ve hala yaygın olarak altın standart5,13,14,15 olarak kabul edilir , 16 , 17. bu proteinin doğal özelliklerine bağlıdır beri Ancak, ayrıntılı çalışmalar bu sistemi ile sınırlıdır. Çeşitli teorik yaklaşımlar tek-filament düzeyinde olmayan önemsiz mekanik davranışları açıklamasını binasında nişan ve özellikle farklı ölçekleme öngörüleri doğrusal elastik Yaylası kesme modülü, G için bağımlılığı için yol açmıştır 0 (Yani, ağ "esneklik"), konsantrasyon (c) ve lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Konsantrasyon ölçekleme aktin esaslı ile deneyler veya diğer model sistemleri kolayca erişilebilir olmakla ve teorik Öngörüler titizlikle olmuştur iken13,16,24, doğrulanmadı 25, lp ile ilgili olarak ölçekleme deneysel olarak erişilemeyen kalmıştır. Ayrıca semiflexible polimerler belirleyici miktarıdır bağımsız bir değişken olduğu için lp bu, ancak, büyük bir sınırlama var.

Bu Merkez, doğal sınırlama aktin sabit lp veya diğer biyolojik kaynaklı polimerler kollajen gibi son zamanlarda mekanik özelliklerini tunable kiremit tabanlı DNA tüpler, istihdam ederek çözümlenmiş 9 , 26 , 27 , 28. mimarileri hafif değişimler (örn., farklı sayıda kurucu DNA iplikçikleri birim halka içinde) tüplerin verim lpFloresans mikroskobu ile değerlendirilebilir, için farklı değerler olarak bir dalgalanan tüp analiz veya birkaç yapıştırılır tüpler eğri yapılandırmaları değerlendirilmesi,9,28daha önce açıklanan. Bu analizler lp değerleri farklı tüp nüfusun birden fazla büyüklük üzerinde değişiklik ve farklı değerlendirme teknikleri tutarlı sonuçlar9,28verim saptandı.

Doğal olarak, konsantrasyon ve lp doğrusal elastik Yaylası kesme modül G0 genel ölçeklendirme tüm önceki teorik yaklaşımlar ile tutarsız olarak bildirilmiştir özellikle bir çok gösteren 9, lptahmin edilen bağımlı daha güçlü. Bu bulgular semiflexible polimerler Merkezi özelliklerini incelemek için yeni bir modeli sistem değerini vurgulamak. Nistihdam-sarmal DNA tüpler önemli ölçüde bu soruşturmalar kapsamını genişletiyor. Sadece lp temel malzeme değiştirmeden serbestçe değiştirilebilir, ancak DNA'ın doğasında programlanabilir doğa Glossar veya Kinetik anahtarlama işlemleri gibi ek öğeleri sistematik incelenmesi etkinleştirebilirsiniz. Ayrıca, bu tüpler suda çözünür ve yeterli pH ve algılanabilir bozulması9olmadan birkaç hafta iyonik koşullarında çoğu proteinler aksine, istikrarlı.

Bu tüpler birleştirmek için kullanılan DNA oligonucleotides ayrı bir kümesi, her biri iki komşu iplikçik için tamamlayıcı temel sıraları paylaşan iki etki alanı içeren (belirli dizileri nedeniyle, bir tek tel saç pins gibi yapıların oluşamıyor). Tamamlayıcı dizileri birbirine bağlı n çift sarmallı kesimleri kapalı, yarı üst üste halkaları oluşturan bir döngüsel şekilde melezlemek (şekil 1A ve B). Bu yüzük form Kesikli çapı (şekil 1 c) ve yarı üst üste yapılandırmalarını Aksiyel yapışkan uçlar başka bir yüzük yapışkan sonuna kadar tamamlayıcı gösterir. Oligonucleotides eşleşen bu seçmeli ek Yüzüklerin ipliksi DNA sarmalı tüpler boyutu n (nHT) etkili polimerizasyon için önde gelen bir istifleme tetikler. Kontur onların uzunlukları genellikle birkaç mikron uzunluğunda ölçmek ve onların uzunluğu dağıtım aktin filamentleri9,26,27,28karşılaştırılabilir. Onlar gerçekten de polimerizasyon Kinetik bu aktin filamentleri ve mikrotübüller benzer sergilemek için benzer DNA nanotüpler gösterilmiştirp sınıf "xref" = > 29. Sayı n temel halka yapısı kadar yapma bireysel DNA iplikçiklerinin bağlı olarak, nHT mimari, hem de circumference ve diameter, controllably değiştirilebilir. Yüzük/tüpler çevresi artırır daha fazla DNA dizilerini kullanarak ve daha yüksek rijidite için karşılık gelen yüksek lp değerleri (şekil 1 c), mekanik özelliklerine karşılık gelen mimari değişikliği kaydırır. Mezoskopik ölçekte daha yüksek sertlik nedeniyle daha az bükülmüş biçimler bu büyük lp değerleri çevirmek (şekil 1 d ve E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. n HTs hazırlanması

Not: Burada, n farklı tek DNA iplikçiklerin helix tüpler belirli bir boyuttaki oluşumunda yer gösterir. N = 8, sekiz farklı tek DNA dizilerini bir birim yüzüğü olun.

  1. Satın alma DNA dizileri (HPLC saflık sınıf veya daha yüksek) uygun bir DNA sentezi üzerinden hizmet veya yüksek kaliteli sentez ve arıtma (Tablo 1 ' de verilen örnek dizileri) gerçekleştirmek.
  2. Liyofilize resuspend oligonucleotides arıtılmış su ve takip daha fazla resuspension adımları şirketten ilgili kılavuzda verilen. 200 µM son bir konsantrasyon elde etmek için su miktarını ayarlamak.
  3. Belirleme konsantrasyonları tek DNA iplikçikleri dağıtıcısı tarafından verilen değerleri doğrulamak için (Örneğin, UV-Vis spektroskopisi 260 ile nm) tam stoichiometry derleme işlemi için çok önemli olduğu için. Belirli molar ağırlık ve her tek iplikçikli DNA Oligonükleotid tükenme katsayısı dikkate alarak oligonucleotides, konsantrasyonu hesaplayın.
    Not: Extinction katsayısı değerleri doğal olarak farklı ard arda geliş için değişir ve ticari olarak satın alınan DNA belgelerinde belirtilen. Onlar da serbestçe kullanılabilir çevrimiçi araçlar bir dizi kullanarak en yakın komşu modeline göre hesaplanır. Spektrometre doğrusal aralığı ile uyum sağlamak için konsantrasyon belirlenmesi için kullanılan örnek sulandrarak göz önünde bulundurun.
  4. Bir micropipette kullanarak bir kapsayıcı istenen n HTs oluşturmak thermocycler için (Örneğin, bir 200 µL PCR tüp) uygun DNA iplikçikleri-aynı anda toplama-in her mix (son arabellek koşulları: 1xTE (10 mM Tris ve 1 mM EDTA, pH 8) ve 12,5 mM MgCl 2).
    Not: Son DNA n HT örnekleri n oluşur - 1 iplikçikleri, U 1 − U n − 1 ve bir T n strand. Konsantrasyon strand başına kullanıcı gereksinimlerine bağlı olarak alt-micromolar için 10'dan fazla µM farklı (Örneğin, < strand tek filamentler gözlemlemek sonraki seyreltme için veya daha yüksek konsantrasyonlarda incelenmesi için başına 1 µm yoğun ağ mekanik).
  5. N HTs bir thermocycler (bir sonraki hızlı damla ila 65 ° C ile 90 ° C'de 10 dakika denatürasyon; yavaş sıcaklık 65 ° C -0,5 K 20 sıcaklık adımlarla 30 dk için tamamlayıcı baz eşleşmesi ile 55 ° C için azaltın melezlemek Her; ve bir hızlı bırak 55 ° c ila 20 ° C); şekil 2A bkz.
    Not: Yavaş azalma adımları 65 ° c ortalama üretim boyu artırmak için uzamış; Ancak, sonraki hızlı açılan 20 ° c polimerli tüpler toplama önlemek çok önemlidir.
  6. İçin 3 hafta tespit düşüşü olmaksızın 4 ° C'de melezleşmiştir n HTs depolamak.
    Not: floresan için n HTs etiketli mikroskobu, melezleşmiştir U1 ile değiştirilmiş U1-Cy3 (Tablo 1) (kısmen) yerine kullanarak. Uzun gözlem süreleri için kurulan anti-beyazlatma ajanlar eklenmesi tavsiye edilir.
  7. Dikkatle seyreltik örnek istenen son konsantrasyonu (Örneğin, 4 µM ağlar veya 20 nM tek-filament gözlemler için) örnek arabellek kullanarak. Olası hata kaynaklarını en aza indirmek için istenen son toplama örnekleri montajı.

2. Reolojisi kesme

  1. Seç uygun bir geometri (tabak tabak ya da koni-plaka) dinamik kesme rheometer için. Küçük birimler (Yani, 200 µL aşağıda), kullanmak için koni-plaka geometri.
  2. Örnek dinamik kesme rheometer üzerinde yük.
  3. Hava-su arabirimi örnek ve potansiyel buharlaşma etkileri önlemek için aşağıdaki adımları kullanarak çevre passivate.
    1. Örnek örnek arabellek Bath 2.5 mL ile surround.
    2. Yüzey aktif hemen altında micelle konsantrasyon ekleyin.
    3. Örnek hava ile doğrudan temas önlemek için bir lipid ile örnek için Hamilton şırınga kullanılır.
  4. Islak sünger ile donatılmış bir kap ile örnek odası mühür ve mümkünse, daha fazla (örnek) temas değil bir ek su banyosu ile buharlaşma bastırmak.
  5. Oda sıcaklığında rheometer özel yazılım kullanarak ölçüm Başlat; (fizyolojik şartlarda gerekiyorsa) alternatif olarak, ölçüm 37 ° C gibi farklı sıcaklıklarda gerçekleştirmek.
    Not: Isıtma için geliştirilmiş buharlaşma açar iken örnek soğutma kez su buharı yoğunlaşma tarafından çevredeki havadan eşlik ediyor. Tüm ölçümler bir dizi sabit bir sıcaklıkta gerçekleştirilmesi gereken her iki etkileri kontrol edilemez bir şekilde örnek konsantrasyonu değiştirebilirsiniz.
  6. Oda sıcaklığında 2 h için equilibrate örnek sağlar. Zaman evrim zaman süpürme ile takip edilebilir (bir veri noktası dakikada; γ zorlanma %5; = frekans f 1 Hz =).
  7. İstenen test protokolleri ile mekanik özelliklerini ölçmek. Başlatma sıklığı piyango bir dizi (f-piyango) çünkü onlar örnek olduğu gibi bırakmak ve daha fazla ölçülerini izin.
    Not: Ayrıca, kısa f-piyango taşınan dışarı önce ve sonra uzun ölçümleri (uzun f gibi-piyango ile daha yüksek çözünürlük) örnek boyunca tam ölçüm protokolünün değişmemiştir doğrulamak için.
    1. Gerçekleştir kısa bir f-süpürme (Örneğin, γ = %5; f = 0.01 Hz ila 30 Hz; yılda 5 veri noktaları).
    2. Gerçekleştirmek uzun f-süpürme (Örneğin, γ = %5; f = 0,001 Hz ila 30 Hz; 21 veri noktaları yılda); düşük frekanslı rejim değil gerekli ölçüm süresini azaltmak atlanabilir.
    3. Kısa f gerçekleştirmek-süpürme.
    4. Bir γ-tarama gerçekleştirmek (Örneğin, f = 1 Hz; γ = %0.0125 %100 için; yılda 20 veri noktaları).
      Not: kısa f kullanın - ilk olarak, genellikle önceki f ile tutarsız olduğu gibi süpürme - ağlar genellikle rüptürü γ-tarama sırasında veya plakalar bağlantısını kesin çünkü süpürür. Alternatif olarak, γ-rampa kullanın (Örneğin, 0.025 s -1, t = 60 = s); Ancak, rampaları gerektirir genellikle değişen motor modu, yani sonraki kısa f-piyango sahte.
  8. Bin ve/veya pürüzsüz bir Gauss çekirdek ile ham veri.

3. tavlama DNA Floresans destekli analiz,

  1. 8 hazırlamak aliquots 12 µL 1-4 µM kullanarak her örnek için DNA strand, TE arabellek x 12.5 mM MgCl 2 1 ve 1 x nükleik asit jel başına leke 10.000 x DMSO hisse senedi. Hiçbir DNA negatif bir denetimle olun ama nükleik asit jel leke içerir.
  2. Aliquots bir gerçek zamanlı PCR tabağa aktarın ve tutkal yapıştırıcı film ile (Örneğin, bir 96-iyi tepki plaka).
    Not: kullanılan protokolleri tavlama termal yüksek sıcaklıklarda örnekleri buharlaşır. Böylece, kuyuları sıkı su buharlaşma ve konsantrasyon artış, özellikle uzun süreli deneyler sırasında önlemek için yapıştırıcı film ile kapalı olduğundan emin olun.
  3. 100 x g gaz kabarcıkları kaldırmak için oda sıcaklığında 1 dk. için plaka santrifüj kapasitesi; gaz kabarcıkları genişletirseniz, kuyuları analiz olamaz.
  4. Kapalı plaka bir gerçek zamanlı kantitatif PCR sisteme yük.
  5. Bir tavlama programını çalıştırın. DNA için 10 dk. damla hızlı bir şekilde ile 72 ° c sıcaklık 90 ° C'de denatüre O zaman, sıcaklık yavaş yavaş 0.5 ° C tarafından her 30 dk azaltın. Sinyal çürüdü sonra sıcaklık rampa hızlandırmak.
    Not: 72 ° C yeterince gerçek hibridizasyon sıcaklığı olduğunu; Böylece, sinyal gerekli sıcaklık aralığı belirlemek için uygun bir geniş sıcaklık aralığında kaydedilir.
  6. Cycler kapak en az 100 ° buharlaştırılmış örnek yapıştırıcı film üzerinde yoğunlaşma önlemek için c ısıtır emin olun.
  7. Derleme sırasında örnekleri ile bir argon-iyon lazer 488, heyecanlandırmak nm ve 550, Floresans algılamak bir nükleik asit jel leke kullanırken nm (veya hayalice benzer). Diğer boyaları bir uygun uyarma/emisyon kombinasyonu seçmek. Floresans sinyal genel artırmak için mümkün olduğunca sık ölçmek dahili kamerayı kullanarak sinyal kalitesini.
    Not: Burada, her 9 ölçümleri alınmıştır s.
    8. Önceden ayarlanmış erime ve programları tavlama uygulandığında,
  8. verileri çözümlemek için sağlanan yazılım kullanır. Aksi takdirde, floresan sinyal göreceli değişiklik elde etmek her sıcaklık adımı için ortalama değeri önceki ortalama değerden çıkarma.

4. AFM Imaging

  1. Mika ayırmak (Örneğin, Mika " V1 ") ticari olarak mevcut yapışkan bant ekleme ve sökük uzakta; tarafından Mika en üst tabakası kaldırılmalıdır.
  2. Bir micropipette kullanarak önceden oluşturulmuş n HT için 10 dk. yerleşmek izin ve taze cleaved Mika üzerinde katlanır arabellek içeren Mg 2 + mevduat
  3. , Geri kalan sıvı kaldırmak için küçük masa santrifüj 2.000 x g aralıklarla kısa 3 sn içinde örnekleri spin. Birkaç n HTs hala Mika yüzeye eklenmelidir.
  4. Yüksek sertlik (Örneğin, 54 Nm -1) ile bir konsol ipucu kullanın ve iç AFM yazılım ile rezonans frekansı belirlemek.
  5. Kayıt modu zarar veya n sözkonusu yerinden önlemek için düşük tarama hesaplı (Örneğin, 1 satır/s) dokunarak havada AFM ile yükseklik profili

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DNA nanotüpler (Şekil 2) bir sıcaklık rampa üzerinden Meclisi bu yapay semiflexible polimerler oluşturmak için çok güvenilir bir yöntemdir. Bu polimerler gibi aktin filamentleri, doğal olarak meydana gelen karşılıkları için benzer özelliklere sahip ama mekanik özelliklerini controllably olabilir bu yana çok daha geniş bir deneysel çerçeve9,27 değişmiş sağlamak . Biyopolimer gibi onlar ağları (şekil 3) düzenlenmiş ve özellikle filaman sertlik toplu yapıları ve özellikleri üzerinde etkisini test etmek bir izin. Şekil 4' te gösterildiği gibi bu ağlar suşları için doğrusal zorlanma rejim aktin filamentleri ağların özelliklerini yakından benzer % 10, görüntüler. İçinde bu rejim, doğrusal kesme Reolojisi kolayca, örneğin, DNA nanotüp ağların değişik Frekanslar9' probed elastik ve yapışkan yanıt belirlemek için uygulanır. Bu testler bu ağlardan ağırlıklı olarak Melosun davrandığını ortaya (şekil 5). Ölçümleri proteinler ile aksine bu tüpler örnek hava-su arayüzü denatüre değil ve bu nedenle, stratejileri pasivasyon sofistike (şekil 6) gerekli. Bu nedenle, işleme örnekleri oldukça basittir ve çok sağlam, düşük örnek örnek varyasyonlar ile tutarlı sonuçlar verimli olduğu ispatlanmıştır.

Ancak, ister ücretsiz "yapışkan biter" unpaired tek DNA her tüp her iki ucundaki iplikçikli sorusu olaylar kaldı istenmeyen, Stokastik hibridizasyon tetikleyebilir. Bu endişe adrese, tamamlayıcı "kap sona" dizileri tüp ucunun kapsayan sonra hibridizasyon işleminin tam örnek için eklenmiştir. Ancak, Şekil 7 filamentler ucu sınırı tespit etkisi yoktur ve tüp biter ağ9herhangi bir geçici crosslinking etkisi teşvik değil göstermektedir. Olaylar yapışmasını zaman örnek çok kabaca ele sadece önemli bir rol oynamaktadır ve tüpler sert pipetting nedeniyle kesin. Bu kırılma noktaları gerçekten crosslinking etkileri, doğrusal olmayan yanıt sertleşme zorlanma (şekil 8) gibi sistem kendisini ikna etmek için görünür.

Örnekleri özenle hazırlanan onlar filaman konsantrasyonu (Þekil 9A) veya filaman sertlik (şekil 9B)9 var oluşan ağlar mekanik özellikleri üzerinde etkisini test etmek için kullanılabilir semiflexible polimerler. İlk kez filaman sertlik ve ağ esnekliği arasındaki kantitatif bağlantı deneysel ve sistematik, baskın teorik Öngörüler çelişmektedir lineer güç hukuk davranış verimli incelenmiştir. Bu sonuçlar DNA nanotüpler vardı eskiden deneysel olarak erişilemeyen9,27semiflexible polimerler etkilerini incelemek için yeni, çok yönlü bir araç olduğunu göstermektedir. Şimdi, çeşitli teoriler deneysel olarak, filamentler sebat uzunluğu lp bağımlılıkları hakkında ifadeler içeren test edilebilir. Ayrıca, reptation (şekil 10), gibi çok temel etkileri sertlik değişir tüpler istihdam ederek çeşitli açılardan araştırmış.

Adı Sıra
U1: a1 *-b1 *-a2-b2 GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT
U1-Cy3: a1 *-b1 *-a2-b2 Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT
U2: a2 *-b2 *-a3-b3 GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT
U3: a3 *-b3 *-a4-b4 GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT
U4: a4 *-b4 *-a5-b5 GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT
U5: a5 *-b5 *-a6-b6 GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT
U6: a6 *-b6 *-a7-b7 GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG
U7: a7 *-b7 *-a8-b8 GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA
U8: a8 *-b8 *-a9-b9 TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA
U9: a9 *-b9 *-a10-b10 GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC
U10: a10 *-b10 *-a11-b11 TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT
Ü11: a11 *-b11 *-a12-b12 AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA
U12: a12 *-b12 *-a13-b13 ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA
U13: a13 *-b13 *-a14-b14 GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC
T4: a4 *-b4 *-a1-b1 GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T5: a5 *-b5 *-a1-b1 GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T6: a6 *-b6 *-a1-b1 GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T7: a7 *-b7 *-a1-b1 GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T8: a8 *-b8 *-a1-b1 TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T9: a8 *-b8 *-a1-b1 GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T10: a10 *-b10 *-a1-b1 GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T14: a14 *-b14 *-a1-b1 TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
son kapağı A1 CCTAATCGCC
son kapağı A2 CCTTTAGATCC
son kapağı A3 CCACTCTTCC
son kapağı A4 CCGTGAGAACC
son kapağı A5 CCGCACGACC
son kapağı A6 CCAACGATGCC
son kapağı A7 ATGCACCTCC
son kapağı A8 AACGGTAACTA
son kapağı B1 * ACGCTAAGCCA
son kapağı B2 * ACCAGATACA
son kapağı B3 * ACAAGATGTCA
son kapağı B4 * ACGCATTGCA
son kapağı B5 * ACTGTCGAACA
son kapağı B6 * ACTTCTATCA
son kapağı B7 * CATTCAAAGCT
son kapağı B8 * TCCCAAGTCA

Tablo 1: ngörüntülenen HTs hibridizasyon için DNA örneği dizileri rakam 1 c, da nHTs9, önceki çalışmalarda kullanılan sınıf "xref" = > 26,27,28. (Örneğin, a1 tamamlayıcı sırası a1 * ile hybridizes) yedi farklı tüp mimarileri Meclisi sıraları verilen kümesi sağlar. Burada verilen değil diğer tüp mimarileri de toplama veya çıkarma iplikçiklerinin strand n U1göre cyclization eşliğinde tarafından bir araya gelebilir.

Figure 1
Şekil 1: tüp derleme ve mimarisi. (A) şematik bir 4HT Meclisi oluşan dört ayrı 42 mers. Sürekli değişen etki alanları (kısa siyah keneler unhybridized üsleri belirtiniz) uzun siyah keneler tarafından belirtilen 10-11 üslerinin aracılığıyla bitişik tek iplikçikli DNA iplikçikleri melezlemek. Bu yarım sendeleyerek motifi her iki eksen boyunca yapışkan uçlar özellikleri, okla gösterilen Aksiyel büyüme, etkinleştirme. U1 ve T4 sınır lifler de tamamlayıcı etki alanları özelliği ve böylece sağ okla gösterilen kapalı bir halka oluştururlar. Bu taslak 2D bir temsil olduğunu unutmayın; Melez devlet ipliklerini çift sarmal oluşturur ve tüm üsleri eşleştirilmiş. (B) 4HT tetramer iki çift sarmal ile sözde-3D şeması gölgeli uzak katmanda kaplı. Çift sarmal için tamamlayıcı etki alanları oluşturmak ve her iki bitişik çift sarmal birim uzunluk öğesi başına bir kez tüp bağlı. Bir U2 strand netlik için kalın çizilir. (C) yedi farklı tüp mimarileri örnekleri, ile 4 arasında değişen strand sayılar verilir HT 1.2 26 µm. için arasında değişen 14 HT ve lp (D ve E) Cy3-etiketli, Epi-floresan görüntüleri adsorbe 5 HT ve 10 HT göstermek farklı kavisli hatları ile farklı stiffnesses. Kırmızı kaplaması ile uçtan uca mesafe R ve kontur uzunluğu lCgörüntü analizi yoluyla buldum filaman dağılımı var. Şekil Schuldt ve ark9uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: sıcaklık rampa ve karşılık gelen DNA nanotüpler montajı. (A) DNA nanotüpler bir thermocycler bir iletişim kuralı birkaç farklı sıcaklık üzerinden yaklaşık 11 h. (B) bir gerçek zamanlı kantitatif PCR sistemi, lekeli iplikçiklerinin floresan sinyal göreceli değişiklik adımları içeren yolu ile monte edilir yeni kurulan çift iplikçikli DNA için sıcaklık rampa giderken ölçüsüdür. DNA nanotüpler türüne bağlı olarak, belirtilen derleme farklı. Daha karmaşık oluşturan yapı, muhtemelen daha fazla iplikçikleri beri daha geniş derleme (ve bu nedenle daha farklı diziler ve yerel tavlama sıcaklıkları ile kesimleri) tarafından yönlendirilen bir işlemi uygun konumlarda melezlemek gerek Stokastik ısı dalgalanmaları. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: 8HTs 4 µM, dolaşık bir ağ görüntüsünü temsilcisi AFM. Yükseklik profil 8HTs bir Mika yüzey absorbe ön şekillendirilmesi ağının havada dokunarak modu kullanılarak kaydedildi. AFM görüntüleri ağ 2D bir projeksiyon görselleştirmek ama beri tüpler gibi ağlar 2D bir yapılandırmada sıkıştırılmış veri (Örneğin, Kafes boyutu) 3D çalışması için güvenilir çıkarılması için izin vermez. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: doğrusal Aralık. Zorlanma ölçümleri (G' 1 Hz =) bir geniş doğrusal elastik Plato, doğrusal olmayan davranış sertleştirme zorlanma gibi tezahür gibi crosslinking etkileri belirtileri olmadan ortaya koyuyor. (Her niçin HT farklı) bir karakteristik yük elastik Yaylası modülü geri dönüşümsüz kırılır. Hata çubuklarını her tüm gerçekleştirilen ölçümler ortalama değeri standart sapması temsil eder. Şekil Schuldt ve ark9uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: tipik frekans bağımlılığı bir dolaşık 6HT ağının. DNA tüplerinin ağları geniş esneklik Yaylası üzerinden dört büyüklük, uygulamalı Frekansa bağlı olarak göster. Bir polimer ağı, elastik bölümü beklendiği gibi (G') karmaşık kesme modülü anlamlı viskoz bölümünü daha yüksektir (G''). Şekil Schuldt ve ark9uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: Hava-sıvı arayüzey etkisi yok. Sıklığı piyango (f-piyango; γ = %5) 8HT örnekleri 8 µM, buharlaşma ve jelleşme etkileri hava-su arayüz etkisi önemsiz ortaya. Farklı denge, hem de büyük ölçüde arayüzü (yüzey aktif maddeleri ve lipidler), kümeleme protein azaltmak için bilinen iki yöntem kullanıldı. Yöntemin bağımsız, buharlaşma veya yüzey elastikiyet ciddi etkileri hakkında bir bilgi kaydedildi. Burada, G' elastik modül ve G temsil eder '' viskoz modülü (kesikli çizgiler) temsil eder. Şekil Schuldt ve ark9uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: son değişiklik etkisi. Elastik Yaylası modülü 8HTs ile onların anılan sıraya göre tamamlayıcı dizileri yapışkan ücretsiz uçları kapatma zaman sabit kalır. Şekil Schuldt ve ark9uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: işleme yordamlarını ön şekillendirilmesi DNA'ın etkisi ağlar üzerinde ölçüm. Ön şekillendirilmesi ağlar hibridizasyon sonra nasıl işlendiğini bağlı olarak, ölçüleri farklı olabilir. Bu örnekte DNA nanotüpler pipetting sırasında kesme akışı büyük ölçüde değişik ve çok kabaca ele Eğer tüpler kırdı. Kırılma yol arasındaki istenmeyen etkileşimler için tamamlayıcı tek iplikçikler artış esneklik içinde açar ve doğrusal olmayan etkileri neden olmaktadır, kırık veya parçalanmış kesimleri için bağıntı maruz s(artış esneklik büyük suşları, yeşil Curve) sertleştirme zorlanma gibi uch. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9: DNA nanotüpler lp bağımlılıkları çalışmanın etkinleştirin. (A) ağları ile nHTs semiflexible polimerlerin eğitim sisteminin artan konsantrasyon (konsantrasyon süpürme), Biyopolimer aktin gibi temel çalışmalar için benzer mekanik yanıt incelenmesi sağlar. (B) Ayrıca, doğal olarak meydana gelen ile olanaksız olduğu ile ilgili temel filamentler değişen lp mekanik yanıt belirlenmesi tüplerinin farklı mimariyi kolaylaştırmak semiflexible polimerler. Bu amaçla, veri a elastik Yaylası modülü ile ilgili lpölçekleme adrese replotted. Hata çubuklarını her tüm gerçekleştirilen ölçümler ortalama değeri standart sapması temsil eder. Şekil Schuldt ve ark9uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 10
Şekil 10: Reptation ve kafes boyutu. Reptating filamentler (etiketsiz bir ağ içinde; gömülü tek etiketli DNA 8HT kayıt Floresans görüntüleri c = 14 µM) filamentler ağdaki düğümler doğası doğrulamak için kullanılabilir. Herhangi bir çapraz etkisi bu tek boyutlu difüzyon engel olur. İç metin: Reptation analiz de aktin ölçümleri için karşılaştırır ve teorik tahminleri30ile aynı fikirde konsantrasyonları ile ölçekleme kafes boyutunu belirlemek için kullanılabilir. Hata çubuklarını her tüm gerçekleştirilen ölçümler ortalama değeri standart sapması temsil eder. Şekil Schuldt ve ark9uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Uygun şekilde oluşturulmuş ağlar elde etmek için DNA nanotüpler montaj önemli bir adımdır. Sentez işlemi sırasında hatalar tüp kalite olumsuz; Bu nedenle, HPLC veya daha sıkı bir süreç oligonucleotides arındırmak için kullanılması önerilir. N kurucu oligonucleotides kümesi içinde ekimolar stoichiometry üzerine toplanan DNA nanotüpler yanı sıra kendi uzunluğu dağıtım yerine ayrık oluşumu bağlı olduğundan, konsantrasyonları remeasure gereklidir satın alınan ipliklerini beri değerleri göz önüne alındığında önemli ölçüde gerçek konsantrasyon değişebilir. Bu, örneğin, bir Absorbans dalga boyu 260, UV-Vis spektroskopisi tarafından gerçekleştirilen nm. Moleküler ağırlık ve yok olma katsayıları farklı diziler arasında değişir notu istiyorum; Bu nedenle, Absorbans konsantrasyon içine çevirmek için değerler için her DNA Oligonükleotid tespit edilmelidir. Bir NanoDrop gibi küçük örnek birimleri en iyi şekilde ekipmanları kullanırken her ölçüm noktası birkaç kez alınan ve ortalama olarak gerekir. Spektrometre tespiti doğrusal aralığı ile uyumlu. Gerekirse konsantrasyonu tayini için kullanılan kesir sulandırmak. Hafif yanlışlıklar, doğru stoichiometry ve kalite tüp oluşumu üzerinde büyük bir etkisi olabilir; Bu nedenle, tek tellerinin pipetting mümkün olduğunca kesin olmalıdır. Daha sonra son örnek çözümü iyice yavaş yavaş örnek yukarı ve aşağı thermocycler yerleştirmeden önce pipetting tarafından karışık olması. İpliklerini görselleştirme için floresan boyalar ile değişiklik yaparsanız, tüm adımları korumalı doğrudan güneş ışığı ve kurulan anti-beyazlatma ajanlar (sistemleri, kayıt atma gibiYani, oksijen daha sonra ek bir ortamda yapılmalıdır glikoz oksidaz/katalaz) önerilir. Sonra tek iplikçikler doğru tampon koşullarda karışık, bir sıcaklık rampa yapıları (şekil 2A) melezlemek uygulanır. Bu sıcaklık nerede DNA çift sarmal formu önceden belirlenmiş kritik hibridizasyon sıcaklık uyar. DNA hibridizasyon Kinetik (Yani, yerel DNA UV Absorbans31, Kalorimetre32veya floresan boyalar33) analiz etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. İkinci yöntemde, boya son derece floresan kompleksleri ilişkisiz boyalar daha parlak oluşturan DNA çift sarmal içine intercalate. Onlar kısmen çift iplikçikli ancak tek iplikçikli DNA34bağlamak. Bu nedenle, bu tür boyalar DNA nanostructure kendinden montajlı sistem35 içinde izlemek için uygulanan ve ideal montaj koşulları tanımlamak için kullanılan.

Başlangıçta, herhangi bir çift iplikçikli DNA örneği, dubleks, önceden tanımlanmış ve gizemli gibi içinde istenmeyen baz eşleşmesi önlemek için bir yüksek sıcaklıkta (90 ° C) denatüre. Bir sonraki kademeli düşüş sıcaklık ( şekil 2Aiçin benzer) temel soyma olayları etkinleştirme DNA iplikçiklerinin termal hareket azaltır. Serbest enerji indirilmesi nedeniyle, DNA iplikçikleri tercihen tamamlayıcı onların dizileri melez. Bir dsDNA özgü intercalating boya uygulandığında, parlaklığı sırayla yeni kurulan çift iplikçikli DNA34için nicel bir ölçü olduğu son derece floresan kompleksleri, oluşumu ile artar. 4HTs ve 8HTs oluşumu için Floresans sinyalinin göreceli değişiklik şekil 2Bçizilir. Bu göreceli değişiklik floresan yoğunluğu her sıcaklık için ortalama ve daha sonra önceki sıcaklığı ortalama değeri çıkarılarak hesaplanır. Sıcaklık azaltılarak, yükseltilmiş bir floresan olabilir (şekil 2B) algıladı ve bu eğri zirvesine büyük hibridizasyon olaylar gerçekleştiği sıcaklık vurgulamaktadır. Eğrileri damla bir plato ulaşan yoğunluk değerleri ifade eder. DNA yapısı ve (küçük veya büyük birtakım DNA iplikçiklerimesela ) karmaşıklığına bağlı olarak, en üst nokta keskin (şekil 2B, mavi eğrisi) veya geniş (şekil 2B, yeşil eğri) olabilir. Mümkün olduğunda, bu her yeni tasarlanmış yapısı sıcaklık rampa yavaş yavaş azalan bölümü melezleşmiştir dsDNA kesimleri oluşumu ile tüpler oluşumu oluştuğu aralığı içeren emin olmak test edilmelidir. Uygun sıcaklık sonra rejiminin belirlenir, nanoyapıların başarıyla çok dar sıcaklık aralıkları (şekil 2B, mavi eğrisi) veya35bile isothermally monte edilebilir. Periyodik kafesler içinde birden fazla DNA hibridizasyon iplikçikleri Not kooperatif tavlama etkileri35,daha fazla DNA tavlama destekleyen36, neden olmaktadır. Boyalar enterkalasyon DNA sarmal onların standart 10.5 baz çifti sarmal dönüş yapılandırma, böylece tüpler genel geometri değiştirme başına ötesinde streç düşünülmelidir. Bu nedenle, bir molekül başına 900 DNA baz çifti35üzerinde boya konsantrasyonu yükseltmek için tavsiye edilmez. Ayrıca, pik montaj sıcaklığı gerçek en iyi tavlama sıcaklığından sapma. Yüksek hassasiyet elde etmek ve tüp oluşumu için en iyi koşul belirlemek için DNA hibridizasyon özel Jel Elektroforez ile double-checked olması gereken pek çok yavaş değişen sıcaklık adımları sırasında araştırılmalıdır. DNA nanotüpler durum için üç adım Protokolü kurduk. İlk olarak, örnek 90 ° C DNA tek iplikçikler halinde denatüre ısıtılır. Daha sonra bir geniş sıcaklık aralığı (yaklaşık Floresans sinyalinin derleme tepe) kaplıdır. Bizim durumumuzda, 65 ° C 55 ° C, bir adım -0,5 ° c de her 30 dk arasında değişen 10 ° C bir dizi kaplıdır. Son adımda, sıcaklık hızla oda sıcaklığında - veya bizim durumda, 20 ° C - olduğu gibi herhangi bir olumsuz etkileşimlerin ara sıcaklıklarda (şekil 2A) önlemek için düşürmelisin. Genellikle, thermocyclers soğuk sıcaklıklarda örneklerinden ısı. Bu nedenle, kapağı sıcaklığını örnek sıvı buharlaşma son örnek konsantrasyonu artar derleme sırasında sınırlamak için düzenleme yapmak önemlidir.

NHTs uygun şekilde oluşur ise, etkileşimleri crosslinking etkileri ayrı borular arasında neden olmadan tamamen dolaşık ağlara (şekil 3), düzenlemek. Glossar muhtemelen kusursuz bir tüp veya komşu tüpler tamamlayıcı tek iplikçikli kesimlerinde biriyle eşleştirmek serbest olması yapışkan ucunda uzanan unpaired DNA parçaları neden. Bu efektleri zorlanma sertleştirme gibi doğrusal olmayan özellikleri neden ( Gartan ' daha büyük suşları için), ama onlar yok ağlar (şekil 4) dolaşmış. Görüntülenen γ-piyango da genel olarak uygun doğrusal zorlanma rejimler rheological ölçümler için ortaya koyuyor. Belirli bir eşiğin ağ yırtığı veya geri dönüşümsüz sistem zarar rheometer plakaları ile temas kaybeder. Bu nedenle, uygulamalı suşları güvenilir veri elde etmek için doğrusal rejiminde olmalıdır. Tipik olarak, % 5'lik bir yük veri oldukça gürültü rejimi üzerinde verim için yeterli olduğunu. Daha yüksek suşları uygulanabilir; Ancak, onlar kolayca rüptürü eşik yaklaşımı ve sonuçları falsifi olabilirDoğrusal olmayan rejiminde ölçme nedeniyle ed.

Rheological ölçümler örnek dikkatli ol, tutarlı bir hazırlık gerektirir ve tekrarlanabilir ve yorumlanabilir sonuçları elde etmek için ölçüm iletişim kuralları dikkatle incelenmesi. Merkez nokta bu ağlar çoğunlukla sadece tekrarlanabilir yapısı olduğundan rheometer plakaları arasında tamamen rasgele, izotropik ağ kurmaktır. Böylece, oldukça uzun denge kez (genellikle yaklaşık 2 h, hatta bazen daha fazla) pipetting sırasında kesme kaynaklı hizalama örnek nedeniyle herhangi bir sipariş etkileri dağıtmak için ihtiyaç vardır. Ön-test deneyler sistem zaman evrimi (zaman süpürme) denge sırasında gerekli zaman dilimi belirlemek için bu kaydı için tavsiye edilir. Sinyalleri yaylalar daha fazla değişiklik yapılmadan ulaştığınızda, sistem equilibrated. Koşullar tespit, bir kez denge istenen testleri bir yük gibi rampa veya f veya γ temizleyicileri, idam edilecek. Suşları geniş bir yelpazede test sonuçta ağ veya bağlantı plakaları yok edebilir. Testleri rüptürü eşiğin suşları için sınırlı ise, ancak, zorlanma rampalar ve piyango yinelemeli olarak potansiyel yaşlanma veya histeresis etkileri araştırmak için tekrar edilebilir. Fdurumunda-temizleyicileri, ölçüm saatlerini-farklı ölçüde. Bir salınım birkaç dakika sürebilir bu yana önemli ölçüde düşük frekanslarda test deneyler, uzatır. Unutmayın, ndurumunda HTs, f-piyango ortaya elastik modül G' viskoz modül Gaşıyor '' yaklaşık bir büyüklük tarafından bu sistemler ( baskın elastik tepki gösterir Şekil 5). Genel olarak, farklı deneyler kısa ftarafından eşlik edilebilir-piyango önce ve sonra sistem ölçüm tarafından rahatsız edilmeden kaldı doğrulamak için ana deneme. Ancak, bazı makineler özellikle dinamik deneyler değiştirirken ölçümleri, farklı türleri için temel motor modunu değiştirmek zorunda (Örneğin, salınım f-piyango) statik yük rampasının. Bu değişiklik genellikle ağ yok ve sonraki ölçümler Meneviş spontan büyük suşları tarafından eşlik ediyor. Böylece, bu rheometer kullanılan teknik özellikleri kontrol etmek için tavsiye edilir.

Reolojisi deneyler aktin tabanlı sistemlerde sistemin hava-su arayüzü meydana gelen proteini denatürasyon dramatik bir etki ortaya koyuyor. Denatüre protein unspecifically, böylece tüm sistemin mekanik özelliği son derece hakim bir yoğun jel şekillendirme uygun. Örnek çevreleyen hava ile doğrudan temas önlemek için aynı zamanda örnek su içeriği buharlaşma bastırmak pasivasyon teknikleri kullanılabilir. Üç olası yöntemleri şunlardır: (i) olduğu gibi örnek; aynı arabellek ile örnek odası çevreleyen (ii) arabirimi nedeniyle (bazı yüzey polimer biçimler ile müdahale bu yana, özen göstermelidir) hidrofobik ve hidrofilik etki alanları kapsayacak şekilde yüzey aktif maddeleri kullanarak; veya (iii) yüzey aktif maddeleri olarak benzer etkileri ile daha biyolojik olarak uyumlu lipidler istihdam. NHTs denatürasyon etkileri arayüz tabi olmak bulunamadı ve sonuçlar hata önemli bir potansiyel kaynağı ortadan kaldırır pasivasyon yöntemi (şekil 6), bağımsız olan unutulmamalıdır. Genel olarak, örnek odası her zaman nem odası içinde buharlaşma baskılayarak artırmak için nemli sünger ile donatılmış bir kap ile kapalı olmalıdır.

Kısaca açıklandığı gibi daha önce potansiyel bir kaynak hata DNA tabanlı sistemlerde unhybridized DNA, unpaired tek iplikçikli DNA gibi çıkıntılar kusurları veya ek crosslinking etkilere neden nanotüpler ucunda. Araştırmak ve/veya bu olasılığı ortadan kaldırmak için tamamlayıcı kısa lifler bu yapışkan uçlar kap için kullanılabilir. Ancak, kendi araştırmalar gösterdi ki tanıtılan nHTs ve dolaşık ağların davranışını etkilemez değişmeden (Şekil 7) kalmıştı iplikçikleri kapatma ek. Ancak, tamamlayıcı serileri ile yapışkan uçlar kapatma istenmeyen etkileşimler bastırmak diğer DNA tabanlı (ve daha karmaşık) sistemleri için yararlı olabilir. Ayrıca, nHTs örnekleri dikkatle pipetted (Örneğin, seyreltme adımları ve numune hazırlama için) tüpler için herhangi bir son dakika veya diğer zarar önlemek için. Çözüm pipetted Eğer çok kabaca tüpler kontrol edilemez bir şekilde kır, önde gelen kusur noktalarda yapışkan uçlar göstererek çok sayıda tüpler ve potansiyel crosslinking arasındaki etkileşimler içinde belgili tanımlık sistem istenmeyen. Bu sinyal ile müdahale ve γ-piyango (şekil 8) görülür duruma zorlanma sertleştirme gibi doğrusal olmayan etkileri yanı sıra etkileri sertleşme için yol açar. Böylece, dolaşık çözüm sadece yapılması gereken yavaş yavaş pipetting ve pipet ipuçları ile oldukça büyük bir çapı kullanarak (-pipet ucu sonu kesme var tavsiye) üzerine boruları kesme azaltmak için zorlar.

Sonuç olarak, DNA nHTs semiflexible polimerler çalışma ve mekanik olarak ayarlanabilir hydrogels yeni bir sınıfı temsil eden bu filamentler oluşan ağlar toplu uygun ve son derece uyarlanabilir modeli sistemi vardır. Tüpler özenle hazırlanan çeşitli durumlarda filamentler lp etkisini test etmek için kullanılabilir. Toplu rheological ölçüm ağlar, örneğin dolaşmış, konsantrasyon ve lp ile Elastik modül teorik olarak öngörülen bağımlılıklarını deneysel olarak türetilmiş ölçekleme ile tutarsız olduğunu ortaya koymaktadır (Şekil 9)9yasaları. Bu çalışmada bir ağ esnekliğini temel polimerler sertliği artırarak daha çalışır vurgular. Geleneksel olarak, bir hidrojel sertliği artan çözümü daha fazla polimerler ekleyerek veya Glossar (fiziksel veya kimyasal) komşu polimerler37,38arasında inducing sağlanır. Ancak, daha yüksek bir moleküler içeriği de uygulamaları 3D hücre kültürü gibi azaltılmış Kafes boyutu ile ilişkili. Glossar, öte yandan, hassas mekanik özellikleri39ayarlama daha da zorlaştıracak temel ağ mimarisi içinde karmaşık morfolojik değişiklikler neden olabilir. NHTs ağları kullanarak, ancak, bir tam sayede sertleşme etkileri ise Kafes boyutu değişmeden yalnızca temel filamentler sertliği değiştirerek indüklenen bu parametrelerin ayırımı için izin verir. Ayrıca, tüp mimarileri özellikle seçici entegre crosslinking, oluşturan, benzer şekilde dolaşık ağlarda daha deneysel olarak teorik predictions sınamak için olanaklar gibi ek efektler için değiştirilebilir Parametreler gibil p veya crosslink büyüklüğü ve gücü ağları için. Genel olarak, programlanabilir mimari uygulamaları, lpçalışma için izin kapsamını genişletiyor-bağımlı etkileri sadece toplu olarak, aynı zamanda tek molekül düzeyde. Etiketli tüpler çalışmaya, örneğin, lp bir filament tek boyutlu hareket üzerinde bağımlılık genellikle reptation (şekil 10)9' a adı verilen tüp benzeri hapsi olarak ağdaki gömülü olabilir. Bu diffusive hareket görünmüyorsa, crosslinking efektleri tarafından bastırılmış bu yana da ağ düğümler doğası doğrular. Temel dinamiklerini analiz ayrıca ağ kafes boyutunu ortaya koymaktadır. Ayrıca, bu tüpler sertliği bağımlılık ve sembolik demetleri40,41,42,43, oluşumu üzerinde temel tüplerinin araştırmak için kullanılabilir 44 , crosslinking etkileri ya da yolu ile indüklenen star benzeri Aster46,47,48,49,50gibi 45 veya üst düzey yapıları tatlı kalabalık ortamlar27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Biz finansman DFG (1116/17-1) ve Leipzig doğal bilimler "BuildMoNa" (GSC 185) tarafından kabul. Bu eser Fraunhofer çekin projeye 601 683 desteklemiştir. T. H. Avrupa Sosyal Fonu (ESF-100077106) finansman kabul eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM cantilever ACTA AppNano
AFM - NanoWizard 3 JPK Instruments
CCD camera Andor iXon DV887
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DNA oligonucleotides Biomers.net For sequences see Table 1
DNA Cy3-labeled oligonucleotides Biomers.net For sequence see Table 1
EDTA Sigma-Aldrich E-9884
Epi-fluorescence micro-scope Leica DM-IRB
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
Mica "V1", 12 mm round Plano GmbH 50-12
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4306311
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc.
100x objective Leica5 506168
Purified water Merk Millipore - Milli-Q & Elix
Sapphire PCR tubes Greiner Bio-One 683271
TProfessional Standard PCR Thermocycler Core Life Sciences Inc. 070- Standard
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405
Rheometer TA Instruments ARES
SYBR® Green I nucleic acid gel stain Thermo Fisher Scientific Inc. S7567
Tris Sigma-Aldrich T4661
Triton X-100 Sigma-Aldrich Co. X-100 Suppresses evaporation of sample at air-water interface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. The Theory of Polymer Dynamics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Hinsch, H., Frey, E. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat]. , Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009).
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).

Tags

Biyomühendislik sorunu 128 Reolojisi semiflexible polimerler sebat uzunluğu DNA tüpler Biyopolimer aktin hidrojel ağlar
DNA nanotüpler Semiflexible polimerler eğitim için çok yönlü bir araç olarak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schnauß, J., Glaser, M.,… More

Schnauß, J., Glaser, M., Lorenz, J. S., Schuldt, C., Möser, C., Sajfutdinow, M., Händler, T., Käs, J. A., Smith, D. M. DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers. J. Vis. Exp. (128), e56056, doi:10.3791/56056 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter