Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لدراسة التفاعلات الحمض النووي-البروتين بالتأمل الداخلي الإجمالي fluorescence مجهرية (تيرفم) استخدام ركيزة λ سيتيسبيسيفيكالي تعديل الحمض النووي وكم-نقطة المسمى البروتين.
Abstract
مجهرية fluorescence إسهامات عظيمة في تشريح آليات معقدة من العمليات البيولوجية على مستوى جزيء واحد. في فحوصات جزيء واحد لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي من البروتين، وهناك اثنين من العوامل الهامة للنظر فيها: الركيزة الحمض النووي بما يكفي لطول السهل والمراقبة ووضع العلامات بروتين مع تحقيق فلورسنت مناسب. 48.5 kb λ الحمض النووي مرشح جيد للركيزة الحمض النووي. نقاط الكم (قدوتس)، كفئة من المسابر الفلورسنت، السماح للمراقبة منذ فترة طويلة (دقائق إلى ساعات)، والحصول على صورة عالية الجودة. في هذه الورقة، نقدم بروتوكولا لدراسة تفاعلات البروتين الحمض النووي على مستوى جزيء واحد، الذي يشمل إعداد λ سيتيسبيسيفيكالي تعديل الحمض النووي ووصفها بروتين المستهدف مع المغلفة ستريبتافيدين قدوتس. لدليل على المفهوم، نختار شركة مصفاة نفط عمان (التعرف على منشأ المعقدة) في مهدها الخميرة وتين فائدة وتصور تفاعله مع أرس (تسلسل تكرار صورة مستقلة) باستخدام تيرفم. مقارنة مع أخرى تحقيقات الفلورسنت، قدوتس بمزايا واضحة في دراسات جزيء واحد نظراً لاستقرارها عالية ضد فوتوبليتشينج، ولكن تجدر الإشارة إلى أن هذه الخاصية تحد من تطبيقها في الاختبارات الكمية.
Introduction
التفاعلات بين البروتينات والحمض النووي تعتبر أساسية للعديد من العمليات البيولوجية المعقدة، مثل تكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي، والنسخ. على الرغم من أن النهج التقليدية قد يلقي الضوء على خصائص هذه العمليات، العديد من الآليات الرئيسية لا تزال غير واضحة. ، مع تقنيات جزيء واحد سريع النمو، بعض الآليات في الآونة الأخيرة تناول1،،من23.
تطبيق الفحص المجهري fluorescence جزيء واحد على تصور تفاعلات البروتين-الحمض النووي في الوقت الحقيقي أساسا يعتمد على وضع الكشف عن الأسفار والمسابير الفلورسنت. لدراسة جزيء واحد، من المهم أن تسمية بروتين الاهتمام مع تحقيق فلورسنت مناسب نظراً لأنظمة الكشف عن الأسفار في معظمها متاح تجارياً.
ويشيع استخدام البروتينات الفلورية في البيولوجيا الجزيئية. ومع ذلك، منخفضة الإضاءة الفلورية والاستقرار ضد فوتوبليتشينج تقييد تطبيقها في العديد من فحوصات جزيء واحد. النقاط الكم (قدوتس) إشارات صغيرة جسيمات نانوية4. نظراً لخصائصها الضوئية الفريدة، قدوتس 10-20 مرات أكثر إشراقا والأصباغ عدة آلاف المرات أكثر استقرارا من المستخدمة على نطاق واسع العضوية5. وعلاوة على ذلك، قد قدوتس كبير ستوكس تحول (الفرق بين موقف قمم الإثارة والانبعاثات)5. وهكذا، يمكن استخدام قدوتس للمراقبة منذ فترة طويلة (دقائق إلى ساعات)، والحصول على صور ذات المعدلات العالية من الإشارات إلى الضجيج، في حين أنهم لا يمكن أن تستخدم في الاختبارات الكمية.
وحتى الآن، هناك طريقتان لتسمية بروتين المستهدف مع قدوتس سيتيسبيسيفيكالي: وسم مع المعونة من قدوت مترافق الابتدائي أو الثانوي الأجسام المضادة6،،من78؛ أو وضع العلامات المستهدفة البروتين مع قدوتس مباشرة، التي ترتكز على تفاعل قوي بين البيوتين وستريبتافيدين9،،من1011،،من1213. قدوتس Streptavidin المغلفة متوفرة تجارياً. في دراستنا الأخيرة، سيتيسبيسيفيكالي كانت تنقية البروتينات بيوتينيلاتيد في مهدها الخميرة بكفاءة عالية من co-overexpression من البيرا ومعلم أفي البروتينات في فيفو10. بالتالي والاستفادة المثلى من فحوصات جزيء واحد14،15،،من1617، لاحظنا التفاعلات بين البروتينات المسماة قدوت والحمض النووي في استخدام جزيء واحد مستوى تيرفم10.
هنا، علينا أن نختار في مهدها الخميرة أصل الاعتراف المعقدة (شركة مصفاة نفط عمان)، التي يمكن التعرف على وجه التحديد والربط بتسلسل صورة مستقلة النسخ المتماثل (جمعية الإغاثة اﻷرمنية)، كما لدينا بروتين الفائدة. ويقدم البروتوكول التالي إجراء خطوة بخطوة لتصور التفاعل بين شركة مصفاة نفط عمان المسمى قدوت مع جمعية الإغاثة اﻷرمنية باستخدام تيرفم. ويرد وصف إعداد الركيزة الحمض النووي تم التعديل سيتيسبيسيفيكالي، بيوتينيليشن الحمض النووي، وتنظيف ساترة والروغان، الجمعية تدفق الخلية، وتصوير جزيء واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد الركازة الحمض النووي λ-ARS317
- بناء الركيزة الحمض النووي والتعبئة والتغليف
- هضم الحمض النووي λ الأصلية باستخدام زهوأنا الإنزيم؛ تضخيم الحمض النووي bp 543 تأثير جزء ARS317 من الحمض النووي الجينومي للناشئين الخميرة التي تحتوي على 20 كبسولة تفجير باستخدام bp مثلى تسلسل من المنبع والمصب من زهوأنا الموقع الإنزيم على الحمض النووي لامدا. إضافة 100 نانوغرام من زهوأنا هضم الحمض النووي λ و 10 نانوغرام من الحمض النووي تجزئتها إلى 10 ميليلتر نظام رد فعل جزئ مثلى، واحتضان رد فعل في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- لحزم λ جزئ الحمض النووي، إضافة 25 ميليلتر من مقتطفات التغليف لامدا في المنتج جزئ، واحتضان رد فعل عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. ثم، إضافة ميليلتر 25 إضافية من مقتطفات التغليف لامدا في أنبوب رد فعل. الاستمرار في احتضان رد فعل عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
- إضافة 500 ميليلتر لتمييع العقيمة المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl (pH 8.3)، 100 ملم كلوريد الصوديوم، مجكل 10 مم2) في نظام رد الفعل، وتخلط بلطف بتشغيل الأنبوب رأسا على عقب عدة مرات. إضافة 25 ميليلتر من كلوروفورم وتخلط بلطف وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إضافة 100 ميليلتر من بالعاثية تم حزمها و 100 ميليلتر من بكتيريا LE392MP (مثقف في 0.8-1.0 باستخدام متوسط رطل إضافة مع 10 مم MgSO4) في أنبوب جديد. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 200 ميليلتر من خليط بالعاثية-بكتيريا إلى 4 مل أوفتوب أجار (المتوسطة رطل + أجار 0.7% + 10 مم MgSO4، تبريد إلى 48 درجة مئوية). مزيج فورا بتشغيل الأنبوب رأسا على عقب عدة مرات، ومن أجل ذلك على لوحة المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) رطل.
- احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها وشاشة اللوحة λ-ARS317 باستخدام PCR وتسلسلها.
- تنقية الركازة الحمض النووي من السائل ليساتيس11،18
- اختيار اللوحة واحد في 200 ميليلتر ddH العقيمة2س مع 10 مم مجكل2 و 10 نانومتر كاكل2. مزيج مع 200 ميليلتر من بكتيريا LE392MP (مثقف بين عشية وضحاها في المتوسط رطل)، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- إضافة خليط بالعاثية-بكتيريا إلى 100 مل نزسيم (10 غرام/لتر نيوزيلندي--أمين، 5 غ/لتر الخميرة استخراج 5 جرام/لتر كلوريد الصوديوم، 1 غرام/لتر هيدروليساتي كاسامينو ومجسو4·7H2س ز 2/لتر) المتوسطة والثقافة من أجل ح 7 عند 37 درجة مئوية. إضافة 250 ميليلتر من كلوروفورم في الثقافة ويهز لآخر 10 دقيقة.
- تحويل الثقافة إلى قارورة 200 مل. إضافة 5.8 جم من كلوريد الصوديوم (تركيز نهائي 1 م) ويحرك إلى أن يحل باليد، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية لإزالة الأنقاض الخلية. جمع المادة طافية في قارورة 200 مل وإضافة 10% ربط8000 (m/V). يحرك بحل جهاز إثارة المغناطيسية واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة أو أطول.
- الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية التعجيل في عاثية. إزالة المادة طافية.
- ريسوسبيند متسرعا في 2 مل بالعاثية تمييع المخزن المؤقت. تحويلها إلى أنبوب 15 مل وإضافة 10 ميليلتر من رناسي (التركيز النهائي و 20 ميكروغرام/مل) و 40 ميليلتر من الدناز (التركيز النهائي 5 ميكروغرام/مل). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 2 مل 0.3 M تريس-HCl (pH 9.0)، يدتا 100 ملم + 1.25% الحزب الديمقراطي الصربي، 15 ميليلتر بروتيناز ك (التركيز النهائي 10 ميكروغرام/مل). احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- إضافة 2 مل خلات البوتاسيوم قبل تبريد (3m, pH 4.8)، واحتضان الأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق.
- الطرد المركزي في 8,000 س ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية لإزالة المواد غير قابلة للذوبان.
- إضافة إلى حجم x 0.7 من الايزوبروبانول إلى المادة طافية. مزيج بتشغيل الأنبوب رأسا على عقب عدة مرات، واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- الطرد المركزي في 8,000 س ز لمدة 10 دقيقة على RT يعجل بالحمض النووي. إزالة المادة طافية.
- يغسل الحمض النووي مرة واحدة مع 70% إيثانول بالطرد المركزي في س 8,000 ز للحد الأدنى 10 إزالة المادة طافية.
- الوت الحمض النووي برفق باستخدام 500 ميليلتر المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl، يدتا 1 مم، الرقم الهيدروجيني 8.0) الشركة المصرية للاتصالات، ونقل الحمض النووي في أنبوب 1.5 مل.
- استخراج الحمض النووي مرتين باستخدام الفينول: كلوروفورم بالطرد المركزي في ز 8,000 لمدة 10 دقائق.
- يعجل بالكحول وحدة التخزين x 0.7. مزيج من تحول إلى أسفل بلطف الأنبوب رأسا على عقب، والطرد المركزي في س 8,000 ز لمدة 10 دقائق.
- أغسل مرة واحدة مع الإيثانول 70 ٪، ريسوسبيند في 200 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات. قياس تركيز الحمض النووي، وتخزينها في-20 درجة مئوية في 12.5 ميكروغرام مختبرين.
2-λ-ARS317 الحمض النووي بيوتينيليشن
- إلى فوسفوريلاتي بيوتينيلاتيد النوكليوتيد (5 '--أجتكجككجكك--الأرقام-البيوتين-3') مكملة للنهاية اليسرى لأصلي λ الحمض النووي، وإضافة 1 ميليلتر (100 ميكرومتر) النوكليوتيد وميليلتر 7.5 ddH2س، 1 ميليلتر من 10 × ليجاسى المخزن المؤقت 0.5 ميليلتر من بنك T4. تبني رد فعل في 37 درجة مئوية ح 3.
- فوسفوريلاتي λ-ARS317، وإضافة 12.5 ميكروغرام من λ-ARS317، ميليلتر 3 من 10 × ليجاسى المخزن المؤقت، احتضان 1 ميليلتر من بنك T4، و ddH2س إلى الحجم الإجمالي من 30 ميليلتر. رد فعل في 37 درجة مئوية ح 3.
- أن يصلب النوكليوتيد مع λ-ARS317، إضافة 0.5 ميليلتر من النوكليوتيد فوسفوريلاتيد، ميليلتر 195 ddH2س، ميليلتر 25 × 10 ليجاسى العازلة في أنبوب λ فوسفوريلاتيد-ARS317. المزيج بلطف بتشغيل الأنبوب رأسا على عقب، واحتضان عند 65 درجة مئوية للحد الأدنى 5 تشغيل إيقاف تشغيل سخان كتلة، واسمحوا بارد عينة إلى أقل من 33 درجة مئوية في الكتلة.
- لسد النوكليوتيد مع λ-ARS317، إضافة 1 ميليلتر من ليجاسى T4 الحمض النووي و 0.63 ميليلتر من ATP (200 ملم). المزيج بلطف بتشغيل الأنبوب رأسا على عقب، واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 2 أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تخزين في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
ملاحظة: لتجنب تفتيت الحمض النووي، ينبغي أن يتم جميع الخطوات الاختلاط بلطف تشغيل الأنبوب رأسا على عقب، بدلاً من الاختلاط باستخدام الماصات.
3-ساترة التنظيف والروغان
- تنظيف ساترة
- كوفيرسليبس 20 مكان في الجرار المصبوغة 4 (5 كوفيرسليبس/جرة)، sonicate لمدة 30 دقيقة في الإيثانول، وشطف كوفيرسليبس مع عالي النقاوة ح2س 3 مرات.
- Sonicate لمدة 30 دقيقة مع م 1 هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH)، وشطف كوفيرسليبس مع عالي النقاوة ح2س 3 مرات. كرر الإيثانول، وكوه سونيكيشن مرة واحدة.
- Sonicate مع الأسيتون لمدة 30 دقيقة ومن ثم أشطف بعالي النقاوة ح2س بعناية (3 مرات على الأقل).
ملاحظة: الأسيتون يجب إزالة تماما قبل الشطف بعالي النقاوة ح2س، لأنه قد يسبب انفجار عند اختلاط المذيبات العضوية (مثل الأسيتون) مع الحل البيرانا عن طريق الخطأ14. - وضع في كوفيرسليبس في حل البيرانا (خليط 3:1 ح2هكذا4 و 30 ٪ ح2س2) واحتضان عند 95 درجة مئوية ح 1.
ملاحظة: الحل البيرانا نشيطة للغاية والتآكل، لذا استخدم بحذر. عند إعداد حل البيرانا، إضافة 50 مل ح2س2 أولاً في كوب زجاج 500 مل، ثم قم بإضافة 150 مل ح2حتى4 ببطء إلى الكأس. - أشطف كوفيرسليبس مع عالي النقاوة ح2س 5 مرات. ثم غسل كل ساترة مع عالي النقاوة ح2س دقة استخدام 3 قنينة مملوءة بعالي النقاوة ح2س، وتجفيف ساترة استخدام ورقة من حافة ساترة. ساترة في جرة المصبوغة والجاف ساترة جيدا في فرن 110 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- شطف ساترة مع الميثانول وَجْرَةَ المصبوغة في الفرن 110 ° C مرة أخرى لتجف ساترة تماما.
ملاحظة: تجفيف ساترة دقة مهم جداً، لأن أبتيس سوف يكون الكثير من الهياكل السطحية ممكن حالما يتم حضور المياه19.
- شطف ساترة مع الميثانول وَجْرَةَ المصبوغة في الفرن 110 ° C مرة أخرى لتجف ساترة تماما.
- الروغان ساترة
- أضف 70 مل من محلول silane (الميثانول 93% و 5% الخليك و 2% أبتيس) في كل جرة، برغي الغطاء وترك الجرة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- غسل وتجفيف كوفيرسليبس كما هو موضح في الخطوة 3.1.5، فيما عدا الجاف كوفيرسليبس دقة باستخدام غاز النيتروجين بدلاً من وضعها في الفرن.
- يذوب 150 ملغ من تلفزيون (ميثوكس-البولي إيثيلين جليكول) و 6 ملغ من البيوتين-شماعة (البيوتين-البولي إيثيلين جليكول) في 1 مل من 0.1 متر جديدة الصنع ناكو3 (pH 8.2) تماما. ثم الطرد المركزي في 17، 000 x ز لمدة 1 دقيقة لإزالة أوتاد غير قابلة للذوبان.
ملاحظة: تقدم طازجة ناكو3 استعداد؛ ليس هناك حاجة لضبط الأس الهيدروجيني لها. - ضع كوفيرسليبس سيلانيزيد في مربعات، وهما كوفيرسليبس الصغيرة على العلوي من طرفي كوفيرسليبس سيلانيزيد. "الماصة؛" 100 ميليلتر من حل الوتد في وسط ساترة سيلانيزيد، ومكان آخر سيلانيزيد ساترة في الجزء العلوي.
- إضافة بعض عالي النقاوة ح2س في المربع لإبقائه الرطبة، واحتضان كوفيرسليبس مع الحل شماعة لمالا يقل عن 3 ح في الظلام. يمكن العمل حضانة بين عشية وضحاها، وكذلك.
- فصل أزواج ساترة ومواكبة الوجه السطحية فونكتيوناليزيد وشطف كوفيرسليبس استخدام عالي النقاوة ح2س على نطاق واسع، وتجفيفها مع غاز النيتروجين.
- وضع علامة على الجانب فونكتيوناليزيد من كوفيرسليبس في إحدى الزوايا باستخدام قلم ماركر، الحفاظ على الجانب فونكتيوناليزيد الوجه لأعلى ووضعها في صناديق وتخزينها المربعات في مجففة فراغ لمدة شهر واحد.
- لتخزين في كوفيرسليبس لفترة أطول، ضع ساترة واحد في أنبوب 50 مل حفر مع فتحه واحدة في برنامجه، ثم وضع الأنبوب في كيس من بلاستيك، وختم الحقيبة باستخدام السدادة من فراغ. وبهذه الطريقة، كوفيرسليبس يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية حوالي 3 أشهر.
4-تدفق الخلية الجمعية
- قطع قناة 15 ملم × 2 ملم في وسط قطعة من الشريط على الوجهين (30 ملم × 12 ملم) باستخدام تثقيب.
- قشر قبالة الجانب ورقة من الشريط على الوجهين ولصقه على الشريحة الزجاجية مع اثنين من الثقوب. اضغط لإزالة فقاعات الهواء. استناداً إلى تجربتنا، أنه من الأسهل إزالة فقاعات الهواء عن طريق تقشير قبالة الجانب ورقة من البلاستيك جانب الشريط على الوجهين.
- قطع ساترة فونكتيوناليزيد (60 مم × 24 مم) إلى أربعة أجزاء (30 ملم × 12 ملم) باستخدام كوب مقلوب الماس الكاتب، وإزالة الأنقاض باستخدام غاز النيتروجين. تذكر أن تحافظ فونكتيوناليزيد جانب الوجه لأعلى.
- قشر قبالة الجانب البلاستيك من الشريط على الوجهين، ولصق الشريحة في ساترة فونكتيوناليزيد. اضغط برفق لإزالة فقاعات الهواء بين ساترة والشريط. إزالة فقاعات الهواء جيدا يمكن أن تحمي الخلية تدفق من تسريب بينما المخازن المؤقتة تم ضخها في ذلك.
- إدراج مدخل ومخرج الأنابيب في الثقوب الصغيرة والكبيرة، على التوالي. إصلاح الأنابيب استخدام الإيبوكسي.
- ضخ 20 ميليلتر من ستريبتافيدين (0.2 مغ/مل) في خلية تدفق يدوياً باستخدام المحاقن واحتضان في RT لمدة 10 دقائق. ثم ضخ حظر العازلة10 في الخلية تدفق ليحل محل ستريبتافيدين، ويبقيه في درجة حرارة الغرفة.
5-واحد جزيء التصور
- الحصول على تنسيق محاذاة الأحمر واستعملنا مع A5 على الأسفار المجهر اختبار الشريحة #1 بالإثارة المتزامنة استخدام ليزر 532 نانومتر وليزر 640 نانومتر. إنتاج الصور الطول الموجي مزدوج مع تقسيم البصريات (انظر الجدول للمواد).
- وضع الخلية تدفق على المجهر، والاتصال أنابيب مأخذ توصيل أنابيب أطول مع ربيع 10 مل مثبتة على مضخة لضخ/سحب الآلي لبرمجة.
ملاحظة: ضخ المخازن المؤقتة إلى تدفق الخلية المذكورة أدناه وسائل سحب المخازن المؤقتة من أنابيب مدخل الخلية تدفق للمحاقن. - مضخة المخزن المؤقت حظر في 500 ميليلتر/دقيقة في الخلية تدفق إزالة الهواء بسرعة وتأكد من أن المخزن في الخلية تدفق غير المحظورة. ثم ضخ المخزن المؤقت حظر في 200 ميكروليتر/دقيقة في الخلية تدفق والوجه الأنابيب منفذ لإزالة فقاعات الهواء من الأنبوب مدخل وخلية تدفق دقيق.
ملاحظة: يجب أن يطرد كافة المخازن المؤقتة ضخها في الخلية تدفق في مجفف فراغ لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. - إضافة 0.5 ميليلتر بيوتينيلاتيد λ-ARS317 الحمض النووي إلى 80 ميليلتر من المخزن المؤقت لحظر، وضخه في الخلية تدفق في الدقيقة 25 ميليلتر لمدة 2 دقيقة. ثم مسح λ-ARS317 الحمض النووي باستخدام 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لحظر بمعدل 50 ميكروليتر/دقيقة.
- ضخ 200 ميليلتر ملزم العازلة10 بمعدل 50 ميكروليتر/دقيقة لإزالة المخزن المؤقت حظر في الخلية تدفق.
- إضافة ميليلتر 0.2 المغلفة streptavidin قدوت705 (1 ميكرومتر) و 0.2 ميليلتر من بيوتينيلاتيد شركة مصفاة نفط عمان (1.2 ميكرومتر) في أنبوب، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم إضافة 20 ميليلتر من ربط المخزن المؤقت في الأنبوب، ووضعه على الجليد. يكون التركيز النهائي لشركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 حوالي 10 نانومتر.
- إضافة 2 ميليلتر من شركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 (10 نانومتر)، 1 ميليلتر من DTT (100 ملم)، 1 ميليلتر من ATP (200 ملم) إلى 96 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم. يكون التركيز النهائي لشركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 0.2 شمال البحر الأبيض المتوسط.
- ضخ 20 ميليلتر من 0.2 nM شركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 بمعدل 10 ميليلتر/دقيقة في الخلية التدفق. طرد المفرط شركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 استخدام 200 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم بمعدل 100 ميليلتر/دقيقة. ثم ضخ المخزن المؤقت ملزم مع 30 نانومتر سيتو البرتقالي إلى الخلية تدفق إلى وصمة عار ركائز الحمض النووي بمعدل 100 ميليلتر/دقيقة.
- تثير إشارة705 شركة مصفاة نفط عمان-قدوت والملون "البرتقالي سيتو" إشارة الحمض النووي باستخدام ليزر 405 نانومتر و 532 نانومتر الليزر، على التوالي. مراقبة الإشارات في نفس الوقت مع تدفق ميليلتر في الدقيقة 100 باستخدام عامل تصفية ممر الموجه رباعية (FF01-446/510/581/703-25)، وتسجيل الصور من م-اتفاقية مكافحة التصحر مع 100 مللي ثانية لكل إطار. جمع 20 صورة كدسات من مختلف المجالات.
6-بيانات التحليل
- المحاصيل الصور باستخدام البرمجيات فيجي مع البرنامج المساعد جديد، والذي يتم تعديله بأنفسنا استناداً إلى صورة البرنامج المساعد (OI_cut_RGBmerge) وضعه مختبر الدكتور رون Vale في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو.
- المحاصيل كومة من الصور (512 × 512 بكسل) إلى الكدسات اثنين من الصور (256 × 256 بكسل). واحد هو 532 نانومتر الليزر نتيجة مثيرة، والآخر هو 405 نانومتر الليزر نتيجة مثيرة.
- معالجة صور متسلسلة 61 استخدام المشروع فيجي-الصورة-مداخن-Z (متوسط الشدة).
- قياس طول الحمض النووي (Lالحمض النووي) والمسافة من موقع شركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 (Lشركة مصفاة نفط عمان) ملزمة للحمض النووي للحمض النووي المربوطة نهاية يدوياً.
- حساب نتيجة لشركة مصفاة نفط عمان/l:الحمض النووي باستخدام excel وتحليل البيانات باستخدام الأسلوب bootstrap بالبحث والتطوير، ثم إنشاء الرسم البياني وتناسب توزيعات الضبابي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصور التفاعل بين شركة مصفاة نفط عمان المسمى قدوت وجمعية الإغاثة اﻷرمنية، نحن أولاً بناء الركيزة الحمض النووي λ-ARS317. تم إدماج جزء من الحمض النووي الذي يحتوي على ARS317 في زهوأنا الموقع (33.5 كيلو بايت) من الحمض النووي λ الأصلي طريق جزئ المتجانسة (الشكل 1A). المنتج جزئ تمت تعبئتها باستخدام مقتطفات وتم استزراع بالعاثية حزم الجسيمات في لوحات رطل (الشكل 1B). تم فرزهم ببكر البلاك بالعاثية إيجابية وأكدت التسلسل (الشكل 1). تمت تنقيته الحمض النووي λ-ARS317 من ليساتيس السائلة (الشكل 1).
وأجريت فحوصات التصوير جزيء واحد على أن الهدف من نوع تيرفم البنية (الشكل 2). بوضع العلامات بيوتينيلاتيد شركة مصفاة نفط عمان بنسبة 1:1 تقريبا مولى المغلفة ستريبتافيدين قدوتس سريعاً، شركة مصفاة نفط عمان المسمى قدوت تم ضخها في الخلية تدفق المربوطة λ-ARS317. وكان الملون الحمض النووي باستخدام "اللون البرتقالي سيتو". الإشارات من شركة مصفاة نفط عمان المسمى قدوت والبرتقال الملطخة سيتو الحمض النووي تم تصويرها في نفس الوقت باستخدام تيرفم (الشكل 3 ألف-3 ج). لتحديد التوزيع لشركة مصفاة نفط عمان على λ-ARS317، تم فصل المكدس التصوير إلى الكدسات اثنين: مكدس واحد من كومة أخرى من شركة مصفاة نفط عمان الإشارات كما هو موضح في الخطوة 6، 1 (الشكل 3B) والإشارات الحمض النووي. استناداً إلى الصيغة، موقف (kb) = (L/l:شركة مصفاة نفط عمانالحمض الخلوي الصبغي) × 50 كيلو بايت (3D الشكل)، 273 ملزم مواقع شركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 الجزيئات في 168 الحمض النووي ركائز كانت كوانتيتيفيلي حلل. وأظهرت البيانات أن شركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 يربط خصيصا على موقع ARS317 إدراجها مع وفرة عالية ومن الواضح أن (الرقم 3E) . ومن ناحية أخرى، يربط شركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 أيضا على المناطق الغنية في الموقع في الأوسط ونهاية λ الحمض النووي، وما يتسق مع نتائج الدراسة السابقة10مجاناً.
الحصول على صورة عالية الجودة تعتمد على نسبة البروتين وقدوتس المولى في تحليل وضع العلامات. قدوتس المفرطة قد تكون جيدة للبروتين وسم الكفاءة، بل أنها يمكن أن تخلق ضجيج الخلفية. كما هو موضح في الشكل 4، بينما وسم بيوتينيلاتيد شركة مصفاة نفط عمان مع قدوتس ستريبتافيدين المغلفة في نسبة 1:3 المولى، وزاد ضجيج الخلفية. وهكذا، أنها حاسمة لاختيار نسبة البروتينات بيوتينيلاتيد إلى قدوتس المغلفة streptavidin المولى المناسبة.
رقم 1: إعداد الركازة الحمض النووي λ-ARS317- (أ) رسم توضيحي للبناء λ-ARS317. تم إدماج جزء الحمض النووي تحمل ARS317 في λ الحمض النووي قبل اقترانها مثلى. (ب) لويحات على رطل الصلبة المتوسطة. ثلاثة منهم قد اتسمت باستخدام السهام السوداء. (ج) تم تحديد لوحة λ-ARS317 باستخدام PCR. (اليسار) علامة، الحمض النووي (وسط) λ الأصلية، (اليمين) لوحة من λ-ARS317. (د) تم الكشف عن منقي λ-ARS317 الحمض النووي بنسبة 0.6% [اغروس] هلام التفريد. (اليسار) علامة، λ الأصلية (وسط) الحمض النووي (يمين) تنقية λ-ARS317. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: نظرة عامة التخطيطي للخلية الهدف من نوع TIRF وتدفق- فحوصات التصوير جزيء واحد أجريت استناداً إلى تيرفم الجمع بين نظام تدفق الخلية. أجرى لنا تيرفم على مجهر مقلوب مزودة 60 × الهدف النفط (الفتحة العددية = 1.49). الحمض النووي (الخط الرمادي) المربوطة في ساترة في الخلية التدفق من خلال الربط البيوتين-streptavidin، وامتدت بالتدفق من اليسار إلى اليمين. أشارت ملزمة بروتين الحمض النووي المربوطة بنقطة الحمراء-البيضاوي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: قدوت705-وصفت شركة مصفاة نفط عمان (نسبة 1:1 مولى) ملزمة λ-ARS317. (أ) شركة مصفاة نفط عمان و λ-ARS317 الحمض النووي قد لوحظت في وقت واحد. (أعلى) سيتو البرتقال الملون الحمض النووي كان متحمس استخدام ليزر 532 نانومتر ولاحظ استخدام الفرقة انتقال نانومتر 550-613 رباعية الفرقة تمرير عامل التصفية. (أسفل) قدوت705-وصفت شركة مصفاة نفط عمان متحمساً من استخدام ليزر 405 نانومتر ولاحظ استخدام الفرقة انتقال نانومتر 663-743 رباعية الفرقة تمرير عامل التصفية. (ب) تم اقتصاص مكدسات اثنين 256 × 256 الفرعية من المكدس 512 × 512 الأصلي. (ج) الصور المكتسبة باستخدام إطارات متتالية 61 في الكدسات المقابلة. (اليسار) سيتو البرتقال الملون الحمض النووي، قدوت (وسط)705-وصفت شركة مصفاة نفط عمان، الصورة المدمجة (على اليمين)؛ ثلاثة قدوت705-المسمى ملزم شركة مصفاة نفط عمان في موقع ARS317 على ركائز الحمض النووي λ-ARS317 اتسمت باستخدام السهام السوداء. (د) رسم توضيحي لحساب شركة مصفاة نفط عمان ملزمة الموقف على الحمض النووي. Lالحمض النووي يعني طول الحمض النووي، لشركة مصفاة نفط عمان يعني المسافة من شركة مصفاة نفط عمان ربط الموقع على الحمض النووي إلى نهاية المربوطة للحمض النووي. (ه) "الرسم البياني لشركة مصفاة نفط عمان" توزيع ملزمة على الحمض النووي λ-ARS317. ذكر غاوسي يصلح للبيانات باستخدام الخط الأحمر الخالص. أشرطة الخطأ تشير إلى 95% فاصل ثقة استناداً إلى عينات bootstrap 1000. يعني N عدد جزيئات شركة مصفاة نفط عمان. وذكر موقع ARS317 إدراج استخدام سهم أسود. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: شركة مصفاة نفط عمان قدوت المسمى ملزم (نسبة المولى 3:1) λ-ARS317- ولوحظت الحمض النووي شركة مصفاة نفط عمان و λ-ARS317 بنفس الطريقة كما في الشكل 3 ألف. (اليسار) سيتو البرتقال الملون الحمض النووي كان سعيداً باستخدام ليزر 532 نانومتر. (الأوسط) شركة مصفاة نفط عمان المسمى قدوت كان سعيداً باستخدام ليزر 405 نانومتر. الصور المدمجة (يمين). ربط شركة مصفاة نفط عمان المسمى قدوت اثنين في موقع ARS317 على ركائز الحمض النووي λ-ARS317 اتسمت باستخدام السهام السوداء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نقدم هنا، وضع بروتوكول لمراقبة التفاعل بين البروتين المسمى قدوت والحمض النووي λ سيتيسبيسيفيكالي المعدلة باستخدام تيرفم في خلية تدفق. وتشمل الخطوات اللازمة الخاصة بالموقع تعديل الركازة الحمض النووي والحمض النووي بيوتينيليشن، وتنظيف ساترة والروغان، خلية تدفق إعداد، وتصوير جزيء واحد. وهناك نقطتان رئيسيتان ينبغي ملاحظة. أولاً، جميع الخطوات التي تنطوي عليها مع الحمض النووي λ ينبغي معالجته برفق لتقليل أي ضرر ممكن، مثلاً، تجنب الاختلاط بيبيتينج صعودا وهبوطاً مرارا وتكرارا. وثانيا، المهم جداً للتأكد من أن ساترة نظيف بما يكفي لتقليل الضوضاء الخلفية لها. أثناء عملية التنظيف والروغان ساترة، المياه يجب أن تصل إلى مستوى عالي النقاوة، وينبغي أن يكون الهواء خاليا من الغبار. فمن الأفضل إجراء الروغان ساترة والجمعية تدفق الخلية على مقاعد البدلاء نظيفة.
Λ الحمض النووي بفحوصات جزيء واحد لدراسة التفاعل البروتين-الحمض النووي، الركيزة مناسبة مع عدة مزايا20. Λ الحمض النووي طويلة بما يكفي يمكن ملاحظتها بسهولة، وتسمح بتسجيل حركة البروتين على ذلك في تجربة جزيء واحد. وعلاوة على ذلك، تسمح يتدلى ssDNA العديد من التصاميم للربط الحمض النووي λ على ساترة زجاج. في هذه الدراسة، نقدم طريقة لإدراج جزء بلغة الحمض النووي خارجية في موقع معين من الحمض النووي λ. وهكذا، يمكن إدماج مختلف أجزاء الحمض النووي يمكن تحديدها من قبل المستخدم λ الحمض النووي. يمكن أن يكون الحمض النووي المعدل λ مريح تنقيته من ليساتيس السائل بكميات كبيرة لدراسة جزيء واحد.
من الصعب تقييم كفاءة وصفها بدقة في قدوت streptavidin المغلفة وسم المقايسة لأن هناك ما يقرب من 5-10 ستريبتافيدينس كل نانوكريستال قدوت. وبناء على ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل نسبة المولى المناسبة المغلفة ستريبتافيدين قدوتس والبروتينات بيوتينيلاتيد في التجارب. يمكن أن يكون بنسبة 1:1 ضرس مرجع.
تجدر الإشارة إلى أن قدوت لا يمكن استخدامها في فحوصات دقيقة الكمية نظراً لاستقرارها الصور عالية غير مناسب للمقايسة تبييض الصورة. على الرغم من أن يحد ارتفاع ثبات قدوتس تطبيقه في فحوصات الكمي، فإنه يسمح السهل المراقبة وتتبع منذ فترة طويلة5. مع زيادة التطبيقات للفحص المجهري fluorescence جزيء واحد في علم الأحياء، البروتوكول المذكورة في هذه الورقة سوف تسهم إسهاما كبيرا في كشف آليات استقلاب الحمض النووي في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نشكر الدكتور حسن يارديمسى ويارديمسي Dr.Sevim معهد فرانسيس كريك لنوع المساعدة في التجارب جزيء واحد، الدكتور دانيال دوزديفيتش من مختبر الدكتور إريك جيم غرين من جامعة كولومبيا، الدكتور يوجي الشمس من جامعة بكين والدكتور كونلي تشن من جامعة تسينغهوا لإجراء مناقشة مفيدة. وأيد هذه الدراسة "الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين" 31371264، 31401059، فريق الابتكار متعدد التخصصات الأكاديمية ونيوتن المتقدم الزمالة (NA140085) من "الجمعية الملكية".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S.
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
