Summary
Nous présentons ici un protocole pour l’étude des interactions ADN-protéines par microscopie de fluorescence de la réflexion totale interne (TIRFM) en utilisant un substrat d’ADN modifié relativement λ et un point quantique-protéines marquées.
Abstract
La microscopie de fluorescence a apporté des contributions grandes en disséquant les mécanismes de processus biologiques complexes à l’échelle de la molécule. Lors d’essais de la molécule unique pour l’étude des interactions ADN-protéines, il existe deux facteurs importants pour l’examen : le substrat de l’ADN avec assez de longueur pour l’observation facile et étiquetage une protéine avec une sonde fluorescente convenable. l’ADN de 48,5 kb λ est un bon candidat pour le substrat de l’ADN. Points quantiques (Qdots), comme une classe de sondes fluorescentes, permettent l’observation longue durée (minutes et heures) et acquisition d’images de haute qualité. Dans cet article, nous présentons un protocole pour l’étude des interactions ADN-protéines au niveau molécule unique, qui comprend la préparation relativement mis à jour le λ ADN et étiquetage une protéine cible avec la Streptavidine Qdots. Pour une preuve de concept, nous choisissons des ORC (reconnaissance d’origine complexe) dans la levure de bière comme une protéine d’intérêt et visualiser son interaction avec l’ARS (séquence autonome réplication) à l’aide de TIRFM. Par rapport aux autres sondes fluorescentes, Qdots présentent des avantages évidents dans les études de la molécule unique en raison de sa grande stabilité contre le photoblanchiment, mais il est à noter que cette propriété limite son application aux dosages quantitatifs.
Introduction
Interactions entre les protéines et l’ADN sont essentielles pour nombreux processus biologiques complexes, telles que la réplication de l’ADN, réparation de l’ADN et la transcription. Bien que les approches conventionnelles ont fait la lumière sur les propriétés de ces processus, de nombreux mécanismes clés sont encore peu clairs. Récemment, avec les techniques de molécule unique se développe rapidement, certains des mécanismes ont été adressés1,2,3.
L’application de la microscopie de fluorescence de la molécule unique sur la visualisation en temps réel des interactions protéine-ADN principalement dépend du développement de la détection par fluorescence et de sondes fluorescentes. Pour une étude de la molécule unique, il est important d’étiqueter la protéine d’intérêt avec une sonde fluorescente convenable, étant donné que les systèmes de détection de fluorescence sont principalement disponibles dans le commerce.
Protéines fluorescentes sont couramment utilisés en biologie moléculaire. Toutefois, la faible luminosité fluorescente et la stabilité contre le photoblanchiment restreignent son application dans les nombreux essais seule molécule. Boîtes quantiques (Qdots) sont lumineuses minuscules nanoparticules4. En raison de leurs propriétés optiques uniques, Qdots 10 à 20 fois plus vive et plusieurs milliers de fois plus stable que le largement utilisé organiques colorants5. En outre, Qdots ont une grande Stokes Maj (la différence entre la position des pics d’excitation et d’émission)5. Ainsi, Qdots peut être utilisé pour l’observation de longue durée (minutes et heures) et d’acquisition d’images avec des rapports signal sur bruit élevés, alors qu’ils ne peuvent pas être utilisés dans les dosages quantitatifs.
A ce jour, il y a deux approches pour étiqueter une protéine cible avec Qdots relativement : marquage à l’aide d’anticorps primaires ou secondaires conjugués Qdot6,7,8; ou l’étiquetage de la protéine cible avec Qdots directement, qui repose sur l’interaction forte entre la biotine et la Streptavidine9,10,11,12,13. Streptavidine Qdots sont disponibles dans le commerce. Dans notre étude récente, relativement protéines biotinylées dans la levure de bière à haut rendement ont été purifiées par co-surexpression de BirA et protéines marquées Avi en vivo10. En suivant et en optimisant les molécules simples dosages14,15,16,17, nous avons observé les interactions entre protéines marquées Qdot et l’ADN à l’aide seule molécule TIRFM10.
Ici, nous choisissons le bourgeonnement levure origine reconnaissance complexe (ORC), qui peut reconnaître spécifiquement et les lier à la séquence reproduisant de façon autonome (ARS), comme notre protéine d’intérêt. Le protocole suivant présente une procédure pas à pas de visualiser l’interaction des ORC Qdot marqué avec ARS en utilisant TIRFM. La préparation du substrat relativement mis à jour l’ADN, l’ADN biotinylation, le nettoyage de la lamelle couvre-objet et fonctionnalisation, l’ensemble cellule-flux et l’imagerie de la molécule unique sont décrites.
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Protocol
1. préparation du substrat ADN λ-ARS317
- Emballage et construction de substrat de l’ADN
- Digérer l’ADN natif λ utilisant XhoI enzyme ; amplifier un roulement 543 de fragment d’ADN de bp ARS317 partir de l’ADN génomique de bourgeonnement de levure en utilisant des amorces contenant 20 bp homologue séquences d’en amont et en aval de XhoI site enzymatique sur lambda de l’ADN. Ajouter 100 ng de Xhoj’ai digéré l’ADN λ et 10 ng d’ADN des fragments de 10 µL de système de réaction de recombinaison homologue et incuber la réaction à 37 ° C pendant 30 min.
- Pour créer un package l’ADN λ de recombinaison, ajouter 25 µL d’extraits emballage lambda dans le produit de la recombinaison et incuber la réaction à 30 ° C pendant 90 min. Ensuite, ajouter une supplémentaire 25 µL de lambda emballage extraits dans le tube à essais. Continuer à incuber la réaction à 30 ° C pendant 90 min.
- Ajouter 500 µL de tampon de dilution stérile (10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) dans le système de réaction et mélanger doucement en tournant le tube tête en bas plusieurs fois. Ajouter 25 µL du chloroforme, mélanger doucement et conserver à 4 ° C.
- Ajouter 100 µL de phage emballé et 100 µL de bactéries LE392MP (cultivées à 0.8 - 1.0 à l’aide de milieu LB ajoutant avec 10 mM MgSO4) dans un nouveau tube. Incuber à 37 ° C pendant 15 minutes.
- Ajouter 200 µL du mélange de phage-bactérie dans 4 mL d’agar oftop (0,7 % d’agar, milieu LB + 10 mM MgSO4, refroidi à 48 ° C). Mélanger immédiatement en tournant le tube tête en bas plusieurs fois et versez-la dans une assiette préchauffée (37 ° C) LB.
- Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit et la plaque de λ-ARS317 par PCR et séquençage de l’écran.
- Purification d’ADN substrat de lysats liquide11,18
- Choisir une plaque dans 200 µL de ddH stérile2O 10 mm MgCl2 et 10 nM CaCl2. Mélanger avec 200 µL de bactéries LE392MP (cultivée pendant la nuit dans le milieu LB) et incuber à 37 ° C pendant 15 min.
- Ajouter le mélange de phage-bactérie dans 100 mL de NZCYM (10 g/L NZ-amine, 5 g/L extrait de levure, 5 g/L de NaCl, 1 g/L hydrolysat de Casamino et 2 g/L MgSO4·7H2O) moyen et la culture pendant 7 h à 37 ° C. Ajouter 250 µL du chloroforme dans la culture et agiter pendant 10 min.
- Transfert de la culture dans un ballon jaugé de 200 mL. Ajouter 5,8 g de NaCl (concentration finale de 1 M), remuez pour dissoudre à la main et incuber sur glace pendant 30 min.
- Centrifuger à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires. Recueillir le liquide surnageant dans un ballon jaugé de 200 mL et ajouter 10 % PEG8000 (m/V). Remuer pour dissoudre par appareil agitateur magnétique et incuber sur glace pendant 30 min ou plus.
- Centrifuger à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C à précipiter le bactériophage. Retirez le surnageant.
- Resuspendre le précipité dans 2 mL de tampon de dilution des phages. Transférer dans un tube de 15 mL et ajouter 10 µL de RNase (concentration finale est 20 µg/mL) et de 40 µL de DNase (concentration finale est de 5 µg/mL). Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
- Ajouter 2 mL de 0,3 M Tris-HCl (pH 9,0), 100 mM EDTA + 1,25 % SDS, protéinase µL 15 K (concentration finale est de 10 µg/mL). Incuber à 65 ° C pendant 10 min.
- Ajouter 2 mL d’acétate de potassium refroidis (3M, pH 4,8) et incuber le tube sur la glace pendant 10 min.
- Centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les matières insolubles.
- Ajouter 0,7 x volume d’alcool isopropylique dans le surnageant. Mélanger en tournant le tube tête en bas plusieurs fois et incuber pendant 2 min à température ambiante (RT).
- Centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min à RT à précipiter l’ADN. Retirez le surnageant.
- L’ADN se laver une fois avec 70 % éthanol par centrifugation à 8 000 x g pendant 10 min. Retirez le surnageant.
- Éluer l’ADN à l’aide de 500 µL de tampon de TE (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 8,0) doucement et transférer l’ADN dans le tube de 1,5 mL.
- Extraire l’ADN deux fois à l’aide de phénol : chloroforme par centrifugation à 8 000 g pendant 10 min.
- Précipiter avec 0,7 x volume isopropanol. Mélanger en tournant doucement vers le bas le tube à l’envers et centrifuger à 8 000 x g pendant 10 min.
- Laver une fois avec l’éthanol à 70 %, resuspendre dans 200 µL de TE. Mesurer la concentration d’ADN et conserver à-20 ° C à 12,5 µg aliquotes.
2. λ-ARS317 ADN Biotinylation
- De phosphoryler les oligonucléotides biotinylé (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-biotine-3') complémentaire à l’extrémité gauche du natif λ ADN, ajouter 1 µL (100 µM) d’oligonucléotides et 7,5 µL de ddH2O, 1 µL de la mémoire tampon ligase 10 x 0,5 µL de T4 PNK. Incubez la réaction à 37 ° C pendant 3 h.
- Pour phosphoryler λ-ARS317, ajouter 12,5 µg de λ-ARS317, 3 µL de 10 x tampon ligase, 1 µL de T4 PNK et FD2O pour un volume total de 30 µL. Incuber la réaction à 37 ° C pendant 3 h.
- Pour recuire oligonucléotides avec λ-ARS317, ajouter 0,5 µL d’oligonucléotides phosphorylées, 195 µL de ddH2O, 25 µL de tampon de ligase × 10 dans le tube phosphorylés λ-ARS317. Mélanger doucement en retournant le tube et laisser incuber à 65 ° C pendant 5 min. Turn off le chauffe-bloc et laissez la fraîcheur de l’échantillon à inférieure à 33 ° C dans le bloc.
- Pour ligaturer les oligonucléotides avec λ-ARS317, ajouter 1 µL de T4 DNA ligase et 0,63 µL d’ATP (200 mM). Mélanger doucement en retournant le tube et laisser incuber à température ambiante pendant 2 h ou 4 ° C durant la nuit. Conserver à 4 ° C pendant 1 mois.
Remarque : Pour éviter de casser vers le haut de l’ADN, toutes les étapes de mélange devraient être faites tourner doucement le tube tête en bas, au lieu de mélanger à l’aide de pipettes.
3. lamelle couvre-objet nettoyage et fonctionnalisation
- Lamelle couvre-objet de nettoyage
- Place 20 lamelles couvre-objet en 4 cuves de coloration (5 lamelles/jar), laisser agir pendant 30 minutes dans de l’éthanol et rincer les lamelles couvre-objet avec ultrapure H2O 3 fois.
- Laisser agir pendant 30 minutes avec 1 M d’hydroxyde de potassium (KOH) et rincer les lamelles couvre-objet avec ultrapure H2O 3 fois. Répétez l’éthanol et la sonication KOH une fois.
- Ultrasons avec de l’acétone pendant 30 minutes et puis bien rincer avec ultrapure H2O (au moins 3 fois).
Remarque : L’acétone doit être enlevé soigneusement en le rinçant avec ultrapure H2O, car il peut provoquer une explosion en solvant organique (acétone) mélange avec la solution de piranha par erreur14. - Placer les lamelles dans la solution de piranha (mélange de 3:1 H2SO4 et 30 % H2O2) et incuber à 95 ° C pendant 1 h.
NOTE : Solution Piranha est très énergique et érosive, donc à utiliser avec prudence. Lors de la préparation de la solution de piranha, ajouter 50 mL d’H2O2 tout d’abord dans un bécher de verre de 500 mL et puis ajoutez 150 mL d’H2SO4 lentement dans le bécher. - Rincer les lamelles couvre-objet avec ultrapure H2O 5 fois. Puis lavez chaque lamelle avec ultrapure H2O soigneusement à l’aide de 3 gobelets remplis d’ultrapure H2O et séchez la lamelle à l’aide de papier entre le bord de la lamelle. Placez le couvre-objet dans le bol de coloration et sécher la lamelle soigneusement dans un four à 110 ° C pendant 30 minutes.
- Rincez la lamelle avec du méthanol et placer le pot de coloration dans le four à 110 ° C à nouveau pour bien l’assécher la lamelle.
Remarque : La lamelle de séchage soigneusement est très important, car selon auront beaucoup de structures de surface possibles une fois que c’est en présence d’eau19.
- Rincez la lamelle avec du méthanol et placer le pot de coloration dans le four à 110 ° C à nouveau pour bien l’assécher la lamelle.
- Fonctionnalisation de la lamelle couvre-objet
- Ajouter 70 mL de solution de silane (93 % de méthanol, 5 % acétique et 2 % selon) dans chaque pot, visser le couvercle et laisser le bocal à température ambiante une nuit.
- Lavez et séchez les lamelles comme indiqué au point 3.1.5, sauf dry les lamelles soigneusement à l’aide d’azote au lieu de les placer dans le four.
- Dissoudre 150 mg de mPEG (méthoxy-polyéthylène glycol) et 6 mg de biotine-PEG (biotine-polyéthylène-glycol) dans 1 mL de 0.1 M faits frais NaHCO3 (pH 8,2) soigneusement. Puis centrifuger à 17, 000 x g pendant 1 min enlever les chevilles insolubles.
NOTE : Fraîchement NaHCO3 est prêt ; Il n’y a aucun besoin d’ajuster son pH. - Placer les lamelles silanisée dans des boîtes et mettre deux petites lamelles sur le dessus des deux extrémités des lamelles silanisée. Pipetter 100 µL de solution de PEG sur le centre de la lamelle silanisée et placez un autre silanisée lamelle sur le dessus.
- Ajoutez quelques ultrapure H2O dans la zone pour le garder humide et incuber les lamelles couvre-objet avec solution de PEG pendant au moins 3 h dans l’obscurité. Une incubation pendant la nuit peut fonctionner ainsi.
- Séparer les paires de la lamelle couvre-objet et suivre la face surface fonctionnalisée, rincez le couvre-objet en utilisant largement les ultrapure H2O et séchez-les avec de l’azote gazeux.
- Marquez le côté fonctionnalisé les lamelles sur un des coins à l’aide d’un marqueur, garder le côté fonctionnalisé face vers le haut, placez-les dans des boîtes et stocke les boîtes dans le dessiccateur à vide pendant 1 mois.
- Pour stocker les lamelles plus longtemps, placez une lamelle dans un tube de 50 mL foré avec un trou sur le bouchon, puis mettre le tube dans un sac en plastique et sceller le sac à l’aide d’une Scelleuse sous vide. De cette façon, les lamelles peuvent être stockés à-20 ° C environ 3 mois.
4. ensemble de cellule de flux
- Couper une chaîne de 15 × 2 mm au centre d’un morceau de Scotch double-face (30 mm x 12 mm) à l’aide d’un perforateur.
- Décollez le côté papier, du ruban adhésif double-face et coller sur la lame de verre avec deux trous. Appuyez sur pour supprimer les bulles d’air. Selon notre expérience, c’est plus facile d’enlever les bulles d’air en décollant du côté de papier que le côté plastique, du ruban adhésif double-face.
- Couper une lamelle fonctionnalisée (60 × 24 mm) en quatre morceaux (30 mm x 12 mm) à l’aide d’un verre à pointe de diamant pour marquer et retirer les débris à l’aide d’azote gazeux. N’oubliez pas de garder les fonctionnalisés côté face vers le haut.
- Décollez le côté plastique, du ruban adhésif double-face et coller la diapositive sur la lamelle fonctionnalisée. Appuyer doucement pour enlever les bulles d’air entre la lamelle et le ruban. Éliminer complètement les bulles d’air peut protéger les cellules de circulation fuient alors que les tampons ont été pompées dedans.
- Insérez inlet et tube de sortie dans les trous petits et grands, respectivement. Fixer le tuyau avec de l’epoxy.
- Injecter 20 µL de streptavidine (0,2 mg/mL) dans des cellules de circulation à l’aide d’une seringue manuellement et incuber à RT pendant 10 min. Puis pomper blocage tampon10 dans la cellule d’écoulement pour remplacer la Streptavidine et gardez-le à température ambiante.
5. la seule molécule visualisation
- Pour obtenir l’alignement focal du rouge et rouge sombre avec A5 sur la lame de test de microscope de fluorescence #1 excitation simultanée à l’aide d’un laser à 532 nm et un laser à 640 nm. Produire des images de double longueur d’onde avec séparation optique (voir Table des matières).
- Placer la cellule de flux sur le microscope et connecter son tube de sortie pour un plus long tube de connexion avec un ressort de 10 mL, installé sur une pompe à perfusion/retrait automatique programmable.
NOTE : Pompage de tampons dans la cellule de flux mentionnée ci-dessous signifie retirer le tuyau d’arrivée de la cellule de flux tampons à la seringue. - Pomper un tampon bloquant à 500 µL/min dans la cellule de flux pour évacuer l’air rapidement et faire en sorte que la mémoire tampon dans la cellule de flux est débloqué. Pomper le tampon de blocage à 200 µL/min dans la cellule de flux, puis retourner le tube de sortie pour enlever les bulles d’air de la tubulure d’admission et la cellule de flux soigneusement.
Remarque : Tous les tampons pompées dans la cellule d’écoulement doivent être dégazées dans un dessiccateur à vide pendant au moins 15 minutes avant utilisation. - Ajouter 0,5 µL d’ADN λ-ARS317 biotinylé dans 80 µL de tampon de blocage et pompez dans la cellule de flux à 25 µL/min pendant 2 min. Puis rincer l’ADN λ-ARS317 à l’aide de 200 µL de tampon de blocage à un taux de 50 µL/min.
- Pompe 200 µL de liaison tampon10 à raison de 50 µL/min pour retirer le tampon de blocage dans la cellule de flux.
- Ajouter 0,2 µL de streptavidine Qdot705 (1 µM) et 0,2 µL de biotinylé ORC (1,2 µM) dans un tube et incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 20 µL de liaison tampon dans le tube, puis placez-le sur la glace. La concentration finale de ORC-Qdot705 est d’environ 10 nM.
- Ajouter 2 µL de ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µL de la TNT (100 mM), 1 µL de 96 µL de tampon de liaison de l’ATP (200 mM). La concentration finale de ORC-Qdot705 est 0,2 nM.
- Pompe 20 µL de 0,2 nM ORC-Qdot705 à raison de 10 µL/min dans la cellule de flux. Débusquer des excessive ORC-Qdot705 à l’aide de 200 µL de tampon de liaison au taux de 100 µL/min. Puis le tampon de liaison pompe avec 30 nM SYTOX Orange dans la cellule de flux pour colorer les substrats d’ADN à un taux de 100 µL/min.
- Exciter le signal de705 ORC-Qdot et SYTOX Orange colorées signal d’ADN en utilisant un laser à 405 nm et laser de 532 nm, respectivement. Observez les signaux simultanément avec 100 µL/min débit à l’aide d’un filtre passe-bande de quadri-bande (FF01-446/510/581/703-25) et les images par EM-CCD avec 100 ms par image. Recueillir 20 piles d’image de différents domaines.
6. analyse de données
- Cadrer les images à l’aide du logiciel Fidji avec un nouveau plugin, ce qui est modifié par nous-mêmes basés sur le plugin Image (OI_cut_RGBmerge) mis au point par le laboratoire de Dr. Ron Vale à l’Université de Californie à San Francisco.
- Recadrer une pile d’images (512 × 512 pixels) en deux piles d’images (256 × 256 pixels). L’un est un 532 nm laser résultat passionnant, et l’autre est un 405 nm laser résultat passionnant.
- Processus de 61 images séquentiels à l’aide de projet Fidji-Image-piles-Z (intensité moyenne).
- Mesurez la longueur de l’ADN (ADNde L) et la distance entre le site de ORC-Qdot705 (LORC) fixation sur l’ADN et de l’ADN tethered fin manuellement.
- Calculer le résultat de LORC/lADN en utilisant excel, analyser les données à l’aide de la méthode du bootstrap par R, puis créer l’histogramme et ajustement des distributions gaussiennes.
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Representative Results
Afin de visualiser l’interaction entre Qdot marqué ORC et l’ARS, nous avons tout d’abord construit le substrat d’ADN λ-ARS317. Un fragment d’ADN contenant le ARS317 a été intégré dans Xhoje site (33,5 kb) de l’ADN natif λ par recombinaison homologue (Figure 1 a). Le produit de recombinaison a été emballé à l’aide d’extraits et les particules phagiques emballés ont été cultivés sur des plaques LB (Figure 1 b). La plaque positive phage a été projetée par PCR et confirmée par séquençage (Figure 1). Λ-ARS317 ADN a été purifiée à partir les lysats liquides (Figure 1).
Molécules simples tests d’imagerie ont été réalisées sur le montage d’objectif-type TIRFM (Figure 2). En les marquant la biotinylé ORC avec un rapport molaire de près de 1:1-streptavidine Qdots rapidement, ORC Qdot marquée a été pompée dans la cellule de flux captif λ-ARS317. L’ADN était Taché à l’aide de SYTOX Orange. Les signaux de Qdot marqué ORC et ADN SYTOX-Orange-colorées ont été projetés simultanément à l’aide de TIRFM (Figure 3 a-3 C). Pour déterminer la répartition des ORC sur λ-ARS317, la pile d’imagerie a été séparée en deux piles : une pile de signal de l’ADN et de l’autre pile du signal ORC comme indiqué au point 6.1 (Figure 3 b). Selon la formule, Position (Ko) = (L/lORCADN) × 50 Ko (Figure 3D), 273, contraignant les positions des molécules705 ORC-Qdot sur des substrats d’ADN 168 ont été quantitativement analysé. Les données ont montré que l’ORC-Qdot705 lie spécialementsur le site ARS317 inséré avec une abondance évidemment élevé (Figure 3E). Pendant ce temps, ORC-Qdot705 lie également sur les zones riches en AT situés au milieu et l’extrémité libre de l’ADN de λ, qui concorde avec les résultats de l’étude précédente10.
L’acquisition d’images de haute qualité dépend du rapport molaire de protéines et de Qdots dans l’essai de l’étiquetage. Qdots excessive peut être bon pour la protéine à l’étiquetage de l’efficacité, mais ils peuvent créer des bruits de fond. Comme indiqué sur la Figure 4, tout étiquetage le biotinylé ORC avec streptavidine Qdots au rapport molaire de 1:3, le bruit de fond a augmenté. Ainsi, il est essentiel de choisir le rapport approprié de molaire des protéines biotinylées de streptavidine Qdots.
Figure 1 : préparation du substrat ADN λ-ARS317. (A) Illustration de λ-ARS317 construction. Un fragment d’ADN portant le ARS317 a été intégré dans l’ADN de λ par recombinaison homologue. (B) les Plaques sur milieu solide LB. Trois d'entre eux ont été marquées à l’aide de flèches noires. (C) une plaque de λ-ARS317 a été identifiée à l’aide de la PCR. (gauche) Marqueur, ADN λ native (au milieu), une plaque de λ-ARS317 (à droite). (D) l’ADN purifiée λ-ARS317 a été détecté par électrophorèse sur gel d’agarose 0,6 %. (gauche) Marqueur, λ native (celle du milieu) (à droite) l’ADN purifié λ-ARS317. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : aperçu schématique des cellule de FRBR et flux de type objectif. Tests d’imagerie seule molécule ont été effectuées selon le TIRFM combinant avec système de cellule de flux. Notre TIRFM a été réalisée sur un microscope inversé muni d’un 60 X objectif à huile (ouverture numérique = 1,49). ADN (ligne grise) a été attaché sur la lamelle dans la cellule de flux par le biais de la liaison streptavidine-biotine et tendue par le flux de gauche à droite. Une liaison de protéine sur l’ADN captif a été indiquée par un point rouge-ovale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Qdot705-étiqueté ORC (rapport molaire de 1:1) lie λ-ARS317. (A) l’ADN ORC et λ-ARS317 ont été observés simultanément. (en haut) SYTOX Orange tachée ADN était excité à l’aide d’un laser à 532 nm et observé à l’aide de la bande de transmission 550-613 nm du filtre passe-bande quadri-bande. (en bas) QDOT705-marqué ORC étais excité à l’aide d’un laser à 405 nm et observé à l’aide de la bande de transmission 663-743 nm du filtre passe-bande quadri-bande. (B) deux 256 × 256 piles secondaires ont été coupées de la pile originale de × 512 512. (C) les images acquises à l’aide de 61 images séquentielles dans les piles correspondantes. (gauche) L’ADN, (celle du milieu) Qdot705coloré Orange SYTOX-étiqueté ORC, image fusionnée (à droite) ; trois Qdot705-marqué ORC liaison au site de ARS317 sur des substrats d’ADN λ-ARS317 ont été marquées à l’aide de flèches noires. (D) Illustration du calcul de l’ORC liant la position sur l’ADN. LADN désigne la longueur de l’ADN, LORC , la distance de ORC site sur l’ADN de liaison à la fin captif de l’ADN. Distribution en liaison histogramme d’ORC (E) λ-ARS317 ADN. Gaussienne aux données indiquait clairement à l’aide de la ligne rouge solide. Barres d’erreur indiquent un intervalle de confiance 95 % issu des 1000 échantillons bootstrap. N désigne le nombre de molécules d’ORC. Site ARS317 inséré a été indiquée à l’aide d’une flèche noire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : liaison Qdot marqué ORC (rapport molaire de 3:1) sur λ-ARS317. L’ADN ORC et λ-ARS317 ont été observés de la même manière que dans la Figure 3 a. (gauche) SYTOX Orange tachée ADN était excité à l’aide d’un laser à 532 nm. (au milieu) QDOT marqué ORC était excité à l’aide d’un laser à 405 nm. images fusionnées (à droite). Deux liaison ORC Qdot marqué sur le site ARS317 sur des substrats d’ADN λ-ARS317 ont été marquées à l’aide de flèches noires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous présentons ici un protocole pour observer l’interaction entre la protéine Qdot marqués et l’ADN de λ relativement modifiées à l’aide de la TIRFM dans une cellule d’écoulement. Les mesures nécessaires comprennent une modification spécifique du substrat de l’ADN, ADN biotinylation, nettoyage de la lamelle couvre-objet et fonctionnalisation, flux-cellule préparation et single-molecule imaging. Il y a deux points essentiels qui est à noter. Tout d’abord, toutes les étapes avec λ ADN doivent être manipulés délicatement pour diminuer d’éventuels dommages, par exemple, en évitant le mélange en pipettant également monter et descendre à plusieurs reprises. Deuxièmement, il est très important de s’assurer que la lamelle est suffisamment propre pour minimiser le bruit de fond. Pendant le processus de nettoyage et fonctionnalisation de lamelle, l’eau devrait atteindre niveau ultrapure et l’air doit être exempt de poussière. Il est préférable d’effectuer la fonctionnalisation de la lamelle couvre-objet et l’assemblage de la cellule d’écoulement sur un banc propre.
Dans les essais de la molécule unique pour l’étude des interactions protéine-ADN, ADN λ est un substrat approprié avec plusieurs avantages20. L’ADN λ est assez longtemps pour être facilement observée et permettre l’enregistrement mouvement de protéines à ce sujet dans une expérience seule molécule. En outre, les surplombs ADNsb permettent beaucoup de conceptions pour l’attachement λ ADN sur une lamelle de verre. Dans cette étude, nous présentons une méthode pour insérer un fragment d’ADN exogène dans un site spécifique de l’ADN de λ. Ainsi, différents fragments d’ADN définissables par l’utilisateur peuvent être intégrés dans l’ADN de λ. L’ADN modifié λ peut être commodément purifié de lysats de liquides en grandes quantités pour l’étude de la molécule.
Il est difficile d’évaluer l’efficacité d’étiquetage avec précision dans le Qdot streptavidine étiquetage test parce qu’il y a environ 5-10 streptavidins par Qdot nanocristallins. En conséquence, le rapport molaire approprié de streptavidine Qdots et protéines biotinylées doit être optimisé dans les expériences. Un rapport molaire de 1:1 peut être une référence.
Il est à noter que Qdot ne saurait servir dans des dosages quantitatifs précis puisque sa photo-stabilité élevée ne convient pas pour le dosage de photo-blanchiment. Bien que la grande stabilité de Qdots limite son application dans les dosages quantitatifs, il permet facile d’observation et de suivi de longue date5. Avec l’augmentation des applications de la microscopie de fluorescence de la molécule unique en biologie, le protocole décrit dans ce document contribuera grandement à démêler les mécanismes du métabolisme de l’ADN à l’avenir.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Hasan Yardimci et Dr.Sevim Yardimci de l’Institut Francis Crick genre aider dans les expériences de la molécule unique, Dr Daniel Duzdevich du laboratoire du Dr. Eric C. Greene de l’Université de Columbia, Dr Yujie Sun de l’Université de Pékin et Dr Chunlai Chen du L’Université Tsinghua de discussion utile. Cette étude a été financée par le National Natural Science Foundation de Chine 31371264, 31401059, CAS équipe interdisciplinaire de l’Innovation et la bourse avancé de Newton (NA140085) de la Royal Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
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