Summary
מדידות של התרופה היעד אירוסין הן גורם מרכזי פיתוח תרופות יעיל ובדיקת בדיקה כימית. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול למדידת סמים-יעד האירוסין באמצעות הדמיה תוכן גבוהה לאגדת microplate תואמי וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA).
Abstract
Quantitating את האינטראקציה של מולקולות קטנות עם המטרה חלבון המיועד שלהם הוא קריטי עבור פיתוח תרופות, היעד אימות ובדיקת בדיקה כימית. שיטות למדוד תופעה זו ללא שינוי של חלבון המטרה או מולקולה קטנה הם יקר במיוחד אבל טכנית מאתגר. וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA) היא טכניקה אחת לעקוב אחר היעד האירוסין בתאים חיים. כאן, אנו מתארים עיבוד של פרוטוקול CETSA המקורי, אשר מאפשר למדידות תפוקה גבוהה תוך שמירה על לוקליזציה subcellular ברמה תא בודד. אנו מאמינים שפרוטוקול זה מציע מקדמות חשוב ליישום של CETSA עבור אפיון מעמיק של המתחם-יעד אינטראקציה, במיוחד באוכלוסיות הטרוגניות של תאים.
Introduction
בעת פיתוח תרופות חדשות או כימי הגששים חיוני כמה את התצפיות מהדם או פונקציונלי readout למדידות של תפוסת היעד או אירוסין תאים חיים1,2,3. נתונים אלה נחוצים כדי לוודא מולקולה קטנה יגיע למעשה המטרה הרצויה שלו והן כדי לאמת את ההשערה ביולוגי מאחורי חלבון המטרה בחירת4,5. יתר על כן, במהלך פיתוח תרופות, דגם מערכות המורכבות הגוברת משמשים כדי לבחור לאמת חוט המורכב לפני ניסויים קליניים. כדי לאשר תרגום של הביולוגיה על פני המערכות פרה, שיטות איתור סמים-יעד האירוסין וליווי ביולוגיה לאורך כל תהליך הפיתוח זה הם קריטיים.
סמים-יעד האירוסין באופן מסורתי מאתגר כדי לפקח על תאים חיים עם מולקולות קטנות unfunctionalized, חלבונים, במיוחד ברמה תא יחיד עם רזולוציה מרחבית6,7. אחת השיטות האחרונות כדי לבחון האינטראקציה בין יבוצעו בהם שינויים-תרופות, חלבונים בתאים חיים וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA) שבו הנוצרות על-ידי ליגנד ייצוב של חלבון יליד בתגובה אתגר חום הוא כימות8, 9,10. זו מושגת על ידי לכימות חלבון מסיס שנותרו לאחר חשיפה אתגר חום. חשיפה ראשונית של CETSA, תספיג שימשה למטרות איתור. כדי לאפשר הקרנה קמפיינים ופגע triaging של אוספים מתחם גדול יותר, המאמצים כדי להגדיל את התפוקה של ניסויים CETSA יש להוביל להתפתחות של מבחני הומוגנית, המבוססים על microplate מספר10,11. עם זאת, מגבלה אחת באמצעות שיטות אלה היא כי הם הם המתאימים ביותר כיום לטיפול המורכב ב השעיות תא האיתור דורש פירוק התא, מוביל לאובדן מידע מרחבי. CETSA יכול להיות מיושם ניסיוניים כמו משמרת הנוצרות על-ידי ליגנד בטמפרטורה צבירת תרמי (Tagg) גם ריכוז אחד של המולקולה קטנה או ריכוז ליגנד לייצב את החלבון בטמפרטורה יחיד. האחרון נקרא במינון איזותרמי התגובה טביעות אצבעות (ITDRF) שמסמלת את התלות של מדידות אלה על תנאי ניסויי ספציפי.
המטרה של פרוטוקול זה היא כדי למדוד את ההתחייבות היעד באמצעות CETSA ב תאים חסיד על ידי זיהוי נוגדנים (אם) immunofluorescent עם מיקרוסקופ גבוהה-תוכן12. הליך זה מרחיב את הפלטפורמה CETSA המקורי כדי לאפשר את החד-תאיים כימות של היעד האירוסין עם שימור לוקליזציה subcellular. ראוי לציין, בניגוד לדיווחים קודמים רבים, בהליך זה מתחם הטיפול מתבצע בתאים חסיד חי ללא ניתוק משטח או כביסה לפני האתגר חום, וכך לשמר את האיזון מחייב הוקמה שאנו שואפים למדוד13. כיום, השיטה מאומתת עבור מטרה אחת חלבון p38α (MAPK14), תא מספר שורות, אנו מקווים כי על-ידי שיתוף הליך זה הטכניקה שניתן להחילה בהרחבה פרוטאום נמס. אנו צופים כי פרוטוקול זה ניתן להתאים לכל אורך הצינור פיתוח התרופה של ההקרנה, פגע triaging דרך כדי ניטור של היעד האירוסין ויוו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זריעה של תאים
הערה: לקבלת סקירה כללית של זרימת העבודה ראה איור 1. רשימה מפורטת של נוגדנים וחומרים זמינים את הטבלה של חומרים.
- לפני זריעה של התאים, לקדוח חורים עם מקדח רגיל במסגרת שחורה 384-ובכן הדמיה assay צלחות כדי להימנע מלהיות לכוד מתחת לצלחת מאוחר יותר במהלך השלב חימום בועות אוויר. כדי להימנע חלקיקי פלסטיק כניסה הבארות במהלך שלב זה וכדי לשמור על תנאים סטריליים, לאטום הצלחות עם רדיד אלומיניום דבק או לכסות את הצלחת לפני קידוח בשכונה תרביות רקמה. בדרך כלל, די 3 חורים בקוטר 3.5 מ מ בכל צד של הלוח (הקצר).
- הכן ספסל זרימה שכבתית על ידי ניקוי עם 70% אתנול. בעקבות טכניקות סטנדרטי תרביות רקמה aseptic, להסיר מדיה תא הבקבוק או צלחת. לשטוף תאים עם 5-10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל טריפסין הבקבוקון. דגירה. הבקבוק ב 37 ° C עד לנתק התאים A-431. לספור התאים או באמצעות מונה haemocytometer או תא. הכן תא השעיה של 50,000 תאים למ"ל במדיום תרבות.
- לוותר על 40 µL תא השעיה (ויתור צפיפות תא הסופי של 2,000 תאים לכל טוב) לתוך כל טוב של צלחת assay באמצעות מתקן ריאגנט בצובר או pipet רב-ערוצי, בהתאם קנה המידה של הניסוי. בקצרה להעביר את הצלחת מצד לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה על החלק התחתון של הלוח.
- כדי למזער תופעות צלחת-קצה, לאפשר את התאים להסתפק בחלק התחתון של הלוח assay 20 דקות בטמפרטורת החדר האחורי של מכסה המנוע זרימה שכבתית. אז, במקום את הצלחת במיכל פלסטיק עם מגבות נייר לחה כדי להבטיח אווירה לח. לפני השימוש, נגב את מיכל פלסטיק עם 70% אתנול.
- תקופת דגירה בתיבת עם לוחית וזמינותו של 2-3 ימים-37 ° C ו- 5% CO2 ב חממה humidified המקובלת. לפקח על confluency של התאים עד 50-75%, כפי מוערך על ידי בדיקה ויזואלית עם מיקרוסקופ אור.
2. טיפול מורכבות
- ביום של הניסוי, תשאף האמצעי בכל טוב בעזרת דסקית צלחת. מניחים את הצלחת על צלחת למכונת הכביסה, בחר את התוכנית השאיפה. אם דסקית צלחת אינה זמינה, ואז הנוזל ניתן להסיר על ידי היפוך לצלחת עם טוויסט יד מהירה על מגש הפסולת או כיור. הסרה מלאה של נוזל חיוני עבור ביצועים טובים. כל נוזל עודף מוסר לאחר מכן על ידי שמרחתי עם מגבות נייר.
- להוסיף 30 µL של תרכובות מדולל לריכוז הופקעו בינוני התרבות התא באמצעות dispensing אוטומטיות או פיפטה רב-ערוצי בהתאם קנה המידה של הניסוי. מבטיחים להוסיף שלילי (דימתיל סולפוקסיד) ושליטה חיובי (ליגנד ידוע) של כמה בארות שהלוח וזמינותו. מאז זה וזמינותו shift תרמי, זה הכרחי כי ריכוז מתחם חורגת קבוע דיסוציאציה להתבונן ייצוב חלבונים. לפיכך, קו מנחה קשה ריכוז מתחם פי 50 - 100 IC50, אבל יותר פירוט תיאורי עבור ריכוזים במתחם נמצאים במקטע דיון.
הערה: דימתיל סולפוקסיד והסבילות של הקווים התא צריך להיבדק לפני הניסוי. - חותם הצלחת assay שטופלו מתחם עם צלחת לנשימה לאטום, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב חממה humidified במשך 30 דקות.
3. לחמם אתגר
- ראשית, הגדר את המים הרותחים לטמפרטורה הרצויה. שימו לב כי הטמפרטורה הסופית אליה ניתן להגיע בתוך הבארות של צלחת assay יכול להיות שונה הטמפרטורה הסופי באמבט מים. לחקור את ההיסט מראש עם מד חום דמה צלחת, צמד תרמי. זה בדרך כלל לוקח 30 דקות על האמבטיה לייצב את הטמפרטורה הרצויה.
- כדי לוודא כי הטמפרטורה הרצויה היא להגיע בתוך הבארות של צלחת assay במהלך השלב חימום, להכין צלחת דמה unsealed המכיל באותו אמצעי אחסון בינוני כמו הצלחת וזמינותו.
- הסר את הצלחות וזמינותו של החממה. . תוריד את החותם לנשימה, לאטום מחדש את הצלחת assay המכילות את התאים שטופלו מתחם ברדיד אלומיניום דבק חזק על מנת להבטיח כי אין מים לדלוף לתוך הבארות במהלך החימום עוקבות באמבט מים. ודא קדיחת חורים במסגרת צלחת נגיש.
- הניחו את הצלחת assay ואת את הצלחת דמה באמבט מים עם חלקו התחתון של הלוח לכיוון פני המים כדי לאלץ את כל האוויר שנותרו בחוץ מתחת הצלחות.
- נטר את הטמפרטורה בתוך הבארות של צלחת בובה חדשה באמצעות מדחום צמד תרמי.
- מחממים את הצלחת assay באמבט מים במשך 3 דקות. מיד העברה assay וצלחת טמבל אחר המים הרותחים עם מזג חדר מים להתקרר למשך 5 דקות. הצלחת assay מוכן כעת עיבוד נוסף.
4. קיבוע
- לוותר על µL 10 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA) ישירות לצלחת assay באמצעות מתקן ריאגנט בצובר או של pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
הערה: כמה כתות ומייצבים מסווגים מסרטנים, צריכה להיות מלווה תקנות הבטיחות מוסדיים. - האחות הפתרון PFA ולשטוף את התאים עם 300 PBS µL בעזרת דסקית צלחת. מניחים את הצלחת על צלחת למכונת הכביסה, בחר את התוכנית השאיפה.
הערה: הליך זה מוטבה באמצעות פרוטוקול גלישה על צלחת למכונת הכביסה בו נוזלי הוא בו זמנית בגליל, הוסר. אם הצלחת מכונת. כביסה או הליך דומה אינה זמינה, הצעד כביסה לחלופין ניתן לבצע באופן ידני. - ידני שטיפה הליך: הסר את הנוזל מן הבארות על ידי היפוך לצלחת עם טוויסט יד מהירה על מגש הפסולת או כיור. הסרה מלאה של נוזל חיוני עבור ביצועים טובים. להוסיף µL 80 ל- PBS עם פיפטה רב-ערוצי להפוך את הצלחת שוב כמפורט לעיל, חזור על התהליך הכביסה פעמיים. לאחר שעבר כביסה, כתם את הצלחת נגד מגבות נייר נקי כדי להסיר עודפי הנוזל.
5. permeabilization
- הוסף 20 µL של 0.1% (v/v) NP-40 לבארות עם pipet רב-ערוצי, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לשטוף את התאים באמצעות ההליך אותו כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).
- לחלופין, בעת הצורך, החל אנטיגן אחזור פרוטוקול, למשל:
- להוסיף µL 20 1% למען חברה דמוקרטית הבארות עם pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ולשטוף לפי אותו הנוהל המתואר לעיל (שלב 4.2).
- מוסיפים 80 μL של גליצין 10 מ מ ב- pH 7.2, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. האחות הפתרון גליצין בעזרת דסקית צלחת על-ידי הצבת מכונת כביסה צלחת ובחירה פרוטוקול השאיפה. עיין בהערות 2.1 ו- 4.2 אם דסקית צלחת אינה זמינה.
6. חסימת
- להוסיף 15 µL של 1% (w/v) אלבומין שור (BSA) ב- PBS הבארות באמצעות מתקן ריאגנט בצובר או של pipet רב-ערוצי. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעה, או ללון ב 4 ° C בחותם צלחת רדיד אלומיניום.
7. נוגדן ראשוני
- האחות הפתרון חסימה בעזרת דסקית צלחת על-ידי הצבת מכונת כביסה צלחת ובחירה פרוטוקול השאיפה. עיין בהערות 2.1 ו- 4.2 אם דסקית צלחת אינה זמינה.
- להוסיף 10 µL של נוגדן ראשוני מדולל בהתאם 1% (w/v) BSA ב- PBS כדי הבארות באמצעות של pipet רב-ערוצי. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעה, או ללון ב 4 ° C בחותם צלחת רדיד אלומיניום.
8. משני נוגדן
- האחות הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף הבארות לפי ההליך כמתואר לעיל (שלב 4.2).
- להוסיף 10 µL של אלקסה 488 נוגדנים משניים מדולל בהתאם 1% (w/v) BSA ב- PBS. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאטום את הצלחת החותם רדיד אלומיניום דבק כדי להגן מפני אור.
הערה: להגן על צלחת מאור במהלך זה והשלבים הבאים.
9. גרעיני מכתים ומסיכת תא
- להוסיף 10 µL של גרעיני צבע מדולל עד 0.05 מ"ג/מ"ל ב- PBS כדי הבארות באמצעות של pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות נוספות.
- האחות של נוגדנים משניים והפתרון Hoechst ולשטוף הבארות באמצעות ההליך אותו כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).
- להוסיף 10 µL של מסיכת תא מדולל כדי 200 ng/mL ב- PBS כדי הבארות באמצעות pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
- האחות הפתרון מסכת תא ולשטוף הבארות באמצעות ההליך אותו כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).
- לוותר על µL 60 ל- PBS כדי כל הבארות באמצעות צלחת למכונת הכביסה, מתקן ריאגנט בצובר או של pipet רב-ערוצי, לאטום הצלחות עם רדיד אלומיניום דבק.
10. תמונה רכישה וניתוח
- ללכוד תמונות ב- imager תוכן גבוהה באמצעות ערוצי פלורסנט 3: דאפי (387/447), ה-GFP (472/520) ו TexasRed (562 624). רוכשים 4 תמונות לכל טוב באמצעות המטרה X 10. שימוש אוטומטי לייזר פוקוס אוטומטי ולהחיל binning 2 במהלך הרכישה. לאחסן תמונות כקובצי tiff בקנה מידה 16 סיביות, אפור יחד עם מטה-נתונים.
- ניתוח תמונות בעזרת תוכנה הזמינים. זיהוי גבולות התא באמצעות אלגוריתם תא מניה עם דאפי (גרעין) TexasRed (ציטופלזמה).
- לחלץ את העוצמה הממוצעת עבור כל אורכי הגל רכשה עבור ניתוח נתונים נוסף.
- לחשב את הגורם-Z כדי להבטיח את היציבות של וזמינותו.
- לחשב מייצב % באמצעות הנוסחה הבאה: 100 * (1-(עוצמת טוב – שליטה שלילי ממוצע עוצמת טוב) / (ממוצע עוצמת אינטנסיביות שליטה-ממוצע חיובי שליטה שלילי)). הנה שליטה שלילי דימתיל סולפוקסיד והוא בקרה חיובית החומר הפניה. מאז ייצוב המרבי בין תרכובות יכול להשתנות, למעשה להיות גדול מ הפקד חיובי עבור עיקולים ITDRF, עוצמות המזערי והמרבי מייצב עבור כל המתחם משמשים לפעמים במקום ערכי העוצמה של הבארות שליטה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול המתוארים באיור 1 מתאר את זרימת העבודה הבסיסי עבור הפעלת מבחני CETSA על תאים חסיד עם זיהוי של חלבון מסיס שנותרו על ידי הדמיה תוכן גבוהה. זרימת עבודה זו ניתן להתאים בקלות בכל שלבי ההתפתחות assay על-ידי שינוי הפריסה צלחת של תרכובות או ריאגנטים14. אנחנו פירוט התוצאות הצפויות כמה צפוי להשתמש במקרים שלהלן.
זיהוי נוגדנים ופיתוח וזמינותו. תנאי הכרחי לקבלת תוצאות מוצלחות הוא הזיהוי של נוגדן ראשוני או אחרים ריאגנט זיקה מתאימים באופן סלקטיבי מזהה את טופס מקורי של החלבון בנוכחות החלבון צבור, זירז נוצר במהלך החום אתגר בשלב 3. כדי ליצור CETSA וזמינותו הדמיה המתוארים כאן, הוקרנו פאנל של נוגדנים 9 מיקוד p38α ב 52° C עבור האות חלון בין הפקדים חיוביים ושליליים. אנחנו לאחר מכן טיטרציה נוגדנים הטובים ביותר, התיישבו על תנאי שמוצג באיור 2 A, B עם נציג immunofluorescence תמונות עבור p38α מיוצב על ידי של ליגנד ידוע (בקרה חיובית) דימתיל סולפוקסיד (בקרה שלילית). זיהוי נוגדנים צריך גם לא להיות מובסים בגלל השינויים הסתגלותי של החלבון יעד זה עשוי להיגרם על ידי ליגנד מחייב (איור 2C). לדוגמה, BIRB796 יש הרבה זמן את קצב, כימות של היעד אירוסין הייתה אפשרית רק על-ידי החלת שלב האחזור אנטיגן (5.2; איור דו-ממדי). חשוב לאמת את הביצועים של נוגדן ראשוני עם ידוע ליגנדים המכסה אתרי קישור שונים של החלבון היעד אם הם זמינים. האימות נוגדן רצוי נעשה גם עם וגם בלי השלב אחזור אנטיגן.
Tagg ועיקולים ITDRF. כפי שהוזכר לעיל, ניתן להפעיל את הניסויים CETSA בשני מצבים שונים, Tagg עקומות, ניסויים ITDRF. שתי גרסאות לנצל באותו פרוטוקול בסיסי המתוארים באיור 1 ובמקטע פרוטוקול. בכיוונון הראשונה, המטרה היא לאתגר את התאים במילוי הדרגתי טמפרטורת ולהשוות את עקומותagg T ב הנוכחות ואת היעדר ריכוז יחיד של ליגנד. כדי לבצע עיקולagg T, צלחות נפרדות מחוממים במשך 3 דקות על פני מגוון רחב של טמפרטורות. בביצוע הניסוי הזה, חשוב זמן אורך הטיפול מורכב כל צלחת עם הזמן שלוקח לאמבט מים לייצב את הטמפרטורה חדש. בהקשר זה, בנתונים של האתגר חום צעד באמבט מים הוא זמן רב יותר מאשר חימום צינורות במכונת ה-PCR. הנתיב ניסיוני הוא לעקומות התגובה ריכוז הריצה הבא של ליגנד בטמפרטורה קבועה להפקת העקומות ITDRF. באופן כללי, בעת בדיקת מספר תרכובות, וזמינותו לוחות מוכנים עבור תוספת מורכבות מוכנות באמצעות טיפול בנוזלים אוטומטית כדי להשיג את הנתונים ביותר לשחזור. תרכובות באופן סדרתי מעורבבת עם דימתיל סולפוקסיד, מומס ואז תא תרבות המדיה ריכוזי הרצוי. בדרך כלל בדקנו 11 נקודת ריכוז הסדרה החל מ- 50-100 מיקרומטר, דילול קיפול 3 או 4, אבל זה תלוי בעצמת ליגנדים בשימוש. מומלץ קודם לבסס את עקומתagg T הן היעדרות ונוכחות של ליגנד ובחרו את הטמפרטורה לניסויים הבאים איזותרמי שבו יכול להיות שנצפו משמרת בין העקומות. הטמפרטורה שנבחר צריך להיות מסביב או מעל את Tקנאה. שני הפורמטים תאפשר לאישור של היעד אירוסין אך על הדירוג של הזיקות תרכובת ITDRF הניסויים הם לעתים קרובות יותר מתאימים. איור 3A מציג המחשה של תוצאות כימות הצפויה עיקולagg T, איור 3B מכמתת את התוצאות של ניסוי ITDRF טיפוסית.
הקרנת הקמפיין. הפרוטוקול ניתן גם להתאים הקרנת קמפיינים כדי לזהות קלסרים הרומן של החלבון היעד. במקרה זה, חום איזותרמי אתגרים מוחלים על מספר רב של תרכובות-ריכוז יחיד ואחריו ITDRF ניסויים עבור תרכובות ייצוב שזוהה. אנו מכינים צלחות ההקרנה מוכן assay, להעביר את תרכובות מעורבבת עם תרבות המדיה באמצעות טיפול בנוזלים אוטומטית הלוחות assay. כמו עם כל מבחני יציבות תרמית, יש צורך לחרוג קבוע דיסוציאציה להתבונן ייצוב חלבונים, ובכך אנחנו החלת ספריות מולקולה קטנה ב 50 מיקרומטר, כדי להקל על זיהוי פגע. Triaging של מכה באמצעות ITDRF יאפשר מאוחר יותר הדירוג וסדרי תרכובות אלה. איור 4 מראה תוצאה נציג מצלחת ההקרנה.
איור 1 . סקירה סכמטי של הפרוטוקול המתואר במאמר זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . זיהוי נוגדנים ופיתוח וזמינותו. A) נתוני לדוגמה גילוי של האדם p38α בתאים A-431. להחליפן בתמונות החיוביים (1 מיקרומטר AMG548) ושלילי (דימתיל סולפוקסיד) פקדים. אדום - צביעת Hoechst גרעינית, ירוק-p38α מכתים. תמונות שצולמו עם 10 X הגדלה; סרגל קנה מידה לבן מייצג 73 מיקרומטר. B) דוגמה של כימות הנתונים המבוטא תא בעוצמה ממוצעת. קווי שגיאה מייצגים שגיאת תקן של ממוצע של 16 משכפל עבור 6 צלחות נפרדות. כל צלחת היה מחומם ל 52 ° C באמבט מים ואחריו קיבוע של תאים, permeabilization, immunostaining הבאים. עוצמת אות ג) Immunofluorescence נמדד לאחר טיפול A-431 תאים עם 1 מיקרומטר BIRB796 או דימתיל סולפוקסיד כמתואר לעיל שנשמעו קיבעון. בהיעדר צעד חימום, האות BIRB796 הוא נמוך יותר מאשר האות דימתיל סולפוקסיד, רומז כי BIRB796 משבשת את הגילוי של p38α עם נוגדן זה. ד) ITDRFCETSA עקומות עבור תאים שטופלו BIRB796 או עם (משולש כחול) או בלי פרוטוקול אחזור אנטיגן (משולש אפור). איור זה השתנה מ. ואח 2018 Axelsson12. זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . צבירת תרמי ו ITDRF ניסויים. א) צבירת תרמי עקומת ניסויים עבור תאים שטופלו חיובי (1 מיקרומטר AMG548, ב orange) ושלילי פקדים (דימתיל סולפוקסיד באפור). קווי שגיאה מייצגים שגיאת תקן של ממוצע של 32 או 464 משכפל. ב) ITDRFCETSA ניסוי שבוצעה ב 52 ° C עבור תאים שטופלו דילולים טורי של SB203580 בכחול, Skepinone-L בירוק, RWJ67657 באדום. קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע של משכפל 6. כימות הנתונים המבוטא תא בעוצמה ממוצעת, מנורמל נגד הריכוז הגבוה ביותר של המתחם בהתאמה. איור זה השתנה מ. ואח 2018 Axelsson12. זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . סקירה נציג של צלחת ההקרנה בהגדלה X 10- פקדים חיובי (1 מיקרומטר AMG548) נמצאים בעמודות 2 ו- 24, פקדים שלילי (דימתיל סולפוקסיד) נמצאים בעמודות 1 ו- 23. כל בארות אחרים מכילים 50 מיקרומטר של תרכובות ספריית בשימוש להקרנה עם מספר להיטים מסומן. הדמויות שיבוץ, מייצג הקו הלבן בפינה הימנית התחתונה 200 מיקרומטר. איור זה השתנה מ. ואח 2018 Axelsson12. זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי שפורט בסעיף התוצאות, ישנם מספר שלבים מרכזיים להליך. ראשית, חשוב לזהות ריאגנט זיקה באיכות גבוהה. אנו ממליצים על הקרנת ספרייה קטנה של נוגדנים עבור כל מטרה רצויה. לאחר שנבחר נוגדן ראשוני, חשוב גם לאמת את המערכת עבור מספר אתרי קישור שונים של חלבון היעד במידת הצורך. הקרנה הנגד של תרכובות מפריע לאות assay, כפי שמוצג באיור 2C על-ידי השמטת האתגר חום הוא מעודדים. כאשר אות מופחת בנוכחות של ליגנד נצפית, פרוטוקול אחזור אנטיגן כפי שמתואר בשלב 5.2 יכול להיבדק. חימום לא אחיד של הלוחות יכול לגרום לתנודות ולשינויים צלחת-כדי-צלחת הנתונים שנמדדו. מאז הלוחות חלקית טובע בתוך אמבט מים במהלך האתגר החום חולף (שלב 3.4) הבארות החיצוני של הלוחות נחשפים המים החמים לא רק בחלק התחתון של הבארות אלא גם דרך הקיר החיצוני. זה עלול לגרום טמפרטורה גבוהה יותר באותה תקופה ועלייתו בבארות החיצוני של צלחת, צלחת עוקבות אפקטי קצוות. לכן, מומלץ להימנע הבארות החיצוני של הצלחת. ניתן לראות תופעות דומות אם בועות אוויר לכוד מתחת לצלחת במהלך השלב חימום מניעת מספיק מגע בין המים החמים והחלק התחתון של הבארות. לאור האתגרים עם חימום צלחות הדמיה, צלחות שנעשו במיוחד עבור חשיפה לחום, התקנים יכול לעזור לקדם שיטה זו. אנחנו בחנו את השימוש במספר שורות תאים, ומצאו השתנות מצורף משטח את האתגר חום עבור סוגי תאים חסיד. ראשוני ניסויים במעבדה שלנו מראים כי השימוש של מטריצה חוץ-תאית או ציפוי כגון Synthemax II-SC או תא-טאק באפשרותך למזער ניתוק התא, אבל זה יכול להוות אתגר טכני בעת שימוש סוגי תאים למחצה המצורפת. מאז הטיפול המורכב מבוצעת בתאים חיים, מולקולות קטנות חייב להיות הסלולרי חדיר. אם המתחם אינה קרום חדיר, תפוקה גבוהה חלופי CETSA שיטות מומלצות. תרכובות מסוימות צריך להיות מופעל סמויה כדי לאגד שלהם חלבונים היעד11. במקרים אלו, מומלץ יותר תאים טיפול עם המתחם לפני האתגר חום.
פרוטוקול זה דורש לוח אחד מן התא seeding כדי הדמיה הפיכתה נוטה תפוקה גבוהה הקרנת קמפיינים. מספר התאים עבור ניסוי נמוכים בהרבה ניתן להשיג עם שהכלים המערבי או מבחני הקודם AlphaScreen15. יתר על כן, כביסה או שלבים ניתוק התא, אשר עשוי לשנות זמינות תרכובת של האיגוד, מוסרים, לשמר את האיזון מחייב הוקמה דרך השלב אתגר חום. בניגוד שגרות קודמות, חוסר אות עקב cytotoxicity בו זמנית מדווח על ידי צביעת גרעינית. לבסוף, הדמיה משמר את הרזולוציה המרחבית של תאים נפרדים, ומאפשר למדידות האירוסין היעד אוכלוסיות מעורבות של תאים או תא הברית.
להעריך באמת את הישימות של הגישה, ולאחד מאמצים למיגור ולחול בטכניקה פרוטאום ההיתוך נחוצים. בניסויים כאלה עושים נבאר להקל על זיהוי זיקה מתאימים ריאגנטים, אילו ח באופן סלקטיבי על החלבון יליד בנוכחות הנותרים שפגע בסימני ומצטברים חלבונים. כיום אין אנו יודעים כיצד רמות ביטוי החלבון ישפיעו על היכולת למדוד באופן מהימן חלון אות. אנו מצפים זאת כדי לשקף אהדה ואת מידת הבררנות של נוגדנים זמינים, ותצפה כי חלבונים בשפע נמוך טכנולוגיות בשימוש כדי לשפר את האות מבחני immunofluorescent תהיה ישימה. לחלופין, חלבונים מתויגות או תרכובות functionalized יכול לשמש בזיהוי גרסאות של הפרוטוקול המתואר. פרוטוקול זה הוא מוגבל מטרות להמיס ועל האינטראקציות בו יכול להיות שנצפו ייצוב לכימות. לדוגמה, אנדוגני ליגנדים שמסוגל. לייצב את מבחני תא חי, אשר עשוי למנוע ייצוב נוסף על-ידי ליגנד אקסוגני חלבון. אמנם לא בחנו כאן, אנו מאמינים שזה יהיה ניתן מולטיפלקס הקריאות הבאות כדי לאפשר את המחקר של מטרות מרובות בו-זמנית, או יעד עם effectors במורד הזרם. מחקרים נוספים נחוצים לחקור היבטים אלה של בחיי עיר CETSA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין גילויים לדווח.
Acknowledgments
המחברים להכיר תשתית תמיכה מן המדע החיים מעבדה קרולינסקה Institutet. המחברים להכיר גם קלט ודיונים עם מיכאלה Vallin, מגדלנה Otrocka, תומאס Lundbäck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
- Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
- Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
- Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H.
- Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
- Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
- Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
- Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
- Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).
