Summary
Metingen van de drug target betrokkenheid staan centraal in effectieve Geneesmiddelenontwikkeling en chemische sonde validatie. Hier, detail we een protocol voor het meten van de drug-target engagement met behulp van hoge inhoud imaging in een microplate-compatibele adaptie van de cellulaire thermische shift test (CETSA).
Abstract
Quantitating van de interactie van kleine moleculen met hun beoogde eiwit-doelstelling is essentieel voor de Geneesmiddelenontwikkeling, doel validatie en chemische sonde validatie. Methodes die het meten van dit verschijnsel zonder wijziging van het eiwit doel of klein molecuul zijn bijzonder waardevol, hoewel technisch uitdagende. De cellulaire thermische shift test (CETSA) is een techniek om te controleren de betrokkenheid van de doelgroep in levende cellen. Hier beschrijven we een aanpassing van de originele CETSA-protocol, waarmee een hoge doorvoersnelheid metingen met behoud van subcellular localisatie op het niveau van één cel. Wij geloven dat dit protocol biedt belangrijke vorderingen op de toepassing van CETSA voor diepgaande karakterisering van samengestelde doelsoort interactie, met name in heterogene populaties van cellen.
Introduction
Bij het ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen of chemische sondes er absoluut voor het koppelen van de waargenomen farmacologisch effect of functionele uitlezing aan metingen van doel bezetting of engagement in levende cellen1,2,3. Deze gegevens zijn nodig om ervoor te zorgen dat de kleine molecule in feite haar gewenste doel bereikt, zowel voor het valideren van de biologische hypothese achter eiwit target selectie4,5. Bovendien, tijdens Geneesmiddelenontwikkeling, modelsystemen van toenemende complexiteit worden gebruikt om te selecteren en bevestigen van een voorsprong samengestelde voorafgaand aan klinische proeven. Om te bevestigen vertaling van biologie over deze preklinische systemen, zijn methoden voor het traceren van drug-target engagement en bijbehorende biologie in dit ontwikkelingsproces kritisch.
Drug-target engagement is van oudsher uitdagend om te controleren in levende cellen met unfunctionalized kleine moleculen en proteïnen, vooral op het niveau van de eencellige met ruimtelijke resolutie6,7. Een recente methode voor het waarnemen van de interactie tussen ongewijzigd drugs en eiwitten in levende cellen is de cellulaire thermische shift test (CETSA) waarin ligand-geïnduceerde stabilisatie van een natuurlijk eiwit in antwoord op de uitdaging van een warmte is gekwantificeerde8, 9,10. Dit wordt bereikt door het kwantificeren van de resterende oplosbaar eiwit na blootstelling aan een uitdaging van de warmte. In de eerste vermelding van CETSA, werd westelijke vlek gebruikt voor de detectie. Om te schakelen van screening campagnes en sloeg triaging van grotere samengestelde collecties, hebben inspanningen om de doorvoer van CETSA experimenten geleid tot de ontwikkeling van verschillende homogene, microplaat assays10,11. Echter, een beperking met deze methoden is dat zij momenteel het best voor samengestelde behandeling in cel suspensies geschikt zijn en de detectie lysis van de cel vereist, wat leidt tot verlies van ruimtelijke informatie. CETSA kan worden toegepast in experimenteel als een ligand-geïnduceerde verschuiving in thermische aggregatie temperatuur (Tagg) op een enkele concentratie van het kleine molecuul of het ligand nodig om te stabiliseren van het eiwit bij een interne temperatuur. De laatste heet isothermische dosis reactie vingerafdrukken (ITDRF) om aan te duiden van de afhankelijkheid van deze metingen op de specifieke experimentele omstandigheden.
Het doel van dit protocol is voor het meten van betrokkenheid van de doelgroep met behulp van CETSA in Adherente cellen door immunefluorescentie (IF) antistofdetectie met hoge-inhoud microscopie12. Deze procedure strekt zich uit van de oorspronkelijke CETSA platform te maken voor eencellige kwantificering van target engagement met behoud van subcellular localisatie. Met name, in tegenstelling tot vele eerdere verslagen in deze procedure samengestelde behandeling wordt uitgevoerd in levende Adherente cellen zonder oppervlakte detachement of wassen vóór de uitdaging van de warmte, dus het behoud van het evenwicht van de vastgestelde bindende willen we meten van13. Op dit moment de methode is gevalideerd voor één doel eiwit p38α (MAPK14) in verschillende cellijnen, en we hopen dat door het delen van deze procedure de techniek kan worden toegepast in grote lijnen op de smeltende Proteoom. Wij verwachten dat dit protocol kan worden aangepast in de drug ontwikkeling pijpleiding van screening, hit triaging via toezicht op target engagement in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. het zaaien van de cellen
Opmerking: Zie afbeelding 1voor een algemeen overzicht van de werkstroom. Een gedetailleerde lijst van materialen en reagentia zijn beschikbaar in de Tabel van materialen.
- Vóór het zaaien van de cellen, boorgaten met een standaard boor in het kader van zwarte 384-well imaging assay platen om luchtbellen wordt gevangen onder de plaat later tijdens de stap van de verwarming. Om te voorkomen dat plastic deeltjes invoeren van de putten tijdens deze stap en te handhaven van de steriele condities, verzegelen van de platen met een zelfklevende aluminiumfolie of de afdekplaat vóór het boren in de kap van een weefselkweek. Meestal volstaan met 3 gaten met een diameter van 3,5 mm op elk van de kant van de plaat (korte zijde).
- Bereid een laminaire flow-bench door reiniging met 70% ethanol. Na standaard aseptische weefselkweek technieken, media uit cel kolf of afwasmiddel te verwijderen. Wassen van cellen met 5-10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg vervolgens 2 mL trypsine in de kolf. Incubeer de kolf bij 37 ° C, totdat de A-431 cellen los. Cellen tellen hetzij met behulp van een haemocytometer of cel teller. Bereid een celsuspensie van 50.000 cellen/mL in een cultuurmedium.
- Afzien 40 µL celsuspensie (het geven van een definitieve celdichtheid van 2.000 cellen per putje) in elk putje van de plaat van een bepaling met behulp van een bulk reagens dispenser of een meerkanaals Pipetteer, afhankelijk van de omvang van het experiment. Kort gaan de plaat van links-naar-rechts verspreiden van cellen gelijkmatig over de bodem van de plaat.
- U wilt minimaliseren plaat-randeffecten, de cellen te vestigen op de onderkant van de plaat assay gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in de achterkant van de kap laminaire flow toestaan. De plaat dan in een plastic container met vochtig keukenpapier om ervoor te zorgen een vochtige atmosfeer te plaatsen. Vóór gebruik, veeg de plastic container met 70% ethanol.
- Incubeer de doos met de plaat assay voor 2-3 dagen bij 37 ° C en 5% CO2 in een conventionele bevochtigde incubator. Monitor confluentie van de cellen tot 50-75%, zoals beoordeeld door visuele inspectie met een lichte Microscoop.
2. samengestelde behandeling
- Op de dag van het experiment, gecombineerd het medium van elk goed met een plaat wasmachine. Plaats de plaat op de plaat wasmachine en selecteer het programma dat streven. Als een plaat wasmachine niet beschikbaar is, kan dan de vloeistof worden verwijderd door het omkeren van de plaat met een snelle hand twist over een afval lade of een wastafel. Volledige verwijdering van de vloeistof is essentieel voor goede prestaties. Eventuele overtollige vocht wordt vervolgens verwijderd door te deppen met keukenpapier.
- Voeg 30 µL van verbindingen verdund tot de geëigende concentratie in cel kweekmedium met behulp van geautomatiseerde verstrekking of een meerkanaalspipet afhankelijk van de omvang van het experiment. Zorgen om toe te voegen een negatieve (DMSO) en de positieve (bekende ligand) controle aan diverse putjes op elke plaat assay. Aangezien dit een thermische shift test is, is het noodzakelijk dat de samengestelde concentratie overschrijdt de dissociatieconstante om te zien hoe de stabilisatie van het eiwit. Dus een ruwe leidraad voor samengestelde concentratie is 50 - 100 keer de IC50, maar meer detail beschrijvingen voor samengestelde concentraties zijn te vinden in de sectie discussie.
Opmerking: DMSO verdraagbaarheid van de cellijnen moet voor het experiment worden getest. - Zegel de compound-behandelde assay-plaat met een ademende plaat zegel en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator gedurende 30 minuten.
3. warmte uitdaging
- Stel eerst het waterbad tot de gewenste temperatuur. Merk op dat de definitieve temperatuur die wordt bereikt binnen de putjes van de plaat assay van de eindtemperatuur in het waterbad afwijken kan. De offset vooraf onderzoeken met een dummy plaat en thermokoppel thermometer. Meestal duurt het 30 minuten voor het bad te stabiliseren op de gewenste temperatuur.
- Voorbereiden om te controleren dat de gewenste temperatuur is bereikt in de putjes van de plaat assay tijdens de stap van Verwarming, een onverharde dummy plaat met hetzelfde volume van medium als de assay-plaat.
- Verwijder de assay platen uit de incubator. Het ademende zegel opstijgen en opnieuw verzegelen de assay plaat met de compound-behandelde cellen met een strakke zelfklevende aluminiumfolie om ervoor te zorgen dat geen water in de putjes zal lek tijdens de daaropvolgende Verwarming in het waterbad. Ervoor zorgen dat de geboorde gaten in de plaat frame toegankelijk zijn.
- Plaats de assay-plaat en de dummy plaat in het waterbad met de onderkant van de plaat schuin naar het wateroppervlak te dwingen alle resterende lucht uit onder de platen.
- Controleer de temperatuur in de putten van een nieuwe dummy plaat met behulp van een thermokoppel thermometer.
- De plaat van de bepaling in het waterbad gedurende 3 minuten verwarmen. De assay en dummy plaat onmiddellijk overbrengen naar een ander waterbad met kamer-tempered water gedurende 5 minuten afkoelen. De assay plaat is nu klaar voor verdere verwerking.
4. fixatie
- 10 µL 16% (m/v) paraformaldehyde (PFA) rechtstreeks naar de plaat van de bepaling met behulp van een bulk reagens dispenser of een meerkanaals Pipetteer afzien. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
Opmerking: Sommige fixatives zijn ingedeeld als kankerverwekkend en institutionele veiligheidsvoorschriften moeten worden gevolgd. - De PFA-oplossing gecombineerd en spoel de cellen met 300 µL PBS met behulp van een plaat-wasmachine. Plaats de plaat op de plaat wasmachine en selecteer het programma dat streven.
Opmerking: Deze procedure is geoptimaliseerd met behulp van een overloop-protocol op de plaat wasmachine waarin vloeistof wordt tegelijkertijd afgezien en verwijderd. Als een plaat wasmachine of soortgelijke procedure niet beschikbaar is, kan de wassen stap ook handmatig worden gedaan. - Handmatig wassen procedure: Verwijder de vloeistof uit de putten door het omkeren van de plaat met een snelle hand twist over een afval lade of een wastafel. Volledige verwijdering van de vloeistof is essentieel voor goede prestaties. Voeg 80 µL van PBS met een meerkanaalspipet en omkeren van de plaat weer zoals hierboven beschreven, herhaalt u de procedure wassen twee keer. Na de laatste wash, DEP de plaat tegen schone papieren handdoeken te verwijderen van de overtollige vloeistof.
5. permeabilization
- Voeg 20 µL van 0,1% (v/v) NP-40 de putjes met een multichannel Pipetteer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Wassen van de cellen met dezelfde procedure als hierboven (stap 4.2) beschreven.
- Als alternatief, indien nodig, een antigeen ophalen protocol, bijvoorbeeldtoepassen:
- Voeg 20 µL van 1% SDS de putjes met een multichannel Pipetteer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en wassen volgens dezelfde procedure (stap 4.2) bovenstaande.
- Voeg 80 μL van 10 mM glycine bij pH 7,2 en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gecombineerd de glycine-oplossing met behulp van een plaat wasmachine door te plaatsen op de plaat wasmachine en de aspiratie-protocol te selecteren. Zie notities in 2.1 en 4.2 als een plaat wasmachine niet beschikbaar is.
6. blokkeren
- Voeg 15 µL van 1% (m/v) bovien serumalbumine (BSA) in PBS de putjes met behulp van een bulk reagens dispenser of een meerkanaals Pipetteer. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, of 's nachts bij 4 ° C met een aluminiumfolie plaat zegel.
7. primair antilichaam
- Gecombineerd de blokkerende oplossing om met een plaat wasmachine door te plaatsen op de plaat wasmachine en de aspiratie-protocol te selecteren. Zie notities in 2.1 en 4.2 als een plaat wasmachine niet beschikbaar is.
- Voeg 10 µL van primair antilichaam verdund dienovereenkomstig in 1% (m/v) BSA in PBS de putjes met behulp van een meerkanaals Pipetteer. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, of 's nachts bij 4 ° C met een aluminiumfolie plaat zegel.
8. secundair antilichaam
- Het primaire antilichaam-oplossing gecombineerd en was de putjes goed volgens dezelfde procedure als hierboven (stap 4.2) beschreven.
- Voeg 10 µL van secundair antilichaam Alexa 488 verdund dienovereenkomstig in 1% (m/v) BSA in PBS. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Het zegel van de plaat met een zelfklevende aluminiumfolie afdichting te beschermen tegen licht.
Opmerking: Bescherming van de plaat boven licht tijdens deze en de volgende stappen.
9. nucleaire kleuring en cel masker
- Voeg 10 µL van nucleaire kleurstof verdund tot 0,05 mg/mL in PBS de putjes met behulp van een meerkanaals Pipetteer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten extra.
- Het secundaire antilichaam en Hoechst oplossing gecombineerd en was de putjes goed gebruik van dezelfde procedure als hierboven (stap 4.2) beschreven.
- Voeg 10 µL van cel masker verdund tot 200 ng/mL in PBS de putjes met behulp van een meerkanaals Pipetteer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- De cel masker oplossing gecombineerd en was de putjes goed gebruik van dezelfde procedure als hierboven (stap 4.2) beschreven.
- Afzien van 60 µL van PBS aan alle putjes met behulp van de plaat wasmachine, een bulk reagens dispenser of een meerkanaals Pipetteer, en verzegel de platen met een zelfklevende aluminiumfolie.
10. het beeld van verwerving en analyse
- Vastleggen van beelden op een hoge inhoud imager met behulp van 3 TL kanalen: DAPI (387/447), GFP (472/520) en TexasRed (562/624). 4 beelden per putje 10 X streven naar betere coördinatie te verwerven. Gebruik van geautomatiseerde laser autofocus en breng 2 weggooien tijdens overname. Afbeeldingen opslaan als TIFF-bestanden van de 16-bits, grijze schaal samen met metadata.
- Analyseren van beelden met behulp van beschikbare software. Identificeren celbegrenzing met behulp van een algoritme cel scoren met DAPI (nucleus) en TexasRed (cytoplasma).
- Uittreksel gemiddelde intensiteit voor alle verworven golflengten voor verdere gegevensanalyse.
- Berekenen van de Z-factor om ervoor te zorgen de robuustheid van de bepaling.
- % Stabilisatie met de volgende formule berekenen: 100 * (1-(goed intensiteit – gemiddelde goed intensiteit negatieve controle) / (gemiddelde intensiteit positieve controle-gemiddelde intensiteit negatieve controle)). Hier negatieve controle wordt DMSO en positieve controle is de referentiestof. Aangezien de maximale stabilisatie tussen verbindingen kan variëren en in feite groter zijn dan de positieve controle voor ITDRF curven, worden de maximale en minimale stabilisatie intensiteiten voor elke verbinding soms gebruikt in plaats van de intensiteitswaarden van de controle-putten .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol dat is uiteengezet in Figuur 1 beschrijft de fundamentele workflow voor het uitvoeren van CETSA assays op Adherente cellen met opsporing van resterende oplosbaar eiwit door hoge inhoud imaging. Deze werkstroom kan gemakkelijk aan te passen op alle stadia van de ontwikkeling van de bepaling worden door aanpassing van de indeling van de plaat van de verbindingen of reagentia14. We detail verwachte resultaten voor verschillende verwacht hieronder gebruiksvoorbeelden.
Antilichaam identificatie en bepaling ontwikkeling. Een voorwaarde voor succesvolle resultaten is de identificatie van een primair antilichaam of andere geschikte affiniteit reagens dat selectief de oorspronkelijke vorm van het eiwit in aanwezigheid van de geaggregeerde en neergeslagen eiwitten gevormd tijdens de voorronde herkent daag in stap 3. We gescreend om vast te stellen de CETSA imaging assay hier beschreven, een panel van 9 antilichamen gericht op p38α bij 52° C voor signaal venster tussen de positieve en negatieve controles. Vervolgens de beste antilichamen getitreerd en verrekend op de voorwaarden die zijn weergegeven in Figuur 2 , A, B , met vertegenwoordiger immunofluorescentie beelden voor p38α gestabiliseerd door een bekende ligand (positieve controle) en DMSO (negatieve controle). Antilichaam erkenning moet ook niet worden verstoord door de conformationele veranderingen van het target-eiwit dat kan worden veroorzaakt door ligand bindende (figuur 2C). Als voorbeeld, BIRB796 heeft een lange weg tarief en kwantificering van target engagement was slechts mogelijk door toepassing van een antigeen ophalen stap (5.2; Figuur 2D). Het is belangrijk voor het valideren van de prestaties van het primaire antilichaam met bekende liganden voor verschillende bindende plaatsen van het doel-eiwit, indien beschikbaar. De antilichaam-validatie gebeurt bij voorkeur zowel met als zonder het antigeen ophalen stap.
Tagg en ITDRF curven. Zoals hierboven vermeld, kunnen CETSA experimenten worden uitgevoerd in twee verschillende modi, Tagg curven en ITDRF experimenten. Beide varianten gebruiken de zelfde basisprotocol beschreven in Figuur 1 , en in de sectie protocol. In de eerste setup is het doel de cellen met een temperatuurgradiënt uitdaging en vergelijken de Tagg bochten in de aanwezigheid en de afwezigheid van een interne concentratie van ligand. Voor het uitvoeren van een Tagg curve, worden afzonderlijke platen verhit gedurende 3 minuten in een heel scala van temperaturen. Bij het uitvoeren van dit experiment, is het belangrijk om de tijd van de samengestelde behandeling lengte voor elke plaat met de tijd die nodig is voor het waterbad te stabiliseren tot de nieuwe temperatuur. In dit verband is peforming de warmte uitdaging stap in het waterbad meer tijd in beslag dan de verwarming van de buizen in een PCR-machine. Het experimentele pad is aan volgende run concentratieresponskrommen voor een ligand bij een vaste temperatuur voor het genereren van de ITDRF curven. In het algemeen, bij het testen van meerdere verbindingen, zijn assay klaar platen voor de samengestelde toevoeging bereid met behulp van geautomatiseerde vloeibare behandeling om de meest reproduceerbare gegevens. Verbindingen zijn serieel verdund in DMSO en vervolgens opgelost in cel voedingsbodems op de gewenste concentratie. Wij hebben meestal 11 punt concentratie serie basisgewicht van 50-100 µM in 3 of 4 vouw verdunning getest, maar dit hangt af van de sterkte van de liganden gebruikt. Het is aangeraden om eerst de Tagg curve zowel in afwezigheid en aanwezigheid van een ligand en selecteer de temperatuur voor latere isothermische experimenten waar een verschuiving tussen de bochten kan worden waargenomen. De geselecteerde temperatuur moet rond of net boven de Tagg. Beide formaten voor bevestiging van de betrokkenheid van de doelgroep maar voor ranking van samengestelde affiniteiten ITDRF experimenten zijn vaak meer geschikt. Figuur 3A geeft een illustratie van de verwachte gekwantificeerde resultaten voor een Tagg curve en figuur 3B kwantificeert resultaten van een typische ITDRF experiment.
Screening van de campagne. Het protocol kan ook worden aangepast aan de screening van campagnes ter identificatie van de roman bindmiddelen van het target-eiwit. In dit geval, worden isothermische warmte uitdagingen toegepast voor een groot aantal verbindingen op een enkele concentratie gevolgd door ITDRF experimenten voor geïdentificeerde stabiliserende verbindingen. Wij bereiden assay klaar screening platen en overdracht van de verbindingen verdund in kweekmedia aan de platen van de bepaling met behulp van geautomatiseerde liquid handling. Zoals met alle thermische stabiliteit testen, is het nodig te overschrijden de dissociatieconstante om te observeren eiwit stabilisatie, en dus we hebben toegepast klein molecuul bibliotheken op 50 µM om hit identificatie te vergemakkelijken. Triaging van de hits met behulp van ITDRF kan hoger geklasseerd en prioritering van deze verbindingen. Figuur 4 toont een representatief resultaat uit een plaat van de screening.
Figuur 1 . Schematisch overzicht van de in dit artikel beschreven protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Kwalitatieve en kwantitatieve analyse ontwikkeling van het antilichaam. A) voorbeeldgegevens voor detectie van menselijke p38α in de A-431 cellen. Representatieve beelden van positief (1 µM AMG548) en negatieve (DMSO) controles. Red - nucleaire Hoechst kleuring, groen-p38α kleuring. Beelden genomen met 10 X vergroting; de witte schaal staaf vertegenwoordigt 73 µm. B) voorbeeld van gekwantificeerde gegevens uitgedrukt als gemiddelde intensiteit/cel. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde van 16 replicatieonderzoeken voor 6 afzonderlijke platen. Elke plaat werd verwarmd tot 52 ° C in een waterbad gevolgd door fixatie van de cellen, de permeabilization en de daaropvolgende immunokleuring. C) immunofluorescentie signaalsterkte gemeten na behandeling van de A-431 cellen met 1 µM BIRB796 of DMSO zoals hierboven beschreven gevolgd rechtstreeks door fixatie. Bij gebrek aan een stap in de verwarming is het BIRB796 signaal lager dan het signaal van DMSO, suggereren dat BIRB796 de detectie van p38α met dit antilichaam verstoort. D) ITDRFCETSA curven voor cellen behandeld met BIRB796 ofwel met (blauwe driehoek) of zonder (grijze driehoek) antigeen ophalen protocol. Dit cijfer is gewijzigd van Axelsson et al. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Thermische aggregatie en ITDRF experimenten. A) thermische aggregatie kromme experimenten voor cellen met positief behandeld (1 µM AMG548, oranje) en negatieve (DMSO in het grijs) controles. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde van 32 of 464 wordt gerepliceerd. B) ITDRFCETSA experiment uitgevoerd bij 52 ° C voor cellen behandeld met seriële verdunningen van het SB203580 in blauw, Skepinone-L in het groen en RWJ67657 in het rood. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde van 6 wordt gerepliceerd. Gekwantificeerde gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelde intensiteit/cel en tegen de hoogste concentratie van de respectieve verbinding genormaliseerd. Dit cijfer is gewijzigd van Axelsson et al. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Overzicht van de vertegenwoordiger van een screening plaat duikt met 10 X vergroting. Positieve controle (1 µM AMG548) zijn in de kolommen 2 en 24 en negatieve controles (DMSO) zijn in de kolommen 1 en 23. Alle andere putjes bevatten 50 µM van de verbindingen van de bibliotheek die worden gebruikt voor screening met verscheidene hits aangeduid. In de cijfers van de inzet vertegenwoordigt de witte lijn in de lagere juiste hoek 200 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Axelsson et al. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals besproken in het gedeelte ' resultaten ', zijn er verschillende belangrijke stappen voor de procedure. Ten eerste is het belangrijk om te identificeren op een kwalitatief hoogwaardige affiniteit reagens. Het is raadzaam om de screening een kleine bibliotheek met antilichamen voor elke gewenste doelgroep. Nadat een primair antilichaam is geselecteerd, is het ook belangrijk voor het valideren van het systeem voor een aantal verschillende bandplaatsen van de eiwit-doelstelling, indien van toepassing. Contra screening voor verbindingen die met de assay-signaal, interfereren zoals weergegeven in figuur 2C door het weglaten van de uitdaging van de warmte wordt sterk aangemoedigd. Wanneer een verminderde signaal in aanwezigheid van een ligand wordt waargenomen, kan een antigeen ophalen-protocol, zoals beschreven in stap 5.2 worden getest. Ongelijke verwarming van de platen veroorzaken schommelingen en plaat-to-plate variaties in de waargenomen gegevens. Aangezien de platen zijn gedeeltelijk ondergedompeld in een waterbad tijdens de voorbijgaande warmte uitdaging (stap 3.4) worden de buitenste wells van de platen blootgesteld aan het hete water niet alleen aan de onderkant van de putten, maar ook via de buitenste muur. Hierdoor kunnen hogere temperatuur tijdens de zelfde tijd van onderdompeling in de buitenste putjes van de plaat en de daaropvolgende plaat randeffecten. Daarom is het raadzaam om te voorkomen dat de buitenste putjes van de plaat. Eenzelfde effect kunnen ook worden gezien als het luchtbellen zijn opgesloten onder de plaat tijdens de verwarming stap voorkomen voldoende contact tussen het warme water en de onderkant van de putten. Gezien de uitdagingen met verwarming imaging platen, kunnen apparaten en platen speciaal gemaakt voor blootstelling aan warmte helpen verder deze methode. We hebben gekeken naar het gebruik van verschillende cellijnen, en heb gevonden variabiliteit in oppervlakte bijlage na de warmte uitdaging voor aanhangend celtypes. Voorbereidende experimenten in ons lab suggereren dat het gebruik van een conserveren of extracellulaire matrix zoals Synthemax II-SC of cel-Tak mobiele-detachement minimaliseren kunt, maar dit kan het opleveren van een technische uitdaging bij het gebruik van semi-bijgevoegde celtypes. Aangezien samengestelde behandeling wordt uitgevoerd in levende cellen, moet de kleine molecules cel permeabele. Als de verbinding niet permeabel membraan, worden alternatieve hoge doorvoer CETSA methoden aanbevolen. Sommige verbindingen moeten metabolisch om te binden aan hun doel eiwitten11worden geactiveerd. In dergelijke gevallen langere behandeling cellen met de compound voorafgaand aan de uitdaging van de warmte wordt aanbevolen.
Dit protocol vereist een enkele plaat uit cel zaaien naar imaging daarmee vatbaar voor hoge throughput screening van campagnes. Het aantal cellen voor elk experiment is veel lager dan kan worden bereikt met westelijke vlekken of vorige AlphaScreen testen15. Bovendien, wassen of cel detachement stappen, die samengestelde beschikbaarheid en bindende veranderen kunnen, worden verwijderd, behoud van het evenwicht van de vastgestelde bindende stapsgewijs de uitdaging bij warmte. In tegenstelling tot eerdere procedures, is een gebrek aan signaal als gevolg van cytotoxiciteit gelijktijdig gemeld door nucleaire kleuring. Ten slotte, imaging behoudt de ruimtelijke resolutie van de afzonderlijke cellen, waardoor doelwit betrokkenheid metingen in gemengde bevolking van cellen of cel Staten.
Als u wilt echt beoordelen de toepasbaarheid van de benadering, zijn gecoördineerde inspanningen toe te passen de techniek over de smeltende Proteoom nodig. Dergelijke experimenten zal het gemak van de identificatie van geschikte affiniteit reagentia, welk rapport selectief op de inheemse proteïne in aanwezigheid van de resterende gedenatureerd en geaggregeerde eiwitten verduidelijken. Op dit moment weten we niet hoe eiwitniveaus expressie de mogelijkheid om op een betrouwbare manier meten een signaal venster zal beïnvloeden. We verwachten dat dit weerspiegelen affiniteit en de selectiviteit van de beschikbare antilichamen, en anticiperen op dat technologieën gebruikt om te verbeteren signaal in immunefluorescentie testen voor lage overvloedige eiwitten toepassing zullen zijn. Ook kunnen tagged eiwitten of matiemaatschappij verbindingen worden gebruikt voor de detectie in aangepaste versies van de beschreven protocol. Dit protocol is beperkt tot de doelen die smelten en voor interacties waar een kwantificeerbare stabilisatie kan worden waargenomen. Endogene liganden kunnen bijvoorbeeld een eiwit in levende cellen testen, waardoor verdere stabilisatie door een exogene ligand kunnen stabiliseren. Hoewel hier niet verkend, wij zijn van mening dat het mogelijk is te multiplex uitlezingen mogelijk te maken voor de studie van meerdere doelen tegelijk of een doel met stroomafwaartse effectoren. Verdere studies zijn nodig om deze aspecten van in situ CETSA onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen aan verslag.
Acknowledgments
De auteurs erkennen infrastructuurondersteuning van wetenschap voor leven laboratorium en Karolinska Institutet. De auteurs erkennen ook input en discussies met Michaela Vallin, Magdalena Otrocka en Thomas Lundbäck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
- Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
- Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
- Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H.
- Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
- Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
- Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
- Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
- Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).
