Con alto contenuto di Imaging per quantificare l'impegno di destinazione in cellule aderenti

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in biologia chimica e scoperta di farmaci. Ad esempio, il tuo composto si lega alla proteina bersaglio? I principali vantaggi di questa tecnica sono che non c'è alcun requisito di distacco delle cellule aderenti.

E la localizzazione spaziale può essere determinata dall'imaging. Sebbene abbiamo applicato questo metodo nelle linee cellulari, è anche possibile applicare questo metodo ad altri sistemi cellulari come colture primarie e coculture. Prima di seminare le cellule, posizionare le piastre nere di dosaggio di imaging da 384 porsi in una cappa di coltura tissutale e coprire le piastre con un foglio di alluminio prima di utilizzare un trapano standard per realizzare tre fori di diametro di 3,5 millimetri su entrambe le estremità di ciascuna piastra.

Quando le piastre sono pronte, utilizzare la tecnica aseptica per lavare una coltura cellulare A-431 con da 5 a 10 millilitri di PBS. E incubare le cellule con due millilitri di tripina a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule si staccano. Dopo il conteggio, diluire le cellule a 5 per 10 fino alle 4 ° cellule per millilitro nel mezzo di coltura e seminare 40 microlitri di cellule in ogni pozzo di ogni piastra di dosaggio.

Scuotere delicatamente ogni piastra da un lato all'altro dopo la semina per garantire una distribuzione omogenea delle cellule attraverso i fondali del pozzo. Per ridurre al minimo gli effetti del bordo della piastra, lasciare che le cellule si sistemino nella parte inferiore delle piastre di dosaggio per 20 minuti a temperatura ambiente nella parte posteriore della cappa di flusso laminare prima di posizionare le piastre in una camera umidificata personalizzata per due o tre giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno dell'esperimento, utilizzare una rondella per aspirare il mezzo da ogni pozzo.

E aggiungere 30 microlitri del composto di interesse alla concentrazione sperimentale appropriata ai pozzi sperimentali appropriati. Sigillare le piastre di dosaggio trattate con composto con guarnizioni a piastre traspiranti. E riportare le piastre all'incubatore di coltura cellulare per 30 minuti.

Per esporre le cellule a una sfida termica, impostare prima il bagno d'acqua alla temperatura sperimentale appropriata e posizionare una piastra fittizia non sigillata contenente lo stesso volume di mezzo per mezzo e la piastra di dosaggio nel bagno, insieme a un termometro termoplastico per monitorare la temperatura all'interno dei pozzi. Una volta raggiunta la temperatura sperimentale appropriata, rimuovere la guarnizione traspirante da ogni piastra di dosaggio e rigillare le piastre con un foglio di alluminio adesivo stretto per assicurarsi che non perda acqua nei pozzi durante il successivo riscaldamento nel bagno d'acqua. Mantenere accessibili i fori praticati all'interno del telaio della piastra.

Posizionare le piastre di dosaggio e una nuova piastra fittizia nel bagno d'acqua, con i fondi delle piastre angolati verso la superficie dell'acqua per forzare l'aria rimanente da sotto le piastre e iniziare a monitorare la temperatura della nuova piastra fittizia. Un riscaldamento uniforme della piastra è fondamentale per le prestazioni di dosaggio. Fare attenzione a posizionare la piastra nel bagno d'acqua in modo che non ci siano bolle d'aria intrappolate sotto.

Dopo tre minuti, raffreddare immediatamente le piastre in un secondo bagno d'acqua di acqua a temperatura ambiente per cinque minuti prima della loro analisi. Per immagini le cellule, aggiungere prima 10 microlitri di paraformaldeide al 16% direttamente alle piastre di dosaggio per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente. Alla fine del periodo di fissazione, lavare le celle con 300 microlitri di PBS sulla rondella della piastra e aggiungere 20 microlitri dello 0,1%NP40 per un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente.

Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule come dimostrato. E bloccare le cellule con 15 microlitri di albumina siere bovina all'1%, o BSA, per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, utilizzare la rondella per aspirare il siero bloccante e aggiungere 10 microlitri dell'anticorpo primario di interesse ai pozzi appropriati per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, lavare ogni bene con 300 microlitri di PBS ed etichettare le cellule con 10 microlitri dell'anticorpo secondario appropriato per un'ora a temperatura ambiente protetta dalla luce. Per la colorazione nucleare delle cellule, aggiungere 10 microlitri di un colorante nucleare appropriato a ciascun pozzo per 10 minuti a temperatura ambiente. E lavare le cellule in PBS come dimostrato.

Etichettare le celle con 10 microlitri di maschera cellulare per pozzo per 30 minuti a temperatura ambiente. Seguito da un ultimo lavaggio con PBS. Quindi erogare 60 microlitri di PBS fresco ad ogni pozzo e sigillare le piastre con un foglio di alluminio fino all'imaging.

Per immagini le celle, cattura quattro immagini per pozzo su un imager ad alto contenuto utilizzando i canali fluorescenti appropriati sotto l'obiettivo 10 volte utilizzando l'autofocus laser automatizzato e applica il binning durante l'acquisizione. Quindi archiviare le immagini come file dot-tiff in scala di grigi a 16 bit insieme ai metadati. Il riconoscimento degli anticorpi non deve essere interrotto da cambiamenti conformazionali nella proteina bersaglio che possono essere indotti dal legame del ligando.

Ad esempio, BIRB796 ha un tasso di riposo lungo e la quantificazione dell'impegno target è possibile solo applicando un passaggio di recupero dell'antigene. Questo esperimento rappresentativo della curva di aggregazione termica per le cellule trattate con composti di controllo positivi e negativi illustra i tipici intervalli di stabilizzazione proteica dopo il trattamento delle cellule con i composti a varie temperature. Qui viene dimostrato che un tipico esperimento di impronte digitali isotermiche dose-risposta dimostra intervalli rappresentativi di stabilizzazione proteica in risposta a diverse dosi di composto sperimentale.

L'applicazione di sfide di calore isotermico per lo screening composto per identificare nuovi leganti della proteina bersaglio consente l'analisi di un gran numero di composti ad una singola concentrazione contemporaneamente, prima del rilevamento delle impronte digitali isotermiche dose-risposta dei colpi per confermare la stabilizzazione della proteina bersaglio. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che le condizioni sperimentali esatte, come la lunghezza e la temperatura della sfida termica, hanno un impatto sulla potenza osservata dei composti. Non dimenticare che lavorare con la paraformaldeide può essere estremamente pericoloso.

E le precauzioni, come seguire le linee guida istituzionali in materia di sicurezza, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.