Summary
Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Floresans mikroskobu karmaşık biyolojik süreçlerin tek molekül düzeyinde mekanizmaları dissekan harika katkılar yaptı. DNA-protein etkileşimleri çalışmak için tek molekül deneyleri içinde değerlendirilmesi için iki önemli etken vardır: DNA substrat kolay gözlem ve bir protein ile uygun bir floresan probe etiketleme için yeterli uzunlukta. 48,5 kb λ DNA DNA substrat için iyi bir adaydır. Kuantum nokta (Qdots), uzun süre gözlem (dakika saat) ve yüksek kaliteli resim alma floresan problar, bir sınıf olarak izin verir. Bu yazıda, biz DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA hazırlama ve streptavidin kaplı Qdots bir hedef proteini etiketleme içerir tek molekül düzeyinde eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Kavram kanıtı için ORC (kökenli tanıma karmaşık) içinde mayası faiz bir protein seçin ve TIRFM kullanarak bir ARS (özerk Çoğaltma sırası) ile etkileşimi görselleştirin. Diğer Floresan problar ile karşılaştırıldığında, Qdots ise tek molekül çalışmaları nedeniyle yüksek istikrarı photobleaching karşı bariz avantajı var, ama bu özellik nicel deneyleri kendi uygulamasında sınırlar unutulmamalıdır.
Introduction
Protein ve DNA arasındaki etkileşimler DNA ikileşmesi, DNA tamiri ve transkripsiyon gibi birçok karmaşık biyolojik süreçler için gereklidir. Her ne kadar geleneksel yaklaşımlar özellikleri bu süreçlerin ışık, birçok anahtar mekanizmaları hala pek açık değildir. Son zamanlarda, hızla gelişen tek molekül teknikleri ile bazı mekanizmalar ele1,2,3olmuştur.
Protein-DNA etkileşimleri gerçek zamanlı olarak esas olarak görüntülenmesi üzerinde tek molekül floresans mikroskobu uygulanması floresans algılama ve floresan problar gelişimi üzerinde bağlıdır. Bir tek molekül çalışma için beri floresans algılama sistemleri çoğunlukla ticari olarak mevcuttur faiz protein ile uygun bir floresan probe etiketlemek önemlidir.
Floresan Proteinlerin moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılır. Ancak, düşük floresan parlaklık ve istikrar photobleaching karşı birçok tek molekül deneyleri kendi uygulamasında kısıtlayın. Kuantum nokta (Qdots) olan küçük ışık yayan nano tanecikleri4. Nedeniyle benzersiz optik özellikleri, Qdots 10 - 20 kat daha parlak ve5birkaç bin kere daha istikrarlı daha yaygın olarak kullanılan organik boya. Ayrıca, Qdots bir büyük Stokes kayması (uyarma ve emisyon doruklarına konumunu arasındaki fark)5var. Niceliksel deneyleri kullanılan olamaz böylece, Qdots uzun süre gözlem (dakika saat) ve yüksek sinyal gürültü oranı, görüntülerle edinimi için kullanılabilir.
Bugüne kadar Qdots bir hedef proteini site-specifically etiketlemek için iki yaklaşım vardır: birincil veya ikincil antikorlar Qdot Birleşik6,7,8; yardımı ile etiketleme ya da güçlü etkileşim arasında biotin streptavidin9,10,11,12,ve13temel hedef protein Qdots ile doğrudan, etiketleme. Streptavidin kaplı Qdots ticari olarak kullanılabilir. Bizim son çalışmada, site-specifically co-overexpression BirA ve AVI öğesini proteinler tarafından biotinylated proteinleri mayası yüksek verimlilik ile saf vivo içinde10. Aşağıda ve tek molekül deneyleri14,15,16,17en iyi duruma getirme, biz tek molekül düzey kullanarak Qdot etiketli proteinler ve DNA arasındaki etkileşimler gözlenen TIRFM10.
Burada, tomurcuklanma seçtiğiniz ilgi bizim protein özellikle tanımak ve bağlama özerk Çoğaltma sırası (ARS), kökeni tanıma karmaşık (ork), Maya. Aşağıdaki iletişim kuralı TIRFM kullanarak Qdot etiketli ORC ARS ile etkileşim görselleştirmenin adım adım bir yordam sunar. Site-specifically değiştirilmiş DNA substrat, DNA biotinylation, coverslip temizlik ve functionalization, akış hücreli montaj ve tek molekül görüntüleme hazırlanması açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. λ-ARS317 DNA substrat hazırlanması
- DNA substrat İnşaat ve ambalaj
- Xhokullanarak yerel λ DNA sindirmek ben enzim; tomurcuklanma genomik DNA ARS317 Maya 20 içeren primerler kullanılarak 543 bir bp DNA parçası taşıyan yükseltmek bp homolog dizileri akış yukarı ve aşağı Xhoben lambda DNA enzim ücreti. 100 Ekle ng Xhoλ DNA ve 10 sindirilmiş ng DNA parçası Homolog rekombinasyon tepki sisteminin 10 µL ve tepki için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
- Rekombinasyon λ DNA paketlemek için 25 µL lambda ambalaj özler rekombinasyon ürün içine ekleyin ve tepki için 90 dk 30 ° C'de kuluçkaya. Sonra bir ek 25 µL lambda ambalaj özler tepki tüp içine ekleyin. 90 dk 30 ° C'de tepki kuluçkaya devam'i tıklatın.
- Steril seyreltme arabelleği (10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) 500 µL reaksiyon sistemine ekleyin ve karışımı yavaşça baş aşağı birkaç kez tüp çevirerek. Kloroform 25 µL eklemek, karışımı yavaşça ve 4 ° C'de depolayın
- Paketlenmiş fajının 100 µL ve bakteri LE392MP 100 µL ekleyin (0,8 - kültürlü LB orta 10 mM ile MgSO4ekleme kullanarak 1.0) yeni bir tüp içine. 37 ° C'de 15 dakika boyunca kuluçkaya.
- 4 mL oftop agar (LB orta + %0,7 agar + 10 mM MgSO448 ° C-soğutmalı,) içine 200 µL faj-bakteri karışımı ekleyin. Hemen yanında dönme tüp baş aşağı birkaç kez karıştırın ve önceden ısıtılmış (37 ° C) LB tabağa dökün.
- 37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya ve PCR kullanarak ve sıralama λ-ARS317 plak ekran.
- DNA substrat arıtma sıvı lysates11,18
- Steril GKD2O 10 mm MgCl2 ve 10 nM CaCl2200 µL bir plak seç. 200 µL bakteri LE392MP (LB orta kültürlü geceleme) ile karıştırın ve 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.
- NZCYM 100 mL faj-bakteri karışımı ekleyin (10 g/M NZ-Amin, 5 g/L maya ekstresi, 5 g/M NaCl, 1 g/L Casamino hidrolizat ve 2 g/L MgSO4·7H2O) orta ve kültür 37 ° C'de 7 h için Kloroform kültür içine 250 µL ekleyin ve başka bir 10 dakikadır sallamak.
- Kültür bir 200 mL şişe aktarın. NaCl (1 M son konsantrasyonu) 5,8 g ekleyin, el ile çözülmeye karıştırın ve 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
- 12.000 x g 4 ° C'de hücre artıkları kaldırmak için 10 dk de santrifüj kapasitesi. 200 mL şişe süpernatant toplamak ve8000 (m/V) % 10 PEG ekleyin. Manyetik karıştırma aparatı tarafından dağıtılması ve 30 dakika veya daha uzun buza kuluçkaya karıştırın.
- 12.000 x g 10 dk 4 ° C'de bakteriyofaj çökelti, santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırın.
- Çökelti fajının seyreltme arabellek 2 mL resuspend. 15 mL tüp içine aktarmak ve 10 µL RNase (son 20 µg/mL bölgedir) ve (son 5 µg/mL bölgedir) DNaz 40 µL ekleyin. 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
- 0,3 2 mL ekleyin M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM EDTA + %1.25 SDS, 15 µL İndinavir K (son konsantrasyonu ise 10 µg/mL). 10 dk 65 ° C'de kuluçkaya.
- Önceden soğutulmuş potasyum asetat (3 M, pH 4,8) 2 mL ekleyin ve buz için 10 dk metroyla kuluçkaya.
- 8000 x g 4 ° C'de çözünmez malzemeleri kaldırmak için 10 dk de santrifüj kapasitesi.
- İsopropanol 0.7 x hacmi süpernatant ekleyin. Baş aşağı birkaç kez tüp çevirerek mix ve oda sıcaklığında (RT) 2 min için kuluçkaya.
- RT DNA çökelti, 10 min için 8000 x g, santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırın.
- % 70 ile etanol tarafından Santrifüjü 8.000 x g 10 dakika süreyle de kaldırdıktan sonra süpernatant DNA yıkayın.
- Yavaşça 500 µL TE tampon (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) kullanarak DNA elute ve DNA 1,5 mL tüp içine aktarın.
- İki kez fenol kullanarak DNA ayıklamak: kloroform Santrifüjü 10 min için 8000 g de tarafından.
- 0.7 x birim isopropanol ile çökelti. Ters tüp yavaşça aşağı ve 8.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi dönüm tarafından karıştırın.
- Bir kez % 70 etanol ile yıkayın, TE 200 µL içinde resuspend. DNA toplama ölçmek ve 12.5 µg aliquots-20 ° C'de depolayın.
2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
- Biotinylated oligonucleotides fazdan için (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotin-3') yerli sol sonuna tamamlayıcı λ DNA, eklemek 1 µL (100 µM) oligonucleotides, GKD2O, 1 µL 10 ligaz arabellek x 7,5 µL ve T4 PNK 0.5 µL. Tepki 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
- 1 µL T4 PNK ve GKD2O toplam hacmiyle 30 µL. λ-ARS317 fazdan, λ-ARS317 12.5 µg, 10 ligaz arabellek x 3 µL eklemek için 3 h için 37 ° C'de tepki kuluçkaya.
- λ-ARS317 ile oligonucleotides tavlamak için fosforile oligonucleotides 0.5 µL, GKD2O, 10 × ligaz arabelleği fosforile λ-ARS317 tüp içine 25 µL 195 µL ekleyin. Tüp ters çevirerek karışımı yavaşça ve 65 ° c 5 dk. dönüş blok ısıtıcı ve izin 33 ° C blok aşağıda örnek soğumaya kapalı için kuluçkaya.
- λ-ARS317 ile oligonucleotides ligate T4 DNA ligaz 1 µL ve 0,63 µL ATP (200 mM) ekleyin. Tüp ters çevirerek karışımı yavaşça ve 2 saat veya 4 ° C için oda sıcaklığında gecede kuluçkaya. 4 ° C'de 1 ay için saklayın.
Not: DNA'bozulmaması için karıştırma merdivenlerden yavaşça tüp baş aşağı pipetler kullanarak karıştırma yerine çevirerek yapılmalıdır.
3. Coverslip temizlik ve Functionalization
- Temizlik Coverslip
- Yer 20 coverslips 4 boyama kavanoz (5 coverslips/kavanoz), içine 30 dakika içinde etanol için solüsyon içeren temizleyicide ve coverslips ultrasaf H2O 3 kez ile durulayın.
- 30 dakika ve 1 M potasyum hidroksit (KOH) için solüsyon içeren temizleyicide ve coverslips ultrasaf H2O 3 kez ile durulayın. Etanol ve KOH sonication bir kez yineleyin.
- Aseton ile 30 dakika boyunca solüsyon içeren temizleyicide ve ultrasaf H2ile O iyice durulayın (en az 3 kez).
Not: zaman (aseton gibi) organik çözücü yanlışlıkla piranha çözüm ile karışık bir patlama neden olabilir çünkü aseton iyice ultrasaf H2ile O, durulama tarafından kaldırılması gerekir14. - Coverslips piranha çözüm yerleştirin (3:1 karışımı H2SO4 ve % 30 H2O2) ve 1 h için 95 ° C'de kuluçkaya.
Not: Son derece enerjik ve aşındırıcı Piranha çözüm, çok dikkatli kullanın. Piranha çözüm hazırlanırken, 50 mL H2O2 önce 500 mL Cam kabı ekleyin ve H2150 mL kadar ekleyin4 kabı içine yavaş yavaş. - Ultrasaf H2O ile coverslips 5 kere yıkayın. O zaman her coverslip ultrasaf H2O iyice ultrasaf H2ile O dolu 3 şişeler kullanarak ile yıkayıp kağıt coverslip kenarından kullanarak coverslip kurulayın. Coverslip iyice 110 ° C fırında 30 dakika boyunca kuru ve coverslip boyama kavanoza yerleştirin.
- Metanol ile coverslip durulama ve tekrar coverslip iyice kurumasını 110 ° C fırın boyama kavanoz yerleştirin.
Not: bir kez o su19huzurunda APTES çok olası yüzey yapıların olduğundan iyice coverslip kurutma çok önemlidir.
- Metanol ile coverslip durulama ve tekrar coverslip iyice kurumasını 110 ° C fırın boyama kavanoz yerleştirin.
- Coverslip functionalization
- 70 mL silane çözeltisi ekleyin (%93 metanol, %5 asetik ve % 2 APTES) her kavanoza vida kapağı ve oda sıcaklığında kavanoz gece bırakın.
- Yıkama ve coverslips iyice fırına yerleştirerek yerine azot gazı kullanarak coverslips kuru dışında 3.1.5. adımda açıklandığı gibi kuru.
- 150 mg mPEG (metoksi-Polietilen glikol) ve 6 mg biotin-PEG (biotin-Polietilen glikol) iyice 1 mL 0.1 M taze yapılmış NaHCO3 (pH 8.2) geçiyoruz. Sonra santrifüj 17, 000 x g çözünmez mandal kaldırmak 1 dk için.
Not: Taze yapılmış NaHCO3 hazırdır; Onun pH ayarlamak için gerek yoktur. - Silanized coverslips kutularına yerleştirmeniz ve iki küçük coverslips iki ucu silanized coverslips üst kısmında koymak. Silanized coverslip ortasına PEG çözeltinin 100 µL pipet ve başka bir silanized coverslip üstüne yerleştirin.
- Bazı ultrasaf H2O nemli tutmak için kutusuna ekleyin ve coverslips PEG çözüm için en az 3 saat içinde belgili tanımlık karanlık ile kuluçkaya. Bir gecede kuluçka de çalışabilirsiniz.
- Coverslip çiftleri ayırmak ve functionalized yüzey yüz tutmak, ultrasaf H2O yoğun olarak kullanarak coverslips durulayın ve azot gazı ile Kuru onları.
- Coverslips birinde bir marker kalem, functionalized yan yüzleri yukarıya, onları kutularına yerleştirmeniz ve kutuları vakum desiccator 1 ay için stok tutma kullanarak köşeleri functionalized tarafında işaretleyin.
- Coverslips daha uzun süre saklamak için bir coverslip onun kap üzerinde bir delik delinmiş bir 50 mL tüp içine koyun sonra tüp Plastik bir torbaya koyun ve bir vakum mühürleyen kullanarak torba mühür. Bu şekilde, coverslips-20 ° C'de yaklaşık 3 ay depolanabilir.
4. akış hücre derleme
- Çift taraflı bant (30 mm × 12 mm) bir zımba kullanarak bir parçası merkezinde 15 mm × 2 mm kanal kesti.
- Çift taraflı bant kağıt yan soyma ve iki deliği olan cam slaytta yapıştırın. Hava kabarcıkları kaldırmak için tuşuna basın. Bizim deneyime dayalı, Çift taraflı bant plastik yan daha kağıt tarafı kapalı soyulması tarafından hava kabarcıkları kaldırmak kolaydır.
- Functionalized coverslip (60 mm × 24 mm) dört kesilmiş elmas uçlu cam kullanarak parçaları (30 mm × 12 mm) scribe ve azot gazı kullanarak enkaz kaldırmak. Functionalized tutmayı unutmayın yan yüzleri yukarıya.
- Çift taraflı bant plastik yan soyma ve slayt üzerinde functionalized coverslip yapıştırın. Hava kabarcıkları coverslip ve bandı arasında kaldırmak için hafifçe bastırın. Hava kabarcıkları iyice kaldırma akışı hücre arabellekleri içine pompalanır iken sızıntı koruyabilirsiniz.
- Giriş ve çıkış boru sırasıyla küçük ve büyük deliklere yerleştirin. Epoksi kullanarak boru tamir.
- Streptavidin (0.2 mg/mL) 20 µL el ile kullanarak akış hücre pompa ve RT kuluçkaya 10 dakikadır. O zaman değiştirmek streptavidin için akış hücreye engelleme arabellek10 pompa ve oda sıcaklığında saklayın.
5. tek molekül görselleştirme
- Kırmızı ve far-red ile A5 floresans mikroskobu testi slayt #1 üzerinde odak hizalamasını 532 nm lazer ve 640 nm lazer kullanarak eşzamanlı uyarma tarafından elde etmek. (Bkz: Malzemeler tablo) optik bölme ile çift dalga boyu görüntüleri üretmek.
- Akış mikroskobunun yerleştirin ve bir uzun boru ile bir otomatik infüzyon/para çekme programlanabilir pompa yüklü bir 10 mL bahar bağlantı onun çıkış boru bağlayın.
Not: arabellekleri arabelleği akış hücre giriş boru döşeme için şırınga çekilmesi anlamına gelir aşağıda belirtilen akış hücre içine pompalıyor. - Engelleme arabellek 500 µL/dak hızlı bir şekilde hava kaldırmak ve akış hücre arabellekte engellenmemiş olduğundan emin olun akış hücreye pompa. O zaman engelleme arabellek 200 µL/dak akış hücre pompa ve hava kabarcıkları giriş boru ve akış hücre iyice kaldırmak için çıkış boru ters çevirin.
Not: tüm arabellekleri akışı hücre pompalanan bir vakum desiccator en az 15 dakika kullanmadan önce degassed. - Biotinylated λ-ARS317 DNA'ın 0.5 µL engelleme arabellek 80 µL ekleyin ve 25 µL/min 2 min için akış hücre içine pompa. O zaman engelleme arabelleği 200 µL 50 µL/dk hızında çalıştırarak λ-ARS317 DNA sifonu çek.
- Engelleme arabelleği akış hücreye kaldırmak için 50 µL/dk hızında arabellek10 Binding 200 µL pompa.
- Streptavidin kaplı Qdot705 (1 µM) 0.2 µL ekleyin ve biotinylated ork 0.2 µL (1.2 µM) içine bir tüp ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya. O zaman tampon tüp içine bağlama 20 µL ekleyin ve buz üzerinde yerleştirin. Ork-Qdot705 son konsantrasyonu yaklaşık 10 olduğunu nM.
- Ork-Qdot705 2 µL ekleyin (10 nM), DTT (100 mM), ATP (200 mM) 1 µL bağlama arabellek 96 µL içine 1 µL. Ork-Qdot705 son konsantrasyonu 0,2 olduğunu nM.
- 0.2 nM ORC-Qdot705 20 µL 10 µL/dk hızında akış hücre pompa. Bağlama arabellek 200 µL 100 µL/dk hızında çalıştırarak aşırı ORC-Qdot705 , dışarı floş. Sonra pompa bağlama arabellek ile 30 nM SYTOX portakal akış hücresine DNA yüzeylerde 100 µL/dk hızında leke.
- Ork-Qdot705 sinyal heyecanlandıracak ve SYTOX turuncu bir 405 nm lazer ve 532 nm lazer, sırasıyla kullanarak DNA sinyali lekeli. Sinyalleri aynı anda bir avlu-şerit bant filtre (FF01-446/510/581/703-25) kullanarak 100 µL/dak akışı ile işlevlerini izlemek ve kaydetmek çerçeve başına 100 ms tarafından EM-CCD görüntülerle. 20 görüntü yığınları farklı alanlardan toplamak.
6. veri analizi
- Dr. Ron veren laboratuar Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco tarafından geliştirilen resim tapa (OI_cut_RGBmerge) kendimizi tarafından değiştirilir yeni bir eklenti ile Fiji yazılım kullanarak görüntüleri dayalı ürün.
- Bir yığın görüntüleri (512 × 512 piksel) görüntüleri (256 × 256 piksel) iki yığınları kırpma. Biri bir 532 nm lazer heyecan verici sonuç, ve diğeri de bir 405 nm lazer heyecan verici sonuç.
- Fiji-görüntü-yığınlar-Z project (ortalama yoğunluğu) kullanarak 61 sıralı görüntüleri işlemek.
- Ölçü DNA (LDNA) ve DNA'ın ORC-Qdot705 (LORC) bağlama DNA üzerinde sitesinden Uzaklik uzunluğu son el ile gergin.
- LORC/LDNA sonucunu hesaplamak kullanarak excel, r, önyükleme yöntemini kullanarak verileri analiz sonra çubuk grafik oluşturmak ve Gauss dağıtımları uygun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Qdot etiketli ORC ve ARS arasındaki etkileşimi görselleştirmek için ilk λ-ARS317 DNA substrat inşa. ARS317 içeren bir DNA parçası entegre edildi Xhoı (33,5 kb) yerel λ DNA'sı Homolog rekombinasyon (Şekil 1A) tarafından site. Rekombinasyon ürün özleri kullanılarak paketlenmiştir ve paketlenmiş fajının parçacıklar (Şekil 1B) LB tabaklarda kültürlü. Pozitif fajının plak PCR tarafından ekranlı ve (Şekil 1 c) sıralama tarafından onaylandı. Λ-ARS317 DNA sıvı lysates (Şekil 1 d) saflaştırıldı.
Tek molekül görüntüleme deneyleri amaç tipi TIRFM set-up (Şekil 2) üzerinde gerçekleştirilmiştir. Neredeyse 1:1 molar oranı ile biotinylated ork etiketleme tarafından streptavidin kaplı Qdots hızla, Qdot etiketli ORC λ-ARS317 gergin akışı hücre pompalanır oldu. DNA SYTOX turuncu kullanarak lekeli. Qdot etiketli ORC ve DNA SYTOX turuncu lekeli sinyalleri eşzamanlı olarak TIRFM (Şekil 3A-3 C) kullanarak görüntüsü. ORC dağıtım λ-ARS317 olarak belirlemek için görüntü yığını iki yığınları ayrıldı: DNA sinyal ve 6.1 (Şekil 3B) adımda anlatıldığı gibi ORC sinyal diğer yığını bir yığını. Formülü, pozisyon (kb) alarak (LORC/LDNA) × 50 kb (şekil 3D), 168 DNA yüzeyler üzerinde ORC-Qdot705 moleküllerin pozisyonlar olduğunu analiz quantitively bağlama 273 =. Ork-Qdot705 özel bağlar veri gösterdi eklenen ARS317 sitesinde belli ki yüksek bir bereket (3E rakam) ile . Bu arada, ORC-Qdot705 da bulunan Orta ve önceki çalışma10sonuçları ile tutarlıdır λ DNA ücretsiz sonu AT zengini alanlara bağlar.
Yüksek kaliteli resim alma protein ve Qdots molar oranı etiketleme tahlil bağlıdır. Aşırı Qdots verimliliği etiketleme protein için iyi olabilir, ama onlar arka plan gürültü oluşturabilirsiniz. Biotinylated ork streptavidin kaplı Qdots molar oranı 1:3, ile etiketleme süre Şekil 4' te gösterildiği gibi arka plan gürültü arttı. Böylece, uygun molar oranı streptavidin kaplı Qdots için biotinylated proteinlerin seçmek için önemlidir.
Şekil 1: λ-ARS317 DNA substrat hazırlanması. (A) λ-ARS317 inşaat Illustration. ARS317 taşıyan bir DNA parçası tarafından Homolog rekombinasyon λ DNA entegre edildi. (B) plaklar LB katı ortamda. Üç tane siyah ok tuşlarını kullanarak işaretlenmiştir. (C) bir λ-ARS317 plak PCR kullanarak tespit edilmiştir. (sol) Marker, (orta) yerel λ DNA, (sağ) λ-ARS317 bir plak. (D) saf λ-ARS317 DNA % 0.6 özel jel elektroforez tarafından algılandı. (sol) Marker, λ-ARS317 (orta) yerel λ DNA (sağda) saf. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: amaç-türü TIRF ve akış hücre şematik bakış. Tek molekül görüntüleme deneyleri temel akış hücre sistemi ile birleştirerek TIRFM alınarak gerçekleştirilmiştir. Bizim TIRFM bir 60 X Petrol amacı ile donatılmış bir ters mikroskobu üzerinde gerçekleştirildi (sayısal diyafram 1.49 =). DNA (gri çizgi) coverslip biotin streptavidin bağlantı aracılığıyla akış hücredeki üzerinde hayvan zinciri ve akımını soldan sağa doğru uzanıyordu. Hayvan zinciri DNA bir protein bağlayıcı bir kırmızı-oval nokta tarafından belirtilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Qdot705-ORC (1:1 molar oranı) λ-ARS317 üzerinde bağlayıcı etiketli. (A) ORC ve λ-ARS317 DNA aynı anda gözlendi. (üst) SYTOX turuncu lekeli DNA 532 nm lazer kullanarak ve 550-613 nm İletim bant avlu-şerit bant geçiren filtre kullanarak gözlenen heyecan duymuştur. (alt) Qdot705-etiketli ORC 405 nm lazer kullanarak heyecanlandım ve 663-743 nm İletim bant avlu-şerit bant geçiren filtre kullanarak görülmektedir. (B) iki 256 × 256 alt yığınları özgün 512 × 512 yığından kırpılmış edildi. (C) karşılık gelen yığınlarda 61 ardışık çerçeveler kullanarak alınan görüntüleri. (sol) SYTOX turuncu lekeli DNA, (orta) Qdot705-ork, (sağda) birleştirilen görüntüyü; etiketli Üç Qdot705-etiketli ORC bağlama λ-ARS317 DNA yüzeylerde ARS317 sitede siyah ok tuşlarını kullanarak işaretlenen. (D) DNA konumuna bağlama ORC hesaplanması Illustration. DNA uzunluğu LDNA anlamına gelir, LORC mesafe ORC DNA sitesinde hayvan zinciri DNA sonuna kadar bağlama demektir. (E) Histogram ORC bağlama dağıtım λ-ARS317 DNA üzerinde. Gauss için verileri sığdırmak kırmızı düz çizgi kullanarak belirtildi. Hata çubukları 1000 önyükleme örneklere dayalı bir % 95 güven aralığı belirtin. N ORC moleküllerin sayısı anlamına gelir. ARS317 eklenen site siyah bir ok kullanarak belirtildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Qdot etiketli ORC bağlama (3:1 molar oranı) üzerinde λ-ARS317. ORC ve λ-ARS317 DNA Şekil 3Aolduğu gibi aynı şekilde gözlendi. (sol) SYTOX turuncu lekeli DNA 532 nm lazer kullanarak heyecan duymuştur. (orta) ORC Qdot etiketli bir 405 nm lazer kullanarak heyecan duymuştur. (sağ) birleştirilmiş görüntüler. İki Qdot etiketli ORC bağlama λ-ARS317 DNA yüzeylerde ARS317 sitede siyah ok tuşlarını kullanarak işaretlenen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, Qdot etiketli protein ve TIRFM akışı hücrede kullanarak site-specifically değiştirilmiş λ DNA arasındaki etkileşim gözlemlemek için bir protokol mevcut. Gerekli adımlar DNA substrat, DNA biotinylation, coverslip temizlik ve functionalization, hücre içi akış hazırlama ve tek molekül görüntüleme siteye özgü bir değişiklik içerir. Unutulmamalıdır iki anahtar nokta vardır. Yukarı ve aşağı üst üste pipetting karıştırma kaçınarak ilk olarak, tüm λ DNA ile ilgili adımlar yavaşça mümkün herhangi bir hasar, Örneğin, azaltmak için manipüle. İkinci olarak, coverslip onun arka plan gürültü en aza indirmek için temiz olduğundan emin olmak çok önemlidir. Coverslip temizlik ve functionalization sürecinde su ultrasaf düzeyine ulaştırılması gerekmektedir ve hava olmalıdır tozsuz. Coverslip functionalization ve akış hücreli derleme temiz bir Bank üzerinde yürütmek iyidir.
Protein-DNA etkileşim çalışmak için tek molekül deneyleri içinde birkaç avantajları20ile uygun bir substrat λ DNA'sı. Λ DNA kolayca uyulması ve harekette protein molekülünü deneyde kayıt izni için yeterli bir zaman. Ayrıca, ssDNA çıkıntılar λ DNA bir cam coverslip üzerinde hayvan zinciri için birçok tasarım izin verir. Bu çalışmada, biz λ DNA'ın belirli bir sitede bir eksojen DNA parçası eklemek için bir yöntem mevcut. Böylece, çeşitli kullanıcı tarafından tanımlanabilen DNA parçalarının λ DNA entegre edilebilir. Değiştirilmiş λ DNA molekülünü çalışma için büyük miktarlarda sıvı lysates üzerinden elverişli saf.
Yaklaşık 5-10 streptavidins Qdot nanocrystal başına olduğundan tahlil etiketleme doğru streptavidin kaplı Qdot etiketleme etkinliğini değerlendirmek zordur. Buna göre uygun molar oranı streptavidin kaplı Qdots ve biotinylated proteinler deneylerde optimize edilmelidir. 1:1 molar oranı bir başvuru olabilir.
Bu yüksek fotoğraf istikrarı fotoğraf ağartma tahlil için uygun değildir bu yana Qdot doğru nicel deneyleri kullanılamaz olması gerekmektedir. Ne kadar Qdots yüksek kararlılık nicel deneyleri kendi uygulamasında sınırlar, kolay gözlem ve uzun süredir izleme5sağlar. Protokol bu yazıda açıklanan tek molekül floresans mikroskobu biyoloji, uygulamaları artan ile büyük ölçüde gelecekte DNA metabolizmasının mekanizmaları çözülüyor için katkıda bulunacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Dr. Hasan Yardimci teşekkür ediyoruz ve Dr.Sevim Yardimci Francis Crick Enstitüsü tarz için Dr Yujie güneş Pekin Üniversitesi ve Dr Chunlai Chen, Dr. Daniel Duzdevich, Columbia Üniversitesi, Dr Eric C. Greene'in laboratuarından tek molekül denemelerinde yardımcı Tsinghua Üniversitesi yararlı tartışma için. Bu çalışmada, Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin 31371264, 31401059, CAS disiplinler arası yenilik takım ve Newton gelişmiş Bursu (NA140085) Royal Society tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S.
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
