Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבות תלת מימדי של החולה-derived גליובלסטומה תאים בתוך orthogonally tunable biomaterials כחיקוי של מטריקס המוח. גישה זו מספקת במבחנה, פלטפורמה ניסיוני זה שומר על מאפיינים רבים של ויוו גליובלסטומה תאים בדרך כלל לאיבוד בתרבות.
Abstract
גליובלסטומה (GBM) הוא הסרטן הנפוץ ביותר, עדיין הקטלני ביותר, מערכת העצבים המרכזית. בשנים האחרונות, מחקרים רבים התמקדו איך מטריצה חוץ-תאית (ECM) של הסביבה המוח ייחודי, כדוגמת חומצה היאלורונית (HA), מקלה על התקדמות GBM, הפלישה. עם זאת, רוב במבחנה הדגמים תרבות כוללים תאים GBM מחוץ להקשר של ה-ECM. Xenografts מאתר של תאים GBM נמצאים בשימוש נפוץ גם כן. עם זאת, מודלים ויוו להקשות לבודד התרומות של תכונות בודדות של microenvironment הגידול מורכב להתנהגות הגידול. כאן, אנו מתארים פלטפורמה מבוססת הידרוג תלת מימדי (3D) תרבות HA זה מאפשר לחוקרים לשנות באופן עצמאי ריכוז HA וקשיחות. משקל מולקולרי גבוה HA, פוליאתילן גליקול (PEG) מהווים hydrogels, אשר תפור באמצעות תוספת מסוג מייקל בנוכחות תאים חיים. תרבויות הידרוג תלת-ממד של החולה-derived הכדאיות בנספח תאים GBM והתפשטות שיעורי כמו, או טוב יותר, כאשר תרבותי gliomaspheres כסטנדרט. מערכת הידרוג מאפשר גם התאגדות של פפטידים ECM-מימטי לבודד את ההשפעות של תאים ספציפיים-ECM אינטראקציות. Hydrogels שקופים שטיחות כך תאים חיים יכול לדימות בתרבות תלת-ממד. לבסוף, HA הידרוג תרבויות תואמים טכניקות סטנדרטי עבור ניתוחים מולקולרית, תאית, כולל PCR, סופג המערבי cryosectioning ואחריו immunofluorescence מכתים.
Introduction
מערכות תלת מימד (3D) תרבות מסכם את הדברים אינטראקציות בין התאים שלהם שמסביב (ECM) מטריצה חוץ-תאית ברקמות מקורית יותר שלהם1,דו מימדי עמיתיהם (2D)2. החידושים הנדסת רקמות הניבו תרבות מתוחכם, 3D פלטפורמות המאפשרות מבוקרת חקירות רכיבים כימיים 1) איך של מטריקס microenvironment משפיעים על תא התנהגויות ו 2) היעילות של חדש טיפולית אסטרטגיות עבור מספר מחלות, כולל סרטן2. בעוד במבחנה מודלים יכול לזהותה, סיסטמי אותות האנדוקרינית ואת המערכת החיסונית, ולכן לא יכול להחליף לחלוטין ויוו מודלים, הם מספקים מספר יתרונות כולל הפארמצבטית, בקרה ניסויית, כל אחד מהחדרים מכיל ומהירות. כאן, אנו מתארים את השימוש hydrogels המוח-מימטי שבו תלת-ממד תרביות של תאים סרטניים במוח החולה-derived ללכוד היבטים רבים של פיזיולוגיה הגידול, בפרט, הדינמיקה של רכישת טיפול ההתנגדות3. לעומת שיטות אחרות במבחנה , תרבויות אלה כדאי מייצגים ויוו הגידול מודלים, מחקרים קליניים3.
גליובלסטומה (GBM) הוא הסרטן תכופים וקטלני ביותר שמקורם במוח, עם חציון ההישרדות של 1-2 שנים רק4,5. בשנים האחרונות, מחקרים רבים התמקדו השפעת הסביבה מטריקס הגידול ב- GBM-6,-7,-8. ECM המוח ייחודי דווחה להשפיע על נדידת תאים GBM, התפשטות והתנגדות טיפולית6,7,8,9,10,11 , 12. חומצה היאלורונית (HA) הוא גליקוזאמינוגליקן שופע (איסור פרסום) במוח, זה מקיים אינטראקציה עם אחרים GAGs ואיפה proteoglycans לטופס הידרוג דמוי רשת שינוי13. מחקרים רבים דיווחו על HA ביטוי בגידולים GBM והשלכותיה עוקבות על סרטן התקדמות8,9,13,14,15,16 ,17. רכיבים אחרים ECM להשפיע גם על GBM גידול וצמיחה של הפלישה6,7,15,18. לדוגמה, fibronectin ו vitronectin, אשר בדרך כלל overexpressed ב- GBM, לגרום heterodimerization של קולטני אינטגרין פני שטח התא דרך איגוד רצף "RGD" וליזום מורכבים cascades איתות המקדמים הגידול הישרדות19 20, ,21. מלבד השפעות הביוכימי, תכונות פיזיקליות של המטריקס רקמות להשפיע גם על GBM התקדמות22,23.
רכישת מתמיד של עמידות לטיפולים הוא אחד המניעים העיקריים של GBM קטלני4. סמים מציג תוצאות מבטיחות במודלים 2D או gliomasphere נכשלו מחקרים בבעלי חיים מאוחרים יותר, מקרים קליניים3, המציין כי ההשפעות של גורמים microenvironmental באופן משמעותי תרמו GBM הגידול תגובה1. בעוד מודלים בעלי חיים יכול לספק תלת-ממד, מבחינה פיזיולוגית המתאים microenvironment לתאים החולה xenografted ולהפיק24,תוצאות הרלוונטית קלינית25, המורכבות של המוח microenvironment ויוו הופך מאתגרת כדי לקבוע אילו תכונות, כולל אינטראקציות סלולרי-מטריקס, מפתח על ספציפי לתוצאות ביולוגי. זיהוי של מטרות טיפוליות חדשות ייהנו משימוש של פלטפורמות תרבות פשוטה שבה מוגדרים הביוכימי ומאפייני ביופיזיקלי.
בניגוד biomaterial שדווחה בעבר דגמי26,27 microenvironment הגידול GBM, אשר לא מתגשם נכון שליטה בתכונות הביוכימי ופיזית בודדים של ECM, פלטפורמת biomaterial אורתוגונלית סופגת מאפשר כאן דיווח על התרומות של תכונות עצמאיות מרובות פנוטיפ תאים GBM. כאן, אנו מציגים מערכת הידרוג מבוסס-HA, orthogonally tunable, לתרבות תלת-ממד של החולה-derived תאים GBM. Hydrogels נוצרות מתוך שני מרכיבים פולימריים: HA פעילים ביולוגית 1) ו- 2) ביולוגית אינרטי פוליאתילן גליקול (PEG). פג הוא חומר מסתיימים, הידרופילית בשימוש נרחב עם חלבון נמוכה ספיחה ו מינימלית immunogenicity28. כאן, כ- 5% של moieties חומצה גלוקורונית ב- HA שרשראות הן functionalized עם קבוצות תיול כדי לאפשר crosslinking כדי זמינים מסחרית 4-זרוע-יתד הסתיים עם maleimides באמצעות תוספת מסוג מיכאל. בצורתו הנפוצה ביותר בגוף, HA קיימת בשלשלאות משקל מולקולרי גבוה (HMW). כאן, רמה נמוכה של שינוי של HMW HA (500-750 kDa) מסייעת לשמירה על אינטראקציות מקורית של HA, קולטני התא שלה, כולל CD4429. על ידי החלפת פג-תיול HA-תיול תוך שמירה על יחס טוחנת קבועה של תיולים הכולל כדי maleimides, ריכוז HA יכול להיות decoupled מן התכונות המכאניות של hydrogels שנוצר. יתר על כן, הפקדים stoichiometric יכול לשמש כדי נזווג המסתיימת בציסטאין פפטידים למספר ממוצע מוגדר של הזרועות המסתיימת ב- maleimide על כל 4-זרוע-יתד. התאגדות של פפטידים נגזר ECM, דבק מאפשרת אינטראקציות עם אינטגרינים על תאים בתרבית, שדרכו אותות ביוכימיים וכימיים הן transduced1. תוספת Maleimide-תיול מתרחשת מהר מאוד בתנאים פיזיולוגיים, צמצום הזמן הנדרש תא כימוס, למקסם הישרדות של החולה-derived תאים. יתר על כן, תרבויות הידרוג יכולים להיות מטופלים כמו דגימות רקמה טיפוסי, עולים בקנה אחד עם טכניקות אפיון סטנדרטי כולל סופג המערבי, cytometry זרימה של immunofluorescence מכתים. הפרוטוקול הבא מתאר את נהלי בדיית hydrogels, הקמת תרבויות תלת-ממד של החולה-derived תאים GBM וטכניקות לניתוח הביוכימי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השלבים אוסף רקמה אנושית בוצעו תחת פרוטוקולים המאושרות כמוסד.
1. Thiolation של חומצה היאלורונית
הערה: יחסי טוחנת מתוארים לגבי המספר הכולל של קבוצות carboxylate אלא אם צוין אחרת.
- להמיס 500 מ"ג נתרן היאלורונית (HA, 500-750 kDa) ב 10 מ"ג/מ"ל במים מזוקקים, יונים (לשכפל2O) ב החיטוי עיקור, 250 מ ל Erlenmeyer את הבקבוק. מערבבים את הפתרון (~ 200 סל ד) בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפזר באופן מלא HA. השתמש בר stir, צלחת מגנטית מערבבים כדי לשמור התגובה זע במהלך הליך thiolation.
- באמצעות 0.1 M חומצת מימן כלורי (HCl), להתאים את רמת החומציות של הפתרון HA 5.5. שוקלים לצאת 69.6 מ"ג (0.25 x יחס טוחנת) של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
הערה: למרות undissolved EDC אפשר להוסיף ישירות אל הפתרון HA, זה בדרך כלל יותר קל להתמוסס EDC לראשונה ב 1 מ"ל של לשכפל2O ולאחר מכן להוסיף במהירות את הפתרון EDC לפתרון HA. טרום התפרקות ב 1 מ"ל של לשכפל2O יכול להעשות גם עם N-hydroxysuccinimide (NHS), cystamine dihydrocholoride לפני הוספת התגובה בשלבים 1.3 ו- 1.4. - להוסיף 17.9 מ ג (0.125 x יחס טוחנת) NHS התגובה. להתאים את ה-pH של התמיסה תגובה ל 5.5 שימוש 0.1 M HCl, דגירה התגובה בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות.
- להוסיף 70.0 מ ג (0.25 x יחס טוחנת) של cystamine dihydrochloride לתוך הפתרון התגובה. השתמש 0.1 M הידרוקסיד הנתרן (NaOH) כדי להתאים את ה-pH ל 6.25. דגירה התגובה בטמפרטורת החדר למשך הלילה תוך כדי ערבוב.
- למחרת, השתמש 1 M NaOH כדי להתאים את ה-pH של התמיסה התגובה בסביבות 8. להוסיף 192 מ ג (4 x יחס טוחנת) של dithiothreitol (DTT) התגובה. להתאים את ה-pH בחזרה ל- 8 לאחר תוספת של DTT ולהשאיר ערבוב במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.
- השתמש 1 M HCl כדי להתאים את ה-pH ל- 4. להעביר את התערובת התגובה כולה לתוך קרום דיאליזה טרום רטוב (משקל מולקולרי ניתוק סביב 13 kDa) ו dialyze נגד לשכפל2O מראש להתאים ל- pH 4.
הערה: היקף לשכפל2O לדיאליזה צריך להיות לפחות 40 פעמים הנפח של הפתרון יפעלו ויגיבו HA (למשל, 50 מ ל מדגם 2 ל' לשכפל2O, pH 4). - להחליף את הפתרון דיאליזה (לשכפל2O, pH 4) פעמיים ביום במשך 3 ימים בטמפרטורת החדר.
- לסנן את הפתרון dialyzed דרך קרום מיקרומטר 0.22, מסנן מונחה ואקום. פלאש להקפיא תמיסת thiolated HA בחנקן נוזלי. השתמש של איזה שהוא לופילייזר להקפיא יבש דגימות מעל 2 ימים. Thiolated חה בטופס יבש יכול להיות מאוחסן של desiccator און ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים.
- כדי לקבוע את מידת thiolation, להשתמש במבחן של אלמן ו/או פרוטון NMR ספקטרוסקופיה30,31.
2. הכנת חומרים Crosslinking
- להמיס thiolated HA-הריכוז הרצויה (בדוגמה זו, 13.3 מ"ג/מ"ל) ב- saline באגירה HEPES (20 מ מ HEPES במאגר מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) של האנק, התרגלו למניית pH של 8-9) המבחנה אמבר כדי למזער חשיפה תאורת. שמור את הפתרון זע ללא הרף.
הערה: היווצרות חוב דיסולפידי בין תיולים מצומדת כדי HA עלולה להתרחש אם ה-pH הוא מעל 8, ריכוז הפתרון הוא גבוה מדי, או הפתרון שנשאר זע במשך זמן רב מדי לפני gelation. כדי למנוע בעיה זו, השתמש מתחת 15 מ"ג/מ"ל של thiolated HA, להמיס thiolated HA תוך שעתיים על הקמת hydrogels. - להמיס 4-זרוע-פג-maleimide (פג-מל, 20 kDa) ו- 4-זרוע-פג-תיול (פג-תיול, 20 kDa) בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), pH 7.4, להכין 50 מ"ג/מ"ל פג-מל ופתרונות פג-תיול מניות.
הערה: זה לוקח לפחות שעה מלאה להתמוסס ריאגנטים פג. - אם הוספת ECM-derived פפטידים, להמיס פפטידים המכילים ציסטאין PBS להכין פתרון מניות.
הערה: השתמש ריכוז מניות של 2-4 מ מ. - גומי סיליקון להשרות תבניות אתנול לפחות 20 דקות כדי לנקות ואז החיטוי אותם עבור עיקור.
3. הידרוג Crosslinking, כימוס תא
הערה: בתור דוגמה העטיפה של ארבעה הפרט, hydrogels 80 µL עם 0.5% (w/v) HA מודולוס compressive של 1 kPa הוא תיאר3. אנא עיין בטבלה 1 מתכונים לדוגמה המניבים hydrogels עם מאפיינים שונים: שני hydrogels שילוב של פפטיד אינטגרין מחייב RGD ו- hydrogels שני שילוב כמוסות ציסטאין כפקד שלילי לפעילות פפטיד. זריעה ריכוז של החולה-derived תאים GBM הוא תאים למ"ל 500,000.
- הפתרון מניות פג-מל (50 מ"ג/מ"ל, משלב 2.2) 12.5 מ"ג/מ"ל מדולל על-ידי הוספת µL 40 של הפתרון מניות 120 µL PBS. פצל את הפתרון מדולל שני צינורות microcentrifuge 1.5 mL כך כל שפופרת יש 80 µL.
- הוסף µL 16 מניות RGD פתרון (2.8 מ"מ, משלב 2.3) שפופרת אחת µL 16 מניות ציסטאין לפתרון (2.8 מ"מ, משלב 2.3) הצינור השני. מערבולת לערבב. במקום הפתרונות של פג-מאל-RGD או פג-מאל-CYS על הקרח עד לשימוש בשלב 3.9.
הערה: ההליך כפי שמתואר כאן התשואות hydrogels עם ~ 140 מיקרומטר של פפטיד. . זה שווה ערך כ 1 מתוך כל הזרועות 8 פג זמין מלהיות כבוש עם פפטיד. זה יכולים להיות מגוונים על ידי שינוי היחס טוחנת של פפטידים המסתיימת בציסטאין לקבוצות maleimide זמין. באופן כללי, ריכוז מרבי של 280 מיקרומטר של פפטיד יכולה להיות מושגת תוך השארת עדיין מספקת מספר קבוצות maleimide זמין עבור הידרוג crosslinking. - לדלל את פג-תיול מניות פתרון (50 מ"ג/מ"ל, משלב 2.2) 5 מ"ג/מ"ל על ידי ערבוב 4 µL של 50 מ"ג/מ"ל פתרון מניות עם µL 36 ל- PBS. הוסף µL 120 של מומס, thiolated HA מהשלב 2.1 לתערובת.
הערה: הפתרונות של HMW חה הם מאוד צמיגה. לפיכך, אנו ממליצים להשתמש micropipette רחב-דיזה עצה להעביר פתרונות. פיפטה לאט כדי להימנע פתרון נדבקות קירות micropipette עצה וכדי לשפר את דיוק המדידה. - למקם את התבניות נקי, יבש (להכין בשלב 2.4) כל טוב של צלחת 12-ובכן שטופלו תרביות רקמה. משתמש נקי, בוטה סוף טיפ פיפטה, הקש את ג'ל עובש ואיטום שח כפול בין תבניות בתחתית הצלחת היטב.
הערה: בודק את החותם שוב לפני כימוס למניעת דליפה. - המעבר בתרבית תאים GBM, מביצועם לתאים בודדים, לקבוע ריכוז תא תיאר כאמור3.
הערה: כמה שורות GBM לא יכול להיות חלופה מועדפת לתאים בודדים. במקרה זה, ניתן לכלול כל gliomaspheres. עם זאת, להכין הפומבית תאים בודדים לאחר תא מדויקים סופר לשיפור הפארמצבטית. הפרוטוקול עבור gliomasphere passaging משתנה בין מעבדות שונות, רבים מהם סביר תואם הידרוג אנקפסולציה.- (מומלץ) צנטריפוגה gliomaspheres ב 500 g x עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע ולהוסיף 1 מ"ל של האנזים דיסוציאציה תא בגדר התא. לאחר מכן, תדגור במשך 5 דקות, בעדינות הקשה את הצינור כדי להתסיס
- להוסיף 4 מ של תרבות שלמה בינונית (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 µg/mL הפארין, תוספת G21 ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין ב DMEM/F12) לתאים.
- צנטריפוגה שוב ב 500 g x עבור 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. לבסוף resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של המדיום מלאה, עוברים תאים על תנאי דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. שטיפה (מומלץ) לשחזר מסננת עם אוטם 4 נוספים של המדיום מלאה כדי למקסם את מספר התאים.
- מעריכים את הריכוז של תאים ההשעיה באמצעות hemocytometer. פצל התליה תא 2 צינורות צנטריפוגה, איפה כל שפופרת מכיל תאים ~ 80,000. צנטריפוגה ב 500 g x עבור 5 דקות; באופן כללי, תאים 80,000 יפצה 2 80 µL hydrogels.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend גלולה אחת ב- 80 µL של פג-מאל-RGD פתרון, גלולה השני ב- 80 µL של פג-מאל-CYS פתרון (להכין בשלב 3.1).
- שימוש µL 200, wide-דיזה micropipette עצה, לוותר על µL 40 בפתרון HA (מתוך שלב 3.3 לעיל) לתוך כל עובש סיליקון גומי (כמו להכין בשלב 3.4).
- שימוש µL 200, wide-דיזה micropipette עצה, מערבבים את µL 40 של פג-מאל-CYS או פג-מאל-RGD פתרון תא עם הפתרון HA ב כייר. פיפטה למעלה ולמטה במהירות לא יותר מ 10 פעמים. חזור על כל תרבות ג'ל בהכנה.
הערה: שלב זה דורש אימון, מאז gelation הראשונית מתרחשת במהירות (תוך 30 s). פיפטה מעלה ומטה תוך כדי תנועה הטיפ למיקומים שונים בתבניות כדי להבטיח אפילו ערבוב. שמור תמיד את הקצה מתחת למפלס נוזלי כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. לא לערבב יותר מדי פעמים כמו ג'ל יכול לקבל נוצר בתוך micropipette הפתרון עצה. פג-מאל-CYS ו- PEG-מאל-RGD יכול להיות משולב-יחסי בדרגות שונות כדי להשיג את הריכוז פפטיד RGD הרצוי. - מקום טוב-הצלחת המכיל ג'ל-אנקפסולציה תאים לתוך חממה תרבות תא 37 ° C 5-10 דקות להבטיח השלמה של התגובה.
- להוסיף 2-2.5 מ של תרבות בינוני בכל טוב עם ג'לים במבנה תקין. השתמש סטרילי, 2 µL פיפטה עצה או מיקרו-מרית, להפריד בעדינות את התבנית ואת ג'ל. השתמש מלקחיים מראש מעוקרות להסרת העובש מהצלחת היטב. מקם את הצלחת טוב לחזור תא חממה (37 ° C ו- 5% CO2) עבור תרבות, ניסויים עתידיים.
הערה: משוך כייר אנכית כלפי מעלה כדי למנוע פגיעה התרבויות ג'ל. באופן כללי, בינוני בתרבויות ג'ל יש להחליף כל 3-4 ימים. הקפידו לא תשאף hydrogels בעת הסרת בינוני. אם זו בעיה, אנו ממליצים להשתמש פיפטה של העברת פלסטיק. אם מתוכנן ביולומינסנציה הדמיה כדי לעקוב אחר מספר הטלפון הנייד, תאים GBM חייב להיות transduced עם lentivirus קידוד צורונים ביטוי לוציפראז לפני כימוס, כפי שתואר לעיל3. עבור ביולומינסנציה הדמיה, להוסיף 1 מ מ D-luciferin תרבות בינוני 1 h לפני הפריה חוץ גופית הדמיה.
4. lysate הכנה סופג המערבי
- מקררים 1.5 mL צינורות microcentrifuge על הקרח (1 לכל דגימות ג'ל). צנטריפוגה מגניב עד 4 ° C.
- הסר בינוני טוב צלחות. העברת ג'לים לתוך צינורות prechilled microcentrifuge.
- להוסיף 100 µL ריפה מאגר עם מעכבי פרוטאז/פוספטאז x 1.
- באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 20 גרם, לשבור את הג'ל על ידי דחיפת התערובת כל דרך המחט לפחות 20 פעמים.
- פלאש ספין המדגם באמצעות microcentrifuge העליון ספסל ומקום הדגימה בחזרה על קרח.
- מערבולת דוגם בקצרה כל 5 דקות עבור סכום כולל של 20 דקות.
- צנטריפוגה דגימות ב 14000 g x למשך 15 דקות ב 4 º C.
- תגובת שיקוע להעביר צינורות microcentrifuge חדש, צונן מראש ולאחסן ב-20 ° C (לטווח קצר) או ו-80 מעלות צלזיוס (לטווח ארוך). לבצע באמצעות הליכים סטנדרטיים, כמו שתואר לעיל3אלקטרופורזה בג'ל.
5. לחילוץ תאים בודדים מתרבויות הידרוג עבור Cytometry זרימה
- הסר בינוני והעברת תרבות ג'ל (מתוך שלב 3.11) לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
- דגירה ג'ל עם 500 µL של התא דיסוציאציה האנזים (למשל, TrypLE אקספרס) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, מדי פעם להרים את הצינור כדי להתסיס.
- להעביר את התערובת לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל 5 מ של מדיום מלאה. מניחים את הצינורית על קרח.
- צרף מחט 20 גרם לתוך מזרק 10 מ"ל. משוך בעדינות את המתלים תא למעלה ולמטה דרך המחט 8 פעמים.
- לזרום את התערובת דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל חדש. החל אוטם 5 נוספים של מדיום מלאה דרך מסננת כדי לאסוף את כל התאים הנותרים.
- Centrifuge הדגימה ב 400 x g עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע resuspend בגדר במאגר הרצוי עבור cytometry זרימה (באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים3).
6. הקפאה קריוגנית של Hydrogels על חלוקתה
- הסר בינוני מתרבויות ג'ל (מתוך שלב 3.11).
- דגירה ג'ל תרבויות עם 2 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
התראה: PFA הוא רעיל, יש לטפל בזהירות. - ביום הבא, להסיר מחברים. להוסיף 2 מיליליטר 5% סוכרוז ב- PBS ג'לים, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
- החלף 5% סוכרוז פתרון 2 מ של 20% סוכרוז ב- PBS, דגירה למשך 30 דקות.
- החלף סוכרוז פתרון 2 מ של סוכרוז 20% טרי ב- PBS, תקופת דגירה של 30 דקות נוספות.
- בפעם השלישית, החלף את הפתרון סוכרוז 2 מ של סוכרוז 20% טרי ב- PBS. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- להכין 20% סוכרוז במתחם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר).
הערה: בגלל צמיגות של OCT, פירוק סוכרוז יכול לקחת קצת זמן (עד הלילה). אנו ממליצים לשים את התערובת על גבי מטרף במהלך פירוק כדי לשמור על עצבנות. - למחרת, להסיר את הפתרון 20% סוכרוז, בעדינות שופכים את 20% סוכרוז בפתרון OCT הג'ל. הקפד לכסות את כל הג'ל. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
- להעביר את הג'ל לתוך המרכז של תבנית להטבעה בעזרת מרית גדולה, שטוח; זה חייב להעשות בזהירות כדי למנוע נזק הג'ל.
- מגניב 2-methylbutane בפנים cryochamber עם עודף של קרח יבש.
- למלא את להטבעה OCT טהור (ללא סוכרוז). למלא כדי מתחת לקצה העליון של עובש.
- להקפיא את הדגימה הידרוג על ידי טבילה ב 2 מקורר-methylbutane והמשך ואז חלוקתה.
- סעיף המדגם באמצעות cryostat; סעיף עובי 10-18 מיקרומטר וטמפרטורה אופטים של-26 ° C מומלצים.
- לבצע הליכים סטנדרטיים immunostaining על ג'ל משרטוטי תרבות, כפי שתואר לעיל3.
הערה: PFA ידוע מגרה, גורם מסרטן. בבקשה לטפל ולחסל מחברים לפי מקומית לתקנים ולתקנות.
7. מן דוגמאות הידרוג החילוץ RNA הכולל
הערה: כאן, אנו מתארים פרוטוקול באמצעות פרסומת קיט (ראה טבלה של החומרים) כדי לחלץ RNA הכולל מתאי הידרוג תרבותי. המאגרים כל החומר זמינים בתוך ערכת בשימוש.
- הסר את תרבות בינוני. השתמש פיפטה העברה של P1000 עם נשא רחב עצה להעביר את התרבות הידרוג לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
- להוסיף 350 µL מאגר RLT התרבות הידרוג.
- באמצעות מחט 20 גרם המצורפת מזרק 1 מ"ל, לגרוס את הג'ל על ידי דחיפת התערובת כל דרך המחט לפחות 20 פעמים.
- להעביר את כל התערובת לתוך עמודה מהמגן הניח צינור אוסף 2 מ"ל. צנטריפוגה ב g x 13,000 למשך 2 דקות.
- להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור נקי mL 1.5 microcentrifuge. להיזהר שלא להפריע את התמיסה ג'ל בחלק התחתון.
- מערבבים את הדגימה lysate עם 350 µL של 100% אתנול. העברת כל המדגם מקום בטור (הערכה) ספין בשפופרת אוסף 2 מ"ל. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 13,000 x g.
- עבור והשלבים לטיהור RNA עבור ה-PCR, לפי התקנון הכללי המסופקים על ידי היצרן קיט.
הערה: לאחר ה-RNA מופק, פרוטוקולים סטנדרטיים עבור ה-PCR יכול לשמש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עבור כל אצווה של thiolated HA, מידת thiolation צריך אפשרות לאמת באמצעות H1-NMR או הבדיקה של אלמן. חה שינוי באמצעות ההליך שמתואר כאן באופן עקבי יוצר thiolation ~ 5% (המוגדר כיחס טוחנת תיולים כדי HA disaccharides) (איור 1).
הגדרה זו פלטפורמה תרבות חדשה ידרשו כל מעבדה לביצוע בדיקות קפדניות כדי להבטיח יכולת הקיום תרבות טובה לפני יישום ניסויים בקנה מידה גדול. Hydrogels µL 80 שלנו עם זריעה צפיפות 500,000 תאים למ"ל (40,000 תאים/ג'ל) לגרום באופן עקבי המחירים התפשטות דומה, או יותר טוב, gliomasphere תרבויות (איור 2 א-2 C). בתור HA/פג hydrogels שקופים אופטים, התנהגויות התא יכול להיות שנצפו ישירות בתרבויות בשידור חי, 3D באמצעות מיקרוסקופ חדות או קרינה פלואורסצנטית שלב. איור 3 א מצביע על כך 4 ימים לאחר כימוס, GBM בתאים המכילים RGD hydrogels התערוכה של פנוטיפ פולשני, ואילו תאים תרבותי ב הידרוג באמצעות PEG-מאל-CYS פקדים יש של מורפולוגיה כדורית.
כמו טיפוסי עם מודלים xenograft שבו החוקרים חייבים לחכות ימים חודשים עד גידולים מושתל מגיעים צמיחה הדרגתית24,32, תאים החולה נגזר גם לקחת זמן להסתגל לסביבה תרבות חדשה. לפיכך, אנו ממליצים culturing 4-8 ימים לפני התחלת הניסויים, כגון טיפול סמים, כדי להבטיח שרוב התאים שהזנת את שלב הגידול המעריכי. מעבר טיפולים תרופות, ריאגנטים כמו מסיסים cyclo-RGD, אשר והשמה לשבש תא באינטראקציה עם RGD hydrogels, ניתן להוסיף תרבות בינוני (איור 3 א).
מערכת הידרוג שלנו הוא תואם עם שיטות נפוצות רבות חוקרים glioma ביולוגיה של התא. באמצעות הדמיה ביולומינסנציה, אשר משמש בדרך כלל כדי לנטר מכרסמים xenograft גידולים, מספרם היחסי של התאים קיימא ניתן לצפות בתרבויות הידרוג במהלך הטיפול. איור 3B מספק דוגמה של שיטה זו, איפה תופעות של טרסבה טיפול בתאי GBM תרבותי הידרוג הוערכו מעל 6 ימים. באופן כללי, ניתן לטפל הידרוג תרבויות כמו דגימות רקמה בעת הכנת lysates תספיג או ה-PCR. ניתוח תספיג cleaved poly ADP פולימראז מציין כי במידה היחסית של אפופטוזיס בתאים תמונות ציפורים CD44 שטופלו גבוה יותר תאים GBM wildtype תרבותי ב- 0.5% HA hydrogels (איור 3C). באופן דומה, המתלים תא בודד ניתן להכין מתרבויות הידרוג לניתוח באמצעות cytometry זרימה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים עבור שחרור תאים בודדים רקמות שלם (איור 2). בנוסף לתכונות תא, cryosections של תרבויות מבוססי הידרוג, 3D לשמר ECM שהופקדו על ידי תאים בתרבית. לדוגמה, התצהיר דפוסים של סוג IV קולגן shift בעת טיפול טרסבה הידרוג תרבויות (דמות תלת-ממד).
איור 1 : נציג H 1 -NMR הספקטרום של חומצה היאלורונית thiolated. פסגות משולב עולה כי כ- 5% של קבוצות חומצה גלוקורונית HA שונו עם תיול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : התפשטות של תאים הידרוג-אנקפסולציה. א) תמונות דוגמה של מפוברק-80 µL ג'ל ב 12-ובכן צלחות. לאחר crosslinking, hydrogels היו נפוחות במדיום התרבות תאים. ב) תוצאות נציג של קצב התפשטות נמדד באמצעות cytometry זרימה. תאים GBM (HK301) היו מודגרות עם 1 מיקרומטר אדו (5-ethynyl-2 ′-deoxyuridine) עבור h 2.5 ביום הרביעי לאחר כימוס או passaging. תגובת לחץ שימש נזווג הפלורסנט כדי אדו מואגד, כמפורט שא. et al. 2017. פקדים שלילי3 , שבו אין אדו נוספה לתרבויות, היו כלולים. תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית ג) נציג של חיים (ירוק), המלח (אדום) תאים 24 שעות אחרי הידרוג תרביות של תאים GBM (HK157) הוקמו. גודל ברים = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : אפיון. א) שלב נציג תמונות חדות של 0.5% (w/v) HA תרבותי הידרוג תאים בתנאים משתנים במשך 8 ימים לאחר אנקפסולציה. חיצים מציינים תאים עם מורפולוגיה פולשנית. ב) תמונות נציג של האות ביולומינסנציה נמדד לאחר 15 ימים של טיפול עם 1 מיקרומטר טרסבה או רכב (דימתיל סולפוקסיד). 1 מ מ D-luciferin נוספה תא תרבות בינוני 1 h לפני הדמיה. התאים היו transduced עם lentivirus קידוד עבור הביטוי המכונן של גחלילית לוציפראז לפני אנקפסולציה. ג) נציג החיסון-כתם תמונות ניתוח ביקע poly ADP פולימראז (cl-PARP) ביטוי תאים GBM (HK301) תרבותי hydrogels עם 0.5% (w/v) הא ו 1 kPa מודולוס compressive. כל החתוכה הראו תמונות היו אותה האבן החשופה. ד) נציג מכתים של קולגן הרביעי (ירוק) ו Hoechst 33342 (כחול) בתאים תרבותי הידרוג HK301 12 ימים לאחר הטיפול עם 1 מיקרומטר טרסבה או רכב (דימתיל סולפוקסיד). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| סוג ג'ל | החלק (40 µL כל) | חלק ב' (40 µL כל) | ||||
| 4Arm-פג-מל (50 מ"ג/מ"ל) | ציסטאין או RGD (סיכון 2.81 מ מ) | PBS (pH 7.4) | 4Arm-פג-תיול (50 מ"ג/מ"ל) | PBS (pH 7.4) | HA-S (13.3 mg/mL) | |
| 1kPa HA 0.5% (w/v) | 10 ΜL | 4.00 ΜL | 26 ΜL | 1.00 ΜL | 9.00 ΜL | 30.0 ΜL |
| 2kPa HA 0.5% (w/v) | 20.0 ΜL | 4.00 ΜL | 16.0 ΜL | 8.00 ΜL | 2.00 ΜL | 30.0 ΜL |
| 1kPa HA 0.1% (w/v) | 10 ΜL | 4.00 ΜL | 26 ΜL | 8.00 ΜL | 26.0 ΜL | 6.00 ΜL |
טבלה 1. ניסוחים הידרוג מניב שליטה עצמאית של ריכוז HA לבין תכונות מכניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדור של לשחזור נתונים באמצעות מערכת תלת-ממד תרבות זו דורשת: 1) עקבי thiolation אצווה-כדי-אצווה של HA, 2) תרגול כדי להשיג ערבוב של הידרוג מבשרי וטיפול יעיל של הידרוג תרבויות כדי למנוע נזק ו- 3) ממוטבים זריעה צפיפות עבור כל קו תא בשימוש.
כאשר אחוז משקל מסוים של HA היא הרצויה ב הידרוג, מידת thiolation של HA קובע את צפיפות crosslink. אנו ממליצים להשתמש כמות עקבית של HA עבור כל תגובה thiolation כדי למזער את הווריאציה אצווה-כדי-אצווה. אנו ממליצים כי לפחות 300 מ ג של HA לשמש עבור כל תגובה thiolation כך מאותה אצווה של thiolated HA יכול לשמש עבור חזרה ניסיוני מרובים. היחס טוחנת של תיולים לקבוצות maleimide פג 4-הזרוע צריכה להיות תמיד להיות 1.1:1 על מנת להבטיח יעילות מרבית crosslinking. לפיכך, אם מידת thiolation מגוונת, אז הסכום של פג-מל הוסיף שתישמר בהתאם. כאשר פפטידים נמצאים מצומדת כדי maleimides לפני היווצרות ג'ל, המספר המשוער של הזרועות פג עם פפטידים קשור חייב להיות מופחתים מן המספר הכולל של maleimides זמין לחישוב זה. בנוסף, אנו ממליצים לשמור את מידת thiolation HA מתחת ל 10-15% כדי להימנע מיצירת קשר דיסולפידי שימנעו התפרקות, עקבי gelation.
תגובת סיפוח מיכאל-סוג בין קבוצות תיול maleimide מבטיחה ש-gelation הזה מתרחש בתוך פחות מדקה. בעוד gelation מהיר זה ממזער את כמות הזמן תאים הושעו ב הידרוג מבשרי הם ללא בינוני מלא, אשר עלול לסכן את הכדאיות שלהם, התהליך כימוס דורש ניסיון עם כל pipetting של ערבוב צעדים כדי להשיג תוצאות לשחזור. בדרך כלל, יש לנו מתלמדים חדשים לתרגל כמה סיבובים של gelation ללא תאים לפני ביצוע ניסויים עיטוף "אמיתי".
שני גורמים יכולים להיות צבט לווסת מהירות gelation: pH טמפרטורה, קודמן התגובה. מורידים את טמפרטורת התגובה על ידי הצבת את הצלחת היטב על הקרח תוך כדי ערבוב מאיטה את התגובה ומספק זמן רב יותר לערבב קודמן פתרונות. עם זאת, זה חייב להתבצע בתנאים סטריליים באמצעות טכניקות aseptic נאותה. באופן דומה, ניתן לשנות את ה-pH של קודמן פתרונות כדי להגדיל או להקטין את זמן התגובה באמצעות pH גבוה או נמוך, בהתאמה. מאז thiolated HA היא דיאליזה נגד מים חומציים כדי למנוע היווצרות קשר דיסולפידי, משוקם thiolated HA תניב pH נמוך יותר מאשר אחרת עשוי להיות צפוי. באופן כללי, שיחזור ב- 20 מ מ HEPES במאגר HBSS, מותאם pH 9, תניב pH ליד כאשר 7 15 מ"ג/מ"ל של thiolated HA (~ 5% thiolated) התפרקה. אנו ממליצים להשתמש pH 6.8-7 thiolated HA פתרון כדי לאפשר אפילו ערבוב של ג'ל פתרון תוך מיקסום בריאות.
זריעה צפיפות במהלך אנקפסולציה היא קריטית עבור הכדאיות הסלולר ו הפארמצבטית ניסיוני. אנו ממליצים זריעה בטווח של 100,000 ל 2,000,000 תאים למ"ל. מצאנו כי טווח זה הוא אופטימלי הכדאיות של רוב סוגי תאים תוך מניעת נגמר-confluency בתוך מסגרת זמן ניסיוני לפחות 3 שבועות. צפיפות זריעה הראשונית זה מייעל את הכדאיות צריך להיקבע השפעול עבור כל סוג התא המשמש.
נקטו זהירות יש לנקוט בעת שינוי המדיום תא כדי למנוע נזק הידרוג תרבויות. בפרט, הקפידו לא תשאף הידרוג לתוך פיפטה. לפיכך, לא להשתמש השאיפה ואקום ולהשתמש במקום זאת פיפטה העברה סטרילי לרוקן באופן ידני. שינוי רק חצי המדיום בתרבות טוב בכל פעם עשוי גם לסייע.
באופן כללי, טכניקה זו דורשת תרגול כדי להשיג את הדרוש מיומנות ידנית ועקביות. פרוטוקול ספציפי המעבדה הוא הוקם, מערכת התרבות 3D מאפשר החוקר להשתמש שיטות אפיון רבות כמו טיפוסי עבור תרבית תאים ורקמות explanted. . הנה, תארנו מספר טכניקות לניתוח, כולל immunofluorescence, cytometry זרימה, סופג המערבי ביולומינסנציה הדמיה של תרבויות בשידור חי, 3D (איור 2-3). עבור פרוטוקולים מפורטים יותר של שיטות אפיון, נא עיין. שא ואח 20173. לבסוף, כפי hydrogels HA/פג שקוף אופטית, טכניקות במיקרוסקופ אור רגיל, כולל הדמיה קונאפוקלית, ניתן לעקוב אחר תרבויות בשידור חי, 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה במימון NIH (R21NS093199) ופרס של 3R UCLA קשת. תודתנו שנמנמתי ללכת למעבדה של ד ר הארלי קורנבלום למתן השורות תא HK301 ו- HK157. אנו מודים גם UCLA רקמות פתולוגיה הליבה מעבדה (TPCL) עבור cryosectioning, מתקן ליבה מתקדמות אור מיקרוסקופ/ספקטרוסקופיה (צדקה) ב קליפורניה Nanosystems המכון (CNSI) באוניברסיטת קליפורניה לשימוש של מיקרוסקופ קונפוקלי, UCLA Crump המכון הדמיה מולקולרית באמצעות מערכת הדמיה IVIS, UCLA מולקולרית מכשור מרכז (MIC) למתן ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית, ו Cytometry Core זרימה של Jonsson מקיף סרטן מרכז (JCCC) באוניברסיטת קליפורניה על מתן אינסטרומנטציה עבור זרימת cytometry.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
References
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Holland, E. C.
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010. Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).
- Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).
- Zamecnik, J. The extracellular space and matrix of gliomas. Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).
- Jadin, L., et al. Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors. Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).
- Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H.
- Pedron, S., et al. Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics. MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).
- Jiglaire, C. J., et al. Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening. Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).
- Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
- Day, A. J., Prestwich, G. D. Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).
- Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro. Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).
- Gilg, A. G., et al. Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors. Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).
- Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer. Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).
- Varga, I., et al. Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis. Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).
- Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).
- Bello, L., et al. αvβ3 and αvβ5 integrin expression in glioma periphery. Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).
- Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition. Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).
- Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Oh, Y. T., et al. Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma. PloS one. 9 (8), e103327 (2014).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Wang, C., Tong, X., Yang, F. Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels. Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).
- Zhu, J. Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering. Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).
- Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. Hyaluronan fragments: an information-rich system. European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).
- Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination. Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).
- Jin, R., et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair. Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).
