Con alto contenuto di Imaging per quantificare l'impegno di destinazione in cellule aderenti

Durante lo sviluppo di nuovi farmaci o sonde chimiche è essenziale per accoppiare l'effetto farmacologico osservato o lettura funzionale ad misure di capienza di destinazione o di fidanzamento in cellule vive^1,2,3. Tali dati sono necessari per assicurare che la piccola molecola infatti raggiunge la sua destinazione desiderata sia per convalidare l'ipotesi biologica dietro proteine bersaglio selezione^4,5. Inoltre, durante lo sviluppo di farmaci, sistemi di modello di complessità crescente vengono utilizzati per selezionare e confermare un piombo composto prima del test clinici. Per confermare la traduzione di biologia attraverso questi sistemi preclinici, metodi per tracciare l'impegno di droga-destinazione e biologia in tutto questo processo di sviluppo di accompagnamento sono critici.

L'impegno di droga-destinazione è tradizionalmente difficile da monitorare in cellule vive con Gegbenenfalls piccole molecole e proteine, soprattutto a livello di singola cellula con risoluzione spaziale^6,7. Unmodified risale un metodo per osservare l'interazione tra farmaci e proteine in cellule vive è il test di spostamento termico cellulare (CETSA) in cui stabilizzazione indotta da legante di una proteina nativa in risposta ad una sfida di calore è quantificata^{8, 9,10}. Ciò avviene mediante la quantificazione della proteina solubile rimanente dopo l'esposizione a una sfida di calore. La divulgazione iniziale di CETSA, western blot è stato usato per il rilevamento. Per attivare campagne di screening e colpire triaging delle più grandi collezioni di composti, gli sforzi per aumentare il throughput di CETSA esperimenti hanno portato allo sviluppo di parecchi saggi omogenei, basati su micropiastra^10,11. Tuttavia, una limitazione con questi metodi è che attualmente meglio sono adatti al trattamento composto in sospensioni delle cellule e la rilevazione richiede la lisi cellulare, portando alla perdita di informazioni spaziali. CETSA può essere applicato sperimentalmente sia come uno spostamento indotta da legante in temperatura di aggregazione termica (T_agg) ad un'unica concentrazione della molecola piccola o alla concentrazione di ligando necessaria per stabilizzare la proteina ad una singola temperatura. Quest'ultimo è definito le impronte digitali di isotermici dose risposta (ITDRF) per indicare la dipendenza di queste misurazioni specifiche condizioni sperimentali.

L'obiettivo del presente protocollo è quello di misurare l'impegno di destinazione utilizzando CETSA in cellule aderenti di rilevazione dell'anticorpo di immunofluorescenza (IF) con microscopia ad alto contenuto¹². Questa procedura si estende la piattaforma CETSA originale per consentire per cella singola quantificazione di aggancio di obiettivo con conservazione della localizzazione subcellulare. In particolare, a differenza di molti rapporti precedenti, in questa procedura composto trattamento viene effettuato in cellule vive aderente senza distacco di superficie o lavaggio prima della sfida di calore, preservando così l'equilibrio stabilito associazione che intendiamo misurare¹³. Attualmente, il metodo viene convalidato per una destinazione della proteina p38α (MAPK14) in diverse linee cellulari, e ci auguriamo che attraverso la condivisione di questa procedura la tecnica può essere applicata ampiamente attraverso il proteoma di fusione. Prevediamo che questo protocollo può essere adattato in tutta la pipeline di sviluppo di droga dallo screening, ha colpito triaging attraverso al monitoraggio dell'obiettivo fidanzamento in vivo.

1. semina delle cellule

Nota: Per una panoramica generale del flusso di lavoro vedere la Figura 1. Un elenco dettagliato dei materiali e i reagenti sono disponibili nella Tabella materiali.

1. Prima della semina delle cellule, forare con una punta standard nella cornice di nero piastre dosaggio imaging da 384 pozzetti per evitare bolle d'aria intrappolata sotto la piastra più tardi durante la fase di riscaldamento. Per evitare di entrare i pozzetti durante questo passaggio di particelle di plastica e per mantenere condizioni di sterilità, sigillare le piastre con un foglio di alluminio adesivo o coprire la piastra prima della foratura in una cappa di coltura del tessuto. In genere, sono sufficienti 3 fori con un diametro di 3,5 mm su ogni lato della piastra (lato corto).
2. Preparare una flusso laminare panchina pulendo con etanolo al 70%. A seguito di tecniche di coltura tissutale asettica standard, rimuovere supporti dalla cella boccetta o il piatto. Lavare le cellule con 5-10 mL di tampone fosfato salino (PBS) e quindi aggiungere tripsina 2ml al pallone. Incubare la beuta a 37 ° C fino a staccano le cellule di A-431. Contare le celle utilizzando un contatore emocitometro o cella. Preparare una sospensione di cellule di 50.000 cellule/mL nel terreno di coltura.
3. Dispensare 40 µ l di sospensione cellulare (pari ad una densità di cella finale di 2.000 cellule per pozzetto) in ciascun pozzetto di una piastra di analisi utilizzando un dispenser di reagente di massa o di una pipetta multicanale, a seconda dell'entità dell'esperimento. Brevemente, spostare la piastra da lato a lato per disperdere le cellule in modo uniforme sul fondo della piastra.
4. Per ridurre al minimo gli effetti di bordo piastra, permettono alle cellule di stabilirsi nella parte inferiore della piastra dosaggio per 20 minuti a temperatura ambiente nella parte posteriore della cappa a flusso laminare. Quindi, posizionare la piastra in un contenitore di plastica con tovaglioli di carta umidi per garantire un'atmosfera umida. Prima dell'uso, pulire il contenitore di plastica con etanolo al 70%.
5. Incubare la casella con la piastra di dosaggio per 2-3 giorni a 37 ° C e 5% di CO₂ in un incubatore convenzionale. Monitorare la confluenza delle cellule fino al 50-75%, come valutata mediante ispezione visiva con un microscopio ottico.

2. trattamento di compound

1. Il giorno dell'esperimento, aspirare il mezzo da ogni pozzetto usando una rondella di piatto. Posizionare la piastra sulla rondella piastra e selezionare il programma di aspirazione. Se non è disponibile una rondella di piatto, il liquido può essere rimosso invertendo la piastra con un tocco di mano rapida sopra un vassoio dei rifiuti o un lavandino. Rimozione completa del liquido è essenziale per la buona prestazione. Liquido in eccesso viene quindi rimosso tamponando con carta assorbente.
2. Aggiungere 30 µ l di composti diluito alla concentrazione appropriato nel mezzo di coltura cellulare mediante erogazione automatizzato o una pipetta multicanale a seconda dell'entità dell'esperimento. Assicurarsi di aggiungere un negativo (DMSO) e il controllo positivo (noto ligando) a diversi pozzi su ogni piatto di dosaggio. Poiché si tratta di un'analisi termica dello spostamento, è necessario che la concentrazione di composta supera la costante di dissociazione per osservare la stabilizzazione proteica. Così, una guida di riferimento per la concentrazione di composti è 50 - 100 volte la IC₅₀, ma più descrizioni di dettaglio per le concentrazioni di composte si trovano nella sezione discussione.
   Nota: Tollerabilità di DMSO delle varietà di cellula dovrebbe essere testato prima dell'esperimento.
3. Tenuta la piastra di dosaggio composto-trattati con una piastra traspirante sigillare e incubare a 37 ° C e 5% di CO₂ in un incubatore per 30 minuti.

3. calore sfida

1. In primo luogo, è possibile impostare il bagno di acqua alla temperatura desiderata. Si noti che la temperatura finale che viene raggiunta all'interno i pozzetti della piastra, l'analisi può essere diversa dalla temperatura finale nel bagno d'acqua. Indagare l'offset in anticipo con un termometro a termocoppia e piastra fittizio. In genere si impiegano 30 minuti per il bagno stabilizzare la temperatura desiderata.
2. Per verificare che è raggiunta la temperatura desiderata nei pozzetti della piastra dosaggio durante la fase di riscaldamento, preparare una piastra fittizia non sigillata contenenti lo stesso volume del mezzo come la piastra di dosaggio.
3. Rimuovere le piastre di dosaggio dall'incubatrice. Togliere il sigillo traspirante e richiudere e sigillare la piastra di test che contiene le cellule composto-trattate con un foglio di alluminio adesivo stretto per garantire che l'acqua non colerà nei pozzetti durante il riscaldamento successivo nel bagno d'acqua. Assicurarsi che i fori praticati nella piastra del telaio siano accessibili.
4. Posizionare la piastra di dosaggio e il manichino nel bagno d'acqua con il fondo del piatto inclinato verso la superficie dell'acqua per forzare qualsiasi aria restante fuori da sotto le piastre.
5. Monitorare la temperatura all'interno dei pozzetti di una nuova piastra manichino con un termometro a termocoppia.
6. Scaldare la piastra di dosaggio nel bagno d'acqua per 3 minuti. Trasferire immediatamente il dosaggio e la piastra fittizio per un altro bagno di acqua con acqua sala-temperato per raffreddare per 5 minuti. La piastra di dosaggio è ora pronta per l'ulteriore elaborazione.

4. fissazione

1. Pipettare 10 µ l 16% (p/v) di paraformaldeide (PFA) direttamente alla piastra dosaggio usando un erogatore di reagente di massa o di una pipetta multicanale. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
   Nota: Alcuni fissativi sono classificati come cancerogeni e norme di sicurezza istituzionale dovrebbero essere seguite.
2. Aspirare la soluzione PFA e lavare le cellule con 300 µ l PBS utilizzando una rondella di piatto. Posizionare la piastra sulla rondella piastra e selezionare il programma di aspirazione.
   Nota: Questa procedura è stata ottimizzata utilizzando un protocollo di overflow sulla rondella piastra in cui liquido è contemporaneamente dispensato e rimosso. Se non è disponibile una piastra rondella o procedura analoga, la fase di lavaggio in alternativa può essere fatto manualmente.
3. Procedura di lavaggio manuale: Rimuovere il liquido dai pozzetti invertendo la piastra con un tocco di mano rapida sopra un vassoio dei rifiuti o un lavandino. Rimozione completa del liquido è essenziale per la buona prestazione. Aggiungere 80 µ l di PBS con una pipetta multicanale e capovolgere la piastra come descritto sopra, ripetere il lavaggio due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, tamponare la piastra contro gli asciugamani di carta pulita per rimuovere il liquido in eccesso.

5. permeabilizzazione

1. Aggiungere 20 µ l di 0.1% (v/v) NP-40 per i pozzetti con una pipetta multicanale e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Lavare le cellule con la stessa procedura come descritto in precedenza (punto 4.2).
2. In alternativa, se del caso, applicare un protocollo di recupero dell'antigene, per esempio:
   1. Aggiungere 20 µ l di 1% SDS per i pozzetti con una pipetta multicanale. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e lavare secondo la stessa procedura descritta sopra (punto 4.2).
   2. Aggiungere 80 µ l di glicina 10 mM a pH 7,2 e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione di glicina utilizzando una rondella piastra spostando sulla rondella piastra e selezionando il protocollo di aspirazione. Se una rondella di piatto non è disponibile, vedere note in 2.1 e 4.2.

6. blocco

1. Aggiungere 15 µ l di 1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) in PBS pozzetti utilizzando un dispenser di reagente di massa o di una pipetta multicanale. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora o durante la notte a 4 ° C con un sigillo di piastra in alluminio estruso.

7. primaria dell'anticorpo

1. Aspirare la soluzione di blocco utilizzando una rondella piastra spostando sulla rondella piastra e selezionando il protocollo di aspirazione. Se una rondella di piatto non è disponibile, vedere note in 2.1 e 4.2.
2. Aggiungere 10 µ l di anticorpo primario diluito in conseguenza a 1% (p/v) BSA in PBS per i pozzetti usando una pipetta multicanale. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora o durante la notte a 4 ° C con un sigillo di piastra in alluminio estruso.

8. secondaria dell'anticorpo

1. Aspirare la soluzione di anticorpo primario e lavare i pozzetti secondo la stessa procedura come descritto in precedenza (punto 4.2).
2. Aggiungere 10 µ l di anticorpo secondario Alexa 488 conseguenza diluito in 1% (p/v) BSA in PBS. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Sigillare la piastra con un foglio di alluminio adesivo sigillo al riparo dalla luce.
   Nota: Proteggere la piastra dalla luce durante questo e i passaggi successivi.

9. nucleare macchiatura e maschera di cella

1. Aggiungere 10 µ l di colorante nucleare diluito a 0,05 mg/mL in PBS per i pozzetti usando una pipetta multicanale. Incubare a temperatura ambiente per ulteriori 10 minuti.
2. Aspirare la soluzione di Hoechst e un anticorpo secondario e lavare i pozzetti utilizzando la stessa procedura come descritto in precedenza (punto 4.2).
3. Aggiungere 10 µ l di cella maschera diluito a 200 ng/mL in PBS per i pozzetti usando una pipetta multicanale. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
4. Aspirare la soluzione di maschera di cella e lavare i pozzetti utilizzando la stessa procedura come descritto in precedenza (punto 4.2).
5. Versare 60 µ l di PBS in tutti i pozzetti usando una pipetta multicanale, un dispenser di reagente di massa o la rondella piastra e sigillare le piastre con un foglio di alluminio adesivo.

10. acquisizione e analisi delle immagini

1. Catturare le immagini su un alto contenuto imager utilizzando 3 canali fluorescente: DAPI (387/447), GFP (472/520) e TexasRed (562/624). Acquisire 4 immagini per pozzetto utilizzando obiettivo 10x. Utilizzare l'autofocus automatico laser e applicare binning 2 durante l'acquisizione. Memorizzare le immagini come file di tiff a 16 bit, grigio scala insieme ai metadati.
2. Analizzare le immagini utilizzando il software disponibile. Identificare i bordi della cella utilizzando un algoritmo di cella segnando con DAPI (nucleo) e TexasRed (citoplasma).
3. Estratto di intensità media per tutte le lunghezze d'onda acquisita per ulteriore analisi di dati.
4. Calcolare il fattore di Z per assicurare la robustezza del dosaggio.
5. Calcolare la stabilizzazione % utilizzando la seguente formula: 100 * (1-(ben intensità – media intensità ben controllo negativo) / (media controllo negativo positivo controllo-media intensità di intensità)). Qui il controllo negativo è DMSO e controllo positivo è la sostanza di riferimento. Poiché la massima stabilizzazione tra composti possa variare e in realtà essere maggiore il controllo positivo per le curve ITDRF, le intensità di stabilizzazione di massima e minima per ogni composto sono a volte utilizzate al posto dei valori di intensità di pozzetti di controllo del .

Il protocollo descritto nella Figura 1 descrive il flusso di lavoro di base per l'esecuzione di saggi CETSA su cellule aderenti con rilevazione della proteina solubile rimanente da alto contenuto imaging. Questo flusso di lavoro può essere facilmente adattato a tutte le fasi di sviluppo di analisi modificando il layout della piastra dei composti o reagenti14. Dettagliamo i risultati attesi per più atteso seguito di casi di utilizzo.

Identificazione degli anticorpi e sviluppo di analisi. Un prerequisito per risultati di successo è l'identificazione di un anticorpo primario o altro reagente adatto affinità che riconosce selettivamente la forma nativa della proteina in presenza della proteina aggregata e precipitata formata durante il calore sfida nel passaggio 3. Per stabilire il dosaggio di imaging CETSA descritto qui, abbiamo proiettato un pannello di 9 anticorpi p38α a 52° C per finestra di segnale tra i controlli positivi e negativi di targeting. Abbiamo quindi titolato gli anticorpi migliori e si stabilirono sulle condizioni illustrate nella Figura 2 A, B con rappresentante immagini di immunofluorescenza per p38α stabilizzata da un ligando noto (controllo positivo) e DMSO (controllo negativo). Riconoscimento anticorpale non deve essere interrotto dai cambiamenti conformazionali della proteina dell'obiettivo che può essere indotta dal ligando vincolanti (Figura 2). Ad esempio, BIRB796 ha una lunga sconto sul prezzo, e quantificazione di aggancio di obiettivo era possibile solo applicando un passo di ricupero dell'antigene (5,2; Figura 2D). È importante convalidare le prestazioni dell'anticorpo primario con ligandi noti che coprono siti di legame differenti della proteina bersaglio, se disponibile. La convalida dell'anticorpo viene eseguita preferibilmente con e senza il passaggio di ricupero dell'antigene.

Curve ITDRF e Tagg . Come accennato in precedenza, esperimenti CETSA possono essere eseguiti in due modalità diverse, Tagg curve ed esperimenti ITDRF. Entrambe le varianti utilizzano lo stesso protocollo di base descritto in Figura 1 e nella sezione protocollo. Nel primo setup, lo scopo è di sfidare le cellule con un gradiente di temperatura e di confrontare le curve diagg T in presenza e in assenza di un'unica concentrazione del ligando. Per eseguire una curva diagg T, piastre separate sono riscaldati per 3 minuti in una gamma di temperature. Nell'eseguire questo esperimento, è importante cronometrare la durata del trattamento composto per ogni piatto con il tempo che necessario per il bagno di acqua stabilizzare alla nuova temperatura. A questo proposito, peforming la sfida di calore passo nel bagno d'acqua è più tempo di riscaldamento tubi in una macchina PCR. Il percorso sperimentale è di prossima esecuzione concentrazione curve di risposta di un ligando ad una temperatura fissa per generare le curve ITDRF. In generale, quando si verifica più composti, dosaggio piatti pronti per l'aggiunta di composto vengono preparati utilizzando automatizzato dei liquidi per ottenere i dati più riproducibili. Composti sono in serie diluiti in DMSO e poi sciolto in terreni di coltura delle cellule ad una concentrazione desiderata. In genere abbiamo testato serie 11 punti di concentrazione a partire da 50-100 µM a 3 o 4 fold diluizione, ma questo dipende la potenza dei leganti utilizzati. Si consiglia in primo luogo stabilire la curva diagg T sia in assenza e in presenza di un ligando e selezionare la temperatura per successivi esperimenti isotermici dove può essere osservato un cambiamento tra le curve. La temperatura selezionata dovrebbe essere intorno o appena sopra la Tagg. Entrambi i formati permettono per la conferma dell'impegno di destinazione, ma per la classifica delle affinità composto ITDRF esperimenti sono spesso più adatti. Figura 3A Mostra un'illustrazione di risultati attesi quantificati per una curva diagg T e Figura 3B quantifica i risultati di un esperimento ITDRF tipico.

Campagna di screening. Il protocollo può anche essere adattato per lo screening di campagne per identificare nuovi leganti della proteina bersaglio. In questo caso, sfide di calore isotermici vengono applicate per un gran numero di composti in un'unica concentrazione seguita da esperimenti ITDRF per composti identificati stabilizzante. Prepariamo i test screening pronto piastre e trasferire i composti diluiti in terreno di coltura per le lamiere di dosaggio automatizzato dei liquidi. Come con tutte le analisi di stabilità termica, è necessario superare la costante di dissociazione per osservare la stabilizzazione proteica e così abbiamo applicato librerie di piccole molecole a 50 µM per facilitare l'identificazione di colpo. Valutazione dei successi utilizzando ITDRF permetterà successivamente classificazione e definizione delle priorità di questi composti. La figura 4 Mostra un risultato rappresentativo da un piatto di screening.

Figura 1 . Descrizione schematica del protocollo descritto in questo articolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 . Sviluppo di identificazione e dosaggio di anticorpi. A) dati di esempio per il rilevamento di p38α umano in cellule di A-431. Immagini rappresentative di positivo (1 µM AMG548) e (DMSO) controlli negativi. Rosso - macchiatura nucleare Hoechst, colorazione verde-p38α. Immagini scattate con ingrandimento 10x; la barra della scala bianco rappresenta 73 µm. B) esempio di dati quantificati, espressi come media intensità/cella. Barre di errore rappresentano errore standard della media di 16 replicati per 6 piastre separate. Ogni piatto era riscaldata a 52 ° C in un bagno di acqua seguito da fissazione delle cellule, permeabilizzazione e immunostaining successive. C) immunofluorescenza segnale intensità misurata dopo trattando le cellule A-431 con 1 µM BIRB796 o DMSO come descritto sopra seguito direttamente tramite la fissazione. In assenza di una fase di riscaldamento, il segnale di BIRB796 è inferiore rispetto al segnale di DMSO, suggerendo che BIRB796 interrompe il rilevamento di p38α con questo anticorpo. D) ITDRFCETSA curve per le cellule trattate con BIRB796 o con (triangolo blu) o senza protocollo di recupero dell'antigene (triangolo grigio). Questa figura è stata modificata da Axelsson et al 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 . Esperimenti di aggregazione termica e ITDRF. A) esperimenti di curva di aggregazione termica per le cellule trattate con positivo (1 µM AMG548, in arancione) e (DMSO in grigio) controlli negativi. Barre di errore rappresentano errore standard della media di 32 o 464 repliche. B) esperimentoCETSA ITDRF eseguito a 52 ° C per le cellule trattate con diluizioni seriali di SB203580 in blu, Skepinone-L in verde e RWJ67657 in rosso. Barre di errore rappresentano errore standard della media delle 6 ripetizioni. Dati quantificati sono espressi come media intensità/cella e normalizzati contro la più alta concentrazione di rispettivo composto. Questa figura è stata modificata da Axelsson et al 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 . Quadro rappresentativo di una piastra di screening a 10 ingrandimenti. Controlli positivi (1 µM AMG548) sono nelle colonne 2 e 24 e controlli negativi (DMSO) sono nelle colonne 1 e 23. Tutti i altri pozzetti contengono 50 µM di libreria composti utilizzati per lo screening con parecchi colpi denotati. Nelle figure inserto, la linea bianca in basso a destra rappresenta 200 µm. Questa figura è stata modificata da Axelsson et al 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno alcuna informativa al rapporto.