Summary
Aquí, presentamos un protocolo de estudio de las interacciones DNA-proteína por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) utilizando un sustrato de ADN λ site-specifically modificado y un etiquetado proteína del punto cuántico.
Abstract
La microscopía de fluorescencia ha hecho grandes contribuciones en la disección de los mecanismos de los procesos biológicos complejos en el plano de la molécula sola. En los ensayos de molécula única para el estudio de las interacciones DNA proteína, hay dos factores importantes para su consideración: el sustrato de ADN con suficiente longitud para la observación fácil y etiquetado una proteína con una sonda fluorescente adecuada. 48,5 kb λ DNA es un buen candidato para el sustrato de la ADN. Puntos cuánticos (Qdots), como una clase de sondas fluorescentes, permiten la observación de largo plazo (de minutos a horas) y adquisición de imágenes de alta calidad. En este trabajo, presentamos un protocolo de estudio de las interacciones DNA-proteína a nivel de una sola molécula, que incluye preparar un site-specifically modificado λ DNA y etiquetado una proteína diana con Qdots recubiertas de estreptavidina. Para una prueba de concepto, elegir ORC (reconocimiento de origen complejo) en levadura de florecimiento como una proteína de interés y visualizar su interacción con un ARS (secuencia de replicación Autónoma) usando TIRFM. En comparación con otras sondas fluorescentes, Qdots tienen ventajas obvias en los estudios de molécula única debido a su alta estabilidad contra el fotoblanqueo, pero cabe señalar que esta propiedad limita su aplicación en ensayos cuantitativos.
Introduction
Las interacciones entre proteínas y ADN son esenciales para muchos procesos biológicos complejos, como la replicación del DNA, la reparación del ADN y la transcripción. Aunque los enfoques convencionales han arrojado luz sobre las propiedades de estos procesos, muchos de los mecanismos claves aún no están claros. Recientemente, con el rápido desarrollo técnicas sola molécula, algunos de los mecanismos han sido accedido1,2,3.
La aplicación de la microscopia de la fluorescencia de una sola molécula en visualizar las interacciones DNA proteína en tiempo real sobre todo depende del desarrollo de la detección de fluorescencia y sondas fluorescentes. Para el estudio de una sola molécula, es importante identificar la proteína de interés con una sonda fluorescente adecuada desde sistemas de detección de fluorescencia sobre todo están disponibles comercialmente.
Proteínas fluorescentes se utilizan en biología molecular. Sin embargo, el bajo brillo fluorescente y estabilidad contra el fotoblanqueo restringen su aplicación en muchos análisis a la sola molécula. Puntos cuánticos (Qdots) son pequeños emisores de luz nanopartículas4. Debido a sus propiedades ópticas únicas, Qdots son 10 - 20 veces más brillantes y varios miles de veces más estable que el ampliamente utilizado orgánicos colorantes5. Por otra parte, Qdots tienen un gran Stokes shift (la diferencia entre la posición de los picos de excitación y emisión)5. Así, Qdots puede utilizarse para la observación desde hace mucho tiempo (minutos a horas) y adquisición de imágenes con altos cocientes signal-to-noise, mientras que no pueden ser utilizados en los ensayos cuantitativos.
Hasta la fecha, existen dos enfoques para identificar una proteína diana con Qdots site-specifically: etiquetado con la ayuda de anticuerpos primarios o secundarios conjugados Qdot6,7,8; o etiquetado la proteína diana con Qdots directamente, que se basa en la fuerte interacción entre biotina y estreptavidina9,10,11,12,13. Recubiertas de estreptavidina Qdots están comercialmente disponibles. En nuestro reciente estudio, site-specifically proteínas biotinilado en levadura de florecimiento con la eficacia alta se purificaron por co-sobreexpresión de BirA y proteínas etiquetadas Avi en vivo10. Siguiente y optimización de los ensayos de una sola molécula14,15,16,17, observamos las interacciones entre etiquetado Qdot proteínas y DNA en la sola molécula nivel utilizando TIRFM10.
Aquí, elegimos el florecimiento levadura origen reconocimiento complejo (ORC), que específicamente puede reconocer y unirse a la secuencia de replicación autónoma (ARS), como la proteína de interés. El siguiente protocolo presenta un procedimiento paso a paso de visualizar la interacción de ORC Qdot etiquetados con ARS usando TIRFM. Se describen la preparación del sustrato de ADN site-specifically modificado, la Biotinilación de ADN, la limpieza de cubreobjetos y funcionalización, el montaje de celda de flujo y la proyección de imagen de una sola molécula.
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Protocol
1. preparación del sustrato de ADN λ-ARS317
- Embalaje y construcción del sustrato de ADN
- Digerir el ADN nativo λ mediante XhoI enzima; amplificar un cojinete de fragmento de ADN de bp 543 ARS317 de la DNA genomic de florecimiento levadura usando las cartillas que contienen 20 homóloga de la bp secuencias de aguas arriba y aguas abajo de XhoI sitio de la enzima en el ADN de lambda. Añadir 100 ng de Xhodigiere ADN λ y 10 ng de ADN fragmento a 10 μl de sistema de reacción de recombinación homóloga e incubar la reacción a 37 ° C durante 30 minutos.
- Para la recombinación λ DNA del paquete, añadir 25 μl de los extractos de empaquetado de lambda en el producto de la recombinación e incubar la reacción a 30 ° C durante 90 minutos. A continuación, agregar un adicional 25 μl de los extractos de empaquetado de lambda en el tubo de reacción. Seguir a incubar la reacción a 30 ° C durante 90 minutos.
- Añadir 500 μl de tampón de dilución estéril (10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) en el sistema de reacción y mezclar suavemente girando el tubo boca abajo varias veces. Añada 25 μl de cloroformo, mezclar suavemente y guardar a 4 ° C.
- Añadir 100 μl de fagos empaquetados y 100 μl de las bacterias LE392MP (cultivadas en 0.8 - 1.0 con medio LB añadiendo con 10 mM MgSO4) en un tubo nuevo. Incubar a 37 ° C durante 15 minutos.
- Añadir 200 μL de mezcla de fago-bacteria en agar oftop de 4 mL (0,7% de agar, medio LB + 10 mM MgSO4, enfriado a 48 ° C). Mezclar inmediatamente girando el tubo boca abajo varias veces y verter en un plato precalentado (37 ° C) LB.
- Incubar la placa a 37 ° C durante la noche y la placa de ARS317 λ mediante PCR y secuenciación de la pantalla.
- Purificación de sustrato de ADN de lisados líquido11,18
- Elegir una placa en 200 μL de ddH estéril2O de 10 mM de MgCl2 y 10 nM CaCl2. Mezclar con 200 μL de bacterias LE392MP (cultivada durante la noche en medio LB) e incubar a 37 ° C durante 15 minutos.
- Añadir la mezcla de fago-bacteria en 100 mL de NZCYM (10 g/L amina de Nueva Zelanda, 5 g/L levadura extracto, 5 g/L de NaCl, 1 g/L Casamino hidrolizado y MgSO4·7H2O de 2 g/L) medio y la cultura de 7 h a 37 ° C. Añadir 250 μl de cloroformo en la cultura y agite por otros 10 minutos.
- Transferencia de la cultura en un matraz de 200 mL. Agregar 5,8 g de NaCl (concentración final de 1 M), agitar para disolver con la mano e incubar en hielo durante 30 minutos.
- Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C para eliminar los restos celulares. Recoger el sobrenadante en un matraz de 200 mL y añadir 10% PEG8000 (m/V). Revolver para disolver por el aparato de agitación magnética e incubar en hielo durante 30 minutos o más.
- Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C para precipitar el bacteriófago. Eliminar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado en 2 mL de tampón de dilución de fago. Transferir a un tubo de 15 mL y añadir 10 μl de ARNasa (concentración final es de 20 μg/mL) y 40 μl de DNasa (concentración final es de 5 μg/mL). Incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
- Añadir 2 mL de 0,3 M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + 1.25% SDS, proteinasa μl 15 K (concentración final es de 10 μg/mL). Incubar a 65 ° C durante 10 minutos.
- Añadir 2 mL de acetato de potasio previamente enfriado (3 M, pH 4.8) e incubar el tubo en hielo durante 10 minutos.
- Centrifugue a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C para eliminar el material insoluble.
- Añadir un volumen de 0,7 x de isopropanol en el sobrenadante. Mezcla girando el tubo boca abajo varias veces e incubar durante 2 min a temperatura ambiente (RT).
- Centrifugue a 8.000 x g por 10 min a temperatura ambiente para precipitar el ADN. Eliminar el sobrenadante.
- Lavar el ADN una vez con el 70% etanol por centrifugación a 8.000 x g durante 10 minutos retirar el sobrenadante.
- Eluir el ADN con 500 μl de tampón TE (10 mM de Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) con suavidad y transfiera el ADN en tubo de 1,5 mL.
- Extraer el ADN dos veces con fenol: cloroformo por centrifugación a 8.000 g durante 10 minutos.
- Precipitado con isopropanol de volumen x 0,7. Mezcle girando el tubo de arriba abajo suavemente y centrifugar a 8.000 x g durante 10 min.
- Una vez lavado con etanol al 70%, resuspender en 200 μL de TE. Medir la concentración de ADN y almacenar a-20 ° C en 12,5 μg alícuotas.
2. ARS317 de λ DNA Biotinilación
- Que fosforilan biotinilado oligonucleótidos (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-biotina-3') complementarios para el extremo izquierdo del nativo λ DNA, añadir 1 μl (100 μm) de oligonucleótidos, 7.5 μl de ddH2O, 1 μl de 10 x buffer ligasa y 0,5 μl de T4 PNK. Incubar la reacción a 37 ° C durante 3 horas.
- Fosforilan λ ARS317, añadir 12,5 μg de ARS317 λ, 3 μl de 10 x buffer ligasa, 1 μl de T4 PNK y ddH2O volumen total de 30 μl. Incubar la reacción a 37 ° C durante 3 horas.
- Para Recueza oligonucleótidos con λ-ARS317, Añadir 0,5 μl de oligonucleótidos fosforiladas, 195 μl de ddH2O, 25 μl de tampón de ligasa × 10 en el tubo de la λ-ARS317 fosforilada. Mezclar suavemente girando hacia abajo del tubo e incubar a 65 ° C por 5 min vuelta apagado el calentador del bloque y dejar que el fresco muestra a debajo de 33 ° C en el bloque.
- Para ligan oligonucleótidos con λ-ARS317, añadir 1 μl de T4 ADN ligasa y 0.63 μl de ATP (200 mM). Mezclar suavemente girando el tubo boca abajo e incubar a temperatura ambiente durante 2 h o 4 ° C durante la noche. Almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
Nota: Para evitar romper el ADN, todos los pasos de los mezcla deben hacerse girando suavemente el tubo boca abajo, en lugar de mezcla utilizando pipetas.
3. cubreobjetos limpieza y funcionalización
- Cubreobjetos de limpieza
- Cubre-objetos 20 lugar en 4 recipientes de tinción (5 cubreobjetos/jar), someter a ultrasonidos durante 30 minutos en etanol y enjuagar el cubreobjetos con ultrapura H2O 3 veces.
- Someter a ultrasonidos durante 30 minutos con 1 M hidróxido de potasio (KOH) y enjuague el cubreobjetos con ultrapura H2O 3 veces. Repita el etanol y sonicación KOH una vez.
- Someter a ultrasonidos con acetona durante 30 minutos y luego enjuague con ultrapura de H2O bien (por lo menos 3 veces).
Nota: Acetona debe eliminarse completamente mediante enjuague con ultrapura de H2O, ya que puede causar una explosión cuando el solvente orgánico (como acetona) mezclado con la solución Piraña por error14. - Coloque el cubreobjetos solución Piraña (3:1 mezcla de H2SO4 y 30% H2O2) e incubar a 95 ° C durante 1 hora.
Nota: Solución Piraña es altamente energético y erosiva, use con precaución. Preparar solución Piraña, añadir 50 mL de H2O2 primero en un vaso de vidrio de 500 mL y luego agregar 150 mL de H2hasta4 lentamente en el vaso. - Enjuague el cubreobjetos con ultrapura de H2O 5 veces. Luego lave cada cubreobjetos con ultrapura de H2O con 3 vasos llenados de la poste-limpieza de H2O y seque el cubreobjetos papel desde el borde del cubreobjetos. Coloque el cubreobjetos en el recipiente de tinción y seque el cubreobjetos cuidadosamente en un horno de 110 ° C durante 30 minutos.
- Enjuague el cubreobjetos con metanol y coloque la jarra de tinción en el horno de 110 ° C para secar el cubreobjetos.
Nota: Secado bien el cubreobjetos es muy importante, porque APTES tendrá un montón de posibles estructuras superficiales una vez que está en presencia de agua19.
- Enjuague el cubreobjetos con metanol y coloque la jarra de tinción en el horno de 110 ° C para secar el cubreobjetos.
- Funcionalización de cubreobjetos
- Agregar 70 mL de solución de silano (93% de metanol, 5% acético y 2% APTES) en cada frasco, el tapón de rosca y deje el frasco a temperatura ambiente durante la noche.
- Lave y seque el cubreobjetos, como se describe en el paso 3.1.5, excepto seco el cubreobjetos con nitrógeno en lugar de colocar en el horno.
- Disolver 150 mg de mPEG (metoxi-polietilenglicol) y 6 mg de biotina-PEG (biotina-polietilenglicol) en 1 mL de 0.1 M hizo fresco NaHCO3 (pH 8.2) completamente. Luego centrifugar a 17, 000 x g durante 1 min quitar las clavijas insolubles.
Nota: Recién hecho NaHCO3 está listo; no hay necesidad para ajustar su pH. - Pon el cubreobjetos silanizada en cajas y dos cubreobjetos pequeño en la parte superior de dos extremos de los cubreobjetos silanizada. Pipetear 100 μl de solución de PEG en el centro del cubreobjetos silanizada y coloque otro cubreobjetos silanizada en la parte superior.
- Añadir algunos ultrapura de H2O en el cuadro para mantenerlo húmedo e incubar el cubreobjetos con solución de PEG durante al menos 3 h en la oscuridad. Una incubación durante la noche puede trabajar así.
- Separar los pares de cubreobjetos mantener la cara superficial funcionalizada, enjuague el cubreobjetos utilizando extensivamente ultrapura de H2O y séquelos con gas nitrógeno.
- Marca el lado funcionalizado de cubreobjetos en uno de los rincones con un rotulador, mantenga el lado funcionalizado boca arriba, coloque en cajas y almacena las cajas en el desecador de vacío durante 1 mes.
- Para almacenar el cubre-objetos durante más tiempo, coloque un cubreobjetos en un tubo de 50 mL con un agujero en la tapa, luego poner el tubo en una bolsa de plástico y selle la bolsa con un sellador del vacío. De esta manera, el cubreobjetos pueden almacenarse a-20 ° C aproximadamente 3 meses.
4. unidad de celda de flujo de
- Corte un canal 15 mm × 2 mm en el centro de un pedazo de cinta de doble cara (30 x 12 mm) con un golpeador.
- Desprenda el lado de papel de la cinta de doble cara y pegarlo en la diapositiva de cristal con dos agujeros. Presione para quitar burbujas de aire. Basándonos en nuestra experiencia, es más fácil eliminar las burbujas de aire desprendiendo la parte del papel que el lado plástico de la cinta de doble cara.
- Un cubreobjetos funcionalizado (60 x 24 mm) a cortar cuatro piezas (30 x 12 mm) utilizando un vidrio punta de diamante Escribano y eliminar los desechos usando nitrógeno gas. Recuerde que debe mantener el funcionalizados cara.
- Desprenda el lado plástico de la cinta de doble cara y pegue la diapositiva en el cubreobjetos funcionalizado. Presione suavemente para quitar burbujas de aire entre el cubreobjetos y la cinta. Eliminar completamente las burbujas de aire puede proteger la célula de flujo de fuga mientras que los tampones se bombea en él.
- Insertar entrada y la tubería de salida en agujeros grandes y pequeñas, respectivamente. Fijar el tubo con resina.
- Bomba de 20 μl de estreptavidina (0,2 mg/mL) en la celda de flujo usando una jeringa manual e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego bomba bloqueo buffer10 en la celda de flujo para reemplazar a estreptavidina y mantenerlo a temperatura ambiente.
5. sola molécula visualización
- Obtener la alineación focal rojo y far-red con el A5 en la diapositiva de prueba de microscopio de fluorescencia #1 excitación simultánea utilizando láser 532 nm y una 640 nm láser. Producir imágenes de longitud de onda dual con división óptica (véase Tabla de materiales).
- Coloque la celda de flujo en el microscopio y conecte la tubería de salida a un largo tubo conexión con un resorte de 10 mL instalado en una bomba de infusión retiro automatizado programable.
Nota: Bombeo de buffers en la célula de flujo mencionada significa retirar topes del tubo de entrada de la célula de flujo para la jeringa. - Bomba de solución amortiguadora de bloqueo en 500 μl/min en la célula de flujo para eliminar el aire rápidamente y asegurarse de que el búfer en la celda de flujo es desbloqueado. Entonces la solución amortiguadora de bloqueo de la bomba a 200 μL/min en la célula de flujo y tapa el tubo de salida para eliminar las burbujas de aire de la tubería de entrada y la celda de flujo completamente.
Nota: Todos los búferes bombeados dentro de la célula de flujo deben ser desgasificados en un desecador de vacío durante al menos 15 minutos antes de usar. - Añadir 0,5 μl de biotinilado λ-ARS317 ADN en 80 μl de solución amortiguadora de bloqueo y bomba dentro de la célula de flujo en 25 μl/min durante 2 minutos. Luego enjuague ARS317 λ DNA con 200 μL de solución amortiguadora de bloqueo a una tasa de 50 μl/min.
- 200 μL de binding buffer10 a razón de 50 μl/min para quitar el amortiguador de bloqueo en la celda de flujo de la bomba.
- Añadir 0,2 μl de streptavidin recubierto Qdot705 (1 μm) y 0.2 μl de biotinilado ORC (1,2 μm) en un tubo e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación añadir 20 μl de binding buffer en el tubo y coloque en hielo. La concentración final de ORC Qdot705 es alrededor de 10 nM.
- Añadir 2 μl de ORC Qdot705 (10 nM), 1 μl de la TDT (100 mM), 1 μl de la ATP (200 mM) en 96 μl de tampón de Unión. La concentración final de ORC Qdot705 es de 0.2 nM.
- Bomba de 20 μl de 0,2 nM ORC Qdot705 a razón de 10 μl/min en la célula de flujo. Lave de excesiva ORC Qdot705 con 200 μL de tampón de unión a razón de 100 μl/min. Luego el tampón de Unión bomba con 30 nM SYTOX naranja dentro de la célula de flujo para teñir sustratos de ADN a un ritmo de 100 μl/min.
- Excitar la señal de705 ORC Qdot y SYTOX naranja manchado señal de ADN usando un 405 nm láser y láser de 532 nm, respectivamente. Observar las señales simultáneamente con 100 μl/min del flujo usando un filtro pasabanda de banda cuádruple (FF01-446/510/581/703-25) y grabar las imágenes por el EM-CCD con 100 ms por fotograma. Recoger 20 pilas de imágenes de diferentes campos.
6. Análisis de datos
- Cultivo las imágenes utilizando el software de Fiji con un nuevo plugin, que es modificado por nosotros basadas en el plugin de imagen (OI_cut_RGBmerge) desarrollado por laboratorio el Dr. Ron Vale Universidad de California en San Francisco.
- Una pila de imágenes (512 × 512 píxeles) de los cultivos en dos pilas de imágenes (256 × 256 píxeles). Uno es un 532 nm láser resultado emocionante, y el otro es un 405 nm láser resultado emocionante.
- Proceso de 61 imágenes secuenciales mediante proyecto de la Fiji-imagen-pilas-Z (intensidad media).
- Mida la longitud de la DNA (ADNde L) y la distancia entre el sitio de ORC Qdot705 (LORC) enlace sobre el ADN y el ADN había atado final manualmente.
- Calcular el resultado de LORC/lADN usando excel, analizar los datos utilizando el método de bootstrap por R, entonces crear el histograma y ajuste de distribuciones Gaussian.
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Representative Results
Para visualizar la interacción entre etiquetado Qdot ORC y la ARS, se construyó primero el sustrato de ADN λ ARS317. Un fragmento de ADN que contiene ARS317 fue integrado en Xhositio (33,5 kb) de nativos λ DNA por recombinación homóloga (figura 1A). El producto de la recombinación fue empaquetado usando los extractos y las partículas de fagos empaquetados fueron cultivadas en placas de LB (figura 1B). La placa de fagos positivos fue defendida por PCR y confirmada por la secuenciación (figura 1). Se purificó ADN λ-ARS317 de los lisados líquidos (figura 1).
Ensayos de una sola molécula se realizaron en la configuración TIRFM de tipo objetivo (figura 2). Por etiquetado el biotinilado orco con un cociente molar de 1:1 casi Qdots recubiertas de estreptavidina rápidamente, etiquetado Qdot orco fue bombeado dentro de la célula de anclado de flujo λ ARS317. ADN se tiñó con SYTOX naranja. Las señales de marcado Qdot ORC y ADN teñidos de naranja SYTOX fueron imágenes concurrentemente usando TIRFM (Figura 3A-3 C). Para determinar la distribución de ORC en λ-ARS317, la pila de imágenes fue separada en dos pilas: una pila de señal de ADN y la otra pila de señal orco como se describe en el paso 6.1 (figura 3B). Basado en la fórmula, posición (kb) = (L/lORCADN) × 50 kb (figura 3D), 273 vinculante puestos de ORC Qdot705 moléculas sobre sustratos de ADN 168 fueron analizado cuantitativamente. Los datos mostraron que la ORC Qdot705 especialmente se uneen el sitio ARS317 insertado con abundancia obviamente alto (figura 3E). Mientras tanto, ORC Qdot705 se une también en las zonas ricas en AT situadas en el centro y el extremo libre del ADN λ, que es consistente con los resultados del anterior estudio10.
La adquisición de imágenes de alta calidad depende de la relación molar de la proteína y Qdots en el análisis del etiquetado. Qdots excesiva puede ser bueno para la proteína de etiquetado de eficiencia, pero pueden crear ruido de fondo. Como se muestra en la figura 4, mientras que etiquetado biotinilado ORC con recubiertas de estreptavidina Qdots en proporción molar de 1:3, aumenta el ruido de fondo. Por lo tanto, es fundamental elegir la relación molar apropiada de proteínas biotinilado a Qdots recubiertas de estreptavidina.
Figura 1: preparación del sustrato de ADN λ ARS317. (A) ilustración de la λ-ARS317 construcción. Un fragmento de ADN con ARS317 fue integrado en λ DNA por recombinación homóloga. (B) placas de medio sólido LB. Tres de ellos fueron marcadas con flechas negras. (C) una placa de ARS317 λ fue identificada usando PCR. (izquierda) Marcador, ADN λ nativo (medio), (derecha) una placa de λ ARS317. (D) purificada ARS317 λ DNA fue detectado por electroforesis en gel de agarosa 0,6%. (izquierda) Marcador, λ (medio) nativa (derecha) de ADN purificado λ ARS317. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: esquema Resumen de objetivo tipo TIRF y flujo de la célula. Análisis imagen sola molécula se llevaron a cabo en base al TIRFM combinando con sistema de celda de flujo. Nuestro TIRFM se realizó en un microscopio invertido con un 60 X objetivo de aceite (apertura numérica = 1.49). ADN (línea gris) fue atado sobre el cubreobjetos en la celda de flujo a través de la vinculación de biotina-estreptavidina y estirado por el flujo de izquierda a derecha. Una Unión a proteínas en el ADN atada fue indicada por un punto rojo oval. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Qdot705-etiquetado ORC (relación molar 1:1) vinculantes para λ ARS317. (A) ORC y λ-ARS317 DNA fueron observados simultáneamente. (top) Naranja de SYTOX DNA manchada estaba emocionado con láser 532 nm y observado usando la banda de transmisión de 550-613 nm del filtro paso banda de banda cuádruple. (parte inferior) Qdot705-etiquetado orco estaba entusiasmado con un 405 nm láser y observado usando la banda de transmisión 743 663 nm del filtro paso banda de banda cuádruple. (B) dos de 256 × 256 sub apilados fueron recortadas de la original pila de × 512 512. (C) las imágenes adquiridas con 61 Marcos secuenciales en los anaqueles correspondientes. (izquierda) SYTOX naranja manchado ADN, Qdot (medio)705-etiquetado ORC, imagen fusionada (derecha); tres Qdot705-etiquetado atascamiento de ORC en ARS317 sitio sobre sustratos de ARS317 λ DNA fueron marcadas con flechas negras. (D) ilustración del cálculo del ORC vinculante posición sobre el ADN. LADN significa la longitud del ADN, LORC significa la distancia de ORC enlace sitio sobre el ADN al final atado de ADN. (E) histograma de ORC enlace distribución λ-ARS317 ADN. Gaussiana a los datos fue indicada con la línea roja sólida. Barras de error indican un intervalo de confianza del 95% basado en muestras bootstrap de 1000. N significa el número de moléculas de la orco. Sitio de ARS317 insertado fue indicada con una flecha negra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: enlace etiquetado Qdot ORC (fracción molar 3:1) en λ ARS317. ORC y λ-ARS317 DNA fueron observados en la misma forma que en la Figura 3A. (izquierda) Naranja de SYTOX DNA manchada estaba emocionado con láser 532 nm. (medio) Etiquetado Qdot orco estaba emocionado con un 405 nm láser. imágenes combinadas (derecha). Dos enlace etiquetado Qdot ORC en ARS317 sitio sobre sustratos de ARS317 λ DNA fueron marcadas con flechas negras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, presentamos un protocolo para observar la interacción entre la proteína marcada Qdot y el ADN λ site-specifically modificado utilizando el TIRFM en una celda de flujo. Las medidas incluyen la modificación específica de sustrato de ADN, ADN biotinylation, cubreobjetos limpieza y funcionalización, celda de flujo la preparación y proyección de imagen de una sola molécula. Hay dos puntos clave que deben tenerse. En primer lugar, todos los pasos involucrados con λ DNA deben manipularse con cuidado para reducir posibles daños, por ejemplo, evitando mezclar mediante pipeteo arriba y abajo repetidamente. En segundo lugar, es muy importante para que el cubreobjetos esté lo suficientemente limpio como para reducir su ruido de fondo. Durante el proceso de limpieza y funcionalización de cubreobjetos, agua debe alcanzar nivel ultrapura, y el aire debe estar libre de polvo. Es mejor llevar a cabo la funcionalización del cubreobjetos y montaje de celda de flujo en una mesa de trabajo limpia.
En los ensayos de molécula única para estudiar la interacción de la proteína ADN, ADN λ es un sustrato adecuado con varias ventajas20. Λ DNA es suficiente para ser fácilmente observado y permiten grabar movimiento de proteínas en él en el experimento de una sola molécula. Además, los voladizos de ssDNA permiten muchos diseños para tethering λ DNA en un cubreobjetos de vidrio. En este estudio, se presenta un método para insertar un fragmento de ADN exógeno en un sitio específico del ADN λ. Así, varios fragmentos de ADN definibles por el usuario pueden integrarse en λ DNA. El ADN modificado de λ puede ser convenientemente purificado de lisados líquido en grandes cantidades para el estudio de la molécula sola.
Es difícil evaluar la eficacia de etiquetado con precisión en el Qdot recubiertas de estreptavidina, etiquetado análisis porque hay aproximadamente 5-10 streptavidins por Qdot nanocristales. En consecuencia, la relación molar apropiada de Qdots recubiertas de estreptavidina y proteínas biotiniladas debe optimizarse en los experimentos. Un cociente molar de 1:1 puede ser una referencia.
Cabe señalar que Qdot no puede utilizarse en ensayos cuantitativos exactos, ya que su alta estabilidad de la foto no es adecuado para el análisis de foto-blanqueo. Aunque la alta estabilidad de Qdots limita su aplicación en ensayos cuantitativos, permite la fácil observación y seguimiento de largo plazo5. Con el aumento de aplicaciones de la microscopía de fluorescencia de una sola molécula en biología, el protocolo descrito en este documento contribuirá grandemente a desentrañar los mecanismos del metabolismo de ADN en el futuro.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Hasan Yardimci y Dr.Sevim Yardimci del Instituto Francis Crick de tipo ayuda en los experimentos de una sola molécula, Dr. Daniel Duzdevich del laboratorio del Dr. Eric C. Greene de la Universidad de Columbia, Dr. Yujie Sun de la Universidad de Pekín y Dr. Chunlai Chen de La Universidad de Tsinghua de discusión útil. Este estudio fue apoyado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China 31371264, 31401059, equipo de innovación interdisciplinar del CAS y la Newton avanzado beca (NA140085) de la Real Sociedad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
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