Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה (TIRFM) באמצעות מצע DNA λ ששונה site-specifically נקודה קוונטית הנקרא חלבון.
Abstract
מיקרוסקופיה קרינה פלואורסצנטית תרם תרומות גדול בניתוח במנגנונים של תהליכים ביולוגיים מורכבים ברמת מולקולה בודדת. מולקולה בודדת מבחני ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א, ישנם שני גורמים חשובים עבור שיקול: המצע DNA עם אורך מספיק עבור תיוג חלבון גשש פלורסנט מתאימים ופיקוח קל. 48.5 kb λ DNA הוא מועמד טוב המצע הדנ א. נקודות קוונטיות (Qdots), כמחלקה של הגששים פלורסנט, מאפשרים התבוננות ותיק (דקות עד שעות) ו ייבוא תמונות באיכות גבוהה. בנייר זה, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א ברמת מולקולה בודדת, הכוללת הכנת λ ששונה site-specifically DNA, תיוג חלבון המטרה עם מצופים streptavidin Qdots. עבור הוכחת הרעיון, נוכל לבחור אורק (זיהוי מקור מורכבים) בניצני שמרים כמו חלבון עניין והמחש ביחסיו עם ארס (רצף באופן עצמאי שכפול) באמצעות TIRFM. לעומת אחרים הגששים פלורסנט, Qdots יש יתרונות ברורים במחקרים מולקולה בודדת בשל עמידותו גבוהה נגד photobleaching, אך ראוי לציין כי מאפיין זה מגביל את היישום שלה במבחני כמותית.
Introduction
אינטראקציות בין חלבונים ודנ א חיוניים רבים תהליכים ביולוגיים מורכבים, כגון שכפול ה-DNA, DNA לתקן שעתוק. למרות גישות קונבנציונליות יש לשפוך אור על המאפיינים של תהליכים אלה, מנגנונים מרכזיים רבים עדיין אינם ברורים. לאחרונה, עם טכניקות מולקולה בודדת המתפתחת, חלקם של המנגנונים היו כשהיא ממוענת1,2,3.
היישום של מולקולה בודדת פלורסצנטיות מיקרוסקופ על להמחיש בעיקר אינטראקציות חלבון-DNA בזמן אמת תלויה ההתפתחות של זיהוי קרינה פלואורסצנטית וזונדים פלורסנט. עבור מחקר מולקולה בודדת, חשוב לה תווית החלבון עניין גשש פלורסנט מתאים מאחר ומערכות גילוי פלורסצנטיות הם בעיקר זמינים מסחרית.
פלורסנט חלבונים משמשים בביולוגיה מולקולרית. עם זאת, הבהירות פלורסנט נמוך ויציבות נגד photobleaching להגביל את היישום שלה במבחני מולקולה בודדת רבים. נקודות קוונטיות (Qdots) הם זעיר פולט-אור חלקיקים4. בשל תכונותיהם אופטי ייחודי, Qdots בהירים 10 - 20 פעמים, מספר אלפי פעמים יציב יותר מאשר בשימוש נרחב אורגניים צובעת5. יתר על כן, Qdots יש גדולים סטוקס shift (ההפרש בין המיקום של פסגות עירור, פליטה)5. לכן, ניתן להשתמש Qdots תצפית ותיק (דקות עד שעות), רכישת תמונות עם יחס אות לרעש גבוה, בזמן שהם לא יכול להיות מנוצל על מבחני כמותית.
עד כה, ישנן שתי גישות לתייג את חלבון המטרה עם Qdots site-specifically: תיוג בסיועם של7,6,Qdot מצומדת ראשית או משנית של נוגדנים8; או תיוג היעד החלבון עם Qdots ישירות, אשר מבוססת על האינטראקציה חזקה בין ביוטין ו streptavidin9,10,11,12,13. מצופים Streptavidin Qdots זמינים מסחרית. במחקר האחרון שלנו, site-specifically biotinylated חלבונים בניצני שמרים עם יעילות גבוהה היו מטוהרת על-ידי co-ביטוי של בירה וחלבונים מתויג אבי in vivo10. על ידי16,1715,14,מבחני יחיד מולקולה הפעולות הבאות ואופטימיזציה, ראינו את האינטראקציות בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ודנ א-באמצעות רמת מולקולה בודדת TIRFM10.
כאן, אנו בוחרים את ניצני שמרים מקור זיהוי מורכבים (ORC), אשר ניתן באופן ספציפי לזהות, לאגד הרצף באופן עצמאי שכפול (ARS), כמו שלנו חלבון עניין. הפרוטוקול הבא מציג הליך שלב אחר שלב של ויזואליזציה האינטראקציה של התווית על-ידי Qdot אורק עם ארס של שימוש TIRFM. הכנת המצע דנ א שונה site-specifically, biotinylation את ה-DNA, הניקוי coverslip functionalization, את מכלול תאי זרימה ואת ההדמיה מולקולה בודדת מתוארים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת המצע DNA λ-ARS317
- ה-DNA המצע בנייה ואריזה
- לעכל λ יליד הדנ א באמצעות Xhoאני האנזים; להגביר את קטע DNA 543 בן שלוש bp כיוון ARS317 של ה-DNA גנומי של ניצני שמרים באמצעות תחל המכיל 20 bp הומולוגי רצף של במעלה הזרם, במורד הזרם של Xhoאני האנזים באתר למדא הדנ א. להוסיף 100 ננוגרם של Xhoעיכלתי λ DNA ו-10 נג ה-DNA קטע כדי 10 µL של מערכת התגובה רקומבינציה הומולוגית, דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- כדי לארוז את ה-DNA λ רקומבינציה, להוסיף 25 µL של למדא תמציות אריזה לתוך המוצר רקומבינציה, דגירה התגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. לאחר מכן, להוסיף µL 25 נוספים של למדא תמציות אריזה לתוך הצינור התגובה. להמשיך דגירה התגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
- להוסיף 500 µL מאגר דילול סטרילי (10 מ מ טריס-HCl (pH 8.3), 100 מ מ NaCl, 10 מ מ MgCl2) לתוך מערכת התגובה ומערבבים בעדינות על-ידי הפעלת הצינור למטה מספר פעמים. להוסיף 25 µL של כלורופורם, לערבב בעדינות, לאחסן ב 4 º C.
- להוסיף 100 µL של phage ארוז 100 µL של חיידקים LE392MP (תרבותי-0.8 - 1.0 באמצעות מדיום LB הוספה עם 10 מ מ MgSO4) לתוך צינור חדש. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- להוסיף 200 µL תערובת phage-חיידק לתוך אגר oftop 4 מ"ל (LB בינוני + 0.7% אגר + 10 מ מ MgSO4, מקורר עד 48 ° C). לערבב באופן מיידי על-ידי הפעלת הצינור הפוך מספר פעמים, יוצקים אותו לתוך צלחת מראש ומחוממת (37 מעלות צלזיוס) ליברות.
- דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לבין מסך הפלקיו λ-ARS317 באמצעות PCR וסדר.
- ה-DNA טיהור המצע מ11,lysates הנוזלי18
- בוחר הפלאק אחד לתוך µL 200 של ddH סטרילי2O עם 10 מ מ MgCl2 ו- 10 ננומטר CaCl2. מערבבים עם 200 µL של חיידקים LE392MP (בתרבית לילה במדיום ליברות), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- להוסיף את התערובת phage-חיידק 100 מ של NZCYM (10 גרם/ליטר NZ-אמין, 5 g/L שמרים לחלץ, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino Hydrolysate, ואת 2 g/L MgSO4·7H2O) בינוני ותרבות 7 h ב- 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 250 µL של כלורופורם לתוך התרבות ומנערים עוד 10 דקות.
- העברת התרבות לתוך בקבוקון 200 מ. הוסף 5.8 גר' NaCl (הריכוז הסופי של 1 מ'), מערבבים כדי להמיס בעבודת יד, דגירה על קרח למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה ב g x 12,000 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את שאריות תאים. לאסוף את תגובת שיקוע לתוך בקבוקון 200 מ"ל ולהוסיף 10% יתד8000 (m/V). מערבבים לפרק על ידי מכשיר מלהיב מגנטי ו דגירה על קרח במשך 30 דקות או יותר.
- צנטריפוגה ב g x 12,000 10 דקות ב 4 ° C, כדי לזרז את bacteriophage. הסר את תגובת שיקוע.
- Resuspend את התמיסה ב 2 מ"ל phage דילול המאגר. להעביר אותו לתוך צינור 15 מ"ל ולהוסיף 10 µL של RNase (הריכוז הסופי הוא µg 20/mL) µL 40 של DNase (הריכוז הסופי הוא µg 5/mL). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- להוסיף 2 מ"ל של 0.3 M טריס-HCl (pH 9.0), EDTA 100 מ מ + 1.25% מרחביות, µL 15 proteinase K (הריכוז הסופי הוא 10 µg/mL). דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- להוסיף 2 מ"ל של אשלגן טרום מקורר אצטט (3 מ', pH 4.8), דגירה הצינור על קרח למשך 10 דקות.
- צנטריפוגה ב 8000 g x 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את החומרים לא מסיסים.
- להוסיף x 0.7, כמות אלכוהול איזופרופיל לתוך תגובת שיקוע. לערבב על-ידי הפעלת הצינור הפוך מספר פעמים ולאחר תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- צנטריפוגה ב 8000 g x 10 דקות ב RT, כדי לזרז את הדנ א. הסר את תגובת שיקוע.
- לשטוף את ה-DNA, ברגע עם 70% אתנול על ידי צנטריפוגה-g 8,000 x עבור 10 דקות להסיר את תגובת שיקוע.
- Elute ה-DNA באמצעות µL 500 טה מאגר (טריס-HCl, EDTA 1 מ מ, 10 מ מ pH 8.0) בעדינות, ולהעביר את ה-DNA לתוך צינור 1.5 מ.
- לחלץ את ה-DNA פעמיים באמצעות פנול: כלורופורם על ידי צנטריפוגה ב 8000 g למשך 10 דקות.
- לזרז עם 0.7 x נפח אלכוהול איזופרופיל. מערבבים לפנות הצינור הפוך למטה בעדינות, צנטריפוגה ב g 8,000 x 10 דקות.
- לשטוף פעם עם 70% אתנול, resuspend ב µL 200 של טה. למדוד את ריכוז הדנ א, ולאחסן ב-20 ° C ב- 12.5 µg aliquots.
2. λ-ARS317 דנ א Biotinylation
- כדי phosphorylate biotinylated oligonucleotides (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-ביוטין-3') משלימים לקצה השמאלי של ילידי λ ה-DNA, להוסיף 1 µL (100 מיקרומטר) של oligonucleotides, µL 7.5 של ddH2O, 1 µL של 10 x ליגאז מאגר 0.5 µL של T4 PNK. דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
- Λ-ARS317 phosphorylate, להוסיף µg 12.5 של λ-ARS317, 3 µL של 10 x ליגאז מאגר, µL 1 של T4 PNK, ו- ddH2O לנפח הכולל של µL 30. דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
- כדי anneal oligonucleotides עם λ-ARS317, להוסיף 0.5 µL של phosphorylated oligonucleotides, µL 195 ddH2O, µL 25 × 10 ליגאז מאגר לתוך הצינור λ phosphorylated-ARS317. לערבב בעדינות על ידי מתהפך לגמרי את הצינור, דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להפוך את בלוק חימום, ולתת המגניבים הדגימה כדי מתחת 33 ° C בבלוק.
- כדי מאתרים ומפסיקים את oligonucleotides עם λ-ARS317, להוסיף 1 µL של T4 DNA ליגאז ו µL 0.63 של ATP (200 מ מ). לערבב בעדינות על ידי מתהפך לגמרי את הצינור, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 h או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.
הערה: כדי להימנע נפרדים הדנ א, כל השלבים ערבוב צריכה להיעשות על ידי בעדינות מתהפך ברכבת התחתית, במקום במעורבב באמצעות פיפטות.
3. Coverslip וניקוי Functionalization
- Coverslip ניקוי
- מקום 20 coverslips לתוך צנצנות צביעת 4 (5 coverslips/צנצנת), sonicate במשך 30 דקות אתנול, ולשטוף את coverslips עם הנדסה גנטית H2O 3 פעמים.
- Sonicate במשך 30 דקות עם 1 מ' אשלגן הידרוקסידי (KOH), ולשטוף את coverslips עם הנדסה גנטית H2O 3 פעמים. חזור על אתנול וביו -KOH sonication פעם אחת.
- Sonicate עם אצטון במשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף עם הנדסה גנטית H2O היטב (לפחות 3 פעמים).
הערה: אצטון יש להסיר ביסודיות על ידי שטיפה בעזרת הנדסה גנטית H2O, כי זה עלול לגרום לפיצוץ כאשר הממס האורגני (כגון אצטון) מעורבב עם הפתרון פיראניה בטעות14. - למקם את coverslips לתוך פיראניה פתרון (3:1 תערובת של H2אז4 ו- 30% H2O2) דגירה ב 95 ° C עבור 1 h.
הערה: פתרון פיראניה הוא אנרגטי מאוד, סחף, לכן השתמש בזהירות. בעת הכנת פיראניה פתרון, להוסיף 50 מ של2O H2 תחילה לתוך גביע זכוכית 500 מ"ל, ולאחר מכן להוסיף 150 מ ל H2אז4 לאט לתוך הספל. - לשטוף את coverslips עם הנדסה גנטית H2O 5 פעמים. לאחר מכן לשטוף את כל coverslip עם הנדסה גנטית H2O ביסודיות באמצעות 3 ספלים מלאים הנדסה גנטית H2O, לייבש את coverslip באמצעות נייר מקצה coverslip. למקם את coverslip לתוך הצנצנת מכתימים ויבש את coverslip ביסודיות בתנור 110 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לשטוף את coverslip עם מתנול ומניחים את הצנצנת מכתימים לתוך התנור 110 ° C שוב להתייבש היטב את coverslip.
הערה: ייבוש ביסודיות את coverslip הוא מאוד חשוב, מכיוון APTES יש הרבה מבנים משטח אפשרי ברגע שזה בנוכחות מים19.
- לשטוף את coverslip עם מתנול ומניחים את הצנצנת מכתימים לתוך התנור 110 ° C שוב להתייבש היטב את coverslip.
- Coverslip functionalization
- להוסיף 70 מ של פתרון silane (93% מתנול, 5% אצטית, ו- 2% APTES) לתוך כל צנצנת, לדפוק את הכובע ולהזמין את הצנצנת בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
- שטוף ויבש על coverslips כפי שמתואר בשלב 3.1.5, אלא לייבש את coverslips ביסודיות באמצעות גז חנקן במקום הצבת אותם בתנור.
- יתמוסס 150 מ ג של mPEG (מתוקסי-פוליאתילן גליקול) ו- 6 מ ג של ביוטין-יתד (ביוטין-פוליאתילן גליקול) 1 מ"ל של 0.1 M מתוצרת טרייה NaHCO3 (pH 8.2) ביסודיות. צנטריפוגה ואז בגיל 17, g 000 x עבור 1 דקות להסיר יתדות קשי תמס.
הערה: NaHCO טריים3 הוא מוכן; יש צורך להתאים את החומציות. - מקם את coverslips silanized בתיבות והניח שני coverslips קטן על שני הקצוות של coverslips silanized. פיפטה 100 µL של פג פתרון על מרכז coverslip silanized, מקום אחר silanized coverslip על גבי.
- הוסף כמה הנדסה גנטית H2O בתיבה כדי לשמור את זה לח, דגירה על coverslips עם פג פתרון לפחות 3 שעות בחושך. הדגירה לילה יכול לעבוד גם כן.
- להפריד את זוגות coverslip תמשיך את פני השטח functionalized, לשטוף את coverslips באמצעות הנדסה גנטית H2O בהרחבה ו לייבש אותם עם גז חנקן.
- סמן את הצד functionalized של coverslips באחת הפינות באמצעות עט מרקר, שמור על הצד functionalized כלפי מעלה, מקם אותם בתוך קופסאות, לאחסן את הקופסאות desiccator ואקום במשך חודש.
- כדי לאחסן את coverslips למשך זמן ארוך יותר, מקום אחד coverslip לתוך צינור 50 מ ל קדח עם חור אחד על הכובע שלו, ואז לשים את הצינור לתוך שקית ניילון, לסגור את השקית בעזרת חותם ה ואקום. בדרך זו, coverslips שניתן לאחסן ב-20 ° C כ- 3 חודשים.
4. זרימה תא הרכבה
- חותכים ערוץ 15 מ"מ × 2 מ"מ במרכז של פיסת נייר-דבק כפול (30 מ"מ × 12 מ"מ) באמצעות כבטלן.
- לקלף הצד נייר של הקלטת דו-צדדית והדבק אותו בשקופית זכוכית עם שני חורים. לחץ כדי להסיר בועות אוויר. על סמך הניסיון שלנו, קל להסיר בועות אוויר על ידי פילינג בצד נייר מאשר הצד פלסטיק של הקלטת דו-צדדית.
- חתך של coverslip functionalized (60 מ"מ × 24 מ"מ) לתוך ארבע חתיכות (30 מ"מ × 12 מ"מ) באמצעות כוס יהלום שקצהו הסופר, ולהסיר את הלכלוך באמצעות גז חנקן. זכור לשמור את functionalized בצד פנים למעלה.
- לקלף את הצד פלסטיק של הקלטת דו-צידית, הדבקת השקופית-coverslip functionalized. לחץ בעדינות כדי להסיר בועות אוויר בין coverslip את הקלטת. הסרת בועות אוויר ביסודיות יכול להגן על התא זרימה דולף בזמן מאגרי נשאבו לתוכה.
- הכנס כניסת ו עודפים צינורות לתוך חורים קטנים וגדולים, בהתאמה. לתקן את הצנרת באמצעות אפוקסי.
- משאבה µL 20 של streptavidin (0.2 מ"ג/מ"ל) לתא זרימה באמצעות מזרק באופן ידני, דגירה-RT למשך 10 דקות. ואז לשאוב מאגר חסימה10 לתא זרימה כדי להחליף את streptavidin, ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.
5. הדמיה מולקולה בודדת
- להשיג את היישור מוקד של אדום, מרחיקת אדום עם A5 בשקופית פלורסצנטיות מיקרוסקופ בדיקת #1 על ידי עירור בו זמנית באמצעות 532 ננומטר לייזר ו- 640 ננומטר לייזר. לייצר תמונות גל כפול עם פיצול אופטיקה (ראה טבלה של חומרים).
- מניחים את התא זרימה על המיקרוסקופ וחבר שלה אבובים עודפים חיבור לצנרת יותר עם קפיץ 10 מ"ל להתקין משאבת אינפוזיה אוטומטיות/גמילה לתכנות.
הערה: שאיבה מאגרי לתוך התא זרימה המוזכרים להלן אמצעי מהאמנה מאגרי לאורך צינור כניסת התא זרימה המזרק. - משאבה מאגר חסימה ב- µL 500/דקה לתוך התא זרימה כדי להוציא אוויר במהירות ולהבטיח כי המאגר בתא זרימה זו אינה חסומה. לאחר מכן לשאוב את המאגר חסימה ב- µL 200/דקה לתוך התא זרימה, הפוך לאורך צינור עודפים כדי להסיר בועות אוויר לאורך צינור כניסת והתא זרימה ביסודיות.
הערה: כל מאגרי שאוב לתוך התא זרימה צריך להיות degassed, desiccator ואקום לפחות 15 דקות לפני השימוש. - להוסיף 0.5 µL של ה-DNA λ-ARS317 biotinylated µL 80 מאגר חסימה, לנפח את זה לתוך התא הזרימה ב- µL 25/דקה למשך 2 דקות. ואז שטפי DNA λ-ARS317 באמצעות µL 200 מאגר חוסמת בקצב של µL 50/min.
- משאבה µL 200 של איגוד מאגר10 בקצב של 50 µL/דקה כדי להסיר את המאגר חסימה בתא זרימה.
- הוספת 0.2 µL של מצופים streptavidin Qdot705 (1 מיקרומטר) ו- 0.2 µL של biotinylated אורק (1.2 מיקרומטר) לתוך צינור, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. ואז להוסיף 20 µL של איגוד מאגר לתוך הצינור, ומניחים אותו על קרח. הריכוז הסופי של אורק-Qdot705 הוא כ-10 ננומטר.
- להוסיף 2 µL של אורק-Qdot705 (10 ננומטר), µL 1 של DTT (100 מ מ), µL 1 של ATP (200 מ מ) לתוך µL 96 איגוד המאגר. הריכוז הסופי של אורק-Qdot705 הוא 0.2 ננומטר.
- משאבה µL 20 של nM 0.2 אורק-Qdot705 בקצב של 10 µL/דקה לתוך התא זרימה. לשטוף החוצה של אורק-Qdot מוגזמת705 באמצעות µL 200 איגוד מאגר בקצב של µL 100/min. ואז המשאבה מאגר מחייב עם 30 nM SYTOX תפוז לתוך התא זרימה כתם DNA סובסטרטים בקצב של µL 100/min.
- לרגש את האות705 אורק-Qdot, SYTOX כתום צבעונית דנ א אות באמצעות 405 ננומטר לייזר ו- 532 ננומטר לייזר, בהתאמה. לצפות את האותות בו זמנית עם 100 תזרים µL/דקה באמצעות מסנן bandpass Quad-band (FF01-446/510/581/703-25) והקלט את התמונות על ידי EM-CCD עם ms 100 לכל מסגרת. לאסוף 20 אוספי תמונות מתחומים שונים.
6. ניתוח נתונים
- חיתוך תמונות באמצעות התוכנה פיג'י עם תוסף חדש, שהוא שונה על-ידי עצמנו בהתבסס על התוסף התמונה (OI_cut_RGBmerge) שפותח על ידי במעבדה ד ר רון העמקים באוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו.
- לחתוך ערימה של תמונות (512 × 512 פיקסלים) לתוך שתי ערימות של תמונות (256 × 256 פיקסלים). אחד הוא 532 ננומטר לייזר תוצאה מרגשת, והשני הוא 405 ננומטר לייזר תוצאה מרגשת.
- תהליך 61 תמונות רציפים באמצעות פרויקט פיג'י-תמונות-ערימות-Z (בעוצמה ממוצעת).
- למדוד אורך הדנ א (DNAL) ואת המרחק מאתר של אורק-Qdot מחייב705 (Lאורק) על ה-DNA של הדי קשורה סוף באופן ידני.
- לחשב את התוצאה של Lאורק/Lהדנ א באמצעות excel, לנתח את הנתונים באמצעות שיטת האתחול מאת R, ולאחר מכן ליצור ההיסטוגרמה ובכושר הפצות לפי עקומת גאוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot אורק את ארס, ואנחנו נבנה לראשונה את המצע DNA λ-ARS317. קטע DNA המכיל ARS317 היה משולב לתוך Xhoאני אתר (33.5 kb) של ה-DNA λ מקורי על-ידי רקומבינציה הומולוגית (איור 1 א'). המוצר רקומבינציה נארזה באמצעות תמציות ותרבותית החלקיקים phage הארוז היו על צלחות ליברות (איור 1B). הפלקיו phage חיובי הוקרן על ידי ה-PCR ומאושר על-ידי קביעת רצף (איור 1C). Λ-ARS317 DNA היה טהור מן lysates נוזלי (איור 1D).
מבחני הדמיה מולקולה בודדת בוצעו על הגדרת TIRFM המטרה-סוג (איור 2). על-ידי תיוג של biotinylated אורק עם יחס של 1:1 כמעט טוחנת מצופים streptavidin Qdots במהירות, התווית על-ידי Qdot אורק נשאבה לתוך התא זרימה קשור λ-ARS317. דנ א היה מוכתם באמצעות SYTOX כתום. האותות של אורק התווית על-ידי Qdot, SYTOX-כתום-צבעונית דנ א היו עם תמונה במקביל באמצעות TIRFM (איור 3 אג-3). כדי לקבוע את ההתפלגות של אורק בλ-ARS317, הערימה הדמיה הופרד בערימות שני: מחסנית אחת של אות ה-DNA ואת הערימה של אורק אות כפי שמתואר בשלב 6.1 (איור 3B). לפי הנוסחה, מיקום (kb) = (Lאורק/LDNA) × 50 kb (דמות תלת-ממד), 273 מחייב עמדות של אורק-Qdot מולקולות705 על מצעים דנ א 168 היו quantitively ניתח. הנתונים הראו כי אורק-Qdot705 במיוחד נקשר באתר ARS317 שנוספו עם שפע הניכרים (איור 3E) . בינתיים, אורק-Qdot705 נקשר גם על אזורים AT-עשיר הנמצא אמצע וסוף חינם של ה-DNA λ, דבר העולה בקנה אחד עם התוצאות של המחקר הקודם10.
רכישת תמונות באיכות גבוהה תלוי היחס טוחנת של חלבונים, Qdots ב וזמינותו תיוג. Qdots מוגזם יכול להיות טוב עבור החלבון תיוג יעילות, אך הם יכולים ליצור רעש רקע. כפי שמוצג באיור 4, תוך תיוג של biotinylated אורק עם מצופים streptavidin Qdots ביחס 1:3 שן טוחנת, רעשי הרקע גדל. לפיכך, חיוני לבחור היחס טוחנת המתאים של חלבונים biotinylated מצופים streptavidin Qdots.
איור 1: הכנת המצע DNA λ-ARS317. (א) איור של בנייה λ-ARS317. קטע דנ א נושא ARS317 היה משולב לתוך ה-DNA λ מאת רקומבינציה הומולוגית. הפלאק (B) באמצעי מוצק LB. שלושה מהם היו מסומנים באמצעות החצים השחורים. (ג) שלט λ-ARS317 מזוהה באמצעות PCR. (משמאל) . ובכן, λ מקורי (האמצעי) ה-DNA (מימין) לוח של λ-ARS317. (ד) Purified λ-ARS317 DNA זוהה על ידי 0.6% agarose בג'ל. (משמאל) מרקר, λ (האמצעי) מקורי (מימין) דנ א טהור λ-ARS317. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: סקירה סכמטי של תא המטרה-סוג TIRF וזרימה. מבחני הדמיה מולקולה בודדת בוצעו בהתאם TIRFM שילוב עם זרימה תא מערכת. TIRFM שלנו בוצעה במיקרוסקופ הפוכה מצויד 60 X שמן אובייקטיבי (מפתח נומרי = 1.49). דנ א (קו אפור) הייתה קשורה על coverslip התא זרימה באמצעות הצמדה ביוטין-streptavidin, נמתח על ידי הזרם משמאל לימין. איגוד חלבון על ה-DNA קשור היה שצוין על-ידי נקודה אדום-סגלגל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Qdot705-שכותרתו אורק (יחס 1:1 שן טוחנת) מחייבות את λ-ARS317. (א) DNA אורק, λ-ARS317 נצפו בו זמנית. (למעלה) כתום SYTOX DNA מוכתם התרגש באמצעות 532 ננומטר לייזר ולצפות בעזרת הלהקה שידור 550-613 nm של המסנן מעברים הלהקה עם ארבע ליבות-הלהקה. (למטה) Qdot705-אורק שכותרתו הייתה נרגשת באמצעות 405 ננומטר לייזר ולצפות בעזרת הלהקה שידור 663-743 nm של המסנן מעברים הלהקה עם ארבע ליבות-הלהקה. (B) שני 256 × 256 ערימות המשנה היו תיחתך מערימת × 512 512 המקורי. (ג) תמונות רכשה באמצעות מסגרות רציפים 61 ב הערמות המתאימות. (משמאל) SYTOX תפוז צבעונית ה-DNA, Qdot (האמצעי)705-שכותרתו אורק, התמונה הממוזגת (מימין); Qdot 3705-איגוד אורק שכותרתו באתר ARS317 λ-ARS317 DNA סובסטרטים סומנו באמצעות החצים השחורים. (ד) איור של החישוב של אורק מחייבת עמדה על ה-DNA. Lדנ א אומר אורך DNA, Lאורק אומר את המרחק של אורק מחייב באתר על ה-DNA עד הסוף עגינה של ה-DNA. (ה) היסטוגרמה של אורק הפצה מחייב על ה-DNA λ-ARS317. Gaussian להתאים לנתונים הייתה מצוינת באמצעות קו אדום מוצק. קווי שגיאה מציינים בר-סמך 95% בהתבסס על דגימות האתחול 1000. N מציין את מספר מולקולות אורק. אתר ARS317 מוכנס הייתה מצוינת באמצעות חץ שחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: אורק התווית על-ידי Qdot מחייב (3:1 יחס טוחנת) λ-ARS317. אורק, λ-ARS317 DNA נצפו באותו אופן כמו באיור 3 א. (משמאל) כתום SYTOX DNA מוכתם התרגש באמצעות 532 ננומטר לייזר. (באמצע) התווית על-ידי Qdot אורק התרגש באמצעות 405 ננומטר לייזר. תמונות הממוזג (מימין). כריכת שני אורק התווית על-ידי Qdot באתר ARS317 λ-ARS317 DNA סובסטרטים סומנו באמצעות החצים השחורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבחון את האינטראקציה בין החלבון התווית על-ידי Qdot ה-DNA λ site-specifically ששונתה באמצעות TIRFM בתא-זרימה. הצעדים הנדרשים כוללים שינוי בייעודי לאתר של DNA המצע, דנ א biotinylation, coverslip ניקוי functionalization, זרימה-תא הכנה ואני הדמיה מולקולה בודדת. ישנן שתי נקודות מפתח יש לציין. ראשית, כל הצעדים הכרוכים עם ה-DNA λ צריך להיות מניפולציות בעדינות כדי להקטין נזק אפשרי, למשל, הימנעות ערבוב על-ידי pipetting למעלה ולמטה שוב ושוב. שנית, חשוב מאוד להבטיח coverslip יהיה נקי מספיק. כדי למזער את רעשי הרקע שלה. במהלך תהליך ניקוי, functionalization coverslip, המים צריכים להגיע לרמה הנדסה גנטית, האוויר צריך להיות ללא אבק. עדיף לבצע את coverslip functionalization ואת זרימה-תא הרכבה על ספסל נקי.
מבחני מולקולה בודדת ללמוד אינטראקציית חלבון-DNA, ה-DNA λ הוא המצע המתאים עם יתרונות מספר20. Λ DNA הוא מספיק זמן כדי להיות שנצפו בקלות ולאפשר הקלטה חלבון תנועה על זה בניסוי מולקולה בודדת. יתר על כן, המסוכך על ssDNA מאפשרים עיצובים רבים קשירת דנ א λ על coverslip זכוכית. במחקר זה, אנו מציגים שיטה עבור הוספה של מקטע DNA אקסוגני באתר מסוים של ה-DNA λ. לפיכך, ניתן לשלב שברי DNA למשתמש להגדרה שונים לתוך ה-DNA λ. ה-DNA ששונה λ יכול להיטהר בנוחות מן lysates נוזלי בכמויות גדולות למחקר מולקולה בודדת.
קשה להעריך את היעילות תיוג במדויק Qdot מצופים streptavidin תיוג assay כי ישנם כ 5-10 streptavidins לכל Qdot nanocrystal. בהתאם לכך, היחס טוחנת המתאים של Qdots מצופים streptavidin, חלבונים biotinylated צריך להיות מוטבת בניסויים. יחס של 1:1 שן טוחנת יכול להיות הפניה.
יצוין, כי Qdot אין אפשרות להשתמש במבחני כמותית מדויקת מאז יציבותו-צילום גבוהה היא מצוייה וזמינותו הלבנת-צילום. למרות יציבות גבוהה Qdots מגביל את היישום שלה ב מבחני כמותית, הוא מאפשר מעקב ותיק5ופיקוח קל. עם הגדלת יישומים של מולקולה בודדת פלורסצנטיות מיקרוסקופ בביולוגיה, הפרוטוקול המתואר במאמר זה מאוד יתרום להתיר את המנגנונים של ה-DNA מטבוליזם בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר חסן Yardimci, Dr.Sevim Yardimci של פרנסיס קריק המכון סוג לעזור בניסויים מולקולה בודדת, ד ר דניאל Duzdevich מהמעבדה של ד ר אריק ג גרין של אוניברסיטת קולומביה, ד ר שמש Yujie באוניברסיטת פקין, ד ר צ'ן Chunlai של באוניברסיטת צינג לדיון שימושי. מחקר זה נתמך על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין 31371264, 31401059, צוות החדשנות הבינתחומי CAS ואחווה את ניוטון מתקדם (NA140085) של החברה המלכותית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S.
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
