Summary
마약 대상 포용의 측정은 효과적인 약물 개발 및 화학 프로브 유효성 검사를 중앙. 여기, 우리 선발 마약 대상 포용 셀룰러 열 교대 분석 실험 (CETSA)의 미 판 호환 adaption에 높은 콘텐츠 이미징 사용 하 여 측정 하기 위한 프로토콜.
Abstract
Quantitating 그들의 의도 된 단백질 목표와 작은 분자의 상호 작용 하는 것이 신약 개발, 대상 유효성 검사 및 화학 프로브 유효성 검사에 대 한 중요 합니다. 단백질 대상 또는 작은 분자의 수정 없이이 현상을 측정 하는 메서드는 기술적으로 도전 하지만 특히 가치가 있습니다. 세포 열 교대 분석 실험 (CETSA)은 살아있는 세포에서 대상 참여 모니터링 하 한 기술입니다. 여기, 우리는 단일 세포 수준에서 subcellular 지 방화를 유지 하면서 높은 처리량 측정을 위한 수 있는 원래 CETSA 프로토콜의 적응을 설명 합니다. 우리는이 프로토콜 제공 세포의 유형이 다른 인구에서 특히 화합물 대상 상호 작용의 깊이 특성에 대 한 CETSA의 응용 프로그램에 중요 한 진보를 믿습니다.
Introduction
때 개발 하는 새로운 약물 또는 화학 프로브 측정 대상 인 또는 약혼 라이브 셀1,2,3의 관찰 된 약리 효과 또는 기능 판독 하 필수적 이다. 이러한 데이터는 작은 분자는 실제로 원하는 목표에 도달할 수 있도록 고 단백질 대상 선택4,5뒤에 생물 학적 가설을 확인 하기 위해 필요. 또한, 약물 개발 동안 증가 복잡성의 모델 시스템을 선택 하 여 확증 임상 시험 전에 복합 리드 사용 됩니다. 이러한 전 임상 시스템 생물학의 번역을 확인, 추적 마약 대상 참여와 함께이 개발 과정을 통해 생물학에 대 한 메서드는 중요 합니다.
마약-대상 참여 도전 unfunctionalized 작은 분자와 단백질, 특히 공간적 해상도6,7단일 세포 수준에서 라이브 셀에서 모니터링 하 전통적으로. 간의 상호 작용을 관찰 하는 최근 방법은 수정 되지 않은 약물 및 살아있는 세포에 있는 단백질은 세포 열 변화 분석 결과 (CETSA)는 열 도전 하 응답에서 네이티브 단백질의 ligand 유도 안정화는 정량된8, 9,10. 이것은 열 문제에 노출 된 후 남아 있는 수용 성 단백질을 측정 함으로써 이루어집니다. CETSA의 초기 공개, 서쪽 오 점 검출을 위해 사용 되었다. 심사 캠페인을 활성화 하 고 더 큰 복합 컬렉션의 심사 했다, CETSA 실험의 처리량을 증가 노력 여러 동종, microplate 기반 분석10,11의 개발을 리드를 해야 합니다. 그러나, 이러한 방법 한 가지 한계는 셀 정지에 복합 치료에 현재 가장 적합 한 하며 탐지 세포 세포의 용 해, 공간 정보의 손실에 지도 이다. CETSA 일 수 있다 실험적으로 열 집계 온도 (Tagg) ligand 유도 된 변화에 적용 작은 분자의 단일 농도 또는 ligand 농도 단일 온도에서 단백질을 안정화 하는 데 필요한. 후자은 등온선 복용량 응답 지문 (ITDRF) 이러한 측정 특정 실험 조건에의 의존을 불린다.
이 프로토콜의 목표 대상 약혼이 콘텐츠 현미경12immunofluorescent (IF) 항 체 검출에 의해 부착 셀에 CETSA를 사용 하 여 측정 하는입니다. 이 절차는 subcellular 지 방화의 절약 대상 포용의 단일 셀 정량화에 대 한 허용 하도록 원래 CETSA 플랫폼을 확장 합니다. 특히, 많은 이전 보고서와 달리이 절차에서 복합 치료 수행 됩니다 라이브 부착 세포 표면 분리 또는 열 도전, 따라서 우리가13를 측정 하는 것을 목표로 설립 된 바인딩 균형을 보존 하기 전에 세척 하지 않고. 현재 메서드는 유효성을 검사 한 대상 단백질 p38α에 대 한 (MAPK14)에 여러 셀 라인, 그리고 우리는이 절차를 공유 함으로써 기술 적용 광범위 하 게 녹는 프로테옴 바랍니다. 우리는이 프로토콜 검사에서 약물 개발 파이프라인에 걸쳐 적용할 수 있습니다, 대상 참여에서 vivo에서의 모니터링을 통해 심사 히트 예상.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 셀의 시드
참고: 워크플로 대 한 일반적인 개요에 대 한 그림 1을 참조 하십시오. 재료 및 시 약의 상세 목록 테이블의 재료에서 사용할 수 있습니다.
- 셀의 시드, 이전 나중 단계에서 난방 접시 아래 갇혀 공기 방울을 피하기 위해 검은 384-잘 이미징 분석 결과 접시의 프레임에 표준 드릴 구멍을 드릴 합니다. 플라스틱 입자가이 단계 동안 우물을 입력을 방지 하 고 살 균 조건을 유지 하기 위해 밀봉 접착제 알루미늄 호 일 접시 또는 조직 문화 후드에 드릴링 전에 접시 커버. 일반적으로, 각 접시 (짧은 가장자리)의 측면에 3.5 m m의 직경을 가진 3 구멍 충분.
- 70% 에탄올으로 청소 하 여 층 류 벤치를 준비 합니다. 표준 무 균 조직 배양 기술, 다음 셀 플라스 크 또는 접시에서 미디어를 제거 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 5-10 mL로 세포 세척 하 고 플라스 크에 트립 신 2 mL를 추가 합니다. A-431 셀 분리 될 때까지 플라스 크에서 37 ° C를 품 어. Haemocytometer 또는 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 문화 매체에 50, 000 셀/mL의 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
- 벌크 시 약 디스펜서 또는 실험의 규모에 따라 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 분석 결과 플레이트의 각 음에 세포 현 탁 액 (주는 잘 당 2000 셀 마지막 셀 밀도)의 40 µ L을 분배. 짧게 사이드-투-측면에서 접시의 바닥에 세포를 균일 하 게 분산 하는 접시를 이동 합니다.
- 접시 가장자리 효과 최소화 하기 위해 층 류 두건 뒤 실 온에서 20 분에 대 한 분석 결과 접시의 하단에 정착을 셀 수 있습니다. 다음, 다습 한 대기권을 보장 하기 위해 젖은 종이 타월로 플라스틱 용기에 접시를 놓습니다. 사용 전에 70% 에탄올과 플라스틱 용기를 닦아.
- 기존의 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 2-3 일에 대 한 분석 결과 플레이트 상자를 품 어. 가벼운 현미경으로 검사 하 여 평가는 50-75%까지 셀의 confluency를 모니터링 합니다.
2. 복합 치료
- 실험 당일, 잘 사용 하 여 각 접시 세탁기에서 중간 발음. 접시 와셔에 접시를 놓고 포부 프로그램을 선택 합니다. 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우에, 액체 폐기물 트레이 또는 싱크를 통해 빠른 손 트위스트와 함께 접시를 반전 하 여 제거할 수 있습니다. 액체의 완전 한 제거 좋은 성능을 위해 필수적 이다. 어떤 초과 액체 다음 종이 타월로 dabbing에 의해 제거 됩니다.
- 자동 분배를 사용 하 여 세포 배양 또는 실험의 규모에 따라 멀티 채널 피 펫 적절된 농도를 희석 하는 화합물의 30 µ L를 추가 합니다. 각 분석 결과 접시에 여러 우물을 네거티브 (DMSO)와 긍정적인 (알려진된 ligand) 컨트롤을 추가 하려면 확인 하십시오. 이후이 열 교대 분석 실험, 화합물 농도 분리 상수 관찰 단백질 안정화를 초과 하는 것이 필요 하다. 따라서, 화합물 농도 대 한 대략적인 가이드라인은 50-100 번 IC50, 하지만 화합물 농도 대 한 더 많은 세부 사항 설명을 토론 섹션에서 찾을 수 있습니다.
참고: 셀 라인의 DMSO 내성 실험 전에 시험 되어야 한다. - 인감 숨 플레이트 화합물 처리 분석 결과 플레이트 밀봉 하 고 30 분 동안 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.
3. 열 도전
- 먼저, 원하는 온도에 물 목욕을 설정 합니다. 참고 분석 결과 접시의 우물 내부에 도달 최종 온도 물 목욕에 최종 온도에서 다를 수 있습니다. 더미 플레이트 및 열전대 온도계와 오프셋을 미리 조사. 그것은 일반적으로 원하는 온도에서 안정화 목욕 30 분 걸립니다.
- 원하는 온도 난방 단계 분석 결과 격판덮개의 우물에서에 도달 확인, 분석 결과 접시와 매체의 동일한 볼륨을 포함 하는 봉인 되지 않은 더미 플레이트를 준비 합니다.
- 인큐베이터에서 분석 결과 플레이트를 제거 합니다. 숨 봉인 해제 하 고 다시 물 물 목욕에 연속적인 난방 동안 우물에 누설 것 이다 되도록 꽉 접착제 알루미늄 호 일 화합물 취급 셀을 포함 하는 분석 결과 접시를 봉인. 플레이트 프레임에 드릴된 구멍 액세스할 수 있는지 확인 하십시오.
- 접시 아래에서 밖으로 남아 있는 공기를 물 표면으로 각도 판의 아래쪽 물 목욕에 분석 결과 접시와 접시 더미를 놓습니다.
- 열전대 온도계를 사용 하 여 새로운 더미 격판덮개의 우물 내부 온도 모니터링 합니다.
- 분석 결과 접시 물 욕조에 3 분 동안 열. 즉시 다른 물 목욕을 5 분 동안 방 강화 물 분석 결과 및 더미 플레이트 전송. 분석 결과 격판덮개는 이제 추가 처리에 대 한 준비 이다.
4입니다. 고정
- 벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 분석 결과 접시에 직접 10 µ L 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA)을 분배. 20 분 동안 실 온에서 품 어.
참고: 일부 fixatives 발암으로 분류 되 고 기관 안전 규정을 따라야 한다. - PFA 솔루션 발음 하 고 접시 와셔를 사용 하 여 300 µ L PBS를 가진 세포를 씻어. 접시 와셔에 접시를 놓고 포부 프로그램을 선택 합니다.
참고:이 절차는 최적화 되어 있는 액체는 동시에 적절 하 게 하 고 제거 접시 세탁기에 오버플로 프로토콜을 사용 하. 접시 와셔 또는 유사한 절차를 사용할 수 없는 경우 세척 단계 수동으로 수행할 수도 있습니다. - 수동 세척 절차: 폐기물 트레이 또는 싱크를 통해 빠른 손 트위스트와 함께 접시를 반전 하 여 우물에서 액체를 제거 합니다. 액체의 완전 한 제거 좋은 성능을 위해 필수적 이다. 멀티 채널 피 펫으로 PBS의 80 µ L을 추가 및 위에서 설명한 대로 다시 접시를 반전, 세척 절차를 두 번 반복. 마지막 세척 후 깨끗 한 종이 수건을 초과 액체를 제거에 대 한 접시를 되 리.
5입니다. permeabilization
- 0.1% (v/v) NP 40를 멀티 채널 피펫으로와 웰 스의 20 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 실내 온도에 품 어. (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 셀을 씻어.
- 또는 적절 한 경우 적용 한 항 원 검색 프로토콜, 예를 들면:
- 멀티 채널 피펫으로와 우물에 1 %SDS 20 µ L를 추가 합니다. 5 분 동안 실내 온도에 incubate 고 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차에 따라 씻어.
- PH 7.2에서 10 mM 글리신의 80 μ를 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어. 접시 와셔를 사용 하 여 접시 세탁기에 배치 하 고 포부 프로토콜을 선택 하 여 글리신 솔루션 발음 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우 2.1에 4.2 노트를 참조 하십시오.
6. 차단
- 벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에 PBS에서 1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 15 µ L를 추가 합니다. 접시 알루미늄 호 일 접시 도장 4 ° C에서 1 시간 동안 실내 온도에 또는 밤새 품 어.
7. 1 차 항 체
- 접시 와셔를 사용 하 여 접시 세탁기에 배치 하 고 포부 프로토콜을 선택 하 여 차단 솔루션 발음 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우 2.1에 4.2 노트를 참조 하십시오.
- 1 차적인 항 체 따라 희석의 10 µ L을 추가 1% (w/v) BSA PBS에 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에. 접시 알루미늄 호 일 접시 도장 4 ° C에서 1 시간 동안 실내 온도에 또는 밤새 품 어.
8. 2 차 항 체
- 1 차적인 항 체 솔루션을 발음 하 고 (단계 4.2) 위에서 설명한 동일한 절차에 따라 우물을 세척.
- 알 렉 사 488 이차 항 체 따라 희석의 10 µ L을 추가 1% (w/v) BSA PBS에. 1 시간 동안 실 온에서 품 어. 빛 으로부터 보호 하기 위해 접착제 알루미늄 호 일 인감과 접시를 봉인.
참고:이 빛에서 접시와 후속 단계를 보호 합니다.
9. 핵 얼룩 및 셀 마스크
- 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물 PBS에 0.05 mg/mL를 희석 하는 핵 염색의 10 µ L를 추가 합니다. 추가 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
- 이차 항 체 및 Hoechst 솔루션 aspirate과 웰 스 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 세척.
- 셀 마스크 200 ng/mL PBS에 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에 희석의 10 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- 셀 마스크 솔루션을 발음 하 고 우물 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 세척.
- 접시 와셔, 벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 모든 우물에 PBS의 60 µ L를 분배 하 고 밀봉 접착제 알루미늄 호 일로 접시.
10. 이미지 수집 및 분석
- 3 형광 채널을 사용 하 여 높은 콘텐츠 영상에 이미지 캡처: DAPI (387/447), GFP (472/520) 및 TexasRed (562/624). 10 X 목표를 사용 하 여 잘 당 4 이미지를 취득 합니다. 자동된 레이저 자동 초점을 사용 하 고 범주화 2 중 적용. 16 비트, 회색 스케일 tiff 파일로 메타 데이터와 함께 이미지를 저장 합니다.
- 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. DAPI (핵)와 TexasRed (세포질) 셀 점수 알고리즘을 사용 하 여 셀 경계를 식별 합니다.
- 추가 데이터 분석에 대 한 모든 인수 파장에 대 한 평균 강도 추출 합니다.
- 분석 결과의 안정성을 보장 하기 위해 Z 요소를 계산 합니다.
- 다음 수식을 사용 하 여 % 안정화 계산: 100 * (1-(잘 강도-평균 잘 휘도 부정적인 제어) / (평균 휘도 긍정적인 제어 평균 강도 부정적인 제어)). 여기 부정적인 제어 DMSO 이며 긍정적인 컨트롤 참조 물질 이다. 각 화합물에 대 한 최대 및 최소 안정화 농도 제어 우물의 강도 값 대신 가끔 사용 됩니다 이후 최대 안정화 화합물 사이 다를 수 있으며 실제로 ITDRF 곡선에 대 한 긍정적인 통제 보다 클 수, .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
그림 1 에 설명 된 프로토콜에서는 높은 콘텐츠 영상으로 남아 있는 수용 성 단백질의 탐지와 부착 세포에 CETSA 분석 실험을 실행 하기 위한 기본 워크플로 설명 합니다. 이 워크플로 화합물 또는 약14의 격판덮개 레이아웃을 수정 하 여 쉽게 분석 결과 개발의 모든 단계에 맞게 수 있습니다. 우리 선발 예상된 결과 예상 몇 가지 사용 하는 경우 아래.
항 체 식별 및 분석 결과 개발입니다. 성공적인 결과 대 한 필수 구성 요소는 기본 항 체 또는 선택적으로 열 동안 집계 및 침전 된 단백질의 단백질의 기본 형태를 인식 하는 다른 적합 한 선호도 시 약의 식별 3 단계에 도전 한다. 설정 하려면 여기에 설명 된 CETSA 이미징 분석 결과, 우리는 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 간의 신호 창 52 ° C에서 p38α를 대상으로 하는 9 항 체의 패널 상영. 우리는 다음 최고의 항 체 적정 하 고 p38α 알려진된 ligand (긍정적인 제어)와 DMSO (부정적인 컨트롤)에 의해 안정화에 대 한 면역 형광 이미지 대표 그림 2 A, B 에 표시 된 조건에 정착. 항 체 인식 한다 또한 하지 중단 될 대상 단백질 ligand 바인딩 (그림 2C)에 의해 유도 될 수 있는 구조적 변화에 의해. 예를 들어, BIRB796는 요금에서 긴 및 대상 참여의 정량화는 (5.2; 항 원 검색 단계를 적용 하 여만 가능 그림 2D)입니다. 그것은 가능한 경우 대상 단백질의 다른 바인딩 사이트를 포함 하는 알려진된 ligands와 기본 항 체의 성능을 확인 해야 합니다. 모두와 함께 항 원 검색 단계 없이 항 체 확인 선호 이루어집니다.
Tagg 및 ITDRF 곡선. 위에서 설명 했 듯이, 두 가지 모드, Tagg 곡선 및 ITDRF 실험에서 CETSA 실험을 실행할 수 있습니다. 두 이체 다 프로토콜 섹션에서 그림 1 에 설명 된 동일한 기본 프로토콜을 사용 합니다. 첫 번째 설치에서 목적 온도 그라데이션으로 셀에 도전 하 여 존재에 ligand의 단일 농도 Tagg 곡선을 비교입니다. Tagg 곡선을 수행 하려면 별도 접시는 3 분에 대 한 온도 범위에서가 열. 이 실험을 수행, 각 접시 물 목욕을 새로운 온도를 안정화 하는 데 걸리는 시간으로 복합 치료 길이 시간이 중요 하다. 이와 관련, peforming 및 열 도전 물 목욕에 단계는 PCR 기계에 튜브가 열 보다 더 많은 시간이 소요. 실험적인 경로 ITDRF 곡선을 생성 하기 위해 고정된 온도에 ligand의 다음 실행된 농도 응답 곡선입니다. 일반적으로, 여러 화합물을 테스트 하는 경우 복합 추가 대 한 분석 결과 준비 번호판 자동된 액체 처리를 사용 하 여 가장 재현할 수 데이터를 달성 하기 위해 준비가 되어있습니다. 화합물은 DMSO에 순차적으로 희석 하 고 원하는 농도에 세포 배양에 녹아. 우리는 일반적으로 3 또는 4 배 희석, µ M 50-100에서 시작 하는 11 포인트 집중 시리즈를 테스트 하지만이 사용 하는 ligands의 힘에 따라 다릅니다. 먼저 Tagg 곡선 모두는 ligand의 존재와 부재에 설정 곡선 사이 변화를 관찰할 수 있는 후속 등온 실험 온도 선택 하는 것이 좋습니다. 주위 또는 Tagg바로 위에 선택한 온도 이어야 한다. 두 형식 모두 대상 포용의 확인에 대 한 허용 하지만 복합 화력 ITDRF의 순위에 대 한 실험은 종종 더 적당 한. 그림 3A Tagg 곡선에 대 한 예상된 정량된 결과의 그림을 표시 하 고 그림 3B 는 전형적인 ITDRF 실험의 결과 단정.
캠페인을 심사. 프로토콜 또한 심사 대상 단백질의 비 발한 바인더를 식별 하는 캠페인을 적용할 수 있습니다. 이 경우에, 등온 열 도전 단일 농도 확인 된 안정 된 화합물을 위한 ITDRF 실험 뒤에 화합물의 많은 수를 위해 적용 됩니다. 우리 시험 준비 심사 접시를 준비 하 고 자동된 액체 처리를 사용 하 여 분석 결과 판 문화 미디어에 희석 하는 화합물을 전송. 모든 열 안정성 분석, 것과 같이 관찰 단백질 안정화, 분리 상수를 초과 하는 데 필요한 이며 따라서 우리 히트 식별을 용이 하 게 하 50 µ M에서 작은 분자 라이브러리 적용. 순위 및 우선 순위 지정이이 화합물의 ITDRF를 사용 하 여 조회 수의 심사 후 허락할 것 이다. 그림 4 는 심사 접시에서 대표적인 결과 보여준다.
그림 1 . 이 문서에서 설명 하는 프로토콜의 개요 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 항 체 식별 및 분석 결과 개발입니다. A) A-431 세포에 인간 p38α의 검색을 위한 예제 데이터. 대표 이미지 (1 µ M AMG548) (DMSO) 컨트롤을 제외 하 고. 레드-핵 Hoechst 얼룩, 그린-p38α 얼룩. 10 배 확대;로 찍은 이미지 흰색 눈금 막대 나타냅니다 73 µ m. B) 평균 강도/셀으로 정량된 데이터의 예. 오차 막대는 6 별도 번호판에 대 한 16 복제의 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 각 접시 뒤에 셀, permeabilization 및 후속 immunostaining의 고정 물 욕조에 52 ° C에가 열 했다. A-431 셀 치료 후 C) 면역 형광 신호 강도 측정 1 µ M와 BIRB796 또는 DMSO 위에서 설명한 뒤 직접 고정. 난방 단계의 부재에서 BIRB796 신호 BIRB796이 항이 체와 p38α의 검색을 방해 하는 것을 건의 하는 DMSO 신호 보다 낮습니다. 셀 D) ITDRFCETSA 곡선 BIRB796 치료 (파란색 삼각형)로 또는 (회색 삼각형) 항 원 검색 프로토콜 없이. 이 그림은 Axelsson 그 외 여러분 201812에서 수정 되었습니다. 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 열 집합 및 ITDRF 실험. 셀 A) 열 집계 곡선 실험 긍정적인 치료 (1 µ M AMG548, 오렌지에서) (회색에서 DMSO) 컨트롤을 부정. 오차 막대는 32 또는 464 복제의 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 셀에 대 한 52 ° C에서 B) ITDRFCETSA 실험 SB203580 파란색에서, 녹색에서 Skepinone-L의 직렬 희석 대우와 빨간색으로 RWJ67657. 오차 막대는 6 복제의 의미의 표준 오류를 나타냅니다. 정량된 데이터 평균 강도/셀으로 표현 하 고 각 화합물의 높은 농도 대 한 정규화 됩니다. 이 그림은 Axelsson 그 외 여러분 201812에서 수정 되었습니다. 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 10 배 확대에서 상영 판의 대표 개요. 긍정적인 컨트롤 (1 µ M AMG548) 열 2와 24 이며 부정적인 컨트롤 (DMSO) 열 1, 23에에서. 다른 모든 우물 여러 안타 표시와 함께 심사에 대 한 사용 라이브러리 화합물의 50 µ M를 포함. 삽입 된 그림에서 오른쪽 아래 모서리에 흰색 라인 200 µ m을 나타냅니다. 이 그림은 Axelsson 그 외 여러분 201812에서 수정 되었습니다. 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
결과 섹션에서 설명 했 듯이, 절차를 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 그것은 높은-품질 선호도 시 약을 식별 하는 것이 중요입니다. 각 원하는 대상에 대 한 항 체의 작은 도서관을 심사 하는 것이 좋습니다. 1 차적인 항 체를 선택한 후 적절 한 단백질 대상의 다른 바인딩 사이트의 숫자에 대 한 시스템의 유효성을 검사 하는 것이 중요 이기도 합니다. 열 문제를 생략 하 여 그림 2C 와 같이 분석 결과 신호 방해 하는 화합물에 대 한 카운터 검사는 매우 좋습니다. ligand의 존재에 있는 감소 된 신호를 관찰 하는 때 단계 5.2에서에서 설명한 대로 항 원 검색 프로토콜을 테스트할 수 있습니다. 플레이트의 고르지 못한 난방 관찰된 데이터 변동 및 격판덮개 변형을 일으킬 수 있습니다. 접시 부분적으로 (3.4 단계) 과도 열 도전 하는 동안 물 욕조에 잠긴 이후 플레이트의 외부 우물 외부 벽을 통해 뿐만 아니라 우물의 바닥에서 뿐만 아니라 뜨거운 물에 노출 됩니다. 이 같은 침수 시간 동안 접시와 후속 접시 가장자리 효과의 외부 우물에서 높은 온도 발생할 수 있습니다. 따라서, 격판덮개의 외부 우물을 방지 하는 것이 좋습니다. 기포는 뜨거운 물과 우물의 바닥 사이 충분 한 접촉을 방지 난방 단계 접시 아래 갇혀 경우 비슷한 효과 또한 볼 수 있습니다. 열 이미징 접시와 과제를 감안할 때, 장치 및 열 노출에 대 한 구체적으로 만든 접시 도움이 될이 방법을 사전. 우리 여러 셀 라인의 사용을 탐험 하 고 부착 셀 형식에 대 한 열 도전 후 표면 부착에 다양성을 발견 했다. 우리 실험실에서 예비 실험 Synthemax II-SC 또는 셀 탁 같은 코팅 또는 세포 외 매트릭스를 사용 하 여 셀 분리를 최소화할 수 있지만 반 연결 된 셀 형식을 사용할 때이 기술 도전 포즈 수 것이 좋습니다. 복합 치료는 라이브 셀에서 수행 하 고, 이후 작은 분자 세포 투과성 이어야 합니다. 화합물은 막 투과성, 대체 높은 처리량 CETSA 메서드는 권장 됩니다. 일부 화합물 그들의 타겟 단백질11에 바인딩할 metabolically 활성화 될 필요가 있다. 이러한 경우에 더 이상 치료 셀 열 도전 하기 전에 화합물을 것이 좋습니다.
이 프로토콜에는 높은 처리량 캠페인 상영 의무가 만들기 이미징 하 시드 셀에서 단일 플레이트를 필요 합니다. 각 실험에 대 한 셀 수는 서쪽 오 점 달성 될 수 있다 보다 훨씬 낮은 또는 이전 AlphaScreen 분석 실험15. 또한, 세척 또는 복합 가용성 및 바인딩을 변경할 수 있습니다, 셀 분리 단계 제거 됩니다 열 도전 단계를 통해 설립된 바인딩 평형 유지. 이전 절차와는 달리 세포 독성으로 인해 신호의 부족은 동시에에 핵 얼룩에 의해 보고 됩니다. 마지막으로, 이미징 대상 셀 또는 셀 상태의 혼합된 인구에 있는 약혼 측정에 대 한 수 있도록 개별 셀의 공간 해상도 유지 합니다.
진정으로 평가 방식의 적용, 녹는 프로테옴 걸쳐 기법을 적용 하는 공동된 노력 필요 합니다. 같은 실험 적합 한 선호도 시 약, 나머지의 네이티브 단백질에 선택적으로 보고 변성 그리고 단백질 집계를 식별 용이성을 명확히 것 이다. 우리가 현재 알지 어떻게 단백질 표정 수준 신호 창 안정적으로 측정 하는 능력에 영향을 미칠 것입니다. 우리는이 선호도 사용 가능한 항 체의 선택도 반영 하 고 낮은 풍부한 단백질에 대 한 immunofluorescent 분석 실험에서 신호를 향상 하는 데 사용 하는 기술이 적용 될 것을 기대 합니다. 또는 태그 단백질 또는 기능성된 화합물 검출 기술된 프로토콜의 수정된 버전에 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 녹아 대상 및 상호 작용에 대 한 제한 같지는 안정화를 관찰 될 수 있다. 예를 들어, 내 인 성 ligands exogenous ligand에 의해 더 안정화 수 있는 살아있는 세포 분석 실험에 있는 단백질을 안정 수 있습니다. 여기 탐험 하지, 하지만 우리는 그것은 동시에 여러 대상의 연구에 대 한 허용 하도록 다중 판독 또는 다운스트림 이펙터와 대상에 수 있을 것입니다 믿습니다. 더 학문은 제자리에 CETSA의 이러한 측면을 조사 하는 데 필요한.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 아무 공개 보고 있다.
Acknowledgments
저자는 과학 생활 연구소와 카롤 린스 카 Institutet 위한 인프라 지원을 인정합니다. 저자는 또한 입력과 Michaela Vallin, 막달레나 Otrocka와 토마스 Lundbäck 토론을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
- Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
- Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
- Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H.
- Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
- Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
- Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
- Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
- Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).
